מאמר שיטה

מודל Ileus Murine לאחר הניתוח

DOI:

10.3791/66465

⸱

12 ביולי 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1General Surgery Department, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2National Clinical Research Center for Digestive Diseases, 3State Key Lab of Digestive Health, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 4Immunology Research Center for Oral and Systemic Health, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 5Beijing Laboratory of Oral Health, Capital Medical University School of Stomatology, 6Beijing Clinical Research Institute, 7Medical Research Center, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, 8Beijing Institute of Brain Disorders, Capital Medical University, 9Department of Hernia and Abdominal Wall Surgery, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים מודל מורין של אילאוס לאחר הניתוח שנוצר באמצעות מניפולציה במעיים. תפקוד המעבר במערכת העיכול, שינויים פתולוגיים והפעלת תאי מערכת החיסון הוערכו 24 שעות לאחר הניתוח.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רוב החולים חווים אילאוס לאחר הניתוח (POI) לאחר הניתוח, אשר קשורה לעלייה בתחלואה, תמותה וזמן אשפוז. POI הוא תוצאה של נזק מכני במהלך הניתוח, וכתוצאה מכך הפרעה בתנועתיות במערכת העיכול. המנגנונים של POI קשורים לרגישות עצבית חריגה, תפקוד לקוי של מחסום אפיתל ודלקת מקומית מוגברת. עם זאת, הפרטים נותרו מסתוריים. לכן, מודלים ניסיוניים של מורין חיוניים להבהרת הפתופיזיולוגיה והמנגנון של פגיעה ב-POI ולפיתוח טיפולים חדשניים.

כאן, אנו מציגים מודל מורין של POI שנוצר באמצעות מניפולציה מעיים (IM) הדומה לניתוח קליני; זה מושג על ידי נזק מכני למעי הדק על ידי עיסוי הבטן 1-3 פעמים עם צמר גפן. IM עיכב את המעבר במערכת העיכול 24 שעות לאחר הניתוח, כפי שהוערך על ידי FITC-dextran gavage וזיהוי פלואורסצנטי של מערכת העיכול המגזרית. יתר על כן, נפיחות רקמות של submucosa וחדירת תאים חיסוניים נחקרו על ידי hematoxylin ו eosin צביעה cytometry זרימה. לחץ תקין של IM והשפעה היפרמית על המעי הם קריטיים עבור ההליך. מודל מורין זה של POI יכול לשמש לחקר מנגנוני הנזק למעיים וההתאוששות לאחר ניתוח בטן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אילאוס לאחר הניתוח (POI) היא תסמונת המהווה אתגר משמעותי בתחום בריאות האדם, במיוחד בניהול חולים העוברים ניתוחי בטן. POI, המאופיין בהתאוששות מאוחרת של תנועתיות מערכת העיכול, תורם לשהייה ממושכת בבית החולים ולעלייה בעלויות הטיפול הרפואי, אך לא קיימת הגדרה, אטיולוגיה או טיפול מבוססים1. מחקרים אחרונים שפכו אור על התפקיד המרכזי של תאי מערכת החיסון בהתקדמות POI 2,3,4, אך נדרשת חקירה נוספת כדי להבהיר את המנגנונים הבסיסיים המעורבים.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים מודל מורין של POI המושרה על ידי ניתוח תוך בטני, אשר מחקה באופן הדוק את ההשפעה של ניתוח בטן על מערכת העיכול. מטרתנו הייתה לספק שיטה סטנדרטית למידול נקודות עניין בעכברים, שתאפשר לחוקרים לחקור את הפתופיזיולוגיה שלה ולחקור התערבויות טיפוליות חדשניות.

הרציונל מאחורי הפיתוח והשימוש בטכניקה זו טמון בצורך במודלים פרה-קליניים אמינים לחקר POI. גישות מסורתיות לחקר POI לעתים קרובות חסרות רלוונטיות תרגומית או אינן מצליחות ללכוד את יחסי הגומלין המורכבים של הגורמים התורמים למצב. על ידי הצגת מודל מורין המשכפל באופן הדוק את התרחיש הקליני, חוקרים יכולים לחקור בצורה מדויקת יותר את המנגנונים העומדים בבסיס POI ולבחון התערבויות טיפוליות פוטנציאליות בסביבה ניסויית מבוקרת.

בהשוואה לטכניקות חלופיות, מודל מורין של POI המוצג בפרוטוקול זה מציע מספר יתרונות. בתחילה, שילבנו את ממצאי הניסוי שלנו עם ההתקדמות האחרונה כדי לבסס פרוטוקול סטנדרטי וניתן לשחזור להשראת נקודות עניין בחיות ניסוי. פרוטוקול זה מאפשר הערכה עקבית של תפקוד המעבר במערכת העיכול. שנית, שימוש בצביעה היסטולוגית וציטומטריית זרימה איפשר להעריך את נפיחות הרקמות, התפשטות תאי מערכת החיסון והפעלתם, והניב תובנות חשובות לגבי התהליכים הדלקתיים העומדים בבסיס POI5.

בהקשר הרחב יותר של הספרות, הקמת מודל מורין של POI תורמת לגוף המחקר המתרחב שמטרתו להבין את הפתופיזיולוגיה של מצב זה. על ידי גישור על הפער בין המדע הבסיסי לבין הפרקטיקה הקלינית, מודלים פרה-קליניים ממלאים תפקיד מרכזי בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות עבור POI6. יתר על כן, זמינותם של מודלים סטנדרטיים של בעלי חיים משפרת את יכולת השחזור וההשוואה של ממצאי מחקר במעבדות שונות. עם זאת, מודל POI זה מסתמך על גירוי מכני במהלך ההליך הכירורגי. צורות אחרות של איליאוס המושרה על ידי גירוי עשויות שלא להתאים למודל זה. בנוסף, על החוקרים לקחת בחשבון גורמים כגון תקנות רווחת בעלי חיים, שיקולים אתיים וזמינות משאבים בעת תכנון ניסויים באמצעות מודל זה.

לסיכום, הצגתו של מודל מורין של POI מסמלת התקדמות ראויה לציון במחקר הפרה-קליני על מצב מתיש זה. בנוסף, השתמשנו בציטומטריית צביעה וזרימה של H&E כדי להעריך נפיחות רקמות ושגשוג והפעלה של תאי מערכת החיסון. הקמת מודל POI של מורין תקל על גילוי מנגנוני POI ותקדם את הפיתוח של טיפולים חדשניים לנקודות עניין.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטיפול בבעלי חיים וההליכים הניסיוניים נערכו בהתאם לעקרונות המנחים בטיפול ובשימוש בבעלי חיים (סין) ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים לידידות בבייג'ינג (מס '20-2056). C57BL/6 עכברים (בני 8-12 שבועות) שימשו למחקר.

1. הכנה לניתוח

  1. צום את כל העכברים במשך 12 שעות לפני המידול המתוכנן כדי לעמוד בסטנדרטיזציה של תנאי ניסוי (איור 1A).
  2. להכין ולעקר כלי ניתוח.
  3. הכינו את טריברומואתנול ההרדמה ואת כרית החימום. עקוב אחר כרית החימום כדי למנוע התחממות יתר ושמור אותה בטמפרטורה עקבית (37.5 מעלות צלזיוס).

2. הרדמה

  1. להרדים כל עכבר עם tribromoethanol.
    1. לדלל tribromoethanol להכנת תמיסת 20 מ"ג / מ"ל במי מלח רגילים. לנהל 0.2 מ"ל של פתרון עבודה tribromoethanol לכל 10 גרם של משקל הגוף באמצעות הזרקה intraperitoneal. השתמש משחה אופתלמית על העיניים של עכברים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
    2. יש לוודא שהעכברים מורדמים לחלוטין תוך 5 דקות ולהישאר מורדמים למשך 20 דקות.
  2. להעריך את עומק ההרדמה על ידי התבוננות בחוסר היכולת של העכבר להישאר זקוף ולבדוק הרפיה שרירים. שימו לב לאובדן תנועה רצונית, רפלקס מצמוץ ותגובה לגירוי רפלקס (צביטת בוהן או זנב בלחץ חזק).
  3. להעריך את קצב הנשימה ואת דפוס העכבר על ידי ניטור התנועה של קיר החזה והבטן. ודא שקצב הנשימה הוא ~ 55-65 נשימות לדקה בהרדמה אופטימלית.
  4. הניחו את העכבר המרדים על לוח ואבטחו אותו בנייר דבק.
  5. לאחר שהעכברים הורדמו לחלוטין, השתמשו במכונת גילוח חשמלית להסרת שיער מהבטן. לאחר הגילוח, נגבו את כל השיער הרפוי על הבטן בעזרת כדור צמר גפן לח במי מלח.
    הערה: יש להקפיד על אוורור נאות ושימוש בקולט אדים או בארון בטיחות ביולוגית בעת הטיפול בטריברומואתנול כדי למזער את סיכוני החשיפה. במהלך ההליך, יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות ומעילי מעבדה, כדי למנוע מגע מקרי עם כימיקלים וחומרים ביולוגיים.

3. ניתוח

  1. האריכו לחלוטין את הגפיים כדי לחשוף את הבטן. ודאו שראש העכבר ממוקם כדי לשמור על נתיב אוויר ברור (איור 1B).
  2. יש לחטא את עור אזור הניתוח פעמיים באמצעות כדור צמר גפן ספוג ב-75% אלכוהול. לאחר החיטוי, השתמש בגזה רפואית יבשה וסטרילית כדי להסיר אלכוהול עודף מהבטן. יש לתת לידוקאין (10 מ"ג/ק"ג, תת עורית) באתר המיועד לפני החתך.
  3. השתמש אזמל סטרילי כדי לבצע חתך בעור ולהרים את שריר הבטן פי הטבעת באמצע הבטן באמצעות פינצטה.
    1. בצע חתך קטן לאורך הקו החציוני של שריר הבטן rectus, תוך הקפדה על פגיעה באיברים שונים בבטן.
    2. ודא שהטווח המשוער של החתך הוא כדלקמן. יש לוודא כי השוליים העליונים של החתך הם 6-8 מ"מ מתהליך הקסיפואיד של עצם החזה, השוליים התחתונים הם 6-8 מ"מ מאיבר המין החיצוני, ואורך החתך הוא ~1 ס"מ.
  4. מניחים חתיכת וילון כירורגי סטרילי או גזה סטרילית משני צידי חתך הבטן. השתמשו במלקחיים המוסטטיים כדי לקבע את הגזה הסטרילית בקצה העליון והתחתון של החתך, ולחשוף את החתך (איור 1C).
    הערה: בקבוצת הדמה, החתך היה מכוסה בגזה רטובה במשך 5 דקות ללא כל פעולה כירורגית.
  5. תקן כראוי את הווילונות הסטריליים או הגזה, ולאחר מכן השתמש בשני צמר גפן רטוב מראש עם מלוחים ללחוץ בעדינות על שני הצדדים של דופן הבטן הסמוך לחתך. סחטו כמות קטנה של צינורית המעי דרך החתך וחשפו אותה על-ידי הנחתה על הווילונות הסטריליים או הגזה (איור 1D).
  6. להרטיב לחלוטין שני צמר גפן סטרילי עם מלוחים רגילים. לתפוס בעדינות את רקמת המעי עם צמר גפן לח בזהירות להסיר את המעי הדק.
    1. אתר את caecum ולאחר מכן להוציא את המעי עם צמר גפן סטרילי עד 2 ס"מ לפני הבטן כדי למנוע נגיעה הלבלב. להרחיב את המעי מן הקצה הפרוקסימלי של רצועת הלבלב-תריסריון לקצה הדיסטלי של האזור ileocecal.
  7. הפעל לחץ עקבי לאורך המעי הדק כולו מהקצה הפרוקסימלי ועד לקצה הדיסטלי. הקפידו להפעיל כוח אחיד במשך 5 דקות עד שיופיעו כתמי דימום קטנים על פני השטח של המעי (איור 1E).
  8. לאחר 5 דקות, השתמשו במקלוני צמר גפן סטריליים לחים מראש כדי להחזיר בזהירות את כל המעי הדק לחלל הבטן, בהתאם למיקום האנטומי הפיזיולוגי הרגיל של המעי הדק.
  9. עסו בעדינות את הבטן על פני הגזה הסטרילית ודופן הבטן במשך 3-5 שניות כדי להבטיח שהמעי יחזור למקומו האנטומי הטבעי ולמנוע חסימת מעיים מכנית מלאכותית או פיתול מזנטרי לאחר הניתוח.
  10. הזריקו 100 מיקרוליטר מלח לחלל הבטן כדי להחליף נוזלים שאבדו במהלך הניתוח ולשמן את רקמת הבטן.
  11. סגור את הבטן באמצעות תפר כירורגי 6-0 ובצע סגירה דו שכבתית בחתך הבטן. התחל על ידי סגירת שכבת השריר עם תפרים רציפים, תוך הקפדה על מניעת נזק לאברי הבטן. הרימו את שריר פי הטבעת במהלך התפירה (איור 1F).
  12. לאחר סגירה מוחלטת של שריר הבטן הרקטוס, תפרו אותו לחלוטין עם תפרים פשוטים לסירוגין באמצעות תפר כירורגי 6-0. שמור על אורך תפר של ~0.5 מ"מ ומרווח מחטים של ~2 מ"מ.
  13. לאחר סגירת החתך בבטן, נגבו בעדינות את האזור הסמוך לחתך בגזה רפואית סטרילית יבשה כדי לשמור עליו יבש ונקי מדם, נוזל רקמות או מי מלח רגילים.
  14. יש למרוח כמות קטנה של דבק חתך רפואי על החתך וסביבו כדי למנוע פיצול לאחר הניתוח.
  15. לאחר שהחתך הרפואי התייבש לחלוטין, העבירו את העכברים למגבת נייר, והניחו את מגבת נייר הכלוב על שמיכה מחוממת הנשמרת בטמפרטורה קבועה של 37.5 מעלות צלזיוס עד שהעכברים יתאוששו לחלוטין. אל תשאירו את בעלי החיים ללא השגחה עד שהם חזרו להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה.
  16. העבירו את העכברים הערניים לסביבת מחסום האכלת בעלי החיים ואפשרו להם לשתות בחופשיות עד לזמן הגילוי.

4. בדיקת מעבר במערכת העיכול

  1. יש לתת 200 מיקרוליטר של תמיסת FITC-דקסטרן (5 מ"ג/מ"ל ב-PBS) לעכברים שצמו במשך 22.5 שעות לאחר הניתוח (איור 1A).
  2. יש להרדים את העכברים בשיטה שאושרה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC), כגון שאיפתCO2 ואחריה פריקת צוואר הרחם.
    1. כדי לבודד את מערכת העיכול, לבצע חתך קו האמצע מן הסרעפת אל האגן, בזהירות להסיר את רקמות החיבור שמסביב ואיברים.
    2. יש להפריד את מערכת העיכול מהרקמות והאיברים הסובבים אותה, ולהבטיח כי כל מערכת העיכול מהקיבה ועד פי הטבעת כלולה.
  3. חלקו את מערכת העיכול ל-15 מקטעים שווים (מהקיבה ועד המעי הגס), הממוספרים ברצף מ-1 עד 15 בהתבסס על מיקום פיזיולוגי (רצף: St -S1:S10-Ce-L1:L3) (איור 2A).
  4. חותכים כל קטע של רקמת המעי עם התוכן שלה לחתיכות בגודל 1-4 מ"מ ומניחים אותם לתוך צינורות צנטריפוגה נפרדים 1.5 מ"ל המכילים 1 מ"ל של DPBS.
  5. מערבלים את צינורות הצנטריפוגות במשך 10 שניות כדי ליצור הומוגניות של הדגימות.
  6. צנטריפוגה את הצינורות ב 500 × גרם במשך 1 דקה. אסוף את הסופרנאטנט לכימות פלואורסצנטיות של FITC באמצעות קורא מיקרו-לוחות רב-מצבים.
  7. תאר את המעבר במערכת העיכול על ידי חישוב המרכז הגיאומטרי (GC) של FITC-dextran וחשב באמצעות הנוסחה הבאה: (Σ[% FITC לכל קטע x מספר קטע])/100.

5. שיבוץ פרפין וצביעת המטוקסילין ואאוזין (HE)

  1. הרדימו את העכברים על ידי שאיפתCO2 ואחריה נקע צוואר הרחם לאחר 24 שעות. בצע הטבעה פרפין ובדיקות במערכת העיכול על אותה חיה.
  2. פתח את חלל הבטן ואסף רקמת מעי קטנה לניתוח נוסף.
  3. תקן את המעי כולו עם תוכן המעי בקיבוע של Carnoy (60% מתנול + 10% חומצה אצטית + 30% כלורופורם) ב 4 ° C במשך 2 שעות.
  4. נטרלו את החומציות של הרקמה על ידי שטיפה פעמיים עם מתנול במשך 30 דקות בכל פעם.
  5. החליפו מתנול באתנול פעמיים למשך 30 דקות בכל פעם.
  6. נטרלו את החומציות של הרקמה על ידי שטיפה פעמיים עם מתנול במשך 30 דקות בכל פעם. כדי להשיג שקיפות רקמות עם קסילן, לטבול את הרקמה בקסילן ולדגור במשך 1 שעות.
  7. הטמיעו את הרקמה בשעוות פרפין באמצעות מכונה להטמעת פרפין. חותכים את הרקמה המשובצת לפרוסות בעובי 4 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום.
    הערה: חלקו את המעי הדק לשעוות שונות לשיפור הביצועים. תייג כראוי את המקטעים כדי לזהות את מיקומם.
  8. בצעו צביעה באמצעות ערכת הצביעה HE. אטמו את השקופיות ובחנו אותן תחת מיקרוסקופ לצורך ניתוח.

6. בידוד תאי מערכת החיסון וציטומטריית זרימה

  1. הכן את הפתרונות הבאים.
    1. תמיסת קדם-עיכול: הכינו את תמיסת המלח המאוזנת של Hank ללא Ca2+ ו-Mg2+ עם 1 mM dithiothreitol (DTT) ו-10 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
    2. תמיסת עיכול: הכינו תמיסה המכילה 200 מיקרוגרם/מ"ל DNAase I, 500 מיקרוגרם/מ"ל קולגנאז IV, 4% FBS וחיץ HEPES 100 מיקרומטר בסל"ד 1640.
    3. מאגר עבודות מיון תאים מופעל מגנטית (MACS): הכן מאגר המכיל 5 גרם/ליטר BSA ו- 2 mM EDTA ב- PBS ללא Ca2+ או Mg2+.
  2. הסר תוכן צואה על ידי שטיפת המעיים עם מלוחים רגילים. הסר את המדבקות של פייר ואת רקמת החיבור של המעי הדק. חותכים את המעי הדק לפתוח לאורך, ולאחר מכן לחתוך 1 ס"מ מקטעים PBS קר כקרח.
  3. שטפו את מקטעי המעי בתמיסת קדם-עיכול בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות על שייקר מסלולי. לאסוף את הפתרון predigestion ולסנן אותו דרך מסננות תאים 70 מיקרומטר כדי לקבל לימפוציטים intraepithelial (IELs).
  4. עכל את המקטעים בתמיסת העיכול במשך 30 דקות ולאחר מכן סנן את התרחיף דרך מסננות תאים של 70 מיקרומטר כדי לקבל לימפוציטים lamina propria (LPLs).
  5. צנטריפוגו את תאי LPL ב 500 × גרם במשך 10 דקות, ולזרוק את supernatant.
  6. יש לשטוף ולהשהות את התאים עם DPBS (נתרן אזיד, טריס וללא חלבון) בריכוז של 1 x 106 תאים / 100 μL.
  7. דגרו על התאים בצבע פלואורסצנטי (1:500) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) בחושך.
  8. השהה את התאים עם מאגר MACS וצנטריפוגה אותם ב 500 × גרם למשך 5 דקות.
  9. ספור את התאים המוכתמים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. להשהות מחדש את התאים בריכוז של 1 x 106 תאים / 100 μL של מאגר MACS. ביצוע צביעת נוגדנים (1:200-1:400) על ידי הוספת נפח נוגדנים מתאים לתרחיף התא ודגירת 4°C למשך 15 דקות.
  10. שטוף את התאים כמתואר בשלב 6.8.
  11. זהה את הדגימות באמצעות ציטומטריית זרימה ונתח נתונים באמצעות תוכנת ציטומטריית הזרימה המשויכת 7,8.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, POI נגרם בניתוח על ידי מניפולציה במעיים (IM), הדומה להשפעה של ניתוח קליני. בקבוצת הדמה, בוצע חתך ללא IM. עכברי POI הוקרבו 24 שעות לאחר ניתוח POI יחד עם עכברי בקרת דמה. הפונקציה הקריטית של מערכת העיכול, תפקוד מעבר תוכן, זוהתה על ידי gavage של FITC-dextran. מודל POI נחשב מוצלח מאחר שעוצמת FITC עלתה בחלק הפרוקסימלי של המעי הדק (איור 2B). ממוצע GCs חושב כדי לכמת את תפקוד המעבר של IM ולציין את עקביות הפעולה (איור 2C).

צביעת HE הצביעה על המורפולוגיה של מקטעים שונים במערכת העיכול (איור 3). התת רירית ושכבת השריר החלק של התריסריון והאיליאום התנפחו 24 שעות לאחר השראת POI (איור 3A,B). בהשוואה לעכברים דמים, צביעת תריסריון HE חשפה חדירה מוגברת של תאי מערכת החיסון בעכברי POI (איור 3A).

ניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת צבעים הוא השיטה המרכזית לניתוח הפרופורציה, המצב והתפקוד של תאי מערכת החיסון. רקמת המעי עוכלה עם collagenase ו deoxyribonuclease והופרד לתוך תרחיף תא יחיד עבור ציטומטריה זרימה. אסטרטגיית ה-gating שימשה לקביעת הפרופורציות של תאי CD3 T ותת-אוכלוסיות קשורות בין תאי LPL (איור 4A). סמן ההפעלה וההדבקה CD69 והביטוי של תאי CD4 T, תאי CD8 T ותאי gd T מווסתים בעכברי POI (איור 4B)7. באופן דומה, שיעור תת-האוכלוסייה CD44+ PD-1+ (הפעלה, התמיינות סופנית וסמן תשישות) הראה נטייה גוברת (איור 4C)7. בנוסף ללימפוציטים, הפרופורציות של תת-קבוצות תאים מיאלואידים (נויטרופילים, תאים דנדריטיים ומקרופאגים) גדלות גם הן לאחר ניתוח IM (איור 4D)8.

figure-results-1
איור 1: מודל מורין של אילאוס לאחר ניתוח. (A) סכמטי של מודל מורין של אילאוס לאחר ניתוח. (B) קיבוע עכבר לאחר הרדמה וגילוח. (ג) החתך נחשף וכוסה בגזה רפואית סטרילית. (D) צינורות המעי נסחטו מחלל הבטן דרך חתך הבטן ונחשפו על ידי הנחתם על גזה סטרילית. (E) המעי הדק כולו נחשף לצמר גפן סטרילי לח. (F) שכבת השריר נסגרה בתפר כירורגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: בדיקת מעבר במערכת העיכול להערכת תפקוד מערכת העיכול. ב-22.5 שעות לאחר הניתוח, עכברי הדמה או ה-POI קיבלו תמיסת FITC-דקסטרן והוקרבו 90 דקות לאחר מכן. (A) מערכת העיכול חולקה ל-15 מקטעים ומוספרה לפי מיקום פיזיולוגי. (B) עוצמת FITC של כל מקטע ממערכת העיכול של עכברי דמה ו-POI. (C) המרכזים הגיאומטריים של FITC-dextran המנוהל חושבו ומוצגים כחלקות כינור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: צביעה מייצגת של המעי הדק של עכברי POI. HE צביעה של חתכי רוחב של (A) תריסריון ו (B) ileum מעכברי דמה ו- POI. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר או 25 מיקרומטר (תמונה מוגדלת של הכניסה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: אנליזה ציטומטרית של זרימה מייצגת של תאי מערכת החיסון של המעי הדק מעכברי POI. (A) אסטרטגיית גריטת ציטומטריה של זרימה עבור אוכלוסיות תאי T מרקמות מעי קטנות של עכברי POI 24 שעות לאחר הניתוח. (B) הפרופורציות של סמן פעיל תאי T CD69+ בתאי T CD4, תאי T CD8 ותאי T gd מהמעי הדק של עכברי דמה ונקודות עניין. (C) הפרופורציות של סמנים פעילים CD44+ PD-1+ בקרב תאי CD4 T, תאי CD8 T ותאי gd T במעי הדק של עכברי דמה ונקודות עניין. (D) הפרופורציות של נויטרופילים (Ly6G+ CD11b+), תאים דנדריטיים (CD11c + MHC-II+) ומקרופאגים (CD11b + F4/80+) בקרב CD45+ Aqua- תאים חיסוניים חיים מהמעי הדק של עכברי דמה ו- POI. המספר בכל חלונית מייצג את אחוז סוגי התאים המתאימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצלחת הניתוח נשענת על מספר שלבים קריטיים. ראשית, שמירה על עקביות במהלך ניתוח פנימי של המעי (IM) היא הכרחית כדי לגרום לפגיעה נרחבת במעי הדק. לחץ תקין המופעל במהלך הליך IM ואת ההשפעה hyperemic כתוצאה מכך על המעי הם קריטיים להצלחה כירורגית. התצפית של מערכת העיכול כולה הופכת ורודה ומציגה כתמים דימומים אדומים לאחר שפשוף עם צמר גפן שימש אינדיקטור לניתוח מוצלח. בנוסף, הקפדה על כך שערך ה-GC הממוצע יישאר בערך 5 לאחר הניתוח מצביעה על כך שהמודל היה מוצלח בהשוואה לזה של עכברים שנותחו על ידי דמה. בדיקה מיקרוסקופית של נפיחות רקמות בתת-רירית וחדירת תאי מערכת החיסון, כפי שמודגם על ידי צביעת HE, משמשת גם כשלב קריטי באימות חומרת POI.

ייתכן שיהיה צורך בשינויים בפרוטוקול כדי למטב את התוצאות או לפתור בעיות כלשהן שבהן נתקלתם. לדוגמה, כדי להציג במדויק שינויים מורפולוגיים באפיתל המעי, מומלץ להטמיע את רקמת המעי ואת תכולתה באמצעות הקיבוע של קרנוי9. פרוטוקול הטבעה ייחודי זה מבטיח קיבוע מהיר, החיוני לשימור המורפולוגיה של הרקמות. עם זאת, אם מטרות החוקר מתמקדות באפיתל או בלמינה פרופריה, מומלץ להשתמש בטכניקת הגלגול השוויצרית המשופרת להטמעת שעווה של הכנת רקמת המעי10. טכניקה זו דוחסת את interspace של רקמת המעי ומבטיחה כיוון עקבי של villi, להקל על הטבעה של המעי הדק כולו בדגימה אחת משובצת שעווה.

למרות התועלת שלו, לפרוטוקול יש מגבלות. מגבלה אחת היא ההסתמכות על מודלים של בעלי חיים, שעשויים שלא לשכפל באופן מלא את מורכבות הפתופיזיולוגיה האנושית. בנוסף, וריאציות בטכניקה הכירורגית ובתגובות עכבר בודדות עשויות להציג שונות בתוצאות. על פי המחקר האחרון שלנו, שימוש באופרטור עקבי הוא עיקרון חשוב להפחתת השונות תלוית המפעיל. יתר על כן, ואן ואחרים הציגו מכשיר מתוצרת עצמית המסוגל להחיל משקל מסוים על המעי, ולהבטיח לחץ עקבי על IM על פני עכברים שונים11. גישה זו אכן מוכיחה את עצמה כבעלת ערך בשמירה על עקביות המודל.

פרוטוקול זה מייצג תרומה חשובה לתחום על ידי מתן שיטה סטנדרטית לגרימת POI באמצעות ניתוח IM בעכברים. על ידי הבהרת שלבים קריטיים והצעת שינויים להטמעת רקמות ובידוד תאי מערכת החיסון, פרוטוקול זה משפר את יכולת השחזור והאמינות במידול נקודות עניין. שימוש בציטומטריית זרימה 7,8 לאנליזה של תאי מערכת החיסון מאפשר חקירה מקיפה של התגובה החיסונית העומדת בבסיס הפתוגנזה של POI, משלים טכניקות קיימות ומרחיב את הבנתנו את התסמונת המורכבת הזו.

הפרוטוקול המוצג כאן טומן בחובו הבטחה למחקר פרה-קליני עתידי שיתמקד בהבנה ובטיפול בנקודות עניין (POI). על ידי שכלול טכניקות כירורגיות ואופטימיזציה של שיטות עיבוד רקמות, חוקרים יכולים להמשיך לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס פיתוח POI ולזהות מטרות טיפוליות חדשות. בנוסף, תאימות הפרוטוקול עם ציטומטריית זרימה מאפשרת אפיון חיסוני מעמיק, ופותחת אפיקים לחקירת התערבויות מווסתות חיסון שמטרתן להקל על תסמיני POI. בסך הכל, הפרוטוקול מניח את היסודות לקידום הידע שלנו על POI ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות לשיפור תוצאות המטופלים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו אסירי תודה למרכז חיות המעבדה, למכון המחקר הקליני בבייג'ינג ולבית החולים לידידות בייג'ינג על מתן טיפול לבעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח טכנולוגיות מפתח (מס '2015BAI13B09), הקרן למדעי הטבע בבייג'ינג (מס '7232035), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '82171823, 82374190), וחוקרים צעירים מכובדים מבית החולים לידידות בבייג'ינג (מס 'yyqcjh2022-4).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 M HEPESתרמו15630080
APC נגד עכבר I-A/I-E (MHC-II)Biolegend107614
APC נגד עכבר TCRbBiolegend109212
APC/Cy7 נגד עכבר CD4Biolegend100414
APC/Cy7 נגד עכבר Ly6GBiolegend127624
סגול מבריק 421 נגד עכבר CD69Biolegend104545
סגול מבריק 421 נגד עכבר F4/80Biolegend123132
סגול מבריק 785 נגד עכבר/אנושי CD44Biolegend103041
BUV395 נגד עכבר CD8aBD563786
BUV737 נגד עכבר CD3eBD612771
קולגנאז IVסיגמא-אולדריץ'C5138
מיקרוסקופ תרביתCKX53אולימפוס
דאוקסיריבונוקלאז I מלבלב בקר (<חזק>DNase I)סיגמא-אולדריץ'DN25-5G
DL-Dithiothreitol תמיסתסיגמא-אולדריץ'43816-10ML
EDTAסיגמא-אולדריץ'EDS-100G
FITC נגד עכבר CD45Biolegend
FITC-dextran (70 kWM)Sigma-AldrichFD70-100MGבדיקת מעבר במערכת העיכול
HE ערכת צביעהsolarbioG1120
PE נגד עכבר CD11bBiolegend101208
PE נגד עכבר PD-1Biolegend114118
PE/Cy7 נגד עכבר CD11cBiolegend117318
PercollGE (Pharmacia)17-0891-01
Symphony A5 ציטומטר זרימהBD-זיהויומיון של תאים חיסוניים
TribromoethanolSigma-AldrichT48402הרדמה
Varioskan LUXThermoN16699קורא מיקרו-פלטות מולטימוד
זומבי אקווה ערכת כדאיות ניתנת לתיקוןBiolegend423102פלואורסצנטי צבע כדאיות 
147709

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chapman, S. J., Pericleous, A., Downey, C., Jayne, D. G. Postoperative ileus following major colorectal surgery. Br J Surg. 105 (7), 797-810 (2018).
  2. Farro, G., et al. CCR2-dependent monocyte-derived macrophages resolve inflammation and restore gut motility in postoperative ileus. Gut. 66 (12), 2098-2109 (2017).
  3. Wouters, M. M., Vicario, M., Santos, J. The role of mast cells in functional GI disorders. Gut. 65 (1), 155-168 (2016).
  4. Engel, D. R., et al. T helper type 1 memory cells disseminate postoperative ileus over the entire intestinal tract. Nat Med. 16 (12), 1407-1413 (2010).
  5. Schwartz, C., Voehringer, D. Identification of murine basophils by flow cytometry and histology. Methods Mol Biol. 2163, 367-375 (2020).
  6. Funk, E. K., Weissbrod, P., Horgan, S., Orosco, R. K., Califano, J. A. Preclinical experience with a novel single-port platform for transoral surgery. Surg Endosc. 35 (8), 4857-4864 (2021).
  7. Nemoto, S., Mailloux, A. W., Kroeger, J., Mulé, J. J. OMIP-031: Immunologic checkpoint expression on murine effector and memory T-cell subsets. Cytometry A. 89 (5), 427-429 (2016).
  8. Brandi, J., Wiethe, C., Riehn, M., Jacobs, T. OMIP-93: A 41-color high parameter panel to characterize various co-inhibitory molecules and their ligands in the lymphoid and myeloid compartment in mice. Cytometry A. 103 (8), 624-630 (2023).
  9. Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial organization and composition of the mucosal flora in patients with inflammatory bowel disease. J Clin Microbiol. 43 (7), 3380-3389 (2005).
  10. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. J Vis Exp. (113), e54161(2016).
  11. van Bree, S. H., et al. Novel method for studying postoperative ileus in mice. Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 4 (4), 219-227 (2012).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Intestinal ManipulationGastrointestinal MotilityAbdominal SurgeryImmune Cell InfiltrationFlow CytometryHematoxylin Eosin StainingEpithelial Barrier FunctionInflammation Mechanisms

מאמרים קשורים