הפרוטוקול הנוכחי מתאר מערכת אינדוקציה תלת-ממדית אופטימלית של הרשתית העצבית המפחיתה את ההידבקות והאיחוי של אורגנואידים ברשתית עם חזרתיות ויעילות גבוהות.
מאמר שיטה
* These authors contributed equally
הפרוטוקול הנוכחי מתאר מערכת אינדוקציה תלת-ממדית אופטימלית של הרשתית העצבית המפחיתה את ההידבקות והאיחוי של אורגנואידים ברשתית עם חזרתיות ויעילות גבוהות.
רטינופתיה היא אחד הגורמים העיקריים לעיוורון ברחבי העולם. חקירת הפתוגנזה שלה חיונית לאבחון מוקדם וטיפול בזמן של רטינופתיה. למרבה הצער, מחסומים אתיים מעכבים איסוף ראיות מבני אדם. לאחרונה, מחקרים רבים הראו כי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (PSCs) יכולים להיות ממוינים לאורגנואידים ברשתית (ROs) באמצעות פרוטוקולי אינדוקציה שונים, שיש להם פוטנציאל עצום ברטינופתיה למידול מחלות, סינון תרופות וטיפולים מבוססי תאי גזע. מחקר זה מתאר פרוטוקול אינדוקציה אופטימלי ליצירת רשתית עצבית (NR) המפחיתה באופן משמעותי את ההסתברות לשלפוחית ואיחוי, ומגדילה את שיעור ההצלחה של הייצור עד היום ה-60. בהתבסס על היכולת של PSCs לארגן מחדש את עצמם לאחר דיסוציאציה, בשילוב עם גורמים משלימים מסוימים, שיטה חדשה זו יכולה באופן ספציפי להניע התמיינות NR. יתר על כן, הגישה אינה מסובכת, חסכונית, מפגינה חזרתיות ויעילות ראויות לציון, מציגה סיכויים מעודדים למודלים מותאמים אישית של מחלות רשתית, ומספקת מאגר תאים בשפע ליישומים כגון תרפיה תאית, בדיקות סקר תרופתיות ובדיקות ריפוי גנטי.
העין משמשת כמקור המידע העיקרי בין איברי החישה האנושיים, כאשר הרשתית היא הרקמה החישה הראייתית העיקרית בעיני יונקים1. רטינופתיה עומדת כאחד הגורמים העולמיים העיקריים למחלות עיניים, המובילות לעיוורון2. כ-2.85 מיליון אנשים ברחבי העולם סובלים בדרגות שונות של ליקוי ראייה עקב רטינופתיה3. כתוצאה מכך, חקירת הפתוגנזה שלה חיונית לאבחון מוקדם וטיפול בזמן. רוב המחקרים על רטינופתיה אנושית התמקדו בעיקר במודלים של בעלי חיים 4,5,6. עם זאת, הרשתית האנושית היא רקמה מורכבת ורב-שכבתית הכוללת סוגי תאים שונים. תרביות תאים דו-ממד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מחקר זה נערך בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים הכללי של ה- PLA הסיני. קו WA09 (H9) ESC התקבל ממכון המחקר WiCell.
1. תרבות, מדיה והכנת ריאגנטים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
סקירה גרפית של הפרוטוקול שהשתנה מוצגת באיור 1. H9-ESCs שימשו ליצירת ROs כאשר התאים גדלו לצפיפות של 70%-80%. תרחיפים חד-תאיים של H9-ESCs ב-96 בארות חרוטיות בעלות תחתית V הצטברו ביום הראשון ויצרו EBs עגולים מוגבלים היטב ביום ה-6. ככל שזמן התרבות גדל, נפח ה- EBs גדל בהדרגה. ביום ה-30, מבנים דמויי נוירואפיתל נוצרו בבירור והתעבו במהלך התמיינות ארוכת טווח של NR.
בנוסף, השיטה המתוקנת הושוותה לשתי שיטות אחרות (Kuwahara et al.12 ו-Döpper et
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
ROs אנושיים יכולים לשחזר באופן מרחבי וזמני את התפתחות הרשתית העוברית, ו- ROs מוקדמים מפגינים רמה גבוהה של דמיון לרשתית העובר בשלבים מקבילים של התפתחות15. במונחים של מורפולוגיה של רקמות וביטוי מולקולרי, RO אנושי משקף באופן הדוק את מצב הצמיחה בפועל של רקמת הרשתית, ומספק הזדמנויות עצומות וחסרות תקדים בתחומי מידול מחלות, בדיקות סקר תרופות ורפואה רגנרטיבית. נכון לעכשיו, מספר שיטות שונות הוקמו כדי ליצור ROs מ PSCs אנושיים במבחנה, ושינויים מתמשכים ואופטימיזציות נמצאים בעיצומם כדי לשפר עוד יותר א.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כל המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | פרוסות כביסה |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | תיקון אורגנואידים ברשתית |
| 5 מ"ל פסטר פיפטה | NEST ביוטכנולוגיה | 318516 | פיפטה אורגנואידים רשתית |
| 96 בארות חרוטיות עם תחתית V | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| שקופיות מיקרוסקופ הידבקות | CITOTEST | 188105 | Fix פרוסות |
| AggreWell בינוני | STEMCELL Technologies | 5893 | נטול מים בינוני |
| SINOPHARM | 10009218 | התייבשות | |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | תמיסת נוגדנים ראשונית |
| ZSGB-BIO | ZLI-9556 | ||
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | נוגדן ראשוני |
| אנטי-NESTIN | Sigma | N5413 | נוגדן ראשוני |
| אנטי-עצבי Class III β-טובולין (TUJ1) | Beyotime | AT809 | נוגדן ראשוני |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | |
| תמיסת דיסוציאציה ראשונית של תאים (CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | דיסוציאציה של תאים |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β מעכב |
| תרכיז שומנים כולסטרול | Gibco | 12531018 | 250& |
| תמיסת אחזור אנטיגן ציטראט | Servicebio | G1202-250ML | 20&, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | הקפאת תאים בינוני |
| DAPI | Roche | 10236276001 | כתם נגד גרעיני |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | בינוני |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | חמור בינוני |
| נגד עכבר Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | נוגדן משני |
| חמור נגד ארנב Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | נוגדן משני |
| אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, דיסוציאציה של תאים |
| מטריצה חוץ-תאית (ECM) | לוחות ציפוי | 354277 קורנינג | |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | |
| סרום בקר עוברי | Gibco | A5669701 | |
| מנתח כמותי של תאי רקמה דמויי זרימה | רקמות רקמה Gnostics | TissueFAXS Plus | קטעי סריקה |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | בינוני |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | מעכב Wnt |
| החלפת סרום נוקאאוט | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | מעכב BMP |
| צלחות 24 בארות הידבקות נמוכה | קורנינג | 3473 | |
| צלחות 6 בארות הידבקות נמוכה | קורנינג | 3471 | |
| מדיום תחזוקה (MM) | טכנולוגיות STEMCELL | 85850 | בינוני |
| N2 תוסף | Gibco | 17502048 | |
| נורמלי חמור סרום | Solarbio | SL050 | חסימת מאגר |
| Paraplast | Leica | 39601006 | רקמות הטמעת |
| PBS pH 7.4 בסיסי (1x) | Gibco | C10010500BT | ללא Ca+, Mg + |
| Reconbinant חלבון מורפוגנטי של עצם אנושית-4 (rhBMP4) | R& D | 314-BP | גורם חלבון מרכזי |
| חומצה רטינואית | אבקת Sigma | R2625 | , יש להרחיק מאור |
| SB431542 | מעכב Selleckchem | S1067 | ALK5 |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | מעכב טירוזין קינאז |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| טאורין | סיגמא | T0625-10G | |
| תיוגליצרול | סיגמא | M1753 | |
| טריטון X-100 | סיגמא | X100 | פרמביליזציה |
| WA09 קו תאי גזע עובריים | המחקר | קו תאים | |
| קסילן | סינופארם | 10023418 | הסרת שעווה |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | מעכב רוק |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה