הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תרבית תרחיף ייצור וטיהור של וירוס הקשור לאדנו על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול עבור יישומי in vivo

4.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66460

⸱

9 בפברואר 2024

 ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Florida

במאמר זה

סיכום

וירוס הקשור באדנו מיוצר בתרבית תאי השעיה ומטוהר על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות יודיקסנול כפולה. צעדים כלולים כדי להגדיל את התפוקה הכוללת של הנגיף, להקטין את הסיכון של משקעים וירוס, ועוד לרכז את המוצר הסופי של הנגיף. הטיטרים הסופיים הצפויים להגיע ל-1012 חלקיקים נגיפיים / מ"ל ומתאימים לשימוש פרה-קליני in vivo .

תקציר

פרוטוקול זה מתאר ייצור וטיהור רקומביננטי של וירוס הקשור באדנו (rAAV) על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול, שיטה אגנוסטית לסרוטיפ לטיהור AAV שתוארה לראשונה בשנת 1999. וקטורי rAAV נמצאים בשימוש נרחב ביישומי ריפוי גנטי כדי להעביר טרנסגנים לסוגי תאים אנושיים שונים. בעבודה זו, הנגיף הרקומביננטי מיוצר על ידי טרנספקציה של תאי Expi293 בתרבית תרחיף עם פלסמידים המקודדים את הגנים הטרנסגנים, קפסיד וקטורי ועוזר אדנו-ויראלי. צנטריפוגת צפיפות יודיקסנול מטהרת חלקיקי AAV מלאים בהתבסס על צפיפות החלקיקים. בנוסף, שלושה שלבים כלולים במתודולוגיה זו הנפוצה כיום על מנת להגדיל את תפוקת הנגיף הכוללת, להפחית את הסיכון למשקעים עקב חלבונים מזהמים, ולרכז עוד יותר את תוצר הנגיף הסופי, בהתאמה: משקעים של חלקיקים נגיפיים ממדיה תאית באמצעות תמיסה של פוליאתילן גליקול (PEG) ונתרן כלורי, הכנסת סבב שני של צנטריפוגה הדרגתית צפיפות יודיקסנול, והחלפת חיץ באמצעות מסנן צנטריפוגלי. באמצעות שיטה זו, ניתן להשיג באופן עקבי טיטרים בטווח של 1012 חלקיקים נגיפיים / מ"ל של טוהר יוצא דופן לשימוש in vivo .

מבוא

וקטורים נגיפיים רקומביננטיים הקשורים באדנו (rAAV) הם כלים בשימוש נרחב לטיפול במחלות גנטיות, כולל ניוון שרירים בעמוד השדרה, ניוון רשתית והמופיליה A 1,2,3. וקטורי rAAV מהונדסים כך שיחסרו גנים נגיפיים הנמצאים ב-AAV4 מסוג פראי, נגיף איקוסהדרלי קטן שאינו מעטפה עם גנום DNA ליניארי חד-גדילי של 4.7 קילו-בתים. AAV התגלה לראשונה בשנות ה-60 של המאה ה-20 כמזהם של תכשירי אדנו-וירוס5. למרות גודל הקפסיד הקטן שלו, המגביל את גודל הטרנסגן שניתן לארוז למקסימום של 4.9 קילו-בתים למעט ITRs6, AAV שימושי להעברת טרנסגנים מכיוון שהוא אינו פתוגני בבני אדם, מאפשר ביטוי של טרנסגן בסוגי תאים מתחלקים ולא מתחלקים רבים, ויש לו השפעות אימונוגניות מוגבלות7.

כחברים בסוג dependoparvovirus, הייצור של rAAVs מסתמך על ביטוי של גנים מסייעים נוכח אדנווירוס או וירוס הרפס סימפלקס8. פותחו מספר אסטרטגיות לייצור rAAV, אך ייצור בתאי HEK293 שעברו טרנספורמציה באמצעות הגנים המסייעים E1A/E1B אדנו-ויראליים הוא השיטה המבוססת ביותר המשמשת כיום9. הגישה הכללית של ייצור rAAV מתחילה עם טרנספקציה של תאי HEK293 עם שלושה פלסמידים המכילים את הטרנסגן בתוך חזרות מסוף הפוך (ITR), AAV rep ו cap גנים, וגנים מסייעים אדנו-ויראליים נוספים, בהתאמה. שבעים ושתיים שעות לאחר הטרנספקציה, תאים נקצרים ומעובדים כדי לטהר rAAV המכיל את הטרנסגן.

בפיתוח וקטורי rAAV חדשים למטרות טיפוליות, מטרה עיקרית היא לייצר וקטורים בעלי יעילות התמרה מוגברת. עלייה ביעילות ההתמרה של תאי המטרה פירושה ירידה במינון הקליני הדרוש של rAAV, ובכך להקטין את הסבירות להשפעות אימונוגניות שליליות החל מנטרול בתיווך נוגדנים ועד רעילות חריפה10,11. כדי לשפר את יעילות הטרנסדוקציה של וקטורי rAAV, ניתן לבצע שינויים בגנום הארוז או בקפסיד. שיטות מעשיות לכוונון יעילות הטרנסדוקציה באמצעות תכנון גנום ארוז כוללות שילוב של מקדמים חזקים וספציפיים לרקמות, בחירה מתחשבת של רכיבי עיבוד mRNA, ואופטימיזציה של רצף קידוד לשיפור יעילות התרגום12. שינויים בקפסיד נעשים במטרה להגדיל את הטרופיזם עבור סוגי תאים אנושיים מטרה. מאמצים לפיתוח קפסידים וקטוריים חדשים של העברת טרנסגנים rAAV מאופיינים בדרך כלל בהתמקדות בתכנון רציונלי של קפסידים AAV עם מוטציות ספציפיות המכוונות לקולטני תאים ספציפיים או באבולוציה מכוונת לזיהוי קפסידים עם טרופיזם עבור סוגי תאים ספציפיים מספריות קפסיד קומבינטוריות בעלות מורכבות גבוהה מבלי להתמקד בקולטן ספציפי אחד (אם כי קבוצות מסוימות משלבות גישות אלה)13, 14,15. בגישת האבולוציה המכוונת, ספריות קפסיד קומבינטוריות נבנות באמצעות עמוד שדרה סרוטיפי מסוים עם אזורים משתנים מוטנטים בצד החיצוני של הקפסיד16. ספריות קפסיד קומבינטוריות בנויות לעתים קרובות מסרוטיפים AAV שאינם מקורם בבני אדם, מה שמקטין את הסיכון לחסינות קיימת במהלך השימוש הקליני10. לכן, שיטות טיהור שניתן ליישם על כל סרוטיפ הן אידיאליות כדי לבטל את הצורך אופטימיזציה ספציפית לסרוטיפ עבור הסרוטיפים הפחות נפוצים המשמשים עמוד שדרה עבור ספריות אלה.

צנטריפוגת צפיפות יודיקסנול משמשת לטיהור טיטרים גבוהים של rAAV עם זיהומיות גבוהה17. בפרוטוקול זה, rAAV מיוצר בתרבית תאי תרחיף כדי להפחית את כמות העבודה הדרושה לייצור טיטרים גדולים של AAV. שלב צנטריפוגה נכלל גם כדי לנקות את התא lysate כדי להפחית את נוכחותם של חלבונים מזהמים ולהפחית את הסיכון של משקעים וירוס. פרוטוקול זה הוא שיטה חסכונית לייצור תכשירים של rAAV ברמת טוהר גבוהה המתאימים לשימוש פרה-קליני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הרכב התמיסות והמאגרים המשמשים בפרוטוקול זה מובא בטבלה 1.

תמיסההרכב
חיץ ליזיס AAV1.2 מ"ל של תמיסת NaCl 5 M
2 מ"ל של 1 M Tris-HCl pH 8.5 פתרון
80 uL של 1 M MgCl2 פתרון
mQ מים עד 40 מ"ל
פתרון משקעים AAV40 גרם PEG 8000
50 מ"ל של תמיסת NaCl 5 M
mQ מים עד 100 מ"ל
15% מקטע יודיקסנול7.5 מ"ל OptiPrep
3 מ"ל של 10X DPBS
6 מ"ל של תמיסת NaCl 5 M
30 uL של 1 M MgCl2 פתרון
mQ עד 30 מ"ל
25% מקטע יודיקסנול12. OptiPrep של 5 מ"ל
3 מ"ל של 10X DPBS
30 uL של 1 M MgCl2 פתרון
60 uL פנול אדום פתרון
mQ עד 30 מ"ל
40% מקטע יודיקסנול33.3 מ"ל OptiPrep
5 מ"ל של 10X DPBS
50 uL של 1 M MgCl2 פתרון
mQ עד 50 מ"ל
60% מקטע יודיקסנול50 מ"ל OptiPrep
100 uL פנול אדום פתרון
פתרון חיץ AAV8 מ"ל של 5 M NaCl
20 uL של 10% פלורוני F-68
PBS עד 200 מ"ל

טבלה 1: הרכבי פתרונות עבור פתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. טרנספקציה משולשת של תאי Expi293

  1. תאי Seed Expi293 (ראה טבלת חומרים) בצפיפות התחלתית של 5 x 105 תאים בני קיימא (vc)/מ"ל.
  2. אפשר לתאים לדגור ב 37 ° C עם 8% CO2 ומהירות שייקר של 125 סל"ד עד שהם מגיעים לצפיפות של 3-5 x 106 vc / mL. נטר את צפיפות התאים ואת הכדאיות באמצעות אי-הכללת כחול טריפאן עם מונה תאים אוטומטי (ראה טבלת חומרים).
  3. כאשר התאים מגיעים לצפיפות התא הרצויה, פצלו אותם מ-1 עד 10 על ידי הוספת מדיה חדשה, כך שהנפח הכולל שלהם יהיה פי עשרה מהנפח המקורי שלהם. במידת הצורך, להעביר תאים לתוך בקבוק גדול יותר. חזרה לדגירה.
  4. המשך להרחיב תאים כמתואר בשלבים 1.2-1.3 עד שהם יגיעו לצפיפות של לפחות 2 x 106 vc/mL ב- 250 מ"ל של מדיה בבקבוק 1 L.
  5. יום לפני ההדבקה, לדלל תאים ל 2 x 106 vc / mL ב 250 מ"ל של מדיה, השלכת תאים עודפים לפי הצורך. לדגור על התאים במשך הלילה.
  6. ביום הטרנספקציה, צנטריפוגייט מחצית התאים ב 58 x גרם במשך 5 דקות ב 18 °C (75 °F). השהה מחדש את גלולת התא באותו נפח (125 מ"ל) של מדיום טרי. כדאיות התא צריכה להיות קרובה ל -98%.
  7. הכינו שני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל. תייגו אחד "PEI" ואת השני "DNA".
  8. בצינור החרוטי המסומן PEI, יש לדלל 1.2 מ"ל של PEI (פוליאתילנימין, ראה טבלת חומרים) לנפח כולל של 12.5 מ"ל במדיית OptiMEM.
  9. בצינור החרוטי המסומן DNA, הכינו תמיסה שווה ערך של DNA פלסמיד לסך של 500 מיקרוגרם DNA בנפח כולל של 12.5 מ"ל במדיה OptiMEM.
  10. הוסיפו את תמיסת הדנ"א לתמיסת PEI, הפכו מספר פעמים כדי לשלב היטב, ותנו לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    הערה: קריטי לאפשר לתמיסת ה- DNA-PEI לדגור במשך 10 דקות שלמות על מנת ש- PEI ייצור קומפלקסים טעונים עם ה- DNA.
  11. לאחר שתמיסת DNA-PEI דגירה במשך 10 דקות, השתמש בצינור סרולוגי כדי ליישם באיטיות את תמיסת DNA-PEImax על תאי Expi293. החזירו את התאים הנגועים לאינקובטור ותנו להם לדגור במשך 72 שעות (איור 1).

figure-protocol-1
איור 1: תאי Expi293 שמבטאים GFP יומיים לאחר הטרנספקציה. לאחר טרנספקציה עם פלסמיד המכיל גן עבור GFP, תאי Expi293 מבטאים באופן זמני eGFP. המורפולוגיה של התא עגולה. התמונה צולמה בזמן חשיפה של 15 אלפיות השנייה. תמונות מיקרוסקופ נרכשות באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד בהארה אפי-פלואורסצנטית ומטרה של 10x/0.30. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. טיהור וקטור rAAV

  1. לאחר 72 שעות, להעביר את התאים בהשעיה לשני צינורות חרוטי 250 מ"ל ולסובב אותם למטה ב 415 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  2. יוצקים את המדיה supernatant לתוך צינור חרוטי טרי 500 מ"ל ולאחסן ב 0 ° C על קרח לעיבוד מאוחר יותר.
  3. השהה מחדש כל כדור תא ב- 10 מ"ל של חיץ ליזיס AAV (טבלה 1). אגרו את שני הליזטים יחד באחד הצינורות. שטפו את הצינור השני עם 5 מ"ל נוספים של מאגר ליזה AAV, ולאחר מכן הוסיפו אותו לליזטים המשולבים. להקפיא ב -70 ° C.
    הערה: ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה. אחסנו את המדיה הסופרנאטנטית בטמפרטורה של -70°C במקום על קרח.
  4. הוסף נפח 1:4 של תמיסת משקעים AAV למדיה supernatant משלב 2.2. יש להפוך מספר פעמים כדי לערבב היטב ולדגור בטמפרטורה של 0°C על קרח למשך שעתיים או לילה לפחות.
  5. צנטריפוגייט התמיסה מודגרת ב 3000 x גרם במשך 1 שעה ב 4 ° C.
  6. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה המכילה משקע נגיפי ב-5 מ"ל של מאגר ליזה AAV.
  7. הפשיר את התא lysate ב 37 °C באמבט מים.
  8. אגרו את המשקע הנגיפי עם התא ליזט. זהו הליזט הגס. שטפו את צינור הצנטריפוגה שהכיל את המשקע הנגיפי עם 5 מ"ל נוספים של חיץ ליזה AAV ואגרו עם הליזט הגולמי.
  9. להקפיא את הליזט הגולמי ל -70 ° C, ולאחר מכן להפשיר ב 37 °C (77 °F). חזור על מחזור זה פעם נוספת.
    הערה: אין להשאיר את הליזט הגולמי בטמפרטורה של 37°C למשך זמן רב יותר מהנדרש כדי להפשירו.
  10. לאחר הפשרה בפעם השלישית, מיד להוסיף 4 μL של benzonase לליזט גולמי, להפוך כדי לערבב, לדגור במשך 30 דקות ב 37 ° C.
  11. צנטריפוגט את הליזט הגולמי למשך 10 דקות ב 650 x גרם ב 18 ° C.
  12. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חרוטי נקי בנפח 50 מ"ל. זהו הנגיף הגולמי. השליכו את הכדור.
  13. צנטריפוגט את הנגיף הגולמי למשך 30 דקות נוספות ב 3000 x גרם ב 18 ° C כדי לנקות חלבונים מזהמים.
  14. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חרוטי נקי בנפח 50 מ"ל. זהו הנגיף המובהר.
    הערה: ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה. להקפיא את הנגיף המזוהר ל -70 מעלות צלזיוס.
  15. הגדר את המשאבה הפריסטלטית הרב-ערוצית עם ארבעה צינורות פריסטלטיים (ראה טבלת חומרים). חבר נימים לשני הקצוות של כל צינור.
  16. הניחו את הנימים בצד הקלט של המשאבה בתוך מלאה במים נטולי יונים. מניחים את הנימים בצד המוצא של המשאבה בכד ריק. הפעל את המשאבה הפריסטלטית במהירות 25.0 סל"ד כדי לשטוף את הצינור במים נטולי יונים.
  17. לאחר שטיפה יסודית, רוקן את הצינור הפריסטלטי על ידי הפעלת המשאבה עד שהצינור יתמלא רק באוויר. הניחו את כל הנימים על מגבון נקי ללא מוך.
  18. הניחו ארבעה צינורות אולטרה-צנטריפוגות במדף בצד היציאה של המשאבה.
  19. השתמש בצינור סרולוגי של 10 מ"ל כדי לפזר בזהירות 10 מ"ל של וירוס מובהר לכל צינור אולטרה-צנטריפוגה. היזהר לא להציג בועות אוויר.
    הערה: ניתן למתוח את נפח הנגיף המובהר בכל צינור עד 12 מ"ל לכל צינור, במידת הצורך. להפחית את כמות 60% יודיקסנול כראוי בשלב 2.25 להלן.
  20. הנגיף המזוקק מכוסה בשברי יודיקסנול (טבלה 1) מהצפיפות הנמוכה ביותר לצפיפות הגבוהה ביותר באמצעות המשאבה הפריסטלטית. השבר 15% מתווסף ראשון, אחריו השבר 25%, השבר 40%, ולבסוף השבר 60%. העבר 22 מ"ל (5.5 מ"ל לכל צינור אולטרה-צנטריפוגה) של מקטע 15% יודיקסנול לצינור חרוטי נקי של 50 מ"ל. הניחו את הנימים בצד הקלט של המשאבה לתוך הצינור, וודאו שכל הנימים נוגעים בתחתית הצינור.
  21. הפעל את המשאבה ואפשר לצינור להתמלא במקטע יודיקסנול. כאשר מקטע היודיקסנול מגיע לקצות הנימים בצד המוצא של המשאבה, עצור את המשאבה.
  22. הכנס נימי פלט אחד לכל צינור אולטרה-צנטריפוגה עם וירוס מזוקק, וודא שהנימים נוגעים בתחתית כל צינור אולטרה-צנטריפוגה.
    הערה: יש חשיבות קריטית לכך שלא יישאר אוויר בנימים. יודיקסנול עשוי לזרום דרך הצינור הפריסטלטי בקצב מעט שונה, לכן יש לוודא שכל נימי פלט בודדים מלאים לחלוטין ביודיקסנול לפני הכנסתו לווירוס המזוקק. ייתכן שיהיה צורך לעצור ולהפעיל את המשאבה מספר פעמים.
  23. הפעל את המשאבה ואפשר לצינורות האולטרה-צנטריפוגות להתמלא. כאשר האחרון מבין 15% השבר עומד להילקח לתוך נימי הקלט, עצור את המשאבה. זה קריטי שלא ייכנסו בועות אוויר לצינורות הפריסטלטיים.
    הערה: אם בועות אוויר נכנסות לנימי הקלט, ניתן להפעיל את המשאבה לזמן קצר בכיוון ההפוך כדי לדחוף אותן בחזרה החוצה.
  24. העבר 22 מ"ל (5.5 מ"ל לכל צינור אולטרה-צנטריפוגה) של חלק היודיקסנול 25% לתוך הצינור החרוטי 50 מ"ל. ודא שכל הנימים נוגעים בתחתית הצינור והפעל את המשאבה. כאשר האחרון מבין 25% השבר עומד להילקח לתוך נימי הקלט, עצור את המשאבה.
  25. חזור על שלב 2.24 עם 20 מ"ל (5 מ"ל לכל צינור אולטרה-צנטריפוגה) של חלק 40% יודיקסנול ולאחר מכן עם 24 מ"ל (6 מ"ל לכל צינור אולטרה-צנטריפוגה) של החלק 60%.
  26. אם עדיין נותר נפח לא ממולא בצינור האולטרה-צנטריפוגה, המשיכו להוסיף עוד מהשבר של 60% עד שצינורות האולטרה-צנטריפוגה יתמלאו לחלוטין בנוזל.
  27. ממלאים כל צינור עד שהליזט יוצר כיפה מעל החלק העליון אך אינו גולש מהצינור. עצור את המשאבה בזהירות להסיר כל נימי פלט, נזהר לא להפריע את שיפוע יודיקסנול.
  28. מכסים כל צינור אולטרה-צנטריפוגה בספייסר וטוענים אותו לרוטור Type 70 Ti (ראו טבלת חומרים).
    הערה: ודא שהרוטור מאוזן כראוי. אין לנסות להפעיל את האולטרצנטריפוגה ללא הכשרה מתאימה.
  29. טען את הרוטור Type 70 Ti לתוך אולטרה-צנטריפוגה וצנטריפוגייט ב 489,000 x גרם במשך 1 שעה ב 18 ° C.
  30. לאחר הצנטריפוגה, לפרוק את הרוטור מן ultracentrifuge. השתמש בצבת אף מחט כדי להסיר בזהירות כל צינור אולטרה-צנטריפוגה מהרוטור, תוך הקפדה שלא להפריע לשיפוע היודיקסנול.
  31. השתמש במעמד טבעת תמיכה עם מהדק כדי לאבטח צינור אולטרה-צנטריפוגה אחד.
  32. חבר מחט 20 GA למזרק 5 מ"ל ומניחים בצד. השתמש במגבון ללא סיבים כדי להסיר את הפקק מצינור האולטרה-צנטריפוגה.
  33. חדרו את דופן צינור האולטרה-צנטריפוגה עם המחט כ-3 מ"מ מתחת לממשק היודיקסנול 40%-60% (איור 2).
  34. לאט לשאוף את הממשק וחלק של 40% שבר. הימנע מלשאוף את החלק העליון של 40%, עבור משיכה כוללת של כ 4 מ"ל.
  35. מחזיק אצבע אחת מעל החלק העליון הפתוח של צינור ultracentrifuge, לשלוף את המזרק ולהעביר את שבר AAV שואף לצינור חרוטי 50 מ"ל. יש להשליך את המזרק למיכל חדים. השליכו את צינור האולטרה-צנטריפוגה.
  36. חזור על שלבים 2.31-2.35 עבור כל צינור אולטרה-צנטריפוגה.
  37. לדלל את מקטע AAV שואף בערך פי שניים במאגר ליזה AAV לנפח של 40 מ"ל.
  38. יש לשטוף את הצינור הפריסטלטי כמתואר בשלבים 2.16-2.17.
    הערה: ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה. אחסנו את מקטע ה-AAV המדולל בטמפרטורה של 0°C למשך הלילה.
  39. טען 20 מ"ל כל אחד ממקטע AAV מדולל לשני צינורות אולטרה-צנטריפוגות חדשים.
  40. עבור הסבב השני של צנטריפוגה הדרגתית צפיפות יודיקסנול, חלק AAV מדולל הוא underlaid כמתואר לעיל באמצעות רק 10 מ"ל (5 מ"ל לכל צינור אולטרהצנטריפוגה) של 40% חלק ו 14 מ"ל (7 מ"ל לכל צינור אולטרה צנטריפוגה) של 60% שבר. חזור על שלבים 2.29-2.36 עבור אולטרה-צנטריפוגה ושאיפה.
    הערה: לפני אחסון המשאבה הפריסטלטית והצינורות, שטפו את הצינור במי DI כמתואר בשלבים 2.16-2.17.

figure-protocol-2
איור 2: שיפוע יודיקסנול עם ממשק יודיקסנול 40%-60% מסומן. (A) שיפוע יודיקסנול ראשון. פנול אדום משמש בשברים 40% יודיקסנול ו 60% יודיקסנול. הוא מופיע בצבע שונה בגלל ההבדל ב- pH בין שני השברים. החץ מציין היכן יש להכניס את המזרק כדי לקצור את מקטע ה-rAAV, ממש מתחת לממשק ה-40%-60% יודיקסנול. (B) שיפוע יודיקסנול שני. רק 40% ו 60% שברים יודיקסנול משמשים בשלב זה. החץ מציין היכן יש להכניס את המזרק כדי לקצור את החלק rAAV. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. חילופי חיץ וריכוז וירוסים

  1. לאחר קבלת חלק AAV מהסבב השני של צנטריפוגה הדרגתית צפיפות יודיקסנול, לדלל אותו פעמיים עם תמיסת חיץ AAV.
  2. אזן את המסנן הצנטריפוגלי על-ידי הוספת 20 מ"ל של תמיסת חיץ AAV לחלק העליון של המסנן. צנטריפואט את המנגנון ב 3000 x גרם ב 18 ° C במשך 5 דקות ולהשליך את הזרימה דרך.
  3. הוסף את מקטע ה- AAV המדולל למסנן הצנטריפוגלי. צנטריפואט את המנגנון ב 3000 x גרם ב 18 ° C במשך 5 דקות ולהשליך את הזרימה דרך.
  4. הוסף 20 מ"ל של תמיסת מאגר AAV לחלק העליון של המסנן. צנטריפואט את המנגנון ב 3000 x גרם ב 18 ° C במשך 5 דקות ולהשליך את הזרימה דרך.
    הערה: אם קרום המסנן הצנטריפוגלי נחסם, מה שגורם לתמיסה לזרום דרכו בצורה לא יעילה, השתמש בזהירות במיקרופיפטה P200 כדי לצייר מעלה ומטה את התמיסה בחלק העליון של המסנן. היזהר במיוחד לא לגעת בפילטר עם קצה המיקרופיפטה.
  5. חזור על שלב 3.4 פעמיים נוספות.
    הערה: ודא שה-AAV אינו מרוכז יתר על המידה על-ידי שמירה על נפח של 1 מ"ל לפחות בחלק העליון של המסנן. ייתכן שיהיה צורך להתאים את זמני הצנטריפוגות כדי למנוע ריכוז יתר. אם AAV מרוכז יתר על המידה, משקעים יכולים להתרחש.
  6. עבור טיטר סופי בטווח של 1012 vg / mL, סובב את הנגיף למטה לנפח סופי של כ 1 מ"ל.
    הערה: בהתאם לעמוד השדרה של הסרוטיפ שבו נעשה שימוש וליעילות האריזה של הנגיף, ייתכן שיהיה עליך לרכז את הנגיף בנפח קטן יותר.
  7. השתמש במיקרופיפטה p1000 כדי להעביר את ה- AAV המרוכז מראש המסנן הצנטריפוגלי לצינור מיקרוצנטריפוגה. השתמש מיקרופיפטה p200 כדי לשטוף את המסנן הצנטריפוגלי עם 50 μL של מאגר AAV כדי לאסוף את כל הנגיף שנותר ומאגר עם שאר AAV מרוכז.
  8. יש להפריש אליקוט של 2 μL של AAV מרוכז לטיטר. ראה טבלה משלימה 1 כדי להציג פריימרים של ITR שניתן להשתמש בהם עבור qPCR.
  9. מעבירים את ה-AAV המרוכז דרך מסנן מזרקים של 0.2 מיקרומטר כדי לעקר אותו.
    הערה: בעת עיקור נפח קטן, הקפד לבחור מסנן מזרק בקוטר קטן על מנת למזער אובדן וירוסים. שימוש בפילטר קושר חלבון נמוך בקוטר קטן יגרום לאובדן נגיפי מינימלי (הנתונים אינם מוצגים).
  10. AAV מעוקר יכול לשמש מיד כדי להמיר תאים או מאוחסן ב 4 ° C לשימוש בתוך ארבעה שבועות. זה צריך להיות מאוחסן ב -70 °C לאחסון לטווח ארוך יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שיטה זו יכולה לשמש להשגת טיטרים של לפחות 1012 חלקיקים נגיפיים לכל מ"ל. ניתן להשיג טיטר (איור 3) באמצעות qPCR באמצעות פריימרים ITR המסופקים בטבלה משלימה 1, באמצעות ddPCR או בכל שיטת טיטרינג אחרת. טיטרים תת-אופטימליים יכולים לנבוע משימוש בגן כובע המקודד לקפסיד עם יעילות אריזה ירודה.

מקור אפשרי נוסף לתוצאות תת-אופטימליות הוא יעילות ההולכה הירודה של תאי Expi293. מומלץ שיהיו תאים בצפיפות של 3-4 x 106 vc/mL ביום הטרנספקציה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול טיהור שיפוע צפיפות יודיקסנול כפול הוא השיטה האוניברסלית מכיוון שהוא ישים לכל וריאנטים מוטנטיים AAV, ללא קשר לספציפיות הקולטן שלהם. שיטות מוקדמות לטיהור AAV הסתמכו על צפיפות חלקיקים וכללו צנטריפוגה איזופיקנית ב-CsCl וצנטריפוגה הדרגתית רציפה של צפיפות סוכרוז19. מאוחר יותר פותחו גישות ספציפיות לסרוטיפים, שעשו שימוש בנוגדנים חד-שבטיים הקשורים לעמודות ספרוז20. שיטת טיהור חדשנית מבוססת צפיפות המשתמשת בשיפוע יודיקסנול לא רציף פותחה בשנת 1999 והניבה מבודדי AAV עם זיהומיות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין גילויים לדווח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5810 R צנטריפוגה ספסליתEppendorf22625501
משאבה פריסטלטית 8 ערוצים ווטסון-מרלו020.3708.00A
מונה תאים אוטומטי NanoEntekEVE-MC
Avanti J-E צנטריפוגה מהירהבקמן קולטר369001
BenzonaseThermo Scientific88701
ארון בטיחות ביולוגיLabconco322491101
חממת CO2 עם שייקר מוגדר ל-8% CO2 ו-37 ° C
צינורות צנטריפוגה חרוטייםThermo Scientific33965250 מ"ל
צינורות צנטריפוגה חרוטייםThermo Scientific33965015 מ"ל
מיקרו-פיפטים חד פעמייםFisherbrand21-164-2Gנימים
פוספט של Dulbecco ללא CaCl2 ו-MgCl2  (DPBS) (פי 10)Sigma-AldrichD1408
ECLIPSE Ts2R-FL מיקרוסקופ הפוךNikon
Expi293 ביטוי בינוניGibcoA1435101
Expi293F תאיםGibcoA14527
טיפים לסינוןUSA Scientific1126-78101000 µ L
טיפים לסינוןUSA Scientific1120-8810200 ומיקרו; L
טיפים לסינוןארה"ב סיינטיפיק1120-181020 ומיקרו; L
טיפים לסינוןארה"ב סיינטיפיק1121-381010 ומיקרו; L
מחטים היפודרמיותTyco Healthcare82011220 GA x 1-1/2
A דלי קרח עם מכסהVWR10146-184
JS-5.3 רוטורבקמן קולטר368690
תמיסת מגנזיום כלוריד (1 מ')Millipore SigmaM1028-100ML
מעמד מתכת ומהדק פישרברנד05-769-6Q
צינורות מיקרוצנטריפוגהEppendorf226000281.5 מ"ל
צבת
אופטימה XE-90 אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטרA94471
Opti-MEM I סרום מופחתבינוני Gibco31985062
OptiPrep צפיפות שיפוע מדיה (יודיקסאנול)SerumwerkAXS-1114542תמיסת יודיקסנול 60%
P1000 פיפטגילסוןF144059M
P2 פיפטגילסוןF144054M
P20 פיפטגילסוןF144056M
P200 פיפטגילסוןF144058M
פנול אדום  פתרוןSigma-AldrichP0290
מי מלח חוצץ פוספט (PBS)Sigma-AldrichP4474
בקר פיפטה Pipet-Aid XPDrummond Scientific4-000-101
פלסמיד pCapsidDe novo או Addgene וכו' לא ישיםהשתמשנו ב-pACGrh74. 
פלסמיד pHelperAddgene112867
פלסמיד pTransgeneDe novo או Addgene וכו ' לא ישים:השתמשנו ב-pdsAAV-GFP.
תמיסת פוליאול פלורונית F-68 (10%)Mp Biomedicals92750049
פוליאתילן גליקול 8000מוצרי מחקר בינלאומייםP48080-500.0
פוליאתילנימין הידרוכלוריד מקס (PEI-Max)PolysciencesNC1038561לדלל במים ל-40 μ M
צינורות צנטריפוגה מפוליפרופילן, צינורות צנטריפוגה סטריליים431123500 מ"ל
פוליפרופילן, צינורות צנטריפוגה סטרילייםשל קורנינג430776 250 מ"ל
פוליפרופילן אופטיסילבקמן קולטר361625
פיפטות סרולוגיותאלקלי סיינטיפיקSP250-B50 מ"ל
פיפטות סרולוגיותאלקלי סיינטיפיקSP225-B25 מ"ל
פיפטות סרולוגיותאלקלי סיינטיפיקSP210-B10 מ"ל
פיפטות סרולוגיותאלקלי סיינטיפיקSP205-B5 מ"ל
צלוחיות שייקרפישרברנדPBV1000 1 ליטר
צלוחיות שייקרפישרברנדPBV50-0500 מ"ל
צלוחיות שייקרפישרברנדPBV250250 מ"ל
צלוחיות שייקרפישרברנדPBV12-5125 מ"ל
תמיסת נתרן כלורי (5 מ')פישר סיינטיפיקNC1752640
מזרקים סטרילייםפישרברנד14-955-4585 מ"ל
מסנן מזרקMilliporeSLGV013SL0.22 מיקרון
Tris-HCl pH 8.5 (1 מ')KdRGE3363
רפואי טריפן כחול פתרוןGibco15250061
מכלול מתלה צינורותבקמן קולטר361646
מרווחי צינורות (x4)בקמן קולטר361669
צינורות למשאבה פריסטלטיתפישר סיינטיפיק14190516
סוג 70 Ti רוטור טיטניום בזווית קבועהבקמן קולטר337922
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחדמוגדר על -70 מעלות;
C Vivaspin 20 רכז צנטריפוגליSartoriusVS2041
אמבט מים מוגדר ב-37 מעלות; ג
אף מחט

מקורות

  1. Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
  2. Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S. Focused update on AAV-based gene therapy clinical trials for inherited retinal degeneration. BioDrugs. 34 (6), 763-781 (2020).
  3. George, L. A., et al. Multiyear factor VIII expression after AAV gene transfer for hemophilia A. N Engl J Med. 385 (21), 1961-1973 (2021).
  4. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a vector for gene therapy. Biodrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  5. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. cD. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  6. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
  7. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu Rev Virol. 1 (1), 427-451 (2014).
  8. Zolotukhin, S. Production of recombinant adeno-associated virus vectors. Hum Gene Ther. 16 (5), 551-557 (2005).
  9. Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N., Ayuso, E. Pharmacology of recombinant adeno-associated virus production. Mol Ther - Methods Clin Dev. 8, 166-180 (2018).
  10. Costa-Verdera, H., et al. Understanding and Tackling immune responses to adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 836-852 (2023).
  11. Ertl, H. C. J. Mitigating serious adverse events in gene therapy with AAV Vectors: Vector dose and immunosuppression. Drugs. 83 (4), 287-298 (2023).
  12. Pupo, A., et al. AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy. Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).
  13. Marsic, D., et al. Vector design tour de force: Integrating combinatorial and rational approaches to derive novel adeno-associated virus variants. Mol Ther. 22 (11), 1900-1909 (2014).
  14. Grimm, D., Zolotukhin, S. E Pluribus Unum: 50 Years of research, millions of viruses, and one goal-tailored acceleration of AAV evolution. Mol Ther. 23 (12), 1819-1831 (2015).
  15. Biswas, M., et al. Engineering and in vitro selection of a novel AAV3B variant with high hepatocyte tropism and reduced seroreactivity. Mol Ther - Methods Clin Dev. 19, 347-361 (2020).
  16. Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol Ther. 8 (1), 151-157 (2003).
  17. Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free production of laboratory grade AAV and purification by iodixanol density gradient centrifugation. Mol Ther - Methods Clin Dev. 10, 1-7 (2018).
  18. Chan, C., Harris, K. K., Zolotukhin, S., Keeler, G. D. Rational design of AAV-rh74, AAV3B, and AAV8 with limited liver targeting. Viruses. 15 (11), 2168(2023).
  19. Schmidt, O. W., Cooney, M. K., Foy, H. M. Adeno-associated virus in adenovirus type 3 conjunctivitis. Infect Immun. 11 (6), 1362-1370 (1975).
  20. Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther. 9 (18), 2745-2760 (1998).
  21. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
  22. Clark, K. R., Liu, X., Mcgrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  23. Debelak, D., et al. Cation-exchange high-performance liquid chromatography of recombinant adeno-associated virus type 2. J Chromatogr B Biomed Sci App. 740 (2), 195-202 (2000).
  24. Burova, E., Ioffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Ther. 12 (1), S5-S17 (2005).
  25. Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnol Bioeng. 117 (10), 3199-3211 (2020).
  26. Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 1 (3), 1412-1428 (2006).
  27. Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 28, 146-159 (2022).
  28. Chamberlain, K., Riyad, J. M., Weber, T. Expressing transgenes that exceed the packaging capacity of adeno-associated virus capsids. Hum Gene Ther Methods. 27 (1), 1-12 (2016).
  29. Green, E. A., Hamaker, N. K., Lee, K. H. Comparison of vector elements and process conditions in transient and stable suspension HEK293 platforms using SARS-CoV-2 receptor binding domain as a model protein. BMC Biotechnol. 23 (1), 7(2023).
  30. Erbacher, P., Zou, S., Bettinger, T., Steffan, A. M., Remy, J. S. Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: Biophysical characteristics and transfection ability. Pharm Res. 15 (9), 1332-1339 (1998).
  31. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Hum Gene Ther. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  32. Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).
  33. Wright, J. F., et al. Identification of factors that contribute to recombinant AAV2 particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation. Mol Ther. 12 (1), 171-178 (2005).
  34. Gruntman, A. M., et al. Stability and compatibility of recombinant adeno-associated virus under conditions commonly encountered in human gene therapy trials. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 71-76 (2015).
  35. Srivastava, A. Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized AAV vectors for human gene therapy. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).
  36. Mullard, A. FDA approves first gene therapy for Duchenne muscular dystrophy, despite internal objections. Nat Rev Drug Discov. 22 (8), 610-610 (2023).
  37. Center for Biologics Evaluation and Research. Approved Cellular and Gene Therapy Products. US Food Drug Adm. , (2023).
  38. Kang, L., et al. AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges. J Control Release Off J Control Release Soc. 355, 458-473 (2023).
  39. De Wolf, D., Singh, K., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Hemophilia gene therapy: The end of the beginning. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 782-792 (2023).
  40. Simons, E. J., Trapani, I. The opportunities and challenges of gene therapy for treatment of inherited forms of vision and hearing loss. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 808-820 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מדרג יודיקסנולAAV רקומביננטיייצור וקטורים ויראלייםטיפול גנטיטיהור חלקיקים ויראלייםשקיעה באמצעות PEG
תרבית תרחיף ייצור וטיהור של וירוס הקשור לאדנו על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול עבור יישומי in vivo
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.