מאמר זה מציג מדריך לדגימת שישה איברים משמעותיים ומגוונים בקסנופוס בוגר שניתן לגשת אליהם במהירות ובקלות: חדר הלב, אונת הכבד, הלבלב, גופי השומן, הכליות הזוגיות והעור.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
טכניקות לדגימה מהירה של שישה איברים חיוניים בקסנופוס בוגר
במאמר זה
סיכום
תקציר
Xenopus היה אורגניזם מודל רב עוצמה להבנת התפתחות חולייתנים ומחלות במשך יותר ממאה שנים. בעוד שטכניקות ניתוח ודיסקציה ניסיוניות של העובר תועדו היטב, תיאורים של מבנים ואיברים בוגרים של קסנופוס , יחד עם טכניקות לעבודה עם מבוגרים, לא עודכנו כדי לקחת בחשבון את הדרישות של גישות מודרניות כגון פרוטאומיקה כמותית ושעתוק חד-תאי. הפרספקטיבות של סוג התא ושל הגנים דורשות תצפיות מנוגדות בשלבים עובריים לאלה שברקמות בוגרות. איברי הזחל עוברים שינויים משמעותיים במבנה הכללי, במורפולוגיה שלהם ובמיקום האנטומי שלהם לאורך כל המעבר של הזחל לבוגר, בעיקר במהלך עיצוב מחדש של מטמורפוזה מסיבית. קביעת סטנדרטים חזקים לזיהוי ונתיחת איברים היא חיונית כדי להבטיח שמערכי נתונים הנובעים ממחקרים שבוצעו במעבדות שונות יוכלו להיות עקביים. הפרוטוקול הנוכחי מזהה שישה מהאיברים בקסנופוס הבוגר, ומדגים שיטות לדיסקציה ודגימה של חדר הלב, הכבד, גוף השומן, הלבלב, הכליה הזוגית והעור של הקסנופוס הבוגר. בהתאם לשיטות השימור, האיברים המנותחים יכולים לשמש לפרוטאומיקה כמותית, שעתוק תא בודד/גרעינים, הכלאה באתר , אימונוהיסטוכימיה, היסטולוגיה ועוד. פרוטוקול זה נועד לתקנן את דגימת הרקמות ולהקל על חקירות רב-מעבדתיות של מערכות האיברים הבוגרים.
מבוא
למרות ש"הדיסקציה הדיגיטלית" של קסנופוס בוגר זמינה1, דגימת איברים ורקמות הניתנים לשכפול של קסנופוס בוגר נותרה מאתגרת ללא ההוראה המפורטת הזמינה עבור מודלים בוגרים אחרים (למשל עכברים 2,3,4). מאמר זה נועד לספק הנחיות ברורות לדגימת איברים מדויקת וניתנת לשכפול של קסנופוס בוגר בדומה למה שזמין כיום עבור הזחלים שלהם5. דגש מושם על קלות ההשלמה כדי לשמור על טריות מקסימלית ולהנגיש את הפרוטוקול לכל המשתמשים.
למרות שיש מדריך דיסקציה יסודי עבור Rana sp.6, כמו גם מדריכים רבים לנתיחה בכיתה עבור anuransאחרים 7, אין מדריך דיסקציה ודגימה של Xenopus זמין כרגע. עבור אלה שאינם מכירים שיטות דגימה או אנטומיה של דו-חיים, ההבדלים הקטנים בין Xenopus לבין אנוארים אחרים הופכים משאבים אלה לתת-אופטימליים עבור דגימת רקמות הניתנת לשכפול.
רקמות יקרות ערך רבות אינן כלולות ואף מושלכות במדריך הנוכחי; זאת על מנת להבטיח רעננות רקמות. שש דגימות מוגבלות מספיק כדי להבטיח שניתן יהיה לאסוף רקמות אלה תוך פחות משעה לאחר שהלב מתחיל לפעום, ללא קשר לניסיון או לרמת המיומנות של המשתמש. מדריכים מתקדמים ומפורטים יותר לאיסוף רקמות רבות אחרות נמצאים בהכנה כניירות נלווים נפרדים.
למשתמשים פחות מנוסים, מומלץ תמיד לנסות תחילה פרוטוקול זה על בעלי חיים המורדמים מסיבות שאינן ניסויים לפני דגימת בעלי חיים מאתגרים להחלפה (למשל, טרנסגניים, בעלי חיים בגיל מתקדם וכו'). באופן אידיאלי, כל בעלי החיים שנדגמו יהיו בריאים, ואם נקבה, לא היו מבייצים בשבועיים האחרונים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בוצעו בהתאם לכללים ולתקנות של בית הספר לרפואה של הרווארד IACUC (הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים) (IS 00001365_3). התוצאות המייצגות מוצגות הן עבור זכר לבקנים בוגר והן עבור זכר לבקנים בוגר שאינו מחורר.
1. הכנה ניסיונית
הערה: אם מתבצע פרוטוקול זילוח8 לפני הדגימה, דלג לשלב 2.2.
- ודא שמוסד המחקר אישר את טכניקת המתת החסד המתוארת בפרוטוקול זה.
- הכינו תמיסה של 5 גרם/ליטר MS-222 (טריקאין מתאן-סולפונט) ו-5 גרם/ליטר סודיום ביקרבונט (ראו טבלת חומרים). הנפח חייב להיות גדול מהנפח הדרוש כדי לכסות את בעלי החיים המומתים לחלוטין. בדוק את ה- pH כדי לוודא שהוא ≥7.
- לבצע המתת חסד ראשונית על ידי הצבת Xenopus בתמיסת המתת חסד; בעל החיים יישאר שקוע במשך שעה אחת בסך הכל.
- הגדר את תחנת הדיסקציה כך שמיד לאחר הדגימה, ניתן יהיה לשטוף את כל הרקמות ב- PBS מקורר או 0.7x PBS9 (בהתאם לצרכי הניסוי), לבדוק ולקצץ תחת אור הגדלה פי 5 (או יותר). עמדה זו חייבת גם לאפשר למשתמש להחליף את כל המלקחיים והמספריים או לנגב אותם בין שימושים.
- לאחר שהצפרדע הייתה בתמיסה במשך שעה אחת, המתת חסד ראשונית הושלמה. הסר את הצפרדע ובדוק את אובדן תגובת הכאב על ידי ביצוע צביטה ברגל.
- רשום את הפרטים המתאימים לבעל החיים, כגון מין, זן, מין, גיל ומצב בריאותי, כמו גם אם הוא היה מחורר. שקול את ה- Xenopus ובצע מדידות נוספות, כגון אורך פתח החוטם.
- הניחו את הצפרדע על גבה והצמידו את הגפיים באופן פרוקסימלי לגוף (איור 1).
- בעזרת מספריים דיסקציה, לחתוך דרך העור, במעלה קו האמצע, ולאחר מכן לרוחב, עושה שני דשים.
- בהתייחס לאיור 2, זהו את linea alba והשתמשו במלקחיים כדי לתפוס אותו ולמשוך אותו הרחק מהחלל הקואלומי. חותכים דרך השרירים בזהירות באמצעות מספריים. צור שני דשים מקיר החלל. גזור או נעץ את כל הדשים מהדרך.
- זהה את הלב שעדיין פועם. השתמשו במספריים מנתחים כדי להקטין את עצמות הקוראקואיד (איור 2) כדי לקבל גישה טובה יותר ללב.
הערה: אם הלב הפסיק לפעום לפני הדגימה, יש לציין כי טריות הדגימה נפגעה.
2. דגימה
הערה: אם בעל החיים היה מחורר, דלג לשלב 2.2.
- זהו את קרום הלב הדק ומשכו אותו מתוח בעזרת מלקחיים רקמתיים (איור 3).
- באמצעות קצה מספריים iridectomy, בעדינות לנקב את קרום הלב, נזהר לא לחתוך את הרקמות הבסיסיות. מקלפים את קרום הלב הרחק משלושת חדרי הלב.
- השתמשו במלקחיים כדי לתפוס את החדר לפי הקודקוד, לזהות היכן הוא מתחבר לגזע האאוריקלי ולגזע העורקי (איור 4), וחתכו אותו מתחת לחיבורים האלה (איור 5). במידת הצורך, חתכו את החדר כך שלא יראו רקמות מהאוריקלים או מגזע העורק, ורקמת שסתום בהירה עדיין תיראה בתוך החדר.
הערה: בבעלי חיים שאינם מחוררים, הסרת החדר עשויה להיחשב כהמתת חסד משנית. - 3 האונות של הכבד ייראו (איור 6 ואיור 7). אחזו בשפה של האונה השמאלית (מימין לצופה) והרימו אותה בעדינות כך שצינורות הכבד והציסטיק יהיו גלויים לעין (איור 8). דגמו את 1/3 האונה התחתונה מתחת לקבצים המצורפים האלה (איור 9).
- כדי לקבל גישה טובה יותר לרקמות של צפרדע נקבה, כדאי להסיר את השחלה. זהה את השחלה אשר עטופה בשכבה של הצפק הקרבי הנקרא אפיתל הנבט. הזיזו בעדינות את האונות עד שהן נמצאות בצדדים שלהן כדי להפוך את אזור החיבור לגלוי (איור 10). חיבורים אלה הם גחונים ישירות לכליה הזוגית.
- בעזרת מספריים, הסירו את השחלות קרוב ככל האפשר לכליות מבלי לפגוע בהן (איור 11).
- בדקו את האונה האמצעית (שנקראת גם האונה הקדמית) של הכבד ושימו לב כיצד היא מתחברת לקיבה ולתריסריון דרך המזנטריה וצינור הפטופנקריאטי (שנקרא גם צינור המרה המשותף) (איור 6, איור 7 ואיור 8).
- לנתק את הרצועה mesentery, hepatoduodenal באמצעות מספריים iridectomy, כמו גם את צינור hepatopancreatic שבו הוא פוגש את התריסריון. נתקו את החיבור של הלבלב וצינור הכבד לאונה האמצעית של הכבד כך שלא תצורף רקמת כבד כהה (איור 12).
- אחוז את הבטן עם מלקחיים שיניים ואת הקצה העליון של הלבלב עם מלקחיים רקמות. תחת הגדלה של פי 5, הרחיקו בעדינות את הלבלב מהקיבה (איור 13).
הערה: אם הוא לא יוצא בצורה נקייה, רקמת הלבלב הנותרת תהיה גלויה וניתן לקטוף אותה בשברים. לחלופין, ניתן לנתק את הלבלב באופן שיטתי באמצעות מספריים אירידקטומיים ומלקחיים רקמות. - בהתייחס לאיור 14A, זהו את שלפוחית השתן והוציאו אותה, תוך חיתוך קרוב ככל האפשר לקלואקה. השליכו את הרקמה הזו.
- בהתייחס לאיור 14B, זהו את המעי הגס ומשכו אותו מתוח כדי לנתק את המעי הגס קרוב ככל האפשר לקלואקה. הסר והשליך את כל תעלת alimentary, ניתוק הצפק שבו הוא מתחבר לטחול. הגופות השמנות יהיו כעת נגישות במלואן.
- להקניט את הגופים השמנים כך שהם יהיו בצד שלהם. האזור מעל הכליה, שבו גוף השומן מתחבר לצפק, יהיה גלוי. אחזו בבסיס גוף השומן השמאלי (מימין לצופה) והשתמשו במספריים כדי לחתוך אותו מהצפק, תוך השארת שוליים קטנים כדי שהכליה לא תיפגע (איור 15).
- הסר והשלך את הגוף השמן שנותר. הכליות הזוגיות יהיו כעת גלויות במלואן.
- אצל נקבות צפרדעים או זכרים עם שרידי אובידוקט מובהקים, אחזו באובידוקט ומשכו אותו הרחק מהכליה ומהקלואקה (איור 16). חותכים את האובידוקט במקום שבו הוא פוגש את הקלואקה וממשיכים למשוך אותו הרחק מהכליה, חותכים את כל החיבורים הצפקיים הברורים כשהם מתגלים. השליכו את הרקמה הזו.
- חזור על תהליך זה עם האובידוקט הנותר.
- הכליות עדיין מכוסות בצפק שקוף (retroperitoneal)10. השתמש במלקחיים כדי לתפוס את הכליות ולנתק את הצפק בקצה התחתון שלהם.
- הרימו את הכליות מהחלל הקואלומי באמצעות מספריים כדי לנתק את הצפק קרוב ככל האפשר לכליות מבלי לפגוע בהן (איור 17).
- תחת הגדלה של פי 5, יש לחתוך את עודפי הצפק וכל רקמה אחרת שנותרה (גופי שומן, טחול). אם הצפרדע נקבה, יש לוודא שכל רקמת השחלה שנותרה מוסרת (איור 18). אם הצפרדע זכרית, הסירו בזהירות את האשכים ובדקו אם יש שריד של ביצית, שייתכן שלא ייראה לעין ללא הגדלה (איור 19).
- הסר את הסיכות מהחיה, הפוך אותה על הגחון שלה, ונעץ מחדש את גפיו של החיה.
- בחר אחת מהגפיים האחוריות כדי לדגום ממנה ולהצמיד את כף הרגל של איבר זה.
- הסירו דש עור בצורת שקד מעל הגסטרוקנמיוס/טיביופיבולה (איור 20).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
על-ידי שימוש באיור 1 עד איור 20 וביצוע כל השלבים של פרוטוקול זה, חדר הלב, האונה השמאלית של הכבד, הלבלב, גופי השומן השמאליים, הכליות הזוגיות ודש העור נכרתו באופן נקי תוך שעה מהמתת חסד. בתוך הזמן הזה, הדגימות נשטפות ונחתכות כך שהן יופיעו, כפי שמוצג באיור 21.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מכיוון שפרוטוקול זה נועד למקסם את הטריות, דגימות מסוימות עשויות לכלול רקמות לא רצויות. לדוגמה, צינור hepatopancreatic וכמה mesentery נדגמים עם הלבלב, וכמה רקמת הצפק, בלוטות יותרת הכליה, שופכנים תמיד יידגמו עם הכליות זוג. אם טריות אינה מהווה דאגה, ניתן להשיג דגימה מדויקת יותר באמצעות טכניקות מותאמות.
המראה והמיקום של איברים דומים בין המינים והמינים של Xenopus. עם זאת, צבע הרקמות משתנה באופן משמעותי בהתאם לשאלה אם בעלי החיים היו מחוררים או לא. מסיבה זו נכללות תמונות של בעלי חיים מחוררי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי R24OD031956 מענק OD של NIH. אנו מודים לסמנתה ג'לברט, ג'יל רלסטון וקורה אנדרסון על עזרתן ותמיכתן, כמו גם לעורך ולמבקרים עמיתים אנונימיים על המשוב המועיל שלהם
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| זכוכית מגדלת 5x עם נורת LED ומעמד | amazon.com | אסור לאור B08QJ6J8P1 לייצר חום | |
| צנרת העברה חד פעמית | VWR | 414004-036 | |
| ניתוח מלקחיים מחודדים עדינים | פישר Scinetific | 08-875 | |
| ניתוח: מספריים ניתוח, ישר 6.5 אינץ' | VWR | 76457-374 | |
| מגש חיתוך | של פישר Scinetific | 14-370-284 | הן אלטרנטיבה מקובלת |
| מיכל המתת חסד | ארה"ב פלסטיק | פריט 2860 | מיכלים אטומים חלופיים |
| מכסה מיכל המתת חסד | ארה"ב פלסטיק | פריט 3047 | |
| מספריים לכריתת אירית 6 " | vwr | 470018-938 | מספריים לקשתית הם אלטרנטיבה מקובלת |
| MS-222: סינקאין (לשעבר טריקאין) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | קורנינג | 21-040-CV | |
| נתרן ביקרבונט, אבקה, USP | פישר סיינטיפיק | 18-606-333 | |
| מלקחיים לדגימה, | VWR | 82027-442 | |
| פיני T לניתוח | פישר Scinetific | S99385 |
מקורות
- Porro, L. B., Richards, C. T. Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography. J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).
- Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).
- Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
- Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. Xenopus tadpole tissue harvest. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), 097675(2017).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Dissection of a Frog (Rana sp.). Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).
- O'Rourke, D. P. Amphibians used in research and teaching. ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Effective rapid blood perfusion in Xenopus. JoVE. (issue), e65287(2023).
- Balls, M., Worley, R. S. Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus. Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).
- Holz, P. H., Raidal, S. R. Comparative renal anatomy of exotic species. Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).
- Trott, K. A., et al. Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis). Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).
- Fremont-Rahl, J. J., et al. Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs. Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).
- Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).
- Vitt, L. J., Caldwell, J. P. Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol. Herpetol. , 35-81 (2009).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
