מאמר שיטה

התמיינות ואפיון אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

DOI:

10.3791/66527

⸱

22 במרץ 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Department of Medicine, University of Washington, 2Department of Orthopedics and Trauma Surgery, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג את ההתמיינות של אוסטאוקלסטים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) ומתאר שיטות לאפיון אוסטאוקלסטים ומבשרי אוסטאוקלסט.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט את ההתפשטות וההעברה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ואת התמיינותם לאוסטאוקלסטים. ראשית, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מנותקים לתרחיף חד-תאי לשימוש נוסף בהשראת גוף עוברי. לאחר השראת מזודרמיס, גופים עובריים עוברים התמיינות המטופויטית, ומייצרים אוכלוסיית תאים המטופויטיים צפה. לאחר מכן, התאים ההמטופויטיים שנקטפו עוברים שלב הבשלה של גורם מגרה מושבת מקרופאגים, ולבסוף התמיינות אוסטאוקלסט. לאחר התמיינות אוסטאוקלסט, אוסטאוקלסטים מאופיינים על ידי צביעה עבור TRAP בשילוב עם כתם גרעיני ירוק מתיל. אוסטאוקלסטים נצפים כפוליקריוני TRAP+ מרובי גרעינים. זיהויים יכול להיות נתמך עוד יותר על ידי צביעת Cathepsin K. בדיקות ספיגת עצם ומינרלים מאפשרות אפיון פונקציונלי, המאשר את זהותם של אוסטאוקלסטים בתום לב. פרוטוקול זה מדגים שיטה חזקה ורב-תכליתית להבדיל אוסטאוקלסטים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ומאפשר אימוץ קל ביישומים הדורשים כמויות גדולות של אוסטאוקלסטים אנושיים פונקציונליים. ניתן לחזות יישומים בתחומי חקר העצם, חקר הסרטן, הנדסת רקמות ומחקר אנדופרוטזה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוסטאוקלסטים (OCs) הם סוגי תאים רב-תכליתיים 1,2 שמקורם בהמטופויאטיים, הנמצאים בשימוש נפוץ על ידי חוקרים בתחומים כגון חקר מחלות עצם 3,4, חקר הסרטן 5,6, הנדסת רקמות 7,8 ומחקר אנדופרוטזה 9,10. אף על פי כן, התמיינות OC יכולה להיות מאתגרת מכיוון שמיזוג של מבשרי מונו-גרעיניים לתוך OCs מרובי גרעינים הוא הכרחי כדי ליצור OCs11 פונקציונליים. מספר גורמים ביולוגיים, כגון מפעיל קולטן של ליגנד NF-κB (RANKL) וגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF), נחוצים להתמיינות OC. M-CSF דווח כבעל השפעה חיובית על התפשטות תאים, הישרדות תאים וביטוי RANK 12,13,14. מצד שני, RANKL נקשר ל- RANK, אשר מפעיל מפל איתות במורד הזרם המשרה אוסטאוקלסטוגנזה. ההפעלה מתווכת באמצעות גורם 6 הקשור לקולטן TNF (TRAF6), המוביל לפירוק הגורם הגרעיני של משפר הגן פוליפפטיד קל קאפה במעכב תאי B, אלפא (IκB-α), חלבון קושר הקושר דימרים NF-kB16,17. לפיכך, התפרקות IκB-α משחררת דימרים NF-kB, אשר לאחר מכן עוברים טרנסלוקציה לתוך הגרעין וגורמים לביטוי של גורמי השעתוק c-Fos וגורם גרעיני של תאי T מופעלים 1 (NFATc1). זה, בתורו, מפעיל את השעתוק של מספר רב של חלבונים הקשורים התמיינות OC15,18. חלבונים מווסתים כגון DC-Stamp ו-Atp6v0d2 מתווכים איחוי תאים-תאים של מבשרי OC, מה שמוביל להיווצרות סינקיטיום 19,20,21.

ביחס לתאים ראשוניים אנושיים, CD34+ ו- CD14+ PBMCs הם כיום סוגי התאים הנפוצים ביותר להתמיינות לOCs22. עם זאת, גישה זו מוגבלת על ידי ההטרוגניות באוכלוסיית CD34+ של תאים שנקטפו מתורמים23 ויכולת ההרחבה המוגבלת שלהם. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים מהווים מקור חלופי לOCs. מכיוון שניתן להפיץ אותם ללא הגבלת זמן24, הם מאפשרים הרחבה ושדרוג של ייצור OC. זה מאפשר הבחנה של מספר גדול של OCs, אשר מאפשר מחקר OC.

מספר פרוטוקולים להבחנה של iPSCs ל- OCs פורסמו 25,26,27. ניתן לחלק את כל תהליך ההתמיינות לחלק התפשטות iPSC, חלק התמיינות מזודרמלי והמטופויאטי, והתמיינות OC. התפשטות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לפני תהליך הבידול מאפשרת שדרוג של ייצור המהרה לפני הבידול. קיימות מספר גישות לגבי התמיינות מזודרמלית והמטופויאטית. באופן מסורתי, היווצרות גוף עוברי (EB) שימשה כדי להתמיין תאים hematopoietic, אבל גישות מבוססות monolayer מייצגים אסטרטגיית התמיינות hematopoietic אחרת שאינה דורשת השראת EB. עם זאת, נראה כי מערכות מבוססות מונו-שכבות דורשות אופטימיזציה נוספת, מכיוון שאנו ואחרים מצאנו שגישות מבוססות EB עמידות יותר לבידול של OCs.

במאמר זה אנו מתארים את ההבחנה בין OCs לבין תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים באמצעות פרוטוקול מבוסס EB. פרוטוקול זה הותאם מ- Rössler et al.26 והותאם כדי להגביר את החוסן ולאפשר שימור בהקפאה במהלך תהליך הבידול. ראשית, קצרנו תאים המטופויטיים רק פעם אחת לאחר 10 ימים של התמיינות. תאים המטופויטיים נשמרו אז בהקפאה כדי לאפשר גמישות רבה יותר בתהליך ההתמיינות. בנוסף, הגדלנו את צפיפות זריעת התאים ההמטופויטיים מ-1 x 105 ל-2 x 105 תאים לסמ"ר2 לצורך התמיינות OC. נעשה שימוש בתווך חדש יותר ללא סרום iPSC אנושי (hiPSC-SFM, ראו טבלת חומרים), וציפוי בארות בוצע עם 200-300 מיקרוגרם/מ"ל של תמצית קרום בסיסי (ראו טבלת חומרים) במקום 0.1% ג'לטין. פניצילין/סטרפטומיצין לא נוסף לתקשורת.

הפרוטוקול של Rössler et al.26 הותאם במקור מ-iPSC לפרוטוקול התמיינות מקרופאגים28 המשתמש בהיווצרות EB להתמיינות המטופויטית. בעוד היווצרות EB שימשה במשך זמן ממושך על ידי חוקרים עבור התמיינות hematopoietic29,30, מספר שיטות של אינדוקציה EB תוארו בספרות, כגון צבירה ספונטנית, צנטריפוגה בצלחת באר עגולה תחתית, תרבית טיפה תלויה, תרבית ביוריאקטורים, תרבית צינור חרוט, כלי לרוחב מסתובב לאט, ותרבית ג'ל micromold31. פרוטוקול זה משתמש בצנטריפוגה של iPSCs מנותקים בלוח באר עגול למטה כדי להביא תאי iPSC בודדים לקרבה זה לזה ולאפשר היווצרות כדור (EB), כמתואר להלן.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: ניתן למצוא את כל הריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה בטבלת החומרים. אלא אם צוין אחרת, כל חומרי ההדפסה שוונו מראש ל-37°C לפני השימוש. כל שלבי הצנטריפוגה מבוצעים ב-37°C ובאמצעות מצב האצה/האטה האיטי ביותר. אלא אם כן צוין אחרת, סופרנאטנט מוסר תמיד באמצעות פיפטות זכוכית פסטר חד פעמיות.

1. הפשרה והפצה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים

  1. יום לפני הפשרת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים יש לצפות באר של צלחת בעלת 6 בארות ב-1 מ"ל תמצית קרום בסיסי בריכוז של 200-300 מק"ג/מ"ל. מניחים את צלחת הבאר על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. למחרת, להפשיר ולהעביר את התאים לתוך צינור 15 מ"ל באמצעות פיפטה P1000. Dropwise, להוסיף 5-7 מ"ל של DMEM/F-12 עם 15 mM HEPES.
  3. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הוציאו בעדינות את התאים מהצנטריפוגה, והקפידו לא להפריע לכדורית התא.
  4. הסר בזהירות את הסופרנאטנט עם פיפטה מזכוכית פסטר והשהה מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיום נטול סרום hiPSC (hiPSC-SFM המכיל 10 מיקרומטר של מעכב Rho kinase (ROCK) Y-27632) באמצעות P1000 עם קצוות רחבים.
  5. שאפו את תמצית קרום הבסיס מהמצופה היטב ביום הקודם (שלב 1.1) והעבירו 1 מ"ל של hiPSC-SFM עם 10 מיקרומטר Y-27632 לבאר. הוסף iPSCs מרחפים לבאר כדי להגיע לנפח סופי של 2 מ"ל לכל באר.
  6. סובבו את הצלחת לפיזור שווה של אגרגטי iPSC לפני הכנסתם לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
  7. בצע שינויים בינוניים מלאים אחת ליומיים באמצעות hiPSC-SFM (ללא תוספת של מעכב ROCK Y-27632). iPSCs בדרך כלל מגיעים 70-80% מפגש לאחר 3-4 ימים של התפשטות.

2. iPSCs עוברים

  1. יום אחד לפני העברת iPSCs, מצפים בארות של צלחת 6 בארות עם תמצית קרום בסיסי בריכוז של 200-300 מיקרוגרם / מ"ל. מניחים את צלחת הבאר על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: ודא שהתאים הגיעו למפגש של 70-80% בקירוב. ודא iPSCs לא מקבל overfluent (יותר מ 80% confluency), כמו זה יקדם דיפרנציאציה ספונטנית.
  2. התחל לעבור iPSCs על ידי הסרת אזורים מובחנים או אזורים עם אגרגטים מתים רבים iPSC מתחת לסטריאומיקרוסקופ באמצעות 10 μL או 20 μL פיפטה קצוות או מגרד תאים. אזורים מובחנים ייראו צפופים יותר או לבנים יותר בצבע.
    הערה: צברי תאים מגרדים עשויים עדיין להתחבר חלקית לתחתית הבאר.
  3. שטפו את קרקעית הבאר מספר פעמים עם פיפטה P1000 רחבה כדי להסיר אגרגטים שעדיין עשויים להיות מחוברים חלקית לתחתית הבאר.
  4. השליכו את המדיום המשומש שבו טופחו ה-iPSCs המכיל את אגרגטי ה-iPSC המנותקים. חזור על שלב הכביסה פעמיים נוספות עם מלח חוצץ פוספט (PBS).
  5. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של 5 U/mL Dispase לכל באר. קצוות מושבות iPSC יתרוממו מלוח הבאר, אותו ניתן לצפות תחת המיקרוסקופ הסטריאוסקופי לאחר דגירה של 3-5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. בזהירות להסיר Dispase כדי למנוע עקירה של אגרגטים מנותקים מעט ולהוסיף 1 מ"ל של DMEM/F-12 עם 15 mM HEPES. השתמשו במרים תאים חד פעמי כדי לפרוס את האגרגטים לגדלים קטנים. ניתן לשפר את העקביות של גדלי צבירת iPSC באמצעות כלי העברת תאי גזע.
  7. לשטוף את אגרגטים iPSC פרוס עם המדיום בבאר ולהעביר את המדיום עם אגרגטים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל או P1000 עם קצה רחב משעמם.
  8. שטפו את הבאר עם DMEM/F-12 והעבירו את התווך לצינור של 15 מ"ל עם אגרגטים iPSC.
  9. צנטריפוגה את צברי iPSC פרוסים ב 200 x גרם במשך 3 דקות. הסר את הסופרנאטנט עם פיפטה מזכוכית פסטר והוסף 2 מ"ל של hiPSC-SFM כדי לעקור ולהשהות מחדש את תאי ה- iPSC באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל או P1000 עם קצוות רחבים.
  10. שאפו את שאריות תמצית קרום הבסיס מהצלחת המצופה מראש והוסיפו 1 מ"ל של hiPSC-SFM לכל באר של צלחת 6 הקידוחים.
  11. העבר iPSCs לתוך בארות חדשות של צלחת 6 בארות כך שהנפח הסופי הוא 2 מ"ל של hiPSC-SFM לכל באר באמצעות P1000 עם קצוות משעממים רחבים. בהתאם לקו iPSC, יש למטב את יחסי הפיצול. כאן נעשה שימוש ביחס פיצול של 1:6.
  12. בדוק את הבאר עבור אגרגטים צפים וגודל צבר מתחת לסטריאומיקרוסקופ. באופן אידיאלי, הגודל המצטבר צריך להיות בין 50-200 מיקרומטר.
  13. מערבלים את צלחת הבאר כדי לפזר את התאים באופן שווה על פני הצלחת לאחר העברת האגרגטים ולדגור ב 37 ° C ב 5% CO2 עד 70-80% מפגש.

3. הקפאת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

  1. כדי להקפיא תאי iPSC בחזרה, תאי מעבר כמתואר לעיל (ראה שלב פרוטוקול "2. העברת iPSCs"). לאחר שהתאים נחתכו למושבות ונשטפו מתחתית הבאר (שלב 2.10), סובבו את האגרגטים החתוכים במהירות של 200 x גרם למשך 3 דקות. שאפו את הסופר-נאנט.
  2. הוסף 1 מ"ל של אמצעי שימור בהקפאה ללא סרום לכל באר של צלחת 6 בארות לצינור 15 מ"ל והשהה מחדש את האגרגטים החתוכים באמצעות P1000 עם קצה משעמם רחב.
  3. העבר תאים לתוך cryotubes מסומן מראש. סגור צינורות ולהעביר צינורות לתוך מיכל cryopreservation מראש ב 4 ° C. אחסן תאים ב -80 ° C למשך 24-48 שעות.
  4. העברת קריובלים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
    הערה: סיכום סכמטי של תהליך התמיינות OC מומחש באיור 1.

4. השראת גוף עוברי

  1. לטפח ולהרחיב מספיק iPSCs כמתואר לעיל עבור אינדוקציה EB.
    הערה: ניתן להגדיל את ייצור OC על ידי הגדלת מספר הגופים העובריים, אשר בתורם מייצרים תפוקה כללית גבוהה יותר של תאים המטופויטיים. באר אחת של 70-80% iPSCs מתמזגים מניבה כ 8.4 x 105 תאים לכל באר של צלחת 6 באר. דרושים 12,500 תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים חד-תאיים כדי ליצור גוף עוברי אחד.
  2. שאפו את המדיום המושקע מתרביות iPSC ושטפו את מושבות iPSC עם D-PBS.
  3. הוסיפו 0.5 מ"ל של מגיב דיסוציאציה חד-תאי שחומם מראש לטמפרטורת החדר לכל באר של צלחת בעלת 6 בארות וערבלו את כלי התרבית כך שיצפו את כל משטח הבאר. לדגור על כלי התרבית ב 37 ° C במשך 5-8 דקות.
  4. הסר את כלי הדם מהאינקובטור, שאף מגיב דיסוציאציה של תא בודד, והוסף 1 מ"ל של מדיום התמיינות שלב 1 לבארות, המורכב מתווך נטול סרום hiPSC עם 50 ng/mL חלבון מורפוגנטי של עצם אנושית 4 (hBMP4), 50 ng/mL גורם גדילה אנדותל כלי דם אנושי-165 (hVEGF), 20 ng/mL גורם תאי גזע אנושיים (hSCF), ו-10 מיקרומטר Y-27632.
  5. נתקו תאים בעדינות על ידי שטיפת הבאר בתווך שלב 1. בריכה iPSCs מנותקים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
  6. הוסף 1 מ"ל של מדיום התמיינות שלב 1 לבארות ושטוף את כל התאים שנותרו או השתמש במגרד תאים עבור מושבות שאינן נשטפות בקלות.
  7. לאחר העברת כל התאים לצינור, צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור גלולה התא. שאפו והשעו מחדש את התאים בסך הכל 2 מ"ל של מדיום התמיינות שלב 1 משוקל מראש באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל או P1000 עם קצה משעמם רחב.
  8. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר או מכשיר ספירת תאים אוטומטי. הוסף את התווך לצינור 15 מ"ל המכיל את תרחיף התא הבודד כדי לצלחת 12,500 תאים לכל באר בתחתית עגולה בעלת חיבור נמוך במיוחד 96 בארות צלחת ב -100 מיקרוליטר של מדיום ההתמיינות שלב 1.
    הערה: תחת המיקרוסקופ, תאים יופיעו כתרחיף חד-תאי עם תאים המפוזרים ברחבי הבאר.
  9. צנטריפוגה את לוחות 96 בארות במשך 3 דקות ב 100 x גרם. לאחר הצנטריפוגה, התאים צריכים להתחיל להידמות לספרואידים כאשר מסתכלים עליהם מתחת למיקרוסקופ. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  10. שנה מחצית מהמדיום ביום 1 וביום 2 עם מדיום הבידול שלב 1. כדי לשפר את היעילות, השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להיפטר 50 μL של מדיום התמיינות שלב 1 משומש לתוך צלחת פטרי.
  11. לאחר השלכת המדיום מלוח 96 הקידוחים, בדוק אם יש EBs תחת המיקרוסקופ הסטריאוסקופי שאולי הוסר בטעות. העבר EBs שהוסרו בטעות לצלחת 96 באר באמצעות פיפטה P1000 עם קצוות נשא רחבים.
  12. הוסף 50 μL של מדיום בידול טרי שלב 1 לכל באר של צלחת חיבור 96 באר תחתית עגולה נמוכה במיוחד באמצעות פיפטה רב ערוצית.

5. הבחנה hematopoietic

  1. יום אחד לפני תחילת התמיינות hematopoietic, לצפות באר של צלחת 6 בארות עם 1 מ"ל של תמצית קרום הבסיס בריכוז של 200-300 מיקרוגרם / מ"ל. מניחים את צלחת הבאר על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: כל באר תקבל 8 EBs בנקודה מאוחרת יותר של פרוטוקול זה. בהתאם למספר EBs מוכנים, בארות מעיל בהתאם.
  2. שאפו את עודפי תמצית הממברנה הבסיסית ומלאו מראש בארות של צלחת 6 בארות עם 3 מ"ל של מדיום התמיינות שלב 2, המורכב מתווך בסיסי hematopoietic אליו 2 mM Ultraglutamine, 55 μM 2-mercaptoethanol, 25 ng/mL אנושי interleukin 3 (hIL-3), ו 100 ng/mL אנושי מקרופאג מושבה גורם מגרה (hM-CSF) אנושי.
  3. בעזרת P1000 עם קצוות רחבים, העבירו 8 EBs לכל באר של צלחת 6 הקידוחים. לאחר ההעברה, יש לאשר בעין או מתחת לסטריאומיקרוסקופ כי 8 EBs נמצאים בכל באר.
    הערה: לאחר יום אחד, ה- EBs הצפים ייצמדו לקרקעית הבאר. במהלך 5-7 הימים הבאים, אוכלוסיית תאים צפים המורכבת מתאים המטופויטיים אמורה להיות גלויה. תקופת התמיינות hematopoietic יכול להיות מגוון, החל מ 7 ימים. הבחנה במשך 10 ימים הראתה אוכלוסייה hematopoietic המורכבת מתת-אוכלוסיות גדולות CD45+, CD14+ ו- CD11b+ .
  4. לאחר 5 ימים של טיפול עם מדיום התמיינות שלב 2, בצע שינוי בינוני על ידי הסרת המדיום בילה וניפוקו לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. פיפטה לאט כדי לנסות להסיר כמה שפחות תאים צפים ולשמור על לחץ הגזירה נמוך ככל האפשר. פיפטינג מתחת לסטריאומיקרוסקופ יכול לסייע במניעת הסרה בשוגג של תאים.
  5. מיד להוסיף 1 מ"ל של מדיום דיפרנציאציה שלב 2 טרי לבארות. על מנת לשחזר כל תאים hematopoietic צף כי עשוי להיות כבר נוכח בשלב זה בתהליך ההתמיינות, לא להשליך את המדיום שניתן. במקום זאת, סובבו את הצינור עם המדיום המשומש ב 300 x גרם במשך 5 דקות, ושאפו את supernatant.
  6. הוסף תווך התמיינות טרי שלב 2 לצינור והשהה מחדש על מנת לנתק תאים שאולי הועברו עם התווך המשומש.
  7. הוסף 2 מ"ל של מדיום ההתמיינות הטרי שלב 2 עם התאים המשוחזרים לכל באר, שהיה מלא בעבר ב -1 מ"ל של מדיום ההתמיינות שלב 2.
  8. ביום 10 של התמיינות hematopoietic, לבדוק נוכחות של מספר גדול של תאים hematopoietic צפים. קציר על ידי איסוף אותם בצינור 50 מ"ל. ניתן להקפיא אותם בחזרה ב-10% DMSO, 50% FBS ו-40% בינוני או להשתמש בהם באופן מיידי כדי להתמיין ל-OCs.

6. התבגרות M-CSF ובידול OC

  1. תאי זרע בריכוז של 200,000 תאים לסמ"ק2 על תרבית רקמה מטופלים היטב בצלחות ומטפלים באלפא-MEM, בתוספת 10% FBS ו-50 ננוגרם/מ"ל hM-CSF.
  2. כדי לבצע בדיקות פונקציונליות או הדמיה, נתק את התאים הבשלים M-CSF 3 ימים לאחר הזריעה על ידי שטיפה עם PBS שחומם מראש ל 37 ° C באמצעות P1000 עם קצה בור רחב. ייתכן שיהיה צורך בשלבי שטיפה חוזרים ונשנים כדי לנתק תאים באופן מלא.
  3. מעבירים את התאים המנותקים לצינור של 15 מ"ל באמצעות P1000 עם קצה בור רחב וצנטריפוגה במהירות של 300 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
  4. השהה מחדש והמיס את גלולת התא עם מדיום התמיינות OC, המורכב מאלפא-MEM בתוספת 10% FBS, 50 ng/mL hM-CSF ו-80 ng/mL hRANKL. לספור את התאים באמצעות המוציטומטר או מכשיר ספירת תאים אוטומטי ולזרוע מחדש תאים שהבשילו M-CSF בצפיפות של 200,00-250,000 תאים לסמ"ק2 בכלי תרבית מתאים לבדיקות פונקציונליות או הדמיה (כלומר, בדיקות ספיגת עצם, שקופיות כיסוי להדמיה, וכו ').
  5. להבדיל עם מדיום התמיינות OC במשך 7-9 ימים. בצע שינוי בינוני מלא היטב עם מדיום התמיינות OC טרי כל 2-3 ימים.
    הערה: OCs מרובי גרעינים מופיעים בדרך כלל לאחר 5-7 ימים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניטור מורפולוגיה של התא לאורך תהליך ההתמיינות
כל התוצאות המתוארות להלן נוצרו באמצעות קו MCND-TENS2 iPSC עבור התמיינות OC. קו iPSC זה שימש בעבר במספר מחקרים32,33. עם זאת, קווי iPSC אחרים שימשו בהצלחה גם עם פרוטוקול בידול זה.

הערכה חזותית סדירה מגלה מאפיינים מורפולוגיים שונים ומובחנים של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לאורך תהליך ההתמיינות ל-OCs (איור 2). מושבות iPSC (איור 2A) נותקו לתרחיף חד-תאי, שמופיע כתאים בודדים לאורך לוח הבאר התחתון העגול לפני הצנטריפוגה (איור 2B). לאחר הצנטריפוגה (שלב 4.9 בפרוטוקול), תאים יאספו במרכז פלטת באר החיבור התחתונה העגולה והנמוכה במיוחד, ולאחר מכן ייצרו כדורים (גופים עובריים, EBs, איור 2C). EBs יגדלו פי שניים עד שלושה במהלך תהליך ההתמיינות המזודרמלית (איור 2D) ויהיו גלויים לעין בקלות בסוף תקופת ההתמיינות בת 4 הימים (איור 2E). ניתן לראות EBs נצמדים ומתמזגים עם תחתית צלחת הבאר לאחר ההעברה לבארות של צלחת בעלת 6 בארות לצורך התמיינות המטופויטית (שלב 5.3 בפרוטוקול, איור 2F). לאחר 7-8 ימים, כמויות גדולות של תאים המטופויטיים צפים נראות בתווך התרבית (איור 2G). לאחר קציר וציפוי מחדש של תאים המטופויאטיים, מגיע שלב ההבשלה של M-CSF, ומתחילה התמיינות OC (שלב 6.4 בפרוטוקול). בתוך 5-6 ימים, תאים מרובי גרעינים עם גוף תא גדול ושקוף נראים לראשונה (איור 2H). מספר רב של תאים חד-גרעיניים עדיין נראים בשלב זה. לאחר 2-3 ימים נוספים של התמיינות OC, OCs יתמזגו עוד יותר עם תאים סמוכים כדי ליצור פוליקריונים גדולים עם גרעינים רבים עוד יותר (איור 2I).

הערכת האוכלוסייה ההמטופויטית שמקורה ב- EB
התמיינות המטופויטית יכולה להתבצע למשך זמן משתנה. תקופות זמן המתחילות ב-7 ימים ועד 9 שבועות תוארו בספרות. בפרוטוקול זה, התמיינות hematopoietic מבוצעת לתקופה של 10 ימים. מצאנו ש-10 ימים של התמיינות המטופויטית הניבו מספרים נמוכים של CD34+ מוקדם (0.53%, איור 3A) ומספר גדול יותר של אבות המטופויטיים בשלב הבינוני CD43+ (48.5%, איור 3B). באופן קריטי יותר, כמויות מספיקות של CD45+ (96.2%, איור 3C), CD14+ (33%, איור 3D) ו-CD11b+ (35.9%, איור 3E) HPCs נוצרו לאחר תקופת טיפול של 10 ימים כדי להבדיל אותם בהצלחה לOCs. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להתאים ולמטב את תקופת הטיפול בציטוקינים עבור התמיינות המטופויטית (שלב 5.4 בפרוטוקול) בהתבסס על קו iPSC כדי לייצר כמויות נאותות של תאי CD45+, CD14+ ו- CD11b+ .

בממוצע, 6 מיליון תאים hematopoietic נקצרו לאחר 10 ימים של התמיינות מכל באר עם 8 EBs.

הערכת מורפולוגיה ופעילות OC
לאחר התמיינות OC, OCs ניתן להעריך מורפולוגית ותפקודית. מבשרי OC נזרעים מחדש על שקופיות תא או שקופיות כיסוי לאחר שלב ההבשלה M-CSF כדי לשפר את איכות התמונה בעת צביעה עבור TRAP או Cathepsin K. צביעת TRAP אנזימטית לאחר התמיינות OC מראה OCs גדולים, מרובי גרעינים וחיוביים ל- TRAP (איור 4A). בנוסף, ניתן לראות תאים חד-גרעיניים מעט חיוביים ל-TRAP המשולבים בין OCs רב-גרעיניים. פקדים שליליים ללא תוספת של RANKL אינם מציגים OC רב-גרעיני מאוחה. אף על פי כן, ניתן לתאר מספר קטן של תאים חד-גרעיניים מעט חיוביים ל-TRAP (איור 4B).

תמונות של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) מראות OCs מוכתמים עבור Cathepsin K (טורקיז) ו-F-actin (אדום) בשילוב עם כתם גרעיני DAPI (כחול) (איור 4C, 4D). OCs רב-גרעיניים גדולים נראים לעין כאשר מטופלים ב-RANKL בהתאם לפרוטוקול, אשר מתאר מבנה ציטו-שלד נרחב של F-actin וכתם חיובי עבור Cathepsin K (איור 4C). בקרות שליליות ללא תוספת של RANKL, לעומת זאת, אינן מראות תאים רב-גרעיניים מאוחים.

OCs ניתן להעריך עוד יותר מבחינה תפקודית על ידי מדידת פעילות resorptive . ניתן להשתמש בבדיקות ספיגת עצם או מינרלים כדי לקבוע את פעילות הספיגה. כאן, מבשרי OC נזרעו על בארות מצופות סידן פוספט והובחנו סופנית. אזורים גדולים שבהם נספג מחדש ציפוי המינרלים נראים בצבע אפור-כחלחל (איור 4E). ניתן לזהות בורות ספיגה בגדלים שונים. ציפוי הסידן פוספט הנותר אינו מחודש, נראה בצבע חום. נוכחותם של בורות ספיגה מאשרת את זהותם של התאים מרובי הגרעינים המובחנים כ-OCs. בנוסף, ניתן לכמת בורות ספיגה נוספים על מנת להעריך ולהשוות את פעילות הספיגה. ניתן לכמת את השטח הכולל של מינרל נספג על פני שטח הפנים הכולל של הבאר כמדד אחוזים. בנוסף, ניתן לכמת עוד יותר את גודל ומספר בורות הספיגה שלהם. בקרות שליליות שלא טופלו לא הציגו בורות ספיגה (איור 4F).

figure-results-1
איור 1: המחשה סכמטית של תהליך התמיינות אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים. איור שצויר על ידי חנה בלומקה באמצעות Affinity Designer 2.1.1. האיור משתמש בציורים שהיו בשימוש בעבר33. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תמונות מיקרוסקופיות לאורך תהליך ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים כלפי אוסטאוקלסטים. (A) מושבות iPSC בלתי מובחנות במהלך ההתפשטות. (B) תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים בבארות תחתונות עגולות לאחר דיסוציאציה לתרחיף של תא בודד לפני הצנטריפוגה. (C) תאי גזע מושרים חד-תאיים שנאספו באופן מרכזי בעקבות צנטריפוגה. (D) EBs גדלים בגודלם לאורך תקופת התמיינות מזודרמלית בת 4 ימים. (E) גופים עובריים גלויים לעין לאחר התמיינות מזודרמלית. (F) לאחר העברת גופים עובריים ללוחות 6 בארות מצופות בתמצית קרום בסיסי, ניתן לראות גופים עובריים נצמדים ומתמזגים עם קרקעית הבאר. (G) לאחר 5-7 ימים של התמיינות המטופויטית, ניתן לראות בתווך מספר רב של תאים המטופויטיים צפים. (H) לאחר הבשלת M-CSF, האוסטאוקלסטים הראשונים עם 3-4 גרעינים מופיעים לאחר 5-7 ימים של התמיינות עם RANKL. (I) בסוף התמיינות אוסטאוקלסט ניתן להבחין בתאים גדולים מרובי גרעינים. פסי קנה מידה: A, D, F, G = 200 מיקרומטר, B, C, H, I = 50 מיקרומטר, E = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ניתוח סמנים על פני השטח של תאים המטופויטיים שמקורם בגוף עוברי באמצעות ציטומטריית זרימה. ביטוי סמן מאפשר ניתוח של תאים hematopoietic וזיהוי של תת-אוכלוסיות לאחר gating עבור סינגלים ותאים חיים. (A) אוכלוסיית תאי אב המטופויטיים מוקדמת אונטוגנטית CD34+ קטנה מאוד עד נעדרת בשילוב עם פרוטוקול זה. (B) תאי CD43+ מהווים כ-50% מכלל האוכלוסייה. (C) בשלב מאוחר יותר CD45+ תאי אב hematopoietic מהווים את החלק הגדול ביותר של האוכלוסייה hematopoietic עם 96.2%. (ד, ה) מבשרי OC ישירים יותר של CD14+ ו-CD11b+ מהווים 33% ו-36%, בהתאמה. באדום: בקרה שלילית לא מוכתמת, בכחול: פקדי איזוטיפ, בצהוב: תאים מוכתמים בנוגדן הסמן המתאים. מגרשים משתמשים בנתונים שפורסמו בעבר33. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: הערכה מורפולוגית ותפקודית של אוסטאוקלסטים אנושיים בעלי התמיינות iPSC. (A) צביעת TRAP לאחר התמיינות אוסטאוקלסטים מראה אוסטאוקלסטים גדולים, מרובי גרעינים, חיוביים ל-TRAP. ניתן לראות תאים חד-גרעיניים חיוביים מעט TRAP המשולבים בין אוסטאוקלסטים רב-גרעיניים. (B) בקרות שליליות ללא תוספת של RANKL המוכתמות עבור TRAP אינן מציגות אוסטאוקלסטים רב-גרעיניים מאוחים. עם זאת, ניתן לתאר מספר קטן של תאים חד-גרעיניים חיוביים במקצת TRAP. (C) תמונות מיקרוסקופ סריקה בלייזר קונפוקלי של תאים המטופויטיים ממוינים אוסטאוקלסטים על שקופית כיסוי מוכתמת עבור F-actin (אדום) ו-Cathepsin K (טורקיז) בשילוב עם כתם גרעיני DAPI (כחול) מראות אוסטאוקלסטים חיוביים גדולים מרובי גרעינים של Cathepsin K. (D) בקרות שליליות ללא תוספת של RANKL מראות דומה ל-(B) תאים חד-גרעיניים בצפיפות תאים נמוכה יותר. (E) הערכה תפקודית יכולה להתבצע על ידי הערכת פעילות ספיגה של אוסטאוקלסטים. לשם כך, התמיינות אוסטאוקלסט מבוצעת על בדיקת ספיגת עצם או מינרלים. תמונות באר אריחים שנרכשו במיקרוסקופ שדה רחב הפוך במצב ניגודיות פאזה מתארות אזורי ספיגה גדולים של שכבת מינרל הסידן פוספט. ניתן לכמת עוד יותר את פעילות הספיגה על ידי מדידת אזור הספיגה על פני השטח הכולל. (F) בקרות שליליות ללא תוספת של RANKL אינן מציגות אזורי ספיגה מחדש. פסי קנה מידה: A, B = 100 מיקרומטר, C, D = 50 מיקרומטר, E, F = 1 מ"מ. התמונות נערכו מנתונים שפורסמו בעבר33. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציע שיטה אמינה וחזקה להבדיל iPSCs ל- OCs. עם זאת, ישנם מספר מלכודות שניתן להיתקל בהן לאורך תהליך הבידול. קווי iPSC אנושיים שנוצרו מתאים ממקורות רקמה שונים התמינו בהצלחה באמצעות פרוטוקולזה 33. בעת הקפאת iPSCs בחזרה (ראה שלב פרוטוקול "3. הקפאת iPSCs לאחור"), באר אחת בנקודת המעבר הוקפאה בחזרה לקריביאל אחד. בעת הפשרה (ראה שלב פרוטוקול "1. הפשרה והתפשטות של iPSCs אנושיים"), קריוביאל אחד הופשר לתוך באר אחת של צלחת 6 בארות. קווי iPSC שונים יתנהגו מעט אחרת, ושיעורי ההתפשטות ישתנו. יהיה צורך להתאים את קצב הפיצול בהתאם.

בעת העברת iPSCs או ניתוק iPSCs לתרחיף חד-תאי עבור השראת EB, חשוב להסיר מושבות או אגרגטים של תאים מתים שהתמיינו באופן ספונטני כדי לשפר את היעילות והיעילות של התמיינות מזודרמלית והמטופויאטית. ניתן לעשות זאת תחת סטריאומיקרוסקופ באמצעות מגרד תאים, קצוות פיפטה מפיפטה P10 או P20, או כלי גירוד הבנוי מפיפטהפסטר 35.

כפי שהוזכר לעיל, פרוטוקול זה כרוך בדיסוציאציה של מושבות iPSC לתרחיף חד-תאי עבור אינדוקציה EB, בעוד שבפרוטוקולים אחרים, iPSCs נותרים כאגרגטים לצנטריפוגה עבור אינדוקציהEB 36. גודל EB, מספר תאים, צורה ומורפולוגיה דווחו כולם כמשפיעים על התמיינות 37,38,39. לפיכך, אנו משערים כי הדיסוציאציה לתרחיף חד-תאי מאפשרת אחידות EB-to-EB טובה יותר בגודל ובצורה לאחר צנטריפוגה, ומכאן, תוצאות עקביות יותר של ייצור תאים המטופויטיים31.

תוארו שיטות אחרות להשראת EB. שיטות כאלה המשתמשות בתרחיף חד-תאי בשילוב עם מעכב ROCK כדי לשפר את הישרדות התא דווחו כמועילות בשליטה על גודל EB ותוצאת התמיינות31.

שיטת השראת EB בעלת 96 בארות תחתית עגולה המתוארת בפרוטוקול זה מתאימה לייצור בקנה מידה גדול של EBs ומאפשרת שדרוג של ייצור OC. שיטות חדשניות יותר להתמיינות המטופויטית ללא שלב השראת גוף עוברי עם פוטנציאל להקל על תהליך ההתמיינותתוארו לאחרונה 32. עם זאת, פרוטוקולים אלה טרם נקבעו עבור הבחנה OC33.

בפרוטוקול הנ"ל, אנו מתארים את השינוי הבינוני ביום 5 של התמיינות המטופויטית. מספר קטן של תאים צפים עשוי להופיע כבר סביב יום 4-5 להתמיינות. על מנת להימנע מהשלכת תאים צפים, יש לאסוף את התווך בצינור ולצנטריפוגה לפני השלכתו. לאחר מכן יש לעקור את גלולת התא בתחתית הצינור עם המדיום הטרי ולהעביר אותה חזרה לבארות של צלחת בת 6 בארות. עם זאת, עדיין יש לקבוע את המשמעות של אוכלוסיית התאים הצפים המוקדמת בהתמיינות OC.

הייצור של תאים hematopoietic ניתן להעריך באמצעות cytometry זרימה. תפוקות גבוהות של תאי CD45+, CD14+ ו- CD11b+ רצויות להתמיינות אוסטאוקלסטים33. שימור בהקפאה של תאים המטופויטיים צפים שנקטפו דווח כמאתגר עם שיעורי התאוששות מוגבלים בדרך כלל ויכולת קיום נמוכהשל תאים 40,41. על ידי שימור קריופויאטי של תאים המטופויטיים במדיום שימור קריוגני המורכב מ-50% ממדיום התפשטות תאים המטופויטיים ללא נסיוב (ראו טבלת חומרים), 40% FBS ו-10% DMSO, הצלחנו לשחזר תאים עם כ-90.3% כ-90.3% ±-2.62 SD (n = 7) לאחר ההפשרה.

אוסטאוקלסטוגנזה דורשת איחוי של מבשרי OC חד-גרעיניים מרובים כדי ליצור אוסטאוקלסטים מרובי גרעינים המסוגלים לספיגת מינרלים ועצמות. בעוד שקווי תאים מבשרי OC פשוט זקוקים לתוספת של RANKL כדי לגרום להיווצרות OC42, מבשרי אדם דורשים M-CSF נוסף להישרדות תאיםוהתפשטות 43. OSCAR התגלה לאחרונה כקולטן נוסף המעורב בהתמיינות OC, למרות שרק קולגן מסוג I זוהה עד כה כליגנד. בעוד המחקר של OSCAR עם OCs הנגזרים מ- iPSC עדיין מוגבל, נראה כי ריכוזים על-פיזיולוגיים במבחנה RANKL ו- M-CSF בקו תאי מורין עוקפים את הצורך בהפעלת OSCAR44, הפעלה של OSCAR in vivo נראית כאות קוסטימולטורי הכרחי עבור אוסטאוקלסטוגנזה45. גורם נוסף שיש לקחת בחשבון הוא משטח צלחת הבאר. תכונות כימיות46 ופיזיקליות47 ידועות כמשפיעות על התמיינות אוסטאוקלסטים ויכולות לקדם או לעכב התמיינות מוצלחת. הטרוגניות מסוימת באוכלוסיית המבשרים נראית גם קריטית לאיחוי מוצלח של OCs, שכן גורמים שונים הקשורים להיתוך כגון CD47 ו- DC-STAMP פועלים בשלבים שונים של היתוך אוסטאוקלסטים48.

לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר להבדיל בין OC אנושי לבין iPSCs כדי להקל ולהאיץ את מחקר ההמהרה (OC).

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לחברי מעבדת ג'יאצ'לי על עזרתם ותמיכתם הטכנית. אנו מודים למרכז W. M. Keck Microscopy Center ולמנהל מרכז Keck, ד"ר נתנאל פיטרס, על הסיוע בהשגת תמונות המיקרוסקופ הקונפוקלי והמיקרוסקופ הרחב. אנו מודים גם ל-Flow Core Facility של UW ולמנהל מתקן Flow Core, Aurelio Silvestroni, על התמיכה והסיוע הטכני. לבסוף, אנו מודים לחנה בלומקה על התמיכה באיור ובעיצוב גרפי.

המימון ניתן באמצעות מענק המכונים הלאומיים לבריאות R35 HL139602-01. אנו מכירים גם במענק S10 של NIH S10 OD016240 למימון מכשירים במרכז W. M. Keck וכן במענק NIH 1S10OD024979-01A1 למימון מכשירים במתקן UW Flow Core.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-מרקפטואתנולסיגמא אולדריץ'M6250-10ML
נוגדן - אנטי קטפסין K Abcamab19027
נוגדן - נוגדן אנטי אנושי מצומד APC CD45BD555485
- עכבר מצומד APC IgG1, κ בקרת איזוטיפBD555751
נוגדן - BV711 מצומד אנטי אנושי CD14BD563372
נוגדן - BV711 מצומד עכבר IgG2b, κ בקרת איזוטיפBD563125
נוגדן - עז אנטי ארנב IgG H& L Alexa Fluor® 647Abcamab150079
נוגדן - מצומד PE אנטי אנושי CD14R& D SystemsFAB3832P-025
נוגדן - אינטגרין אנטי-אנושי מצומד PE alpha M/CD11bR& D SystemsFAB16991P-025
נוגדן - נוגדן מצומד PE-Cy7 אנטי אנושי CD34BD560710
- עכבר מצומד PE-Cy7 IgG1 ו-kappa; בקרת איזוטיפBD557872
נוגדן - נוגדן מצומד PE/Cyanine5 אנטי-אנושי CD11bBiolegend301308
נוגדן - עכבר מצומד PE/ציאנין 5 IgG1, κ איזוטיפ CtrlBiolegend400118
נוגדן - עכבר מצומד PerCP-Cy5.5 IgG1 ו-kappa; בקרת איזוטיפBD550795
נוגדן - PerCpCy5.5 מצומד אנטי אנושי CD43BD563521
ערכת בדיקת ספיגת עצםCosmoBioUSACSR-BRA-24KIT
Countess 3 מונה תאים אוטומטיThermoFisher16812556
Cultrex תאי גזע מוסמכים גורם גדילה מופחת תמצית קרום מרתףR& D Sytems3434-010-02תמצית קרום בסיס
DAPIR& D Systems5748/10
Dispase (5 U/mL)STEMCELL Technologies7913
DMEM/F-12 עם 15 מ"מ HEPESתאי גזע36254
DMSOSigma AldrichD2650
DPBSSigma AldrichD8537-500ML
חלבון מורפוגנטי של עצם אנושית 4 (hBMP4)STEMCELL Technologies78211
טכנולוגיות תאי גזעאנושיים IL-378146.1
גורם מגרה מושבת מקרופאגים אנושיים (hM-CSF)טכנולוגיות תאי גזע78150.1
מפעיל קולטן מסיס אנושי של גורם גרעיני-וקאפה; B Ligand (hsRANKL)STEMCELL Technologies78214.1
גורם תאי גזע אנושיים (hSCF)STEMCELL Technologies78155.1
Human TruStain FcX (תמיסת חסימת קולטן Fc)Biolegend422301
גורם גדילה אנדותל כלי דם אנושי-165 (hVEGF165)STEMCELL Technologies78073
Invitrogen Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
MEM α, נוקלאוזידים, ללא פנול אדוםThermoFisher41061029
mFreSRSTEMCELL Technologies05855מדיום שימור בהקפאה ללא סרום
mTeSR Plus בינוניSTEMCELL Technologies100-0276מדיום אנושי ללא iPSC-סרום (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera מטופל, בצורת U-Bottom MicroplateThermo Scientific174925חיבור תחתון עגול נמוך במיוחד צלחת 96 בארות
P1000 קצות קדח רחבThermoFisher2079GPK
מעכב רוק Y-27632STEMCELL Technologies72304
StemSpan SFEMStemCell09650מדיום תרבית תאים המטופויאטית
TrypLE Select Enzyme (1X), ללא פנול אדוםתרמו פישר12563011מגיב דיסוציאציה של תא יחיד
UltraglutamineBioscience LonzaBE17-605E/U1
X-VIVO 15 ללא סרום תאים המטופויאטיים בינוניBioscience Lonza04-418Qמדיום בסיסי המטופויאטי
ומיקרו;-שקופית 8 טוב גבוהIbidi80806

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
  2. Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast functions. Journal of Dental Research. 92 (10), 860-867 (2013).
  3. Buranaphatthana, W., et al. Engineered osteoclasts resorb necrotic alveolar bone in anti-RANKL antibody-treated mice. Bone. 153, 116144(2021).
  4. Wang, L., et al. Isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (147), e58895(2019).
  5. Mercatali, L., et al. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311(2017).
  6. Marino, S., Bishop, R. T., de Ridder, D., Delgado-Calle, J., Reagan, M. R. 2D and 3D in vitro co-culture for cancer and bone cell interaction studies. Methods in Molecular Biology. 1914, 71-98 (2019).
  7. Rementer, C. W., et al. An inducible, ligand-independent receptor activator of NF-κB gene to control osteoclast differentiation from monocytic precursors. PloS One. 8 (12), e0084465(2013).
  8. Rementer, C., et al. Engineered myeloid precursors differentiate into osteoclasts and resorb heterotopic ossification in mice. Research Square Priprint. , 2156913(2022).
  9. Bjelić, D., Finšgar, M. Bioactive coatings with anti-osteoclast therapeutic agents for bone implants: Enhanced compliance and prolonged implant life. Pharmacological Research. 176, 106060(2022).
  10. Minkin, C., Marinho, V. C. Role of the osteoclast at the bone-implant interface. Advances in dental research. 13, 49-56 (1999).
  11. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: Review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 1-35 (2020).
  12. Mun, S. H., Park, P. S. U., Park-Min, K. H. The M-CSF receptor in osteoclasts and beyond. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1239-1254 (2020).
  13. Plotkin, L. I., Bivi, N. Local regulation of bone cell function. Basic and Applied Bone Biology. , 47-73 (2014).
  14. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  15. Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
  16. Boyce, B. F., Xiu, Y., Li, J., Xing, L., Yao, Z. NF-κB-mediated regulation of osteoclastogenesis. Endocrinology and Metabolism. 30 (1), 35(2015).
  17. Novack, D. V. Role of NF-κB in the skeleton. Cell Research. 21 (1), 169-182 (2010).
  18. Kim, K., Lee, S. H., Jung, H. K., Choi, Y., Kim, N. NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP). Molecular Endocrinology. 22 (1), 176-185 (2008).
  19. Wu, H., Xu, G., Li, Y. P. Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (5), 871(2009).
  20. Vignery, A. Macrophage fusion: The making of osteoclasts and giant cells. The Journal of Experimental Medicine. 202 (3), 337(2005).
  21. Chiu, Y. H., Ritchlin, C. T. DC-STAMP: A key regulator in osteoclast differentiation. Journal of Cellular Physiology. 231 (11), 2402(2016).
  22. Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. S., Ansalone, C. Differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood CD14+ monocytes. Journal of Visualized Experiments. (191), e64698(2023).
  23. Gothot, A., Pyatt, R., McMahel, J., Rice, S., Srour, E. F. Functional heterogeneity of human CD34+ cells isolated in subcompartments of the G0 /G1 phase of the cell cycle. Blood. 90 (11), 4384-4393 (1997).
  24. Dinella, J., Koster, M. I., Koch, P. J. Use of induced pluripotent stem cells in dermatological research. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (8), e23(2014).
  25. Grigoriadis, A. E., et al. Directed differentiation of hematopoietic precursors and functional osteoclasts from human ES and iPS cells. Blood. 115 (14), 2769-2776 (2010).
  26. Rössler, U., et al. Efficient generation of osteoclasts from human induced pluripotent stem cells and functional investigations of lethal CLCN7-related osteopetrosis. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 36 (8), 1621-1635 (2021).
  27. Chen, I. -P. Differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into osteoclasts. Bio-Protocol. 10 (24), e3854-e3854 (2020).
  28. Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  29. Abe, K., et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Experimental Cell Research. 229 (1), 27-34 (1996).
  30. Perlingeiro, R. C. R., Kyba, M., Daley, G. Q. Clonal analysis of differentiating embryonic stem cells reveals a hematopoietic progenitor with primitive erythroid and adult lymphoid-myeloid potential. Development. 128 (22), 4597-4604 (2001).
  31. Pettinato, G., Wen, X., Zhang, N. Engineering strategies for the formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 24 (14), 1595(2015).
  32. Ruiz, J. P., et al. Robust generation of erythroid and multilineage hematopoietic progenitors from human iPSCs using a scalable monolayer culture system. Stem Cell Research. 41, 101600(2019).
  33. Blümke, A., et al. Comparison of osteoclast differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells of different tissue origins. Stem Cell Research & Therapy. 14 (1), 319(2023).
  34. Klepikova, A., et al. iPSC-Derived Macrophages: The differentiation protocol affects cell immune characteristics and differentiation trajectories. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 16087(2022).
  35. Neely, M. D., Tidball, A. M., Aboud, A. A., Ess, K. C., Bowman, A. B. Induced pluripotent stem cells (iPSCs): An emerging model system for the study of human neurotoxicology. Neuromethods. 56, 27-61 (2011).
  36. Doulatov, S., et al. Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors. Cell Stem Cell. 13 (4), 459-470 (2013).
  37. Van Winkle, A. P., Gates, I. D., Kallos, M. S. Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells, Tissues, Organs. 196 (1), 34-47 (2012).
  38. Kim, J. M., et al. Assessment of differentiation aspects by the morphological classification of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 20 (11), 1925-1935 (2011).
  39. Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
  40. Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (158), e61038(2020).
  41. Cao, X., et al. Differentiation and functional comparison of monocytes and macrophages from hiPSCs with peripheral blood derivatives. Stem Cell Reports. 12 (6), 1282(2019).
  42. Omata, Y., et al. Interspecies single-cell RNA-seq analysis reveals the novel trajectory of osteoclast differentiation and therapeutic targets. JBMR Plus. 6 (7), e10631(2022).
  43. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  44. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201(2002).
  45. Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in psteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 641162(2021).
  46. Bernhardt, A., Schamel, M., Gbureck, U., Gelinsky, M. Osteoclastic differentiation and resorption is modulated by bioactive metal ions Co2+, Cu2+ and Cr3+ incorporated into calcium phosphate bone cements. PLoS One. 12 (8), e0182109(2017).
  47. Akasaka, T., et al. Different micro/nano-scale patterns of surface materials influence osteoclastogenesis and actin structure. Nano Research. 15 (5), 4201-4211 (2022).
  48. Hobolt-Pedersen, A. S., Delaissé, J. M., Søe, K. Osteoclast fusion is based on heterogeneity between fusion partners. Calcified Tissue International. 95 (1), 73(2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Osteoclast DifferentiationHuman IPSCsEmbryoid Body InductionHematopoietic DifferentiationM CSF MaturationTRAP StainingCathepsin K StainingBone Resorption AssayFlow CytometryMultinucleated Osteoclasts

מאמרים קשורים