מאמר שיטה

הפרעות RNA בפרזיטואיד ביצה, Trichogramma dendrolimi Matsumura

DOI:

10.3791/66250

⸱

21 בנובמבר 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, 2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המניפולציה של הפרעות RNA (RNAi) מהווה אתגר עצום במינים רבים של טפילים בעלי גודל זעיר, כגון צרעות טריכוגרמה . מחקר זה התווה שיטת RNAi יעילה ב - Trichogramma denrolimi. המתודולוגיה הנוכחית מספקת מודל חזק לחקר בקרת גנים בצרעות טריכוגרמה .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טפילי הביצה, Trichogramma spp, מוכרים כמדבירים ביולוגיים יעילים נגד מזיקים לפידופטרנים שונים בחקלאות וביערות. השלבים הלא בוגרים של צאצאי טריכוגרמה מתפתחים בתוך הביצה המארחת, ומפגינים זעירות יוצאת דופן (כ-0.5 מ"מ אורך בוגר). מתודולוגיית RNA-interference (RNAi) התפתחה ככלי חיוני להבהרת תפקודי גנים באורגניזמים רבים. עם זאת, מניפולציה של RNAi במינים מסוימים של טפילים קטנים, כגון טריכוגרמה, הציבה בדרך כלל אתגרים משמעותיים. במחקר זה אנו מציגים שיטת RNAi יעילה ב-Trichogramma denrolimi. ההליך המתואר כולל רכישה ובידוד של דגימות בודדות של T. dendrolimi מביצים מארחות, תכנון וסינתזה של RNA דו-גדילי (dsRNA), השתלת מבחנה וטיפוח של גלמי T. dendrolimi , מיקרו-הזרקה של dsRNA, והערכה לאחר מכן של הפלת גן המטרה באמצעות ניתוח RT-qPCR. מחקר זה מספק הליך מקיף ומפורט ויזואלית לביצוע ניסויי RNAi ב- T. dendrolimi, ובכך מאפשר לחוקרים לחקור את בקרת הגנים במין זה. יתר על כן, מתודולוגיה זו ניתנת להתאמה למחקרי RNAi או מיקרו-זריקות במינים אחרים של טריכוגרמה עם התאמות קלות, מה שהופך אותה להתייחסות רבת ערך לביצוע ניסויי RNAi במינים אנדופרזיטיים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trichogramma spp. הם קבוצה של טפילי ביצים שנעשה בהם שימוש נרחב כחומרי הדברה ביולוגיים יעילים ביותר נגד ספקטרום רחב של מזיקים לפידופטרנים במערכות אקולוגיות חקלאיות ויערות ברחבי העולם 1,2,3,4. היישום של טריכוגרמה בגידול המוני מספק גישה ידידותית לסביבה לניהול בר קיימא של מזיקים 5,6,7. הבנת הביולוגיה המולקולרית של צרעות טריכוגרמה מספקת תובנות חשובות לשיפור יעילות גידול המסה וביצועי השטח של חומרי הדברה ביולוגיים אלה 8,9 על ידי חקירת המתודולוגיה של בקרת גנים ועריכת גנום10.

מאז גילוי ההתערבות הגנטית הספציפית בתיווך RNA דו-גדילי (dsRNA) ב-Caenorhabditis elegans בשנת 1998, שיטת RNA-interference (RNAi) התפתחה לארגז כלים גנטי חיוני לחקר מנגנוני הבקרה של אורגניזמים על ידי דיכוי ביטוי של גני מטרה11. ניסויי RNAi הפכו למתודולוגיה סטנדרטית המיושמת באופן נרחב לחקר תפקוד גנים במינים רבים של חרקים 12,13. אף על פי כן, המניפולציה של RNAi מהווה אתגר עצום במינים טפיליים רבים, במיוחד בקרב אלה השייכים למשפחת הכלסידואידים האנדופרזיטיים 14,15,16. שיטת RNAi תועדה בלפחות 13 מיני טפילים 14,15,16,17,18,19. בין אלה, גישת RNAi בוצעה באופן מקיף בצרעות נסוניה והיא ישימה לאורך כל שלבי ההתפתחות, כולל עוברים, זחלים, גלמים ובוגרים 14,15,16. ראוי לציין כי צרעות נסוניה הן אקטופרזיטואידים, כאשר צאצאיהן מתפתחים בחלל הביניים בין הגלמים המארחים לבין הגולם, מה שמאפשר את גידולם במבחנה וגורם להם לסבול טיפולים מסוימים, כגון מיקרו-הזרקה. בניגוד לצרעות הנסוניה, פרטי טריכוגרמה עוברים את כל התפתחותם העוברית, הזחלית והגולמית בתוך הביצה המארחת. השכבה בשלבי העובר והזחל (העלולה לעכב חדירות dsRNA), פגיעות לנזקים, והקושי לשרוד במבחנה מהווים מכשולים אימתניים 20,21,22. בנוסף, גודלם הזעיר של פרטי טריכוגרמה, בערך ~0.5 מ"מ באורך בוגר או גולם, הופך אותם למורכבים ביותר למניפולציה של 20,21,22.

במחקר הנוכחי, אנו מתארים הליך מקיף לביצוע ניסויים בהפרעות RNA (RNAi) ב- Trichogramma denrolimi Matsumura. הליך זה כולל את ההליכים הבאים: (1) תכנון וסינתזה של RNA דו-גדילי (dsRNA), (2) מיקרו-הזרקה של גלמי T. denrolimi, (3) השתלה ודגירה חוץ גופית של גלמים אלה, ו-(4) זיהוי של הפלת גן מטרה באמצעות ניתוח RT-qPCR. גן המטרה שנבחר לניסוי ה-RNAi הוא הומולוגיה של שרשרת כבדה פריטין (Ferhch). FerHCH, חלבון קושר ברזל, מכיל מרכז פרוקסידאז שניחן ביכולות נוגדות חמצון, המקלות על חמצון Fe2+ עד Fe3+. הוא ממלא תפקיד חיוני בצמיחה והתפתחות של אורגניזמים שונים על ידי שמירה על שיווי משקל חיזור והומאוסטזיס ברזל. דלדול FerHCH יכול לגרום להצטברות יתר של ברזל, מה שמוביל לנזק בלתי הפיך לרקמות, ולעתים קרובות מגיע לשיאו בשינויים פנוטיפיים משמעותיים, כולל פגמים בגדילה, עיוותים ותמותה23,24. מחקר זה מציע מדריך שלב אחר שלב לביצוע RNAi ב- T. denrolimi, אשר יהיה רב ערך לחקר תפקודי הגן בהקשר הרחב יותר של צרעות טריכוגרמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים, התוכנה והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. איסוף ותחזוקת תרבות חרקים

  1. הדביקו קבוצה של ~5,000 ביצים של Corcyra cephalonica (סטינטון) על כרטיס בגודל 9 ס"מ על 16 ס"מ באמצעות תמיסה של 1:5 (v/v) של אבקת גומי ערבי ומים25,26.
    הערה: הימנעו מהצמדת יותר מדי ביצי מארח לכרטיס מכיוון שהצפיפות הופכת אותו לבלתי מעשי עבור הליכי העברה ונתיחה הבאים.
  2. כדי למנוע בקיעה של ביצי מארח, יש להכפיף את כרטיסי הביצים של המארח ל-30 דקות של קרינה על-סגולה (UV) (איור 1-i). לאחר מכן, חתכו את הנייר עם ביצים לא פעילות לכרטיסי ביצים בעובי 1 ס"מ ובקוטר 8 ס"מ, שכל אחד מהם מכיל כ-300-500 ביצים (איור 1-ii)25,26,27.
  3. הכניסו קבוצה של 80-120 צרעות T. denrolimi לתוך צינור זכוכית בקוטר 2 ס"מ ובאורך 8 ס"מ. אוטמים את הצינור עם כותנה.
    הערה: שמרו על הצרעות בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס, עם מחזור אור/חושך של 16 שעות אור ו-8 שעות חושך ושמרו על לחות יחסית של כ-75%.
  4. הציגו קלף ביצה מארחת לצרעות לצורך טפילות (איור 1-ii). הרשו לצרעות להפקיד את ביציהן בביצי הפונדקאי למשך 6 שעות, ולאחר מכן הוציאו מיד את הצרעות.
    הערה: הימנעו מהארכת תקופת הטפילות יתר על המידה מכיוון שהדבר עלול להוביל לצפיפות יתר של צאצאי T. denrolimi בתוך ביצה מארחת, וכתוצאה מכך לתמותת צרעות צאצאים מוגברת28,29.

2. סינתזה של dsRNA

  1. תכנון ערכות פריימר המכילות מקדם T7 לסינתזה של RNA דו-גדילי (dsRNA). בחר קטע של 300-400 bp מגן המטרה (Ferhch) לסינתזה של dsRNA.
  2. לרכוש ערכות פריימר מסונתזות מסחריות לייצור dsRNA עבור הגן הממוקד ו- dsGFP לשימוש כבקרה שלילית.
  3. חלץ תוכן RNA מצרעות 100 T. denrolimi באמצעות הערכה המוזכרת בהתאם לפרוטוקולהיצרן 9. בדוק את איכות תוכן ה- RNA; המשך אם הערך של OD260/OD280 נע בין 1.8 ל- 2.09.
  4. לטהר את תכולת הרנ"א עם 2 μL של 5x buffer (1 U/50 μL), 1 μL של DNAse (1 U/50 μL), ו-6.5 μL של RNA (~100 ng/μL), 0.5 μL של H2O ב-42°C למשך 2 דקות.
  5. בצע תגובת שרשרת פולימראז שעתוק לאחור (RT-PCR) כדי ליצור תבנית cDNA עם 10 μL של RNA מטוהר (~ 100 ng/μL), 4 μL של 5x buffer (1 U/50 μL), 1 μL של Enzyme Mix I (1 U/50 μL), ו- 4 μL של H2O. בצע RT-PCR באמצעות ההגדרות הבאות: 37 ° C למשך 15 דקות, 85°C למשך 5 שניות. יש לאחסן את מוצר ה-cDNA בטמפרטורה של -4°C עד לשימוש.
  6. בצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להגביר את רצפי ה-dsRNA בהתאם לתערובת האב הנזכרת (10 μL של Taq II [1 U/50 μL], 0.8 μL של פריימר קדמי [0.4 μM], 0.8 μL של פריימר הפוך [0.4 μM], 0.8 μL של תבנית DNA [40 ng/μL], ו-7.6 μL של H2O). בצע PCR באמצעות ההגדרות הבאות: 94 °C למשך 2 דקות; 35 מחזורים עם 94 ° C עבור 30 שניות, 60 ° C עבור 30 שניות, 72 ° C עבור 30; 72°C למשך 2 דקות.
  7. להעריך את האיכות של מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 2.0% 5,9 ולאשר את רצף המטרה באמצעות ריצוף Sanger.
  8. יש לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת מיצוי הג'ל בהתאם להנחיות היצרן 9,23.
  9. השתמש במערכת RNAi כדי לסנתז dsRNA עבור גן המטרה עם 10 μL של 2x buffer (0.02 U/μL), 8 μL של תבנית DNA (75 ng/μL), ו 2 μL של תערובת אנזימים (1 U/50 μL) עם ההגדרות הבאות: 37 ° C במשך 30 דקות, 70 ° C במשך 10 דקות, ו 25 ° C במשך 20 דקות. הצהירו את ה-dsRNA המסונתז עם 30 מיקרוליטר של מים נטולי Nuclease.
  10. הערך את האיכות של מוצר dsRNA על ידי הדמיה על 1.0% agarose ג'ל 5,9. לדלל את ה-dsRNA ל-7,000 ננוגרם/מיקרוליטר. בדוק את איכות מוצר ה-dsRNA; המשך אם הערך של OD260/OD280 נע בין 1.8 ל- 2.09. יש לאחסן את מוצר ה-dsRNA בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.

3. השתלת גלמים T. denrolimi

  1. טפחו את ביצי המאכסן הטפיליות במשך כ-8 ימים בטמפרטורה של 25 ± 1°C, תוך שמירה על מחזור אור של 16 שעות / 8 שעות חושך ולחות יחסית של ~75%. ביצי הפונדקאי הטפיליות יושחרו לאחר 5 ימים30 (איור 1-iv,v).
  2. מעבירים את כרטיס הביצית המארחת למיקרוסקופ מנתח. השתמשו בזוג מחטי טונגסטן (איור 1-vi) כדי להסיר בקפדנות את הכוריון מביצי הפונדקאי (איור 1-vii) ולשלוף את הגלמים מבפנים (איור 1-viii)5,17,18.
    הערה: קצה מחט הניתוח צריך להיות פחות מ 0.05 מ"מ.
  3. מכינים צלחת נקייה למצע. שפכו החוצה 10-15 מ"ל של תמיסת אגר בנפח 15 גרם/ליטר, ואפשרו לה להתקרר באופן טבעי (איור 2-i).
    הערה: ערבבו את תמיסת האגר עם 0.5 גרם סטרפטומיצין כדי לעכב את צמיחת המזהמים במבחנה.
  4. השתמשו בקבר שעבר חיטוי כדי לחרוט מספר חריצים בעומק 0.2-0.3 מ"מ וברוחב 0.4-0.8 מ"מ (איור 2-ii).
  5. השתמשו במברשת קטנה (איור 2-iii) כדי להשתיל גולם מביצת הפונדקאי שנותחה לאחד החריצים במצע האגר (איור 2-iv).
  6. חזרו על שלבים 3.4 ו-3.5, והשתילו 100-300 גלמים בנפרד לתוך החריצים בזה אחר זה (איור 2-v).

4. הזרקה זעירה של dsRNA לתוך T. denrolimi pupa

  1. השתמשו במושך מחטי זכוכית כדי למשוך נימי זכוכית (איור 3-i,ii). הגדירו את החום ל-280, את המהירות ל-170, את ההשהיה ל-250 ואת המשיכה ל-30 במושך מחטים (איור 3-iii). הכינו מחטי זכוכית נימיות מרובות למיקרו-הזרקה (איור 3-iv,v).
  2. שיקוע קצה מחט הזכוכית באמצעות צלחת שוחקת (איור 3-vi).
    הערה: ודא שקצה מחט ההזרקה נשאר חד; אחרת, זה עלול לגרום לתמותת גולמים או לעכב זרימת מגיבים דרך המחט (איור 3-vii).
  3. טען כ-2 μL של תמיסת הזרקת dsRNA עם 7,000 ng/μL לתוך מחט ההזרקה המוכנה באמצעות משאבת מיקרו-הזרקה (איור 3-vii).
  4. העבירו את מצע האגר המכיל מאות גלמים על משטח של מיקרוסקופ מורכב (איור 3-viii).
  5. הכניסו בזהירות את מחט ההזרקה לבטן של גולם T. denrolimi בזווית ~30° לבטן מתחת לעדשה (איור 3-ix).
  6. הזריקו בהדרגה ~5 nL של תמיסת ההזרקה (שלב 4.3) לתוך גולם T. denrolimi בעדינות ככל האפשר.
    הערה: גולם T. denrolimi עשוי להתנפח מעט כאשר תמיסת dsRNA מוזרקת. הזרקת כמות מוגזמת של תמיסה לגלמים או שימוש במחטים עם פתחים גדולים מדי עלולים לגרום למוות מוקדם של הגולם. החליפו את המחטים כאשר הן נסתמות לאחר הזרקת מספר עד עשרות גלמים.
  7. חזור על שלבים 4.5 ו -4.6, הזרקת dsRNA לתוך 600 גלמים אחד אחד.
    הערה: לניתוח RT-qPCR אמין, יש לבודד את תכולת הרנ"א מלפחות 100 גלמים. הזריקו לפחות 600 גלמים עבור שלושה עותקים משוכפלים בטיפול dsRNA ושלושה משוכפלים בבקרה השלילית dsGFP 9.

5. דגירה של T. denrolimi pupae

  1. העבר את המצע המכיל גלמים מוזרקים לאינקובטור ב 25 ± 1 ° C עם מחזור אור / כהה 16 שעות / 8 שעות ו ~ 75% RH.
  2. יש לדגור על כ-700 גלמים מסוג T. denrolimi לכל טיפול למשך 24 שעות או 48 שעות. חלץ תוכן RNA מקבוצה של 100 גלמים לכל שכפול9.
    הערה: הסר את הגלמים המכווצים (הגלמים המתים) מהדגימות; אחרת, זה עלול לגרום לטעויות בזיהוי ביטוי גנים.
  3. לדגור ~50 T. denrolimi גלמים בכל טיפול עד שהצרעות מגיחות (איור 3-x). רשום את שיעור ההופעה ואת שיעור העיוות.

6. איתור ביטוי גנים ממוקד

  1. עצבו את ערכת הפריימר עבור גן היעד ואת גני הייחוס עבור RT-qPCR באמצעות כלי עיצוב.
    הערה: ודא שהרצפים של הפריימרים RT-qPCR אינם חופפים לאזור היעד של dsRNA.
  2. השתמש בתיבת מזלג הגן O (FoxO) כגן הייחוס בניתוח RT-qPCR; הפריימרים של FoxO דווחו בעבר9.
  3. השג ערכות פריימר מסונתזות מסחריות. בצע RT-qPCR עם 10 μL של Taq II (1 U/50 μL), 0.8 μL של פריימר קדמי (0.4 μM), 0.8 μL של פריימר הפוך (0.4 μM), 0.8 μL של תבנית (10 ng/μL) ו- 7.6 μL של H2O. בצע RT-qPCR באמצעות ההגדרות הבאות: 95 ° C עבור 30 שניות; 35 מחזורים עם 95 ° C עבור 5 שניות, 57 ° C עבור 30 שניות, 72 ° C עבור 30; 95 °C עבור 10 שניות; 60°C עבור 5 שניות, ו- 95°C עבור 5 שניות.
  4. חשב את ערך הביטוי של גן היעד באמצעות שיטת 2-ΔΔCt 9,25.
  5. להשתמש במבחן Kruskal-Wallis כדי לנתח את הביטוי של גן המטרה תחת השפעת טיפולים שונים (dsFerhch, dsGFP, ללא הזרקה).
    הערה: הימנע משימוש במבחנים פרמטריים (למשל, מבחן t) להשוואות פוסט-הוק מכיוון שההטרוסקדסטיות וחוסר הנורמליות של הנתונים עלולים להוביל למסקנות שגויות25.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיעור ההופעה של גלמי T. denrolimi שהוזרקו עם dsFerhch היה נמוך משמעותית מזה של אלה שהוזרקו עם dsGFP או אלה ללא הזרקה (טבלה 1). מבין הצרעות שהופיעו, 51.85% מצרעות T. denrolimi שהיו נתונות ל-dsFerhch פיתחו כנפיים קטנות מעוותות. הצרעות המעוותות לא נצפו בצרעות שהוזרקו להן dsGFP או ללא כל הזרקה (טבלה 1). יתר על כן, הבטן של גלמי T. denrolimi שהוזרקו עם dsFerhch הפגינו מלניזם שהוא הפנוטיפ של מטבוליזם ברזל חריג

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צרעות טריכוגרמה מוכרות כמדבירות ביולוגיות יעילות, במיוחד נגד מגוון מזיקים לפידופטרנים בחקלאות וייעור1. צרעות זעירות אלה עוברות את השלבים הלא בשלים שלהן בתוך הביצה המארחת, מאפיין המציב אתגרים בביצוע ניסויי RNAi 5,18. מחקר זה מציע מדריך חזותי מקיף לביצוע ניסויי RNAi ב- T. denrolimi. בהתחשב בתכונות הביולוגיות המשותפות בין מיני טריכוגרמה, ניתן להתאים את ההליך בקלות למחקרי RNAi או מיקרו-זריקות במינים אחרים של טריכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי הפרויקטים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32172476, 32102275), התוכנית לחדשנות במדע חקלאי וטכנולוגיה (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108), וקרנות מרכזיות המנחות את פיתוח המדע והטכנולוגיה המקומי (XZ202301YD0042C).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2x ES Taq MasterMix (צבע)Cowin Biotech, סיןCW0690Hכדי להגביר את רצפי ה-dsRNA
20x PBS Buffer, DEPC מטופל (7.2-7.6)Sangon Biotech, סיןB540627-0500לדלל dsRNA
Agar StripShishi Globe Agar Industries Co., Ltd, סיןn/aכדי להפוך את התרבות לבינונית
Ampicillin נתרןסנגון ביוטכנולוגיה, סיןA610028לעשות מדיום
תרבית Bioer אמבט מתכת בטמפרטורה קבועה BIOER, סיןMB-102לסינתזה
נימי זכוכית dsRNA בורוסיליקט WPI, ארה"ב1B100-4כדי למשוך מחט זכוכית נימית
ספסל נקי Airtech, סיןSW-CJ-1FDלהפקת
RNA מים מזוקקים כפוליםסנגון ביוטק, סיןA500197-0500לדילול
תא בדיקות סביבתיות cDNA פנסוניק, יפןMLR-352H-PCלתרבות T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge Eppendrof, גרמניה5418Rלאחסון תכולת RNA
Eppendorf FemtoJet 4iEppendrof, גרמניהFemtoJet 4iלהזרקת T. denrolimi
Eppendorf צנטריפוגה מקוררת אפנדרוף, גרמניה5810R
תמיסת אתנול צנטריפוגה (75%, ללא RNase)אלאדין, סיןM052131-500 מ"ללחילוץ
ערכת מיצוי ג'לאומגה, ארה"בD25000-02כדי לחלץ cDNA
GUM ערביתSolarbio, סיןCG5991-500gלהכנת כרטיס ביצה
איזופרופיל אלכוהול אלאדין, סין80109218לחלץ RNA
חולץ מיקרופיפטה מבוסס לייזר סאטר, ארה"בP-2000למשיכת מחט זכוכית נימית
Microloader אפנדרוף, גרמניה20 ומיקרו; Lלטעינת dsRNA
מטחנת רקמות מרובת דגימות LICHEN, סיןLC-TG-24לטחינת T. denrolimi
מטחנת מחטים סאטר, ארה"בBV-10-Eלטחינת מחט זכוכית נימית
מים ללא נוקלאזסנגון ביוטכנולוגיה, סיןלדילול RNA
OLYMPUS מיקרוסקופאולימפוס, יפןXZX16כדי לצפות במכונת T. denrolimi
PCR Bio-rad, ארה"בS-1000להגברת DNA
PowerPac BasicBio-rad, ארה"בPowerPacTM Basicלזיהוי איכות dsRNA 
פריימר של dsGFP (קדימה)[TAATACGACTCACTATAGGG]
פריימר ACAAACCAAGGCAAGTAATA
של dsGFP (הפוך)[TAATACGACTCACTATAGGG]
פריימר CAGAGGCATCTTCAACG
של Ferhch for qPCR (Forward)TGAAGAGATTCTGCGTTCTCTGCTCTCT
פריימר של Ferhch for qPCR ( הפוך)CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
פריימר של Ferhch עבור RNAi (הפוך)[TAATACGACTCACTATAGGG]AG
פריימר TAGCCATCTTTCC
של Ferhch עבור RNAi(קדימה)[TAATACGACTCACTATAGGG]
ACACTGTCAATCGTCCTG
פריימר של FoxO עבור qPCR (קדימה)CTACGCCGATCTCATAACGC
פריימר של FoxO עבור qPCR (הפוך)TGCTGTCGCCCTTCCT
PrimeScript RT עם מחק gDNA (מושלם בזמן אמת)TaKaRa, יפןRR047A
PCR כמותי בזמן אמת Bio-rad, ארה"בCFX 96 Touchלביצוע תגובת שרשרת פולימראז טרנסקריפטאז הפוך (RT-PCR) 
עיצוב פריימר ובדיקות PCR בזמן אמת (TaqMan)https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi SystemPromega, ארה"בP1700לסינתזה dsRNA   in vitro 
TB Green Premix Ex TaqTM figure-materials-1 (Til RnaseH Plus)TaKaRa, יפןRR820Aלביצוע RT-qPCR
TrichloromethaneKESHI, סיןGB/T682-2002כדי לחלץ RNA
TRIzol ReagentAmbion, ארה"ב15596018כדי לחלץ את תכולת ה-RNA הכוללת מדגימות
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד Thermo, ארצות הבריתForma 911
של RNA ערכת ריאגנטים כלי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
  2. Zhou, J. C., et al. Optimal clutch size for quality control of bisexual and Wolbachia-infected thelytokous lines of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) mass reared on eggs of a substitutive host, Antheraea pernyi Guérin-Méneville (Lepidoptera: Saturniidae). Pest Manag Sci. 76 (8), 2635-2644 (2020).
  3. Li, T. H., et al. Current status of the biological control of the fall armyworm Spodoptera frugiperda by egg parasitoids. J Pest Sci. 96, 1345-1363 (2023).
  4. Zhou, J. C., et al. Effects of temperature and superparasitism on quality and characteristics of thelytokous Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) during mass rearing. Sci Rep. 9 (1), 18114(2019).
  5. Zhou, J. C., et al. Penetrance during Wolbachia-mediated parthenogenesis of Trichogramma wasps is reduced by continuous oviposition, associated with exhaustion of Wolbachia titers in ovary and offspring eggs. Pest Manag Sci. 78 (7), 3080-3089 (2022).
  6. Huang, N. X., et al. Long-term and large-scale releases of Trichogramma promote pesticide decrease in maize in northeastern China. Entomol Gen. 40 (4), 331-335 (2020).
  7. Wang, P., et al. Performance of Trichogramma japonicum as a vector of Beauveria bassiana for parasitizing eggs of rice striped stem borer, Chilo suppressalis. Entomol Gen. 41 (2), 147-155 (2021).
  8. Ning, S. F., et al. The identification and expression pattern of the sex determination genes and their sex-specific variants in the egg parasitoid Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). Front Physiol. 14, 1243753(2023).
  9. Huo, L. X., et al. Selection and evaluation of RT-qPCR reference genes for expression analysis in the tiny egg parasitoid wasp, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). J Asia Pac Entomol. 25 (2), 101883(2022).
  10. Leung, K., et al. Next-generation biological control: the need for integrating genetics and genomics. Biol Rev Camb Philos Soc. 95 (6), 1838-1854 (2020).
  11. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  12. Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
  13. Sun, Y., et al. Silencing an essential gene involved in infestation and digestion in grain aphid through plant-mediated RNA interference generates aphid-resistant wheat plants. Plant Biotechnol J. 17 (5), 852-854 (2019).
  14. Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. J Vis Exp. 130, e56990(2017).
  15. Dalla Benetta, E., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis. J Vis Exp. 166, e61892(2020).
  16. Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
  17. Zhu, K. Y., Palli, S. R. Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference. Annu Rev Entomol. 65, 293-311 (2020).
  18. Colinet, D., et al. Development of RNAi in a Drosophila endoparasitoid wasp and demonstration of its efficiency in impairing venom protein production. J Insect Physiol. 63, 56-61 (2014).
  19. Wang, B., et al. A digestive tract expressing α-amylase influences the adult lifespan of Pteromalus puparum revealed through RNAi and rescue analyses. Pest Manag Sci. 75 (12), 3346-3355 (2019).
  20. Zhou, J. C., et al. Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi is outcompeted by its uninfected counterpart in superparasitism but does not have developmental delay. Pest Manag Sci. 79 (3), 1005-1017 (2023).
  21. Zhou, J. C., et al. Posterior concentration of Wolbachia during the early embryogenesis of the host dynamically shapes the tissue tropism of Wolbachia in host Trichogramma wasps. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1198428(2023).
  22. Lee, T. Y. The development of Trichogramma evanescens Westw. and its influence on the embryonic development of its host, Attacus cynthia ricini Boisd. Acta Entomol Sin Z. 11 (1), 89-119 (1961).
  23. Shen, Y., Chen, Y. Z., Zhang, C. X. RNAi-mediated silencing of genes in the brown planthopper Nilaparvata lugens affects survival, growth and female fecundity. Pest Manag Sci. 77 (1), 365-377 (2021).
  24. Wu, S., Yin, S., Zhou, B. Molecular physiology of iron trafficking in Drosophila melanogaster. Curr Res Insect Sci. 50, 100888(2022).
  25. Zhou, J. C., et al. Wolbachia-Driven Memory Loss in a Parasitic Wasp Increases Superparasitism to Enhance Horizontal Transmission. mBio. 13 (6), e0236222(2022).
  26. Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia. PeerJ. 7, e7567(2019).
  27. Zhang, C., et al. Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi. Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).
  28. Zhang, X., et al. Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi. Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).
  29. Zhou, J. C., et al. Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts. Front Ecol Evol. 9, 730664(2021).
  30. Flanders, S. E. Notes on the life history and anatomy of Trichogramma. Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Gene KnockdownDouble Stranded RNAMicro InjectionHost Egg ParasitizationRT qPCR AnalysisFerritin Heavy ChainBiological Control

מאמרים קשורים