למחברים אין הצהרות גילוי לנשוא.

יישומים microfluidic עבור אבחון פנויה

Microfluidic Applications for Disposable Diagnostics

בראיון זה, ד&quot;ר Klapperich דן תרמופלסטיים ייצור של מכשירים microfluidic ויישומם לפיתוח של כלי אבחון חדשים.

יישומים Microfluidic עבור אבחון פנויה

בראיון זה, ד"ר Klapperich דן בייצור של התקני מיקרופלואידיקה תרמופלסטיים וביישומם לפיתוח של ...

שמי קתרין קלאודברידג' (Catherine CloudBridge) ואני פרופסור לייצור, הנדסה והנדסה ביו-במדית באוניברסיטת בוסטון. כמו כן, אני מנהלת את המעבדה למכשירים ביו-במדיים זעירים וסביבות מיקרו. אנו עוסקים בעיקר בפיתוח אמצעי אבחון חד-פעמיים ליישומים בסביבות עם משאבים מוגבלים.לכן אנו משתמשים במיקרופלואידיקה כדי לייצר את ההתקנים הללו. אנו מעוניינים למעשה בשני תחומי מחקר. בראש ובראשונה, אנו מעוניינים לבחון כיצד ביו-מולקולות ותאים מגיבים למשטחי פולימרים פלסטיים.זוהי מסגרת העל המרכזית שלנו. עבודה זו באה לידי ביטוי ביישומים מיקרופלואידיים לאבחונים חד-פעמיים. לכן, במעבדה, אנו מייצרים התקנים מיקרופלואידיים.בחומרים תרמופלסטיים איננו משתמשים, בדרך כלל, ב-PDMS, שהוא החומר הגומי שרוב האנשים משתמשים בו כדי ליצור מערכות מיקרופלואידיקה במעבדה. אנו מייצרים את המכשירים שלנו מחומרים תרמופלסטיים. אנו מעוניינים להשתמש במכשירים תרמופלסטיים אלה כדי לבצע ביולוגיה מולקולרית בקנה מידה מיקרוסקופי, באופן שיאפשר ביצוע של ביולוגיה מולקולרית בשטח, הרחק ממעבדה מרכזית.האופן שבו זה מיושם במעבדה הוא שאנו מייצרים כרטיסי פלסטיק קטנים, ובתוך כרטיסים אלו נמצאות עמודי מיצוי פאזה מוצקה (solid phase extraction), עמודי ליזיס של תאים או עמודי ערבוב. אנו מבצעים גם תגובת שרשרת פולימראז (polymerase chain reaction) על השבב כטכניקת זיהוי. כל הרכיבים הללו מאוגדים למכשיר קטן שבטווח הרחוק של המחקר יהפוך למכשיר אינטגרטיבי שניתן יהיה להחזיקו ביד ולהוציאו לשטח או לסביבות שבהן מעבדה רחבת היקף, עם כל מכשירי הסנטריפוגה, האינקובטורים לחימום וכדומה, לא תהיה זמינה.לכן, השאיפה שלנו היא להיות מסוגלים להתחיל מדגם אנושי, כגון דם, שתן, צואה או למשל סוואב נזופרינגיאלי, שיהיה מורכב מרירי. ובמוצא של השבב לקבל תשובה, כן או לא, האם אדם נגפה במיקרואורגניזם מסוים. אנו עושים זאת על ידי חיפוש ה-DNA או ה-RNA של אותו מיקרואורגניזם ספציפי, תלוי בסוג המיקרואורגניזם, בתוך דגימת המטופל.לפיכך, האתגרים הטכניים שמתעוררים נמצאים בעיקר בצד של הכנת הדגימה במשוואה זו. כאשר מתחילים עם דם, צואה או שתן, עליך להגיע ממצב שבו יש לך דגימה אנושית מורכבת, המכילה כמות גדולה של חלקיקים פוטנציאליים או מעכבים של PCR או של טכניקות הגברה אחרות, למצב שבו בסוף התהליך תהיה דגימה נקייה מאוד של חומצות גרעין שחולצו, שניתן להשתמש בהן להגברה או לחיפוש אחר DNA או RNA ספציפיים שיעידו אם המיקרואורגניזם שאתה מחפש היה נוכח.כדי לנקות את הדגימות הללו, יש לבצע מספר פעולות. ראשית, יש לסנן את הדגימה, תהליך אשר בהתאם לסוג הדגימה, עשוי לכלול סינון גס או שלב של סבב מהיר (spin) לפני שהדגימה מועברת לשבב. לכן, אנו תמיד שואפים להתחיל עם הדגימות כפי שהן מתקבלות מהקליניקאי.לכן, עבור דגימות שתן, צואה ומטוחי נזל-לוע, המטרה שלנו היא שהקליניקאי פשוט יבצע את עבודתו כפי שהוא רגיל ויגבה את הדגימה כפי שהוא רגיל. לאחר מכן, אנו לוקחים את הדגימה ומניחים אותה על השבבים. לפיכך, אם נדרש סינון נוסף בשלב זה, הסינון יתבצע בתוך השבב.השלב השני כולל, מכיוון שאנו מבצעים בדיקות מולקולריות, את הצורך בליס (lyse) של התאים והמיקרואורגניזמים הנמצאים בדגימה זו. לכן אנו מבצעים שלב ליסיס, הכולל בדרך כלל דחיפה של הדגימה דרך מסנן בעל נקביות קטנות. לעיתים המסנן מכיל גם ננו-חלקיקים כגון ננו-צינוריות פחמן, בעלות קצוות חדים, שיכולים לשמש לפירוק של חלק מהאורגניזמים בעלי דפנות תאים עמידות יותר כמו C difficile, שהיא חיידק גרם-חיובי שאיתו אנו עובדים והוא קשה מאוד לליסיס.לכן עלינו להשתמש בעמודי ליזיס עמידים יותר. אך בדרך כלל אנו מבצעים ליזיס כימי ומכני משולב בתוך השבב. לאחר מכן, מטרתנו היא לקחת את הליזט ולאחר מכן להוציא את החומצות הגרעיניות המזוהות.כעת אנו מעבירים את הליזאט על פני עמודת מיצוי פאזה מוצקה (solid phase extraction column) המשובצת בשבב המיקרופלואידי. עמודת מיצוי פאזה מוצקה זו עשויה מפלסטיק ומיוצרת באמצעות כימיה בעירור פוטו-כימי בתוך התעלה המיקרופלואידית לאחר שהיא כבר יוצרה. בנוסף, היא ספוגה בדרך כלל בחלקיקי סיליקה, מכיוון שאנו מעוניינים לקשור ולשחרר חומצות גרעיניות.במקרים מסוימים, שילבנו גלובוליות oligo DT אם ברצוננו לקשור ולשחרר mRNA באופן ספציפי, למשל, או גלובוליות הנושאות נוגדנים ספציפיים, אם ברצוננו לקשור ולשחרר חלבונים מסוימים. ואנו יכולים להכין עמודי מיצוי המבצעים את כל הפעולות הללו. אך היום נראה לכם כיצד להכין את עמוד המיצוי של sase עם גלובוליות סיליקה.לאחר שביצענו זאת, מעבירים את הליזט דרך עמודת הסיליקה; התהליך עובד בדיוק כפי שעובד ערכה של Qiagen במעבדה בקנה מידה מאקרוסקופי. לאחר מכן נבצע שטיפה כדי להסיר את כל שאר הרכיבים שאינם רצויים, את כל הפחמימות, הליפידים וחומרים אחרים הנמצאים בליזט התאי ובשאר הדגימה האנושית שאיננו מעוניינים בהם. ובסוף התהליך, נבצע אלוציה באמצעות מים.והיתרון בעמודי מיסור של פאזה מוצקה (solid phase extraction) במיקרו-קנה מידה הוא שניתן לבצע אלucia עם כמות קטנה מאוד של מים, בדרך כלל בסדר גודל של 1 עד 5 µL. אנו מקבלים בחזרה כמעט את כל החומצות הגרעיניות שהכנסנו. קצב היעילות הוא כ-70% עד 90% ב-10 µL הראשונים שאנו מקבלים בחזרה מהתעלה הזו.לכן, אם נבצע שטיפה כפולה עם 2 עד 10 µL, נקבל בחזרה כמעט את כל החומצות הגרעיניות שהכנסנו. כך מקבלים לא רק דגימה נקייה שניתן להריץ לה PCR, אלא גם דגימה בריכוז גבוה בהרבה מזה שניתן להשיג באמצעות ערכה סטנדרטית לשולחן המעבדה. המטרה הסופית של כל טכניקות הכנת הדגימות הללו היא ליצור תוצרים התואמים לחלק מהעבודות האחרות שבוצעו בתחום.עבודה מרשימה מאוד בתחום, המראה שניתן לבצע הגברת PCR על גבי שבב. ניתן לבצע את תגובת ה-reverse transcriptase על גבי שבב אם אתם עוסקים בנגיף RNA או אם ברצונכם לבצע ניסוי של ביטוי גנים. ניתן לשלב את טכניקות הכנת הדגימות שלנו ישירות עם PCR על גבי שבב, כך שלא תצטרכו לבצע אף אחד משלבי הניקוי וההכנה של הדגימה על השולחן.בנוסף, ישנו שלב הריכוז שעליכם לבצע כדי להשיג את הנפחים הזעירים הדרושים לביצוע PCR רב-מיקוד (multiplexed PCR) על שבב קטן. לכן, הניסויים שנציג בפניכם היום ידגימו כיצד אנו מרכיבים את השבב המיקרופלואידי, העשוי מתרמופלסטי ולא מ-PDMS. לכן, הוא דורש תהליך ייצור שונה מעט מהמקובל, וכן נראה כיצד שבבים אלו נסגרים.ולאחר מכן כיצד אנו מבצעים את הכימיה בהשראת אור בתוך השבב כדי ליצור את המונולית הפולימרית המשמשת הן לליזיס של תאים והן לחילוץ פאזה מוצקה. ובסוף תהליך זה, שכרגע מדובר בתהליכים מודולריים במעבדה, אך הם יכולים ולהיושמו באופן אינטגרטיבי, תתקבל דגימה מרוכזת מאוד של חומצות גרעיניות, RNA ו-DNA במים, שיכולה לעבור לאחר מכן למודול PCR או למודול הגברה אחר שבו ניתן לבצע זיהוי של מיקרואורגניזם או זיהום. למעשה, יש לנו מענק שאנו עובדים עליו כעת, שבו התחלנו לאסוף דגימות אנושיות מהמרכז הרפואי של בוסטון מחולים שייתכן שהם נגועים בשפעת A או שלא. כיוון שזו עונת השפעת, אלו הן הדגימות שאנו אוספים.ואז במעבדה, אנו מבצעים את בדיקות ה-gold standard כדי לבדוק אם אדם נגוע ב-Influenza A, שזוהי בעיקר בדיקת תרבית, אשר לביצועה נדרשים מספר ימים. ובמקביל לכך, אנו מעבירים את הדגימות הללו דרך המודולים של השבב שלנו. אנו מעבירים אותן דרך עמודת הליזיס, דרך עמודת מיצוי הפאזה המוצקה (solid phase extraction), ולאחר מכן אנו מבצעים את ה-PCR כדי לבחון את רמת הביצועים שלנו בהשוואה לשיטות ה-gold standard.זהו השלב שבו אנחנו נמצאים כעת. אם ניסויים אלו יצליחו, אני חושב שבמהלך ארבע עד שש השנים הבאות, אולי נגיע למצב שבו יהיה לנו שבב משולב ובדיקה מלאה עבור influenza A, ובנוסף אנו עובדים על clostridium difficile ודגימות צואה. ואנחנו גם קרובים מאוד לא רק לשילוב המכשיר, אלא גם לשילוב הבדיקה.לפיכך, פיתוח הבדיקה ותכנון השבב חייבים להתרחש במקביל. עבור יישום מסוים, במטרה להגיע לשימוש במיטת החולה, מדובר בתהליך המכוון למטרה. עליך להכיר את הדגימה ממנה אתה מתחיל ואת המיקרואורגניזם שאתה מחפש כדי לבצע אופטימיזציה לשבב לצורך שימוש במיטת החולה.אז אני, אני לא חושב שאנחנו רחוקים כל כך מלהוציא את זה אל הפועל כפרוטוטיפ. אלו הן מטרות הסוף שלנו, כך שאני מקווה שנגיע לשם.

microfluidic-applications-for-disposable-diagnostics

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Boston University.  בראיון זה, ד"ר Klapperich דן תרמופלסטיים ייצור של מכשירים microfluidic ויישומם לפיתוח של כלי אבחון חדשים.

בראיון זה, ד"ר Klapperich דן תרמופלסטיים ייצור של מכשירים microfluidic ויישומם לפיתוח של כלי אבחון חדשים.

יישומים Microfluidic עבור אבחון פנויה

במאמר זה

סיכום

תקציר

גילויים

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות