הקמה ואפיון של אורגנואידי קיבה שמקורם במטופל מביופסיות של גוף קיבה שפיר ואפיתל אנטראלי

סיכום

אורגנואידים שמקורם בקיבה מוצאים שימוש הולך וגובר במחקר, אך פרוטוקולים רשמיים ליצירת אורגנואידי קיבה אנושיים מתעכלים חד-תאיים עם צפיפות זריעה מתוקננת חסרים. פרוטוקול זה מציג שיטה מפורטת ליצירת אורגנואידים בקיבה באופן אמין מרקמת ביופסיה המתקבלת במהלך אנדוסקופיה עליונה.

תקציר

אורגנואידים שמקורם בקיבה (PDOs) מציעים כלי ייחודי לחקר ביולוגיה ופתולוגיה של קיבה. כתוצאה מכך, PDOs אלה מוצאים שימוש הולך וגובר במגוון רחב של יישומי מחקר. עם זאת, קיים מחסור בגישות שפורסמו לייצור PDO בקיבה מתעכלים חד-תאיים תוך שמירה על צפיפות זריעת תאים ראשונית מתוקננת. בפרוטוקול זה, הדגש הוא על התחלת אורגנואידים בקיבה מתאים בודדים מבודדים ומתן שיטה להעברת אורגנואידים באמצעות פיצול. חשוב לציין, הפרוטוקול מראה כי גישה סטנדרטית לצפיפות זריעת התאים הראשונית מניבה באופן עקבי אורגנואידים בקיבה מרקמת ביופסיה שפירה ומאפשרת כימות סטנדרטי של צמיחת אורגנואידים. לבסוף, ראיות תומכות בתצפית החדשנית כי PDO קיבה מציג שיעורים משתנים של היווצרות וגדילה בהתבסס על האם מקורם של האורגנואידים בביופסיות של הגוף או באזורים אנטראליים של הקיבה. באופן ספציפי, מתגלה כי השימוש ברקמת ביופסיה אנטראלית להתחלת אורגנואידים גורם למספר גדול יותר של אורגנואידים שנוצרו ולצמיחת אורגנואידים מהירה יותר על פני תקופה של 20 יום בהשוואה לאורגנואידים שנוצרו מביופסיות של גוף הקיבה. הפרוטוקול המתואר כאן מציע לחוקרים שיטה בזמן וניתנת לשחזור ליצירה מוצלחת ולעבודה עם PDO קיבה.

מבוא

אורגנואידים הם מבנים תאיים זעירים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) הדומים לארכיטקטורה ולפונקציונליות של האיברים שמהם הם נגזרו ^1,2. מודלים אלה שגודלו במעבדה נוצרים על ידי טיפוח תאי גזע או תאים ספציפיים לרקמות בסביבה מבוקרת המאפשרת לתאים אלה להתארגן בעצמם ולהתמיין לסוגי תאים שונים ^1,2,3. אחד היתרונות העיקריים של אורגנואידים הוא יכולתם לשחזר את הביולוגיה האנושית באופן הדוק יותר מאשר תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות (2D) ^1,2,3. בפרט, אורגנואידים אנושיים הוכחו לשמור על המגוון הגנטי של רקמת המקור שלהם ^3,4,5. אורגנואידים מציעים הזדמנות ייחודית לחקור התפתחות איברים אנושיים, למדל מחלות ולבחון טיפולים פוטנציאליים בסביבת מעבדה מבוקרת. יתר על כן, ניתן להפיק אורגנואידים מדגימות בודדות של מטופלים, מה שמאפשר גישות של רפואה מותאמת אישית ופיתוח פוטנציאלי של טיפולים מותאמים אישית ^3,6,7.

חוקרים השתמשו באורגנואידים של קיבה אנושית כדי לחקור היבטים שונים של ביולוגיה ופתולוגיה של קיבה. דוגמאות בולטות כוללות את השימוש באורגנואידים שמקורם בחולים (PDOs) כדי לחזות תגובות כימותרפיות^לסרטן קיבה ^8,9,10 ולדגמן את תגובת האפיתל לזיהום הליקובקטר פילורי 11,12,13. אורגנואידי קיבה אנושיים מורכבים מסוגי תאים שונים הנמצאים בקיבה, כולל תאי צוואר, תאי בור ותאים תומכים אחרים^11,14. אורגנואידים בקיבה יכולים להיווצר מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) או מתאי גזע שבודדו ישירות מרקמת קיבה המתקבלת באמצעות ביופסיות או מדגימות כריתת קיבה^11,14. בידוד תאי גזע בקיבה מרקמת קיבה נעשה בדרך כלל על ידי בידוד ותרבית בלוטות קיבה או עיכול אנזימטי של דגימות רקמה כדי לשחרר תאים בודדים ^9,13,15. חשוב לציין, ההתמיינות של תאים בתוך אורגנואידים קיבה שנוצרו באמצעות כל אחת מהטכניקות הללו הוכחה כדומה¹³. הפרוטוקול המתואר כאן מתמקד בתקציר חד-תאי.

אורגנואידים מייצגים חידוש מדעי המגשר על הפער בין תרבית תאים מסורתית לבין איברים שלמים. ככל שהמחקר בתחום ממשיך להתקדם, אורגנואידים צפויים לתרום לפיתוח טיפולים וטיפולים יעילים יותר למגוון רחב של יישומים. בהתחשב בשימוש הגובר של PDO קיבה, יש צורך בזמן גישה סטנדרטית הדור שלהם. כאן מתואר הפרוטוקול ליצירת PDO קיבה אנושי מתאים בודדים שבודדו מרקמת ביופסיית קיבה שפירה שנרכשה במהלך אנדוסקופיה עליונה. חשוב וייחודי, נקבע מספר סטנדרטי של תאים בודדים לזריעה כדי ליצור באופן אמין PDO קיבה ולאפשר אפיון לאחר מכן. באמצעות טכניקה זו, הבדלים אמינים בהיווצרות וצמיחה של אורגנואידים שנוצרו מביופסיות של גוף הקיבה או אנטרום קיבה מודגמים.

פרוטוקול

כל הרקמה האנושית המשמשת בפרוטוקול זה נאספה מאנשים שסיפקו הסכמה מדעת לאיסוף רקמות באמצעות מחקר איסוף רקמות קיבה שאושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת פנסילבניה (IRB #842961). המשתתפים במחקר זה נדרשו לעבור אנדוסקופיה עליונה כחלק מהטיפול השגרתי שלהם, להיות בני 18 לפחות ולהיות מסוגלים לספק הסכמה מדעת. כל המחקרים שנערכו עמדו בהנחיות שנקבעו על ידי אוניברסיטת פנסילבניה.

1. הכנה ניסיונית

1. הכן מדיית L-WRN מותנית כמתואר לעיל¹⁶. למרות שהדבר אינו חובה, ניתן לבדוק את ריכוזי Wnt-3A, R-spondin ו-noggin הכלולים במדיה המותנית באמצעות ערכות ELISA הזמינות מסחרית בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
2. הכינו RPMI-אנטיביוטיקה (RPMI-ABX), PBS-Antibiotics (PBS-ABX), PBS-Dithiothreitol (PBS-DTT), חיץ עיכול ומדיה אורגנואידית קיבה (ראה טבלה משלימה 1 להרכב מפורט). מדיה אורגנואיד קיבה יציב במשך שבוע אחד ב 4 °C (75 °F).
3. מלקחיים אוטוקלאביים, מספריים לדיסקציה עדינה וצינורות 1.5 מ"ל.
4. התחילו להפשיר את מטריצת קרום המרתף (מטריג'ל) על קרח.
5. התחל להפשיר את חיץ העיכול ואת טריפסין-EDTA באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
6. הגדר שייקר מסלול אינקובטור ל 37 ° C ו 200 סל"ד.

2. בידוד תאים בודדים מרקמת הביופסיה

1. יש לאסוף ביופסיות קיבה במהלך אנדוסקופיה עליונה¹⁷ בהתאם לפרוטוקול הקליני המוסדי, ככל הנראה תוך שימוש במלקחיים ג'מבו. השתמש במחט קהה כדי לחלץ דגימות רקמה מהמלקחיים ומקם אותן בצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל מדיה RPMI-ABX. שמור את הצינור על קרח להעברה מהירה למעבדה.
   הערה: לכל הפחות, יש לאסוף 2-4 ביופסיות.
2. אפשרו לרקמת הביופסיה להתיישב בתחתית הצינור החרוטי. השתמש פיפטה כדי לשאוף את המדיה ולשטוף את הביופסיות פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ PBS-ABX. אין צורך בצנטריפוגה, מכיוון שחתיכות הרקמה מתיישבות באופן טבעי בצינור החרוט.
3. להעביר לפחות 20 מ"ג של רקמת ביופסיה לצינור 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של PBS-DTT.
4. השתמש מספריים דיסקציה עדינה לחתוך את הרקמה לחתיכות כי הם 1-2 מ"מ או פחות.
5. השתמשו במיניצנטריפוגה שולחנית למשך 15 שניות כדי לצבור חתיכות רקמה בתחתית הצינור ולשאוף כמה שיותר סופרנאטנט. נפח שיורי קטן של PBS-DTT מקובל.
6. הוסף 5 מ"ל של חיץ עיכול מחומם טרי לצינור חרוטי 50 מ"ל. כדי להעביר את חתיכות הרקמה הקטנות מבלי לאבד רקמה, לקחת 500 μL של חיץ העיכול ולהוסיף אותו צינור 1.5 מ"ל המכיל את הרקמה. לאחר מכן, שנה את קצה קצה פיפטה 1000 μL עם מספריים כדי להגדיל את קוטר הקצה, המאפשר שאיפה קלה והעברה של חתיכות רקמה לצינור חרוטי 50 מ"ל המכיל את חיץ העיכול.
7. יש לדגור על חיץ העיכול ותערובת הרקמות בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות עם רעידות מסלוליות ב-200 סל"ד.
8. הוסף 5 מ"ל של טריפסין מחומם עם 0.25% EDTA למאגר העיכול ודגור במשך 10 דקות נוספות ב 37 ° C עם רעידות מסלוליות ב 200 סל"ד.
9. נטרל את חיץ העיכול והטריפסין על ידי הוספת נפח שווה של מדיה מתקדמת (עו"ד) DMEM/F12 והעבר את התמיסה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר.
10. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 1400 x גרם במשך 4 דקות ב 4 ° C. בהתאם לגודל הראשוני של רקמת הביופסיה, כדור תא קטן עשוי להיות גלוי או לא.
11. יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיה מסוג Adv. DMEM/F12 ולספור את מספר התאים הקיימים באמצעות Trypan Blue והמוציטומטר.
12. גלול את התאים שוב דרך צנטריפוגה ב 1400 x גרם במשך 4 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant.
    הערה: איור 1 מציג ייצוג סכמטי של תהליך בידוד תאים בודדים מרקמת הביופסיה.

3. שיבוץ תאים בודדים במטריצת קרום מרתף "כיפה"

1. בהתבסס על המספר הנספר של תאים בני קיימא, חשב את נפח מטריצת קרום המרתף הנדרשת להשגת ריכוז סופי של 10⁵ תאים קיימא לכל 50 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף.
2. בצע את הפעולות הבאות במהירות כדי למנוע ממטריצת קרום המרתף להתפלמר לפני הציפוי. הסר את מטריצת קרום המרתף המופשרת מקרח, הוסף את הנפח שחושב קודם לכן של מטריצת קרום המרתף לתאים, וערבב בעדינות על ידי פיפטציה למעלה ולמטה במשך כ -10 שניות.
   הערה: חשוב להימנע מיצירת בועות במהלך שלב זה. אין לדלל את מטריצת קרום המרתף.
3. פיפטה 50 μL aliquots במהירות של מטריצת קרום המרתף / תערובת תאים למרכז בארות בודדות בצלחת תרבית רקמות 24 בארות.
4. כסו מיד את הצלחת בעלת 24 הקידוחים, ובתנועה חלקה אחת, הפכו את הצלחת על פיה. הניחו את הצלחת ההפוכה באינקובטור תרבית רקמה בטמפרטורה של 37°C למשך 35 דקות כדי לאפשר למטריצת קרום המרתף להתפלמר.
   הערה: היפוך הצלחת חיוני כדי למנוע מהתאים לשקוע לתחתית הצלחת וכדי לאפשר למטריצת קרום המרתף להתפלמר לצורת "כיפה" תלת ממדית.
5. הוסף 500 μL של מדיה אורגנואיד קיבה שחומם מראש לכל באר, להבטיח כי החלק העליון של כל "כיפה" הוא שקוע לחלוטין במדיה. פזרו את המדיה בצד של כל באר כדי למנוע הפרעה ל"כיפה".
6. שנה את המדיה כל 2-3 ימים.

4. מעבר שגרתי של אורגנואידים באמצעות פיצול

1. ברגע שהאורגנואידים מוכנים למעבר, הסר את המדיה מכל באר ייעודית.
   הערה: כדי לקבוע את הזמן המתאים למעבר, עיין בסעיף תוצאות מייצגות.
2. יש לפזר 1 מ"ל של מדיית Adv. DMEM/F12 קרה כקרח ישירות על "כיפה" של מטריצת קרום מרתף. זה אמור בקלות ליזום את פירוק "הכיפה". ממשיכים לשאוף ולפזר עד שכל שברי ה"כיפה" מתנתקים מהצלחת.
3. העבירו הן את המדיה והן את מטריצת קרום המרתף המקוטעת לבאר הבאה, וחזרו על תהליך זה עבור כל הבארות המיועדות למעבר. לאחר פירוק מטריצת קרום המרתף הסופית "כיפה", מחלקים את המדיה ואת תערובת האורגנואידים ומטריצת קרום המרתף לתוך צינור 1.5 מ"ל.
4. חבר קצה של 1000 μL לפיפטה P1000, ולאחר מכן הכנס קצה זה לקצה של 200 μL. זה ייצור קצה פיפטה בקוטר קטן מספיק כדי לשבור את האורגנואידים ועדיין לאפשר שאיפה לנפח גדול יותר.
5. פיפטה נמרצת של תערובת האורגנואידים ומטריצת קרום המרתף מעלה ומטה בערך 25 פעמים כדי לפרק את האורגנואידים לחתיכות קטנות.
6. צנטריפוגה את תערובת האורגנואידים המקוטעת באמצעות צנטריפוגה שולחנית ב 4 ° C במשך 30 שניות ב 2000 x גרם. התוצאה תהיה גלולה של אורגנואידים מקוטעים המופרדים ממטריצת קרום המרתף וממדיה. השתמש פיפטה כדי לשאוף את המדיה ואת מטריצת קרום המרתף supernatant. אין להשתמש בוואקום כדי לשאוף את הסופרנטנט, מכיוון שהגלולה רופפת.
7. חישוב נפח ממברנת מרתף שזה עתה הופשרה נדרש כך שמספר הבארות/כיפות יפוצל ביחס של 1:2 (50 מיקרוליטר/כיפה). מוסיפים את מטריצת קרום המרתף הטרי ופיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב, תוך הקפדה להימנע מיצירת בועות.
8. במהירות aliquot 50 μL של תערובת של שברי אורגנואידים ומטריצת קרום מרתף לתוך בארות בודדות של צלחת 24 בארות.
9. כסו את הצלחת, הפכו אותה והניחו אותה באינקובטור תרבית רקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 35 דקות כדי לאפשר למטריצת קרום המרתף להתפלמר.
10. הוסף 500 μL של מדיה אורגנואיד קיבה שחומם מראש לכל באר.
    הערה: איור 2 מציג סקירה סכמטית של העברת אורגנואידים שמקורם בקיבה באמצעות פיצול.

תוצאות

התוצאות המייצגות הבאות נגזרות מביופסיות שנלקחו מהאפיתל השפיר של גוף הקיבה ואזורי אנטרום קיבה בקיבתם של חמישה חולים שונים שעברו אנדוסקופיה עליונה. שתיים עד ארבע "כיפות" / בארות צופו ונותחו לכל מטופל הן עבור ביופסיות גוף קיבה והן ביופסיות אנטרום. אורגנואידים נוצרו בהצלחה מגוף הקיבה ומרקמת ביופסיית אנטרום קיבה מכל חמשת החולים. בממוצע, 41 אורגנואידים נותחו לכל "כיפה" / באר. כל התמונות הן הקרנות z שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, וכימות גודל האורגנואידים וספריותם בוצע באמצעות תוכנת ניתוח תמונות מסחרית (ראה טבלת חומר...

דיון

להלן מתואר פרוטוקול מפורט ליצירה אמינה של אורגנואידי קיבה אנושיים מתאים בודדים שבודדו מביופסיות של אפיתל שפיר מגוף הקיבה והאנטרום. השלבים הקריטיים בפרוטוקול סובבים סביב תזמון, כמו גם טיפול במטריצת קרום המרתף. כדי לשמר את הכדאיות, חיוני להתחיל את הפרוטוקול בהקדם האפשרי לאחר רכישת רקמת הביופסיה. המטרה היא להתחיל לעכל את רקמת הביופסיה תוך 30 דקות מרגע ביצוע הביופסיה. הטיפול במטריצת קרום המרתף יכול גם להיות מאתגר. כאשר מופשר על קרח, הוא נשאר נוזל; עם זאת, בטמפרטורות מעל 4 °C (75 °F), הוא מתפלמר. לכן, העברה מהירה של מטריצת קר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.25% טריפסין-EDTA	גיבקו	25200-056
A83-01	מו"פ D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amphotericin B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
תאSens	Olympus	n/a
Collagenase III	וורת'ינגטון	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicin	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazole	MP Biomedicals	155710
תוסף N2	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R& D Systems	DY4120-05
Wnt-3a ELISA Kit	R& די מערכות	DY1324B-05
Y-27632	סיגמא אולדריץ'	Y0503