מאמר שיטה

פרדיגמות להערכה התנהגותית במודל דרוזופילה של הפרעת הספקטרום האוטיסטי

3.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66649

⸱

6 בספטמבר 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioscience and Biotechnology, Indian Institute of Technology Kharagpur

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) קשורה להתנהגות חברתית ותקשורתית לקויה ולהופעתה של התנהגות חזרתית. לצורך חקר הקשר בין גנים אוטסיים וליקויים התנהגותיים במודל דרוזופילה , מתוארות במאמר זה חמש פרדיגמות התנהגותיות להערכת ריווח חברתי, תוקפנות, חיזור, טיפוח והתנהגות הרגלה.

תקציר

הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) כוללת קבוצה הטרוגנית של הפרעות נוירו-התפתחותיות עם סימפטומים התנהגותיים נפוצים, כולל ליקויים באינטראקציה חברתית וביכולת תקשורת, התנהגויות מוגבלות או חוזרות משופרות, וגם, במקרים מסוימים, לקות למידה וליקוי מוטורי. דרוזופילה שימשה כאורגניזם מודל שאין שני לו למידול מספר רב של מחלות אנושיות. מכיוון שגנים רבים היו מעורבים באוטיזם, זבובי פירות התגלו כדרך רבת עוצמה ויעילה לבחון את הגנים המעורבים לכאורה בהפרעה. מכיוון שמאות גנים, בעלי תפקידים תפקודיים מגוונים, מעורבים באוטיזם, מודל זבוב גנטי יחיד של ASD אינו ישים; במקום זאת, מוטציות גנטיות בודדות, הפלות גנים, או מחקרים מבוססי ביטוי יתר של הומולוגים של זבובים של גנים הקשורים ל- ASD הם האמצעי הנפוץ להשגת תובנה לגבי מסלולים מולקולריים העומדים בבסיס תוצרי גנים אלה. שורה של טכניקות התנהגותיות זמינות בדרוזופילה המספקות קריאה קלה של ליקויים במרכיבים התנהגותיים ספציפיים. מבחני מרחב חברתי ומבחני תוקפנות וחיזור בזבובים הוכחו כיעילים בהערכת פגמים באינטראקציה חברתית או בתקשורת. התנהגות טיפוח בזבובים היא קריאה מצוינת של התנהגות חזרתית. בדיקת הרגלה משמשת בזבובים כדי להעריך את היכולת ללמידה של הרגלה, אשר נמצא מושפע אצל חלק מחולי ASD. שילוב של פרדיגמות התנהגותיות אלה יכול לשמש כדי לבצע הערכה יסודית של מצב המחלה דמוי ASD האנושי בזבובים. באמצעות שימוש בזבובים מוטנטיים מסוג Fmr1 , שחזור תסמונת ה-X השביר בבני אדם, והפלה בשורה הומולוגית של POGZ בנוירונים של זבובים, הראינו ליקויים הניתנים לכימות בריווח חברתי, תוקפנות, התנהגות חיזור, התנהגות טיפוח והרגלה. פרדיגמות התנהגותיות אלה מודגמות כאן בצורותיהן הפשוטות והפשוטות ביותר, מתוך הנחה שזה יקל על השימוש הנרחב בהן למחקר על ASD והפרעות נוירו-התפתחותיות אחרות במודלים של זבובים.

מבוא

הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) כוללת קבוצה הטרוגנית של הפרעות נוירולוגיות. הוא כולל מגוון של הפרעות נוירו-התפתחותיות מורכבות המאופיינות בגירעונות רב-הקשריים ומתמשכים בתקשורת חברתית ובאינטראקציה חברתית ובנוכחות דפוסי התנהגות ופעילות ותחומי עניין מוגבלים, חוזרים ונשנים1. על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), 1 מכל 100 ילדים מאובחן עם ASD ברחבי העולם עם יחס זכר-נקבה של 4.22. המחלה מתגלה בשנה השנייה או השלישית לחיים. ילדים אוטיסטים מראים חוסר עניין בהדדיות חברתית-רגשית, תקשורת לא מילולית ומיומנויות יחסים. הם מפגינים התנהגויות חוזרות ונשנות כמו תנועה מוטורית סטריאוטיפית, מעקב שגרתי לא גמיש וטקסי, והתמקדות אינטנסיבית בתחומי עניין מוגבלים. ילדים אוטיסטים מראים רמה גבוהה של תגובה כלפי מגע, ריח, צליל וטעם, בעוד שתגובת כאב וטמפרטורה נמוכה יחסית1. החדירה של הפרעה זו שונה גם בקרב חולים שונים הסובלים מאוטיזם ולכן השונות עולה.

האבחנה הקלינית הנוכחית של ASD מבוססת על הערכה התנהגותית של האנשים מכיוון שאין בדיקה גנטית מבוססת סמנים ביולוגיים או נפוצה המכסה את כל הצורות של ASD3. פענוח הבסיס הגנטי והנוירופיזיולוגי יסייע במיקוד אסטרטגיות הטיפול. בעשור האחרון, גוף גדול של מחקר הביא לזיהוי של מאות גנים שנמחקו או עברו מוטציה או שרמות הביטוי שלהם משתנות בחולי ASD. מחקר מתמשך מדגיש את אימות תרומתם של גנים מועמדים אלה באמצעות אורגניזמים מודל כמו עכבר או זבוב פירות, שבמסגרתם, גנים אלה מושמטים או מופלים ולאחר מכן בדיקות ליקויים התנהגותיים דמויי ASD והבהרת מסלולים גנטיים ומולקולריים בסיסיים הגורמים לאנומליות. מודל עכבר המשחזר וריאציות של מספר העתק (CNVs) באתרים הכרומוזומליים האנושיים 16p11.2 מראה חלק מהפגמים ההתנהגותיים של ASD 4,5,6. חשיפה טרום לידתית לתרופה טרטוגנית חומצה ולפרואית (VPA) היא מודל עכבר נוסף המתאר תכונות הדומותלאוטיזם 7,8 אנושי. בנוסף, קיים מגוון מודלים של עכברים המציגים אוטיזם הקשור לתסמונת גנטית, לדוגמה, מודלים סינדרומיים של גן יחיד הנגרמים על ידי מוטציות ב- Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c, ומודלים לא סינדרומיים של גן יחיד הנגרמים על ידי מוטציות בגנים כמו Cntnap2, Shank, Neurexin, או Neuroligin גנים 5.

זבוב פירות (Drosophila melanogaster) הוא אורגניזם מודל בולט נוסף לחקר הבסיס התאי, המולקולרי והגנטי של שפע של הפרעות אנושיות9, כולל ASD. דרוזופילה ובני אדם חולקים תהליכים ביולוגיים שמורים מאוד ברמה המולקולרית, התאית והסינפטית. זבובי פירות שימשו בהצלחה במחקרי ASD 10,11,12 כדי לאפיין גנים הקשורים לאוטיזם ולפענח את תפקידם המדויק בסינפטוגנזה, תפקוד סינפטי ופלסטיות, הרכבת מעגלים עצביים והתבגרות; הומולוגים של זבובים של גנים הקשורים לאוטיזם נמצאו כבעלי תפקידים בוויסות התנהגות חברתית ו / או חזרתית 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. זבוב הפירות עבד גם כמודל לבדיקת גנים ASD וגרסאותיהם 15,22,23. האתגר הגדול ביותר במחקר ASD בזבובים הוא שבניגוד למודלים אחרים של מחלות, אין מודל אחד של זבוב ASD. כדי להבין את ההשפעה של מוטציות או הפלת גן ASD ספציפי, חוקר צריך לאמת אם הפנוטיפים ההתנהגותיים מחקים מספיק את הסימפטומים של חולי ASD ולאחר מכן, להתקדם לקראת הבנת הבסיס המולקולרי או הפיזיולוגי של הפנוטיפים.

לפיכך, זיהוי פנוטיפים דמויי ASD חיוני למחקר ASD במודל הזבוב. קומץ טכניקות התנהגותיות התפתחו במהלך השנים המאפשרות לנו לזהות חריגות כמו ליקויים בהתנהגות / אינטראקציה חברתית, תקשורת, התנהגויות חזרתיות והיענות לגירויים. בנוסף, מספר שינויים ושדרוגים של טכניקות התנהגותיות אלה נעשו במעבדות שונות כדי להתאים לדרישות ספציפיות כגון upscaling, אוטומציה של מבחנים, קריאות, כימות ושיטות השוואה. במאמר וידאו זה, הגרסאות הבסיסיות ביותר של חמש פרדיגמות התנהגותיות מודגמות, אשר, בשילוב, ניתן להשתמש בהן כדי לזהות תוצאות התנהגותיות דמויות ASD בצורה הקלה ביותר.

תוקפנות היא התנהגות מולדת שמורה אבולוציונית המשפיעה על הישרדות ורבייה24. התנהגות תוקפנית כלפי פרטים מושפעת מ"מוטיבציה לחיברות"25,26 כמו גם מ"תקשורת"27, שתיהן נפגעות אצל אנשים הסובלים מאוטיזם. התנהגות תוקפנית מתוארת היטב בדרוזופילה ויכולת הכימות שלה באמצעות בדיקת תוקפנות חזקה 28,29,30 ובסיס גנטי ונוירוביולוגי מובן היטב 31 הופכת אותה לפרדיגמה התנהגותית מתאימה32 להערכת פנוטיפ ASD במודל זבוב. תוקפנות מושפעת מבידוד חברתי הרחק מסביבה חברתית, מה שמוביל לתוקפנות מוגברת; אותו הדבר נצפה כאשר זבובים זכרים שוכנים בבידוד במשך כמה ימים33,34. בדיקה התנהגותית נוספת המכמתת חברותיות בזבובים היא Social Space Assay35, המודדת מרחקים בין שכנים קרובים ומרחקים בין זבובים בקבוצה קטנה של זבובים, מה שהופך אותה למתאימה באופן מושלם לבדיקת תפקידם של אורתולוגים גנטיים ASD בזבוב 12,21,36,37 וכן במודלים סביבתיים של זבוב ASD 38, 39.

בדיקת החיזור של דרוזופילה היא פרדיגמה התנהגותית נוספת המשמשת לעתים קרובות להערכת שינויים במיומנויות חברתיות ותקשורתיות על מעגלים או מניפולציות גנטיות, כולל גנים הקשורים לאוטיזם 18,19,21,40. דפוסי התנהגות חוזרים שכיחים בחולי ASD, אשר מגולמים בזבובים על ידי התנהגות טיפוח - סדרה של פעולות מובחנות וסטריאוטיפיות המבוצעות לצורך ניקוי ומטרות אחרות. הוא שימש בהצלחה לבדיקת ההשפעה של מוטציות בגן ASD בזבובים21,41, כמו גם חשיפה לכימיקלים38,39. התקדמות ואוטומציה מרובות בבדיקה תוארו לפני 16,41,42,43; כאן, אנו מדגימים את דפוס הבדיקה הבסיסי ביותר, שקל לאמץ ולכמת.

ASD ידוע כמשפיע על היכולת להרגלה, למידה וזיכרון אצל חלק מהחולים 44,45,46,47,48,49,50, אורגניזמים מודל ASD 51,52 וגם גורם לליקויים בהתנהגויות ריח שונות50. התרגלות קפיצה קלה של דרוזופילה שימשה בעבר לסינון גנים ASD23. ניתן לבדוק את ההרגלה על ידי שיטה פשוטה של בדיקת הרגלת חוש הריח 53,54,55. אנו מתארים את השיטה לגרימת הרגלת חוש הריח ובודקים את התוצאה באמצעות בדיקת בחירת ריח בינאריתקלאסית 56 המבוססת על מבוך Y, שניתן להשתמש בה כדי לזהות פגמים בהתרגלות בגן ASD, מוטציה או מצב של הפלה גנטית. כדי להעריך אם ההשפעה של מוטציה (או הפלת גנים) או טיפול תרופתי על התנהגותו של זבוב מסתכמת בפנוטיפ דמוי ASD, ניתן להשתמש בשילוב של 5 הבדיקות הללו המתוארות כאן.

פרוטוקול

עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. מבחן תוקפנות

  1. הכנת זירת מבחני התוקפנות
    1. קחו צלחת סטנדרטית של 24 בארות (איור 1A) והשתמשו בכל באר של הצלחת כ"זירה" אחת (איור 1B) לתוקפנות זבובים. מלאו חצי מכל באר במזון זבובים רגיל והניחו לו להתייבש למשך הלילה.
      הערה: לחלופין, ניתן לכלול מוקד לתוקפנות בזירה, כגון נקודה של משחת שמרים או נקבה ערופה כדי להבטיח תוקפנות גברית.
    2. קח כל יריעת פלסטיק / אקריליק שקופה, מספיק כדי לכסות את פני השטח של כשלוש עד ארבע בארות. נקב את היריעה כדי ליצור צמצם קטן בקוטר ~ 2.5 מ"מ להחדרת זבובים בודדים לבארות דרכו.
  2. הכנת שואב הזבוב
    1. קחו צינור גומי/סיליקון באורך 30-50 ס"מ (איור 1C1).
    2. קח קצה פיפטה של 200 μL (או 1,000 μL) וקצץ ~ 1 ס"מ מהקצה הצר. הכנס את הקצה החתוך בקצה אחד של צינור הגומי; טיפ זה יהיה 'קצה הפה', המשמש לשאיפה מבוססת פה.
    3. קח קצה פיפטה נוסף וחתך את הקצה הצר של קצה זה כדי ליצור פתח מספיק כדי שזבוב ייכנס דרכו. הכנס את הבסיס של קצה פיפטה זה לקצה הזנב של הצינור; זה יהיה "קצה הזבוב" של השואפ, שממנו הזבוב יישאב (איור 1C2).
    4. הכניסו פיסת בד רשת או שכבה דקה של כותנה על 'קצה הזבוב' של הצינור - בצומת שבין הצינור לקצה. ודאו שזבוב שנשאף לתוך קצה הפיפטה נשאר לכוד בקצה, לפני הרשת.
    5. אוטמים את הצמתים בין הצינור לקצות הפיפט באמצעות פרפילם.
  3. הכנת צינורות לבתים בודדים ובקבוקונים לדיור קבוצתי
    1. הכנת צינורות דיור יחיד
      1. הוסיפו כמעט 500 מיקרוליטר של מזון זבובים טרי לצינור מיקרופוגה בנפח 2 מ"ל (איור 1D). השתמש בצנטריפוגה קטנה כדי למשוך את המזון למטה לחלק התחתון של הצינור.
      2. הניחו את המזון כך שיתמצק בטמפרטורת החדר על ידי השארת המכסה פתוח למשך הלילה. כסו את הצינורות בחתיכת בד עדינה כדי למנוע מזבובים תועים להיכנס לצינורות.
      3. לנקב את המכסים של צינורות microfuge עם מחטים לזרימת האוויר, ולסגור את העפעפיים לאחר המזון הוא מוצק.
    2. הכנת בקבוקוני דיור קבוצתי
      1. קחו בקבוקוני זבוב רגילים ומלאו מינימום מהבקבוקונים במזון טרי שהוכן (איור 1D).
  4. הכנת הזבובים לפני הניסוי
    1. לשמור על קווי זבוב של הגנוטיפים הרצויים בבקבוקי זכוכית/פלסטיק רגילים המכילים מזון זבובים סטנדרטי באינקובטור בטמפרטורה של 25°C במחזור אור/חושך של 12 שעות.
    2. אספו זבובים חדשים (0 עד 24 שעות) מהגנוטיפ הרצוי והפרידו ביניהם בהרדמה של פחמן דו חמצני באמצעות סטריאומיקרוסקופ.
    3. הכניסו מחצית מהזבובים הזכרים בנפרד ל'צינורות חד-ביתיים'. החזיקו את המחצית השנייה של הזבובים הזכרים בקבוצה של 10 עם נקבות הזבובים ב"בקבוקוני דיור קבוצתיים" רגילים היוצרים מצב חברתי. יש לאחסן את כל הצינורות והבקבוקונים בטמפרטורה של 25°C למשך 5 ימים.
      הערה: שמור על טמפרטורה של 24-25 ° C ו~ 50% לחות בחדר ההתנהגות. זני הזבובים בהם נעשה שימוש היו: w1118 וזבובים מוטנטיים טרנס-הטרוזיגוטים FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. זבובי Fmr1 , שהוחזקו בבידוד במשך 5 ימים, מראים ירידה משמעותית בהתקפי תוקפנות כלפי זכר אחר (איור 1E).
  5. ביצוע ניסוי התנהגות תוקפנות
    1. בצע את ניסוי התוקפנות במהלך חלון הזמן ZT0-ZT3 מכיוון שהזבובים מראים פעילות שיא בתקופה זו של היום.
      הערה: ZT=זמן צייטגבר במחזור אור/חושך סטנדרטי של 12 שעות; ZT0= אורות דולקים, כלומר, תחילת שלב האור, ZT3= 3 שעות לאחר תחילת שלב האור, וכן הלאה. ZT12= אורות כבויים.
    2. להעביר שני זבובים זכרים מתאי השיכון היחידים או הקבוצתיים בשיטת שאיפת הפה לזירת התוקפנות דרך החור במכסה; הרחיקו את החור מיד כדי להבטיח שהזבובים לא יוכלו לברוח.
    3. אפשרו לזבובים להתאקלם בתוך הזירה למשך 1-2 דקות. הפעל טיימר למשך 20 דקות. וידאו להקליט את הזבובים במשך כל 20 דקות על ידי הצבת מצלמה או טלפון נייד בדיוק אנכית מעל הזירה באמצעות מעמד. ודא שסוגי ההתקפות התוקפניות גלויים בסרטון.
      הערה: הקפד על תאורה ברורה של הזירה והימנע מכל סינוור/השתקפות מהמכסה הנופל ישירות על עדשת המצלמה.
    4. חזור על הניסוי עבור 15-20 זוגות זבובים עבור כל גנוטיפ וכל סוג של תנאי דיור.
      הערה: ניתן לשלול הטיה לא מודעת על ידי סמיות כפולה של זבובי הבקרה והבדיקה, כמו גם קבצי וידאו השייכים למספר גנוטיפים.
  6. ניתוח נתוני בדיקת התוקפנות
    1. העבר את קבצי הווידאו למחשב עם מסך גדול מספיק, כך שההתקפות התוקפניות גלויות.
    2. הפעל את הווידאו וספור את המספר הכולל של התקפות אגרסיביות בטווח זמן של 20 דקות58,59.
    3. לאסוף ולארגן נתונים מכל גנוטיפ ומכל תבנית דיור בגיליון אלקטרוני ולבצע ניתוח נתונים באמצעות כל תוכנה סטטיסטית. בצע בדיקת t דו-זנבית והתווה את הנתונים כקופסה ושפם.

2. בדיקת מרחב חברתי

הערה: פרוטוקול הבדיקה, הזירה והניתוח המתוארים כאן תוארו בעבר60,61.

  1. הכנת זירת מבחן המרחב החברתי (SSA)
    1. הניחו את שני הספייסרים האקריליים המשולשים (גובה = 8.9 ס"מ, בסיס = 6.7 ס"מ, ועובי = 0.3 ס"מ) שטוחים על גבי חלון זכוכית מלבני (13.5 ס"מ x 10.4 ס"מ, עובי 0.3 ס"מ) כך שהזוויות הישרות של המרווחים האקריליים מיושרות עם פינות חלון הזכוכית (איור 2A).
    2. הניחו שני ספייסרים אקריליים מלבניים (6.7 ס"מ x 1.5 ס"מ, עובי = 0.3 ס"מ) שטוחים על שמשת הזכוכית, מיושרים עם בסיסי שני המרווחים המשולשים. לאחר סידור זה, אשרו שארבעת הספייסרים האקריליים מקיפים זירה משולשת (~2.16 ס"מ מרובע61) על חלון הזכוכית המלבנית שאינה מכוסה על ידי ספייסרים (איור 2A,B). הניחו מדבקה של סרגל (איור 2C) על אחד המרווחים המשולשים וודאו שהוא נראה מלמעלה.
    3. כעת הניחו חלונית זכוכית מלבנית שנייה (13.5 ס"מ על 10.4 ס"מ, עובי 0.3 ס"מ) על גבי המרווחים האקריליים כך שהיא מתיישרת עם זגוגית הזכוכית בתחתית; ספייסרים אקריליים היו בסופו של דבר דחוקים בין חלל הזכוכית, ומשאירים חלל משולש באמצע בין שתי שמשות זכוכית. השתמש בארבעה תפסי קלסר קטנים כדי להחזיק את החלוניות והספייסרים.
  2. הכנת הזבובים ל-SSA
    1. אספו זבובים שזה עתה נסגרו (0 עד 24 שעות) מהגנוטיפ הרצוי והפרידו ביניהם בהרדמה קרה באמצעות סטריאומיקרוסקופ.
      הערה: יש לקרר את מנגנון ההרדמה הקרה (ניתן להשתמש בצלוחית פטרי) באינקובטור של -20°C. הכניסו את הזבובים לבקבוקונים ריקים, טבלו אותם בקרח (בדלי קרח) עד שהזבובים יהפכו לחסרי תנועה, הניחו אותם על צלחת הפטרי הקרה והתחילו למיין.
    2. אחסנו את הזבובים הזכרים והנקבות בנפרד למשך 24 שעות בבקבוקוני מזון באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך של 12 שעות.
      הערה: עבור הניסויים שהודגמו כאן, זני הזבובים ששימשו היו w1118 וזבובים מוטנטיים טרנס-הטרוזיגוטים FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. ביצוע ניסוי SSA
    1. שמור על אותם תנאי ניסוי כמו בדיקת התוקפנות (טמפרטורה: 24-25 מעלות צלזיוס, לחות ~ 50%) ובצע את הניסוי בחלון הזמן ZT0-ZT3.
    2. הסר את תפס הקלסר הימני התחתון והסט מעט את המרווח המלבני כלפי חוץ, כך שייווצר רווח (~0.5 ס"מ) בין שני המרווחים המלבניים.
    3. מעבירים זבובים (שנאספו ביום הקודם) מבקבוקון המזון לבקבוקון ריק. העברתם לזירת המרחב החברתי (האזור המשולש) על ידי שאיפה עדינה דרך החלל שנוצר בין הספייסרים המלבניים. סגרו מיד את החלל על ידי החלקת הספייסר המלבני ותפס הקלסר בחזרה למקומם וודאו שלא נותר מקום לזבובים לברוח.
    4. על ידי החזקת התא במצב זקוף, הכו בעדינות את התא 3x על כרית רכה כדי להבטיח שכל הזבובים נמצאים בבסיס התא בתחילת הניסוי.
    5. מהדק את תא SSA במצב זקוף והפעל את הטיימר. צלם תמונה ברורה של הזירה לאחר 20 דקות כאשר הזבובים מתיישבים בעמדותיהם בזירה ומראים תנועה מינימלית. הימנעו מסנוור ומתאורה לא סדירה.
    6. חזור על הניסוי 3x עבור אותה אוכלוסיית זבובים על ידי הכאת הזבובים וחזרה על השלבים משלבים 2.3.5 עד 2.3.7 (העתקים פנימיים). חזור 3x עם אוכלוסייה שונה של זבובים מאותו גנוטיפ/מצב (חזרות בלתי תלויות).
      הערה: הקפא את תא הבדיקה כדי להשליך את הזבובים מהחדר. נגבו את משטחי הזכוכית והפלסטיק באתנול כדי להסיר את כל הריחות לאחר סבב אחד של ניסוי שנעשה עם קבוצה אחת של זבובים.
  4. ניתוח נתוני בדיקת המרחב החברתי
    1. נתחו את התמונות בתוכנת ImageJ62 ורשמו את מרחקי השכנים הקרובים ביותר לטיסה כפי שתואר קודם לכן61.
    2. ביצוע ניתוח סטטיסטי ושרטוט גרפים באמצעות תוכנה סטטיסטית.
      הערה: זני הזבובים ששימשו לבדיקת SSA המתוארת כאן היו w1118 ו-Fmr1 trans-heterozygote mutant flies (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. זבובי Fmr1 מראים מרחק גדול משמעותית מהשכנים הקרובים ביותר (איור 2D).

3. בדיקת חיזור

  1. תא החיזור
    1. הרכיבו את כל ארבעת חלקי תא החיזור (איור 3A) יחד בסדר שמוצג באיור 3B. כל נקב של הדיסק המרכזי, הדחוק בין המכסה לחלקי הבסיס, ישמש כ"תא חיזור" (איור 3C).
  2. השגת נקבות מזווגות מראש
    1. התחל ותחזק בקבוקי תרבית מרובים של CS (קנטון S, סוג פראי) זבובים עם ~ 60-100 זבובים זכרים ונקבות בכל בקבוק מזון.
    2. כאשר הבוגרים מגיחים, השליכו את כל הזבובים הבוגרים והעבירו את הזבובים היוצאים מבקבוקים אלה כל 2-3 שעות לבקבוקוני מזון חדשים בתוספת כמות זעירה של משחת שמרים.
      הערה: הימנעו מצפיפות יתר של הבקבוקונים. היזהרו שלא להעביר זבובים, זחלים או גלמים ישנים לבקבוקון ההזדווגות.
    3. דגרו על "בקבוקוני הזדווגות" אלה במשך 4 ימים כדי להבטיח שכל הנקבות הזדווגו.
  3. הכנת צינורות דיור יחיד לזכרים
    1. הוסף כמעט 500 μL של מזון זבובים לכל צינור מיקרופוגה 2 מ"ל. השתמש במכונת מיניצנטריפוגות כדי למשוך את המזון למטה לחלק התחתון של הצינור.
    2. אפשר התמצקות לילה של המזון, לחתוך את המכסה של צינור microfuge, לכסות אותו עם parafilm, ולנקב את parafilm עם מחט לזרימת האוויר.
  4. איסוף ובידוד זכרים בתולים
    1. הגדר צלבים עם 10-15 זכרים ו 20-30 נקבות בתולות של הגנוטיפים הרצויים בבקבוקוני מזון נפרדים.
    2. אספו זכרים בתולים מהגנוטיפים הרצויים מהצאצאים ושמרו אותם בנפרד ב"צינורות חד-ביתיים" באמצעות השואב. המשיכו לאסוף זכרים שזה עתה נסגרו כל 5-6 שעות (עד 40-50 זכרים לכל גנוטיפ) ולבודד אותם בצינורות בודדים בעלי דיור יחיד.
    3. אטמו מחדש את מכסה הצינור עם הפרפילם.
  5. ביצוע ניסוי בדיקת החיזור
    1. לאחר 5 ימים של בידוד של זכרי הבדיקה, בצע את בדיקת החיזור בחלון הזמן ZT0-ZT3.
    2. הגדר את התקני הקלטת הווידאו זמן רב מראש תוך התמקדות בסביבת העבודה של המבחן.
    3. בעזרת שואף, לאסוף נקבה אחת premated (6-10 ימים) מן בקבוקוני ההזדווגות ולהכניס לתוך תא חיזור.
    4. בעזרת השואב, מעבירים בעדינות זבוב זכר (בקרה/בדיקה) מצינור השיכון הבודד לתא החיזור המכיל את הנקבה הקדם-מזווגת היחידה דרך חור ההעברה. סובב את המכסה במהירות כדי לסגור את התא.
    5. וידאו להקליט את ההתנהגות של הזבובים במשך 15 דקות.
  6. ניתוח נתוני וידאו וסטטיסטיקה
    1. להעביר את קבצי הווידאו למחשב; שימו לב למשך הזמן שבילה הזכר בחיזור במשך 15 דקות על ידי מעבר ידני על הסרטון.
    2. חשב את מדד החיזור (CI) עבור כל זבוב זכר, שהוא החלק (או האחוז) של הזמן שהזכר בילה בחיזור אחר הנקבה במשך 15 דקות.
    3. ספרו את המספר הכולל של ניסיונות ההזדווגות ב-15 דקות.
    4. שימו לב למשך זמן הפיגור שהפגין הזכר לפני ניסיונו הראשון לחזר אחריו כחביון החיזור (CL).
      הערה: מומלץ לנתח 40-60 זכרים לכל מצב/גנוטיפ כדי להשיג כוח סטטיסטי ולקבוע את עקביות תוצאות CI.

4. בדיקת התנהגות טיפוח

  1. זירת בדיקת התנהגות טיפוח
    1. השתמש בתא עגול קטן עם נפח של ~0.4 ס"מ3 כזירה לתיעוד התנהגות הטיפוח.
      הערה: אותה זירת חיזור המתוארת בסעיף 3 עשויה לשמש לבדיקת התנהגות טיפוח.
    2. מכיוון שהתנהגות הטיפוח כוללת הקלטה של תנועה של איברים עדינים יותר כמו רגליים, השתמש בהקלטת וידאו ברזולוציה גבוהה או בניגודיות גבוהה. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בלוח LED מכוסה זכוכית מפוזרת כמשטח מואר באופן אחיד במידות 20 ס"מ x 20 ס"מ. הניחו את תא החיזור על גבי הפאנל כדי להבטיח שהאור יעבור מלמטה דרך החדר.
  2. הכנת הזבובים לפני הניסוי
    1. שמור על גנוטיפ ניסיוני זבובים בבקבוקי מזון ב 25 ° C עם מחזור אור / חושך 12 שעות.
    2. אספו זבובים שזה עתה נסגרו (0 עד 24 שעות) מהגנוטיפ הרצוי והפרידו ביניהם בהרדמה קרה באמצעות סטריאומיקרוסקופ כמתואר במבחן המרחב החברתי.
    3. בודדו את הזבובים הזכרים בצינורות חד-ביתיים (כפי שנעשה בהם שימוש בבדיקת התוקפנות) למשך 24 שעות.
      הערה: בניסוי שהודגם כאן, זני הזבובים בהם נעשה שימוש היו: W1118 וזבובים מוטנטיים טרנס-הטרוזיגוטים FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. ביצוע בדיקת התנהגות הטיפוח
    1. לשמור על טמפרטורה של 24-25 °C ולחות ~ 50%; בצע את הניסוי במהלך חלון הזמן ZT0-ZT316.
    2. העבירו זבוב זכר בודד מצינור חד-ביתי לזירת הטיפוח באמצעות שאיפה. החלק מיד את החור במכסה כדי להבטיח שהזבובים לא יוכלו לברוח.
    3. הניחו את זירת הטיפוח על לוח LED מפוזר ואפשרו לזבוב להתאקלם בתוך הזירה למשך דקה. וידאו להקליט את הזבוב במשך 10 דקות על ידי הצבת המצלמה בדיוק אנכית מעל הזירה רכוב על מעמד. ודא שסוגי התקפי הטיפוח גלויים וניתנים לכימות בסרטון.
      הערה: התנהגות הטיפוח כוללת שפשוף של הראש, העיניים, האנטנות, בית החזה, הבטן, איברי המין והכנפיים ברגליים (זוג ראשון: T1, זוג שני: T2, או זוג רגליים שלישי: T3). פרמטרים התנהגותיים של טיפוח שנלקחו בחשבון במחקר זה הם כפי שתוארו ב-Andrew et al. 41 והודגמו באיור 4.
    4. חזור על הניסוי עבור כל גנוטיפ.
    5. ניתוח הנתונים ההתנהגותיים של הטיפוח
      1. נתח את הסרטונים וחשבארבעת הפרמטרים הבאים: מדד הטיפוח (אחוז הזמן המושקע בטיפוח); חביון טיפוח (זמן עד התקף הטיפוח הראשון); מספר התקפת טיפוח; ומשך התקף טיפוח ממוצע (משך התקף כולל/מספר התקף).
      2. סמן התקף טיפוח יחיד כגמור כאשר זבוב מפסיק להראות את אחד הפרמטרים ונשאר ללא תנועה במשך 2 שניות או עוצר את ההתקף והולך לפחות 4 צעדים.

5. בדיקה להרגל חוש הריח

הערה: כפי שניתן לראות באיור 5, ההרכבה הסופית צריכה להיעשות ביום בדיקת מבוך Y-maze54,56.

  1. הכנת זבובים להרגלה
    1. להעלות זבובים של הגנוטיפים הרצויים לכל הניסויים באינקובטור עם טמפרטורת סביבה של 25 oC ו 70% לחות תחת תקן 12 שעות אור: 12 שעות מחזור כהה (LD).
    2. אספו 0-12 שעות, זבובים חדשים שנסגרו לאחרונה והעבירו ~ 30-40 זבובים בבקבוק בינוני טרי עם פקק כותנה מהודק.
    3. הקצו קודים לכל בקבוק כדי לשמור על הנסיין עיוור לגבי הגנוטיפים הנמצאים בניסוי.
  2. השראת הרגלת חוש הריח
    1. מניחים 1 מ"ל של הריח המועדף מהולל בנוזל פרפין (קל) בצינור מיקרופוגה של 1.5 מ"ל. עבור הבקרה, פשוט להשתמש 1 מ"ל של אור נוזלי פרפין בצינור microfuge 1.5 מ"ל. מערבבים את התוכן בצינור למשך 10 דקות כדי להבטיח ערבוב אחיד ולאחר מכן מכסים אותו בניילון נצמד מחורר באופן שווה.
      הערה: בסרטון, 20% אתיל בוטיראט ישמש.
    2. השתמש בחוט כדי להשהות את הצינורות המכילים את הריח המדולל או רק את הנוזל המדלל בבקבוקי מדיה נפרדים המכילים זבובים.
    3. מכסים היטב את הבקבוקים בצמר גפן ולאחר מכן עוטפים בנייר קראפט כדי למנוע דיפוזיה של אדי הריח. תייגו את בקבוקי הבקרה והריח כנאיביים וחשופים לריח (רגילים), בהתאמה. שמור בקבוקי אינדוקציה אלה במשך 3 ימים באינקובטור עם התנאים הנ"ל.
  3. הכנת זבובים ומנגנון מבוך Y
    1. מעבירים את הזבובים מבקבוקי האינדוקציה לבקבוקונים המכילים רק נייר סינון ספוג מים.
    2. הרעיבו אותם במשך כ-16-18 שעות בטמפרטורת החדר לפני הניסוי כדי להגביר את המוטיבציה.
    3. ודא שהרכיבים של מנגנון מבוך Y נקיים ונטולי ריח; להרכיב את ארבעת החלקים בצורה אנכית. חברו את תאי הטיפוס למבוך Y, המחובר לאחר מכן לחלק העליון של המתאם. חברו היטב את תחתית מבוך ה-Y לבקבוקון הכניסה המשמש כגבעול המרכזי בתחתית, כפי שמוצג באיור 5.
    4. חברו את הקצה המתחדד של כל תא טיפוס לבקבוקי ריאגנטים המכילים ריחות (10-3 דילול עם מים מזוקקים) באמצעות צינורות סיליקון נטולי ריח.
    5. יש לשאוב את הריח בקצב זרימה שווה (~120 מ"ל/דקה) מבקבוקי הגז לשתי זרועות ה-Y בעזרת משאבת ואקום ולאפשר לו להרוות למשך 15 דקות לקבלת עקביות.
  4. ביצוע מבחן מבוך Y קלאסי
    1. הכניסו בעדינות את הזבובים המורעבים של כל בקבוקון לבקבוקון הכניסה של מערך מבוך Y.
    2. לאפשר להם להתאקלם לתקופה קצרה; חבר את בקבוקון הכניסה עם מתאם Y מבוך כדי להתחיל את הבדיקה; והניחו לזבובים לטפס על זרועות מבוך ה-Y ולהילכד בשני תאי האיסוף. הגדר את משך הזמן של כל בדיקה לדקה אחת.
    3. בסיום, הקש בחזרה על הזבובים לתחתית בקבוקון הכניסה והחלף את מיקום הזרועות של מבוך Y כדי למנוע הטיית צד. קח ארבע קריאות עבור אותה קבוצה של זבובים.
    4. רשום את מספר הזבובים המטפסים על כל אחת משתי הזרועות של מבוך Y בתוך משך הזמן.
    5. חזור על הבדיקה עבור לפחות 8 אצוות כדי לקבל ערכת נתונים מייצגת.
  5. ניתוח ופרשנות של נתונים שנאספו
    1. כמת את התוצאות על ידי חישוב מדד הביצועים (PI), אשר יכול להיות מיוצג כהפרש בין מספר הזבובים הבוחרים בזרוע האוויר (A) לבין מספר הזבובים הבוחרים בזרוע הריח (O) כשבריר מהמספר הכולל של הזבובים המשתתפים.
    2. השתמש במבחנים סטטיסטיים ( מבחן t של סטודנט לא מזווג) כדי לבדוק אם PI של זבובים תמימים לעומת זבובים שנחשפו לריח הוא משמעותי.

תוצאות

בדיקת תוקפנות
כמודל ASD זבוב, זבובים מוטנטיים Fmr1 שימשו63,64. w1118 זכרים שימשו כביקורת ו-Fmr1 trans-heterozygote Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 זבובים זכרים כזבובי ניסוי; זכרים בוגרים שוכנו בצינורות בידוד במשך 5 ימים. זכרים הומוטיפיים (אותו גנוטיפ, אותם תנאי דיור) הוכנסו לזירת התוקפנות והתנהגותם תועדה במשך 20 דקות. המספר הכולל של התקפים אגרסיביים ב-20 דקות נספר עבור כל גנוטיפ. נמצא כי מספר ההתקפים התוקפניים במהלך 20 דקות היה מופחת באופן משמעותי במקרה של זכרים מוטנטיים מאשר אצל זכרי הביקורת (איור 1E). התוקפנות המופחתת הזו בזבובי Fmr1 יכולה לנבוע מהעניין המופחת באינטראקציה חברתית עם זבוב אחר. לעומת זאת, זבובים זכרים מוטנטיים מסוג Fmr1 ששוכנו בקבוצה/חברה מראים ספירת התקפי תוקפנות דומה לזו של 1118 זבובים ששוכנו חברתית (הנתונים אינם מוצגים), מה שמצביע ככל הנראה על תפקיד חיובי של הסביבה החברתית בהשראת התנהגות חברתית.

בדיקת מרחב חברתי
בדיקת המרחב החברתי בוצעה בזבובי w1118 ומודל ASD (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). המרחק לשכן הקרוב ביותר חושב עבור כל זבוב ובוצעו 10 שכפולים ביולוגיים עבור כל גנוטיפ. הזבובים המוטנטים מראים מרחקי שכנים קרובים יותר באופן משמעותי מאשר עמיתיהם בקבוצת הביקורת (איור 2D), מה שמצביע על העדפה להתרחקות גדולה יותר מזבובים אחרים.

בדיקת חיזור
בדיקת החיזור של זבובים זכרים חד-ביתיים בוצעה כדי לכמת את התנהגות החיזור המולדת של שני זבובי מודל ASD נפרדים. ראשית, התנהגות החיזור של זבובי Fmr1 transheterozygous הושוותה לזו של w1118; זבובי Fmr1 הראו מדד חיזור נמוך משמעותית, כמו גם מספר מופחת של ניסיונות הזדווגות (איור 3E1). בניסוי שני, Row, אורתולוג דרוזופילה של הגן האנושי POGZ (גן סיכון ASDנפוץ מאוד 20), הופל על ידי ביטוי מיקרו-רנ"א קצר שיער כנגד שורה בנוירונים בגוף פטריות באמצעות קו דרייבר MB247-GAL4. זבובי מודל ASD אלה נבדקו עבור כל פגם בדפוס החיזור המולד; מדד החיזור ומספר ניסיון ההזדווגות חושבו מסרטוני 15 דקות. זבובי השורה הראו ירידה משמעותית במדד החיזור, כמו גם ספירות של ניסיונות הזדווגות (איור 3E2), מה שמצביע על תקשורת לקויה שלהם כלפי נקבות.

התנהגות טיפוח
התנהגות טיפוח משמשת כקריאה להתנהגות חוזרת בדרוזופילה 16,42,43. התנהגות הטיפוח כומתה בזבובי Fmr1 transheterozygote והושוותה לזו של w1118. זמן ההשהיה לטיפוח הראשון יורד באופן משמעותי בזבובי Fmr1, בעוד שמשך ההתקף והטיפוח הממוצע ומדד הטיפוח עולים באופן משמעותי בזבובי Fmr1 (איור 4C), מה שמצביע על התנהגות טיפוח משופרת (או חזרתית) בזבובי מודל ASD. לעומת זאת, המספר הכולל של התקפי הטיפוח בזבובים המוטנטים לא נמצא שונה באופן משמעותי בהשוואה לזה של זבובי הביקורת.

בדיקת הרגלת חוש הריח
הרגלה נמצאה פגומה במספר רב של אנשים אוטיסטים והיא יכולה לשמש כבדיקה לאותו הדבר בדרוזופילה23. כאן, הרגלת חוש הריח נבדקה במודל ASD על ידי הפלת שורה בנוירונים בין-עצביים מקומיים של חוש הריח המונעים על ידי LN1-GAL4. בניסויים אלה נעשה שימוש בריח מרתיע, 20% אתיל בוטיראט, כדי לגרום להרגלה בזבובים אלה. התוצאות מראות כי זבובים שנפלו בשורה לא התרגלו לאחר חשיפה לריח במשך 3 ימים (שני הפסים האחרונים בגרף באיור 5E אינם מראים הבדל משמעותי בין זבובים נאיביים לעומת זבובים מורגלים) בהשוואה לזבובים מסוג בר, זבובים המראים התרגלות אופיינית לאחר חשיפה לאתיל בוטיראט במשך 3 ימים (זבובים חשופים מראים ירידה משמעותית במדד הביצועים בהשוואה לזבובים נאיביים). זה מצביע על כך שזבובי ה-row-knockdown אינם מתרגלים לאחר חשיפה לאתיל בוטיראט במשך 3 ימים והם נדחים על ידי הריח הדוחה, מה שמוכיח שזבובי ASD אלה סובלים ממחסור בהרגלה.

figure-results-1
איור 1: זירת תוקפנות ודפוסי התנהגות מייצגים. (A) מערך זירת התוקפנות בצלחת בת 24 בארות עם מכסה מחורר לכניסת זבובים. כניסה: ממדים של זירה אחת עם מזון זבובים בתוכה. (B) תצלום של צינור חד-ביתי המכיל זבוב זכר יחיד ומבודד ובקבוקון של בית קבוצה המכיל זבובים זכרים ונקבות, המתארים סביבה חברתית. (ג) שואף להעברה מבוססת שאיפת פה של זבובים. פריטים הדרושים להרכבת שואב זבוב המציין את צידי הצינור לכניסת זבוב (קצה זבוב) ואת הצד שיוכנס לפה (קצה הפה) (C1) ושואב זבוב מורכב (C2). (D) דפוסי התנהגות תוקפניים מייצגים של גברים-גברים: התקרבות, איום כנפיים, סיף, אחיזה, ריאות, אגרוף והתכתשות. (E) זבובים זכרים מוטנטיים מסוג Fmr1 מראים התנהגות תוקפנית מופחתת כלפי זכרים אחרים בהשוואה לקבוצת הביקורת. תרשים תיבה המציג את מספר ההתקפים התוקפניים של זכרים מבודדים חברתית של w1118 (בקרה) לעומת Fmr1 זבובים טרנס-הטרוזיגוטיים (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הגדרת זירת בדיקת מרחב חברתי. (A) דיאגרמה המציגה מידות וסידור של שמשות זכוכית וספייסרים אקריליים. (B) הסידור הסופי של רכיבי הזירה שבהם הספייסרים האקריליים דחוקים בין חלקי הזכוכית, ומשאירים רווח קטן לכניסת זבובים בתחתית. החלל המשולש שנוצר בין חתיכות זכוכית לספייסרים הוא זירת SSA עבור הזבובים, כאן הזבובים מסוגלים לנוע רק בשני ממדים. (C) תצלום של מערך הזירה הסופי של SSA עם זבובים בתוך התא. קיצור: SSA = מערך מרחב חברתי. (D) זבובי מודל ASD (Fmr1 transheterozygous) מראים התרחקות מוגברת זה מזה בבדיקת המרחב החברתי בהשוואה ל-w 1118. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
תרשים 3: זירת החיזור ודפוסי התנהגות מייצגים. דיאגרמות המציגות (A) עיצוב ו-(B) סידור הדיסקים בזירת בדיקת חיזור. (ג) צילום זירת החיזור לאחר ההסדר הסופי. (D) תמונות מייצגות המציגות דפוסי התנהגות של חיזור של זכר תמים כלפי נקבה מזווגת: מרדף, התמצאות, הבהוב כנפיים, ליקוק, ניסיון הזדווגות והזדווגות. (E) חלקות המציגות מדד חיזור ומספר ניסיונות הזדווגות בשני מודלים של ASD: (E1) זבובים מוטנטיים Fmr1 המראים ירידה משמעותית במדד החיזור ובניסיון ההזדווגות בהשוואה לקבוצת ביקורת w1118 . (ה2) זבובי שורה שימשו כמודל ASD נוסף שבו שורה-shRNA בא לידי ביטויבתאי עצב מסוג bod y פטריות (MB247-GAL4); ירידה משמעותית בהתנהגות החיזור נצפתה עם הפלת שורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: הגדרת זירה ודפוסי התנהגות מייצגים של התנהגות טיפוח. (A) הדיסק או הזירה בצורת גלגל (אותה זירת חיזור שמוצגת באיור 3) מותקנת על לוח LED עם מפזר להארה אחידה מלמטה, והווידאו צולם מלמעלה. זה מבטיח ניגודיות גבוהה יותר הנדרשת לזיהוי תנועה עדינה של תוספות במהלך הטיפוח. (B) תצלומים של דפוסי התנהגות טיפוח שנצפו אצל זבובים זכרים בוגרים. T1 = זוג רגלייםאחד , T2 = זוג רגלייםשני , T3 = זוג רגליים שלישי. מינוח אינטואיטיבי מקוצר משמש לתבניות טיפוח ב-B: T1-head= ראש משופשף ברגליים ראשונות; T1-T1 = זוג הרגליים הראשון שפשף יחד, וכן הלאה. קיצור: LED = דיודה פולטת אור. (C) גרפים המראים תוצאות בדיקת טיפוח שבוצעו בזבובים טרנס-הטרוזיגוטיים Fmr1 והושוו ל-w1118. זבובים מוטנטיים Fmr1 הראו השהיה מופחתת משמעותית עבור התקף הטיפוח הראשון, מה שמצביע על תחילת הטיפוח המוקדמת בהשוואה לקבוצת הביקורת. יתר על כן, משך התקף הטיפוח הממוצע ומדד הטיפוח גדלו באופן משמעותי במוטציות Fmr1 , דבר המצביע על התנהגות חוזרת משופרת בזבובי מודל ASD. לעומת זאת, המספר הכולל של התקפי הטיפוח לא השתנה באופן משמעותי בזבובים המוטנטים בהשוואה לקבוצת הביקורת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: אינדוקציה והגדרת בדיקה להרגלת חוש הריח ותוצאה מייצגת לאחר הבדיקה. (A) רכיבים של מערך בדיקת בחירת הריח הבינארי: (A1) מבוך Y, (A2) המתאם, (A3) הסידור של שני אלה, (A4) זוג צינורות איסוף לחיבור בחלק העליון של זרועות מבוך Y, (A5) בקבוק הזכוכית ושפופרות הזכוכית לשמירה על תמיסת הריח או המים שדרכם יבעבע האוויר לפני שיעבור למבוך Y. (ב) התקנת בקבוק מזון זבוב להשראת הרגלה של חוש הריח; דיאגרמה מצוירת (B1) מראה כיצד צינור מיקרופוגה המכיל ריח תלוי מחוט נחושת באמצע הדרך בתוך הבקבוק; (B2) לבסוף, פתח הבקבוק מכוסה בכותנה ואטום במעטפות נייר חומות. (C) תמונה של הסידור הכולל של מערך מבוך Y. (D) תצלומים המראים את התפלגות הזבובים בתאי איסוף לאחר סיום ניסוי. (ד1) זבובים נאיביים (החשופים לפרפין חסר ריח בלבד, בקרה) מראים דחייה כלפי הריח המרתיע (20% אתיל בוטיראט המשמש להשראת הרגלה במחקר זה) ובוחרים בזרוע מבוך Y המלא באוויר רגיל ואילו (D2) זבובים חשופים (מורגלים) מתפלגים באופן שווה בשתי הזרועות. קיצור: ID = קוטר פנימי. (E) תוצאות בדיקת הרגלת חוש הריח של זבובי שורה הראו פגם בהרגלה. זבובי בר (קנטון S), לאחר חשיפה של 3 ימים לאתיל בוטיראט, הראו ירידה משמעותית במדד הביצועים בהשוואה לזבובים תמימים, דבר המעיד על הרגלה. כאשר צאצאים של זבובי LN1-GAL4 x row-shRNA נחשפו במשך 3 ימים, מדד הביצועים לא נמצא שונה באופן משמעותי מזה של זבובים תמימים; זה מוכיח שזבובי השורה האלה לא התרגלו בחשיפה של 3 ימים לריח, מה ששיחזר סימפטום אנושי דמוי ASD. קיצורים: ASD = הפרעת הספקטרום האוטיסטי; shRNA = RNA קצר סיכת ראש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

דרוזופילה משמשת כאורגניזם מודל משובח למחקר בהפרעות נוירולוגיות בבני אדם בשל רמה גבוהה של שימור רצפי גנים בין גנים של זבובים ומחלות אנושיות9. פרדיגמות התנהגותיות חזקות רבות הופכות אותו למודל אטרקטיבי לחקר פנוטיפים המתבטאים במוטציות המשחזרות מחלות אנושיות. מכיוון שמאות גנים מעורבים בהפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD), לא קיים מודל ASD משותף בשום אורגניזם מודל. לכן, עבור כל מוטציה, החוקרים חייבים תחילה לקבוע פנוטיפים דמויי ASD בזבוב. במאמר זה, ניסינו לייעל את התהליך על ידי הצעת שימוש בחמש פרדיגמות התנהגותיות של זבובים בתיאום להערכה כזו. פרדיגמות אלה משמשות בזבובים כדי להעריך ליקויים התנהגותיים עיקריים ונפוצים של חולי ASD אנושיים: ליקויים חברתיים ותקשורתיים, שיפור התנהגויות חוזרות ונשנות ופגם התרגלות. אם מוטציה בגן זבוב מראה פגמים בכל או ברוב חמש הפרדיגמות הללו, זה יכול להיות אינדיקציה חזקה לתרחיש דמוי ASD.

רוב הפרדיגמות ההתנהגותיות המתוארות כאן שימשו פעמים רבות בספרות קודמת לפתרון שאלות מחקר מגוונות. אין זה נדיר למצוא וריאציות בטכניקות בין מחקרים שונים. השינויים בטכניקות נעשו כדי להתאים לצורך המחקרי ולהתאים לדרישה של השאלה הספציפית הנפתרת. לדוגמה, במבחן החיזור, ניתן לכמת התנהגות חיזור מולדת ומלומדת כלפי זבוב בוחן שיכול להיות זכר לא בוגר65, נקבה בתולה66,67, נקבה טרום זיווג 68,69,70, נקבה בתולה שנהרגה בהקפאה 65, או אפילו נקבה ערופת ראש19. בשיטה המתוארת במאמר זה, נקבות בר שהזדווגו מראש שימשו כבודק כדי לבדוק את דפוס החיזור של זבוב מודל ASD זכר. כושר הקבלה שלנקבה טרום זיווג נמוך יחסית לזה של זבוב בתולי71. כתוצאה מכך, מספר התקפי החיזור הגבריים ומשכם הם יותר כלפי נקבה מזווגת מאשר כלפי בתולה; באופן דומה, ההשהיה להזדווגות ארוכה יותר גם מזו של נקבות בודקות בתולות, ובמקרה כזה ההזדווגות המוקדמת מובילה לירידה במדד החיזור, מה שמקטין את טווח ההשוואה היעילה בין גנוטיפים. לפיכך, השימוש בנקבה מזווגת מראש כבודק מספק ניתוח השוואתי טוב יותר של התנהגות החיזור של זבוב ASD לעומת זבוב מסוג פראי. מצד שני, השימוש בנקבות בתולות עשוי לספק מידע נוסף שעשוי להיות מוסווה כאשר משתמשים בנקבות מזווגות. השימוש בנקבות מזווגות עשוי גם להשפיע ולשנות את התנהגות החיזור הגברי. לסיכום, מוצע לחוקרים לבחור את אסטרטגיית הניסוי שלהם ואת הפירוט בהתאם לצורך של הניסוי הספציפי.

יש להיזהר כאן לפני יישום הטכניקה בכל או בכל הומולוגי הזבובים של גנים אוטיסטים. כל הפרדיגמות ההתנהגותיות הללו מוסדרות על ידי מספר מסוים וקטן של נוירונים. ביטוי של גן מסוים חייב להיקבע תחילה לפני שממשיכים לפרדיגמה התנהגותית מסוימת. לדוגמה, אם הומולוג הזבוב של גן הקשור ל- ASD אינו מתבטא בנוירונים בגוף פטריות או נוירונים גלוטמטרגיים, אז התנהגות החיזור והטיפוח עשויה שלא להיות מושפעת מהמוטציה שלו.

נקודה נוספת שהחוקרים צריכים להיזהר ממנה היא שהיעדר פגם לא תמיד אומר שלמוטציה אין תפקיד. לדוגמה, בניסויי התנהגות הטיפוח עם מוטציות Fmr1 , ספירת ההתקפים הכוללת של הטיפוח אינה נמוכה משמעותית במוטנטים מאשר בקבוצת הביקורת, בעוד שפרמטרים אחרים כמו מדד הטיפוח וכו' מראים פגם בהתנהגות הטיפוח. ניתן להסביר זאת על ידי התארכות כל התקף טיפוח במוטציות Fmr1 , וכתוצאה מכך ספירה נמוכה של מספר ההתקף הכולל למרות שמשך ההתקף הכולל גבוה בהרבה. זה מדגיש את הצורך בכימות של פרמטרים מרובים עבור כל דפוס התנהגות. יתר על כן, יש לזכור כי המונח ASD מכסה מגוון רחב של מחלות הנגרמות על ידי וריאציות בכל אחד ממאות הגנים, וכתוצאה מכך פנוטיפים הטרוגניים עם דרגות שונות של חדירה בקרב האנשים המושפעים. לדוגמה, גירעון התרגלות הוא ציין בחלק מהחולים אבל לא בכולם. אותו הדבר צפוי במודלים של זבובים של המחלה.

לצורך ניתוח התנהגות תוקפנית נלקחו בחשבון במחקר זה סוגים שונים של פרמטרים תוקפניים: ריאות, איום כנף, התנגשות וכו' (איור 1)30. יש לזהות ולספור כל התקף כסוג התקף בודד או כספירת התקף כוללת. חשוב להכיר תחילה את דפוסי התוקפנות של זבובים זכרים, המתואריםב-59,72 ומוצגים באיור 1. בעת ספירת מספרי התקף אגרסיבי, יש לזהות בבירור את נקודות ההתחלה והסיום של אירוע תוקפנות יחיד; סוגים רבים של דפוסי תוקפנות עשויים להופיע בתוך התקף אחד, ואחריו סוף ההתקפה. התקף תוקפנות נחשב להסתיים כאשר זבוב מפסיק להראות כל אחת מההתנהגויות או התנועה התוקפנית למשך 2 שניות או עוצר את ההתקף ומתחיל ללכת.

לרוב הפרדיגמות ההתנהגותיות הללו יש וריאציות והתקדמות מרובות המתוארות על ידי מעבדות מרובות. כל אחד מהשינויים הספציפיים נוצר כדי לענות על הצרכים של מטרה מסוימת. באופן דומה, טכניקות כימות או ניתוח אוטומטיות ומבוססות אלגוריתמים שחררו טכניקות אלה מהסיכוי לשגיאות ידניות. במאמר זה, הטכניקות הבסיסיות ביותר הודגמו עם הכמות הקטנה ביותר של דרישות חומריות, בתקווה כי טכניקות אלה ניתן לאמץ בקלות ולהשתמש על ידי מספר מקסימלי של חוקרים.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

אנו מודים מאוד למאני רמאסוואמי (NCBS, בנגלור) ולבאסקר בקטבצ'אלו (IIT מנדי) על מערך בדיקת ההרגלה ובחירת הריח, לפוואן אגרוואל (MAHE) על הצעותיו יקרות הערך על מבחן התוקפנות, לאמיטאבה מג'ומדר (NCCS, פונה) על שיתוף אב הטיפוס של תא בדיקת החיזור שלו וקווי הזבוב המוטנטים Fmr1 , ולגאורב דאס (NCCS, פונה) על שיתוף קו MB247-GAL4. אנו מודים למרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה (BDSC, אינדיאנה, ארה"ב), המכון הלאומי לגנטיקה (NIG, קיוטו, יפן), אוניברסיטת בנרס הינדו (BHU, ורנסי, הודו) והמרכז הלאומי למדעי הביולוגיה (NCBS, בנגלור, הודו) על קווי דרוזופילה . העבודה במעבדה נתמכה על ידי מענקים מ- SERB-DST (ECR/2017/002963) ל- AD, מלגת DBT Ramalingaswami שהוענקה ל- AD (BT / RLF / RE-ENTRY / 11/2016), ותמיכה מוסדית מ- IIT Kharagpur, הודו. SD ו-SM מקבלים מלגות דוקטורט מ-CSIR-Senior Research Fellowship; ראש הממשלה מקבל מלגת דוקטורט מ-MHRD, הודו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<זירת תוקפנות חזקה>חזקה:
צלחת סטנדרטית של 24 בארות עשויה פוליסטירן12 ס"מ x 8 ס"מ x 2 ס"מ. קוטר באר בודדת = 18 ס"מ. #Z707791 סיגמא-אולדריך; עומק = 1 ס"מ
יריעתחלופה: מכסה מחורר של צלחת תרבית תאים
<חזק>מבחן מרחב חברתי:
קליפס19 מ"מ
יריעות זכוכית ויריעות אקריליק בגדליםעובי = 5 מ"מ
<חזק>בדיקת חיזור:
אגוז ובורג עם הברגה
יריעות פרספקס בצורות מותאמותאישיתט) מכסה: דיסק פרספקס עגול ושקוף בהתאמה אישית (עובי 2-3 מ"מ, קוטר 70 מ"מ) עם חור טעינה אחד באזור ההיקפי וחור בורג נוסף במרכז (קוטר ~ 3 מ"מ לכל אחד); ii) דיסק פרספקס שני שקוף ועבה יותר (עובי 3-4 מ"מ, קוטר 70 מ"מ), עם 6-8 נקבים בקוטר 15 מ"מ, במרחק שווה מהמרכז; iii) בסיס: זהה למכסה למעט ללא חור הטעינה
<חזק>בדיקת טיפוח: < / חזק >
פאנל10– פאנל LED הניתן להרכבה על התקרה 15 וואט
<חזק>הרגל ובדיקת מבוך Y
תאי טיפוסx2, מתאם זכוכית בורוסיליקט
לחיבור מבוך Y עם בקבוקוןפרספקס, בהתאמה אישית, מדידות בבקבוקי ריאגנט <חזקים>איור 5A
שקופיםBorosil #1500017
פקק שטיפתBorosil #1761021
בקבוקוןOD= 25 מ"מ x גובה = 85 מ"מ; ריח זכוכית בורוסיליקט
(אתיל בוטיראט)Merck #E15701
שעוות פרפין (נוזלית) אורSRL #18211
מהדקיפולימד #14098
צינורותOD = 0.6 ס"מ, מזהה = 0.3 ס"מ; מהדקי רולר לבקרת זרימה
משאבתHana #HN-648 (כל משאבת אקווריום עם כיוון זרימה הפוך ידנית)
מבוךזכוכית בורוסיליקט
צינור זכוכית בצורת Y (זכוכית בורוסיליקט)בהתאמה אישית, מדידות ב<חזק>איור 5A
><חזק>פריטים נפוצים:
כל תוכנה להפעלת וידאו (למשל - נגן מדיה VLC)https://www.videolan.org/vlc/
מחשב לניתוח
בקבוקיOD = 60 מ"מ x גובה = 140 מ"מ; בקבוקוני
זבובOD = 25 מ"מ x גובה = 85 מ"מ; תוכנת פריזמה מזכוכית בורוסיליקט
https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
<חזק>לשואב זבובים:
סופג כותנה, חיטוי
Parafilmסיגמא-אולדריץ'
#P7793 טיפיםלפיפטה 200 ומיקרו; L או 1000 ומיקרו; L, בחר depeding על הקוטר החיצוני של צינור הסיליקון אורך צינור סיליקון
/גומי= 30-50 ס"מ. הצינור צריך להיות חסר ריח
<חזק>הרכב מזון זבובים: < / חזק>
מרכיבים (כמות ל -1 ליטר מזון)
אגר (8 גרם)SRL # 19661 (CAS: 9002-18-0)
קורנפלור (80 גרם)אורגני, נרכש
מקומי D-גלוקוז (20 גרם)SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
חומצה פרופיונית (4 גרם)SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
סוכרוז (40 גרם)SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
טגו (מתיל פרה הידרוקסי בנזואט) (1.25 גרם)SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
אבקת שמרים (10 גרם)HIMEDIA # RM027
<קווי זבוב חזקים>זבובים ששימשו בניסויים במחקר זה:
סוג בר (קנטון S או CS)BDSC # 64349
w1118BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ 50M]/TM6B, Tb[+]BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ 113M]/TM6B, Tb[1]BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)BDSC # 50742
LN1-GAL4NP1227, קונסורציום NP, יפן
row-shRNABDSC # 25971
שקוף פלסטיק/אקריליק שקופה קלסר מותאמים אישית LED מכוסה זכוכית מפוזרת כניסה גז זכוכית רולר סיליקון ואקום Y נתוני וידאו זבוב זכוכית / פוליפרופילן תוכנת ImageJ טיימר https://imagej.net/downloads מצלמת וידאו עם הגדרת הקלטת וידאו מצלמת וידאו או מצלמת טלפון נייד תעבוד

מקורות

  1. American Psychiatric Association. American Psychiatric Association DSM-5 Task Force Diagnostic and statistical manual of mental disorders: DSM-5TM, 5th ed. , Am. Psychiatr. Publ. Inc. (2013).
  2. Zeidan, J., et al. Global prevalence of autism: A systematic review update. Autism Res. 15 (5), 778(2022).
  3. Lordan, R., Storni, C., De Benedictis, C. A. Autism spectrum disorders: diagnosis and treatment. Autism Spectr Disord. , Exon Publications. (2021).
  4. Horev, G., et al. Dosage-dependent phenotypes in models of 16p11.2 lesions found in autism. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 17076-17081 (2011).
  5. Bey, A. L., Jiang, Y. Overview of mouse models of autism spectrum disorders. Curr Protoc Pharmacol. 66 (1), 1(2014).
  6. Fetit, R., Price, D. J., Lawrie, S. M., Johnstone, M. Understanding the clinical manifestations of 16p11.2 deletion syndrome: a series of developmental case reports in children. Psychiatr Genet. 30 (5), 136-140 (2020).
  7. Nicolini, C., Fahnestock, M. The valproic acid-induced rodent model of autism. Exp Neurol. 299, 217-227 (2018).
  8. Tartaglione, A. M., Schiavi, S., Calamandrei, G., Trezza, V. Prenatal valproate in rodents as a tool to understand the neural underpinnings of social dysfunctions in autism spectrum disorder. Neuropharmacology. 159, 107477(2019).
  9. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophilamelanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  10. Coll-Tane, M., Krebbers, A., Castells-Nobau, A., Zweier, C., Schenck, A. Intellectual disability and autism spectrum disorders "on the fly": Insights from Drosophila. DMM Dis Model Mech. 12 (5), 1-16 (2019).
  11. Tian, Y., Zhang, Z. C., Han, J. Drosophila studies on autism spectrum disorders. Neurosci Bull. 33 (6), 737-746 (2017).
  12. Ueoka, I., Pham, H. T. N., Matsumoto, K., Yamaguchi, M. Autism spectrum disorder-related syndromes: Modeling with Drosophila and rodents. Int J Mol Sci. 20 (17), 1-24 (2019).
  13. Yost, R. T., et al. Abnormal social interactions in a Drosophila mutant of an autism candidate gene: Neuroligin 3. Int J Mol Sci. 21 (13), 1-20 (2020).
  14. Wise, A., et al. Drosophila mutants of the autism candidate gene neurobeachin (rugose) exhibit neuro-developmental disorders, aberrant synaptic properties, altered locomotion, impaired adult social behavior and activity patterns. J Neurogenet. 29 (2-3), 135-143 (2015).
  15. Koemans, T. S., et al. Functional convergence of histone methyltransferases EHMT1 and KMT2C involved in intellectual disability and autism spectrum disorder. PLoS Genet. 13 (10), e1006864(2017).
  16. Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated levels of the vesicular monoamine transporter and a novel repetitive behavior in the Drosophila model of fragile X syndrome. PLoS One. 6 (11), e27100(2011).
  17. Iyer, J., et al. Pervasive genetic interactions modulate neurodevelopmental defects of the autism-associated 16p11.2 deletion in Drosophilamelanogaster. Nat Commun. 9 (1), 1-19 (2018).
  18. Palacios-Muñoz, A., et al. Mutations in trpγ, the homologue of TRPC6 autism candidate gene, causes autism-like behavioral deficits in Drosophila. Mol Psychiatry. 27 (8), 3328-3342 (2022).
  19. Hahn, N., et al. Monogenic heritable autism gene neuroligin impacts Drosophila social behaviour. Behav Brain Res. 252, 450-457 (2013).
  20. Stessman, H. A. F., et al. Disruption of POGZ is associated with intellectual disability and autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 98 (3), 541-552 (2016).
  21. Hope, K. A., et al. The Drosophila gene sulfateless modulates autism-like behaviors. Front Genet. 10, 574(2019).
  22. Stessman, H. A. F., et al. Targeted sequencing identifies 91 neurodevelopmental-disorder risk genes with autism and developmental-disability biases. Nat Genet. 49 (4), 515-526 (2017).
  23. Fenckova, M., et al. Habituation learning is a widely affected mechanism in Drosophila models of intellectual disability and autism spectrum disorders. Biol Psychiatry. 86 (4), 294-305 (2019).
  24. Trannoy, S., Chowdhury, B., Kravitz, E. A. Handling alters aggression and "loser" effect formation in Drosophilamelanogaster. Learn Mem. 22 (2), 64-68 (2015).
  25. Anderson, D. J. Circuit modules linking internal states and social behaviour in flies and mice. Nat Rev Neurosci. 17 (11), 692-704 (2016).
  26. Flanigan, M. E., Russo, S. J. Recent advances in the study of aggression. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 241-244 (2018).
  27. Sun, Y., et al. Social attraction in Drosophila is regulated by the mushroom body and serotonergic system. Nat Commun. 11 (1), 1-14 (2020).
  28. Nilsen, S. P., Chan, Y. B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophilamelanogaster. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12342-12347 (2004).
  29. Kravitz, E. A., Fernandez, M. delaP. Aggression in Drosophila. Behav Neurosci. 129 (5), 549-563 (2015).
  30. Chen, S., Lee, A. Y., Bowens, N. M., Huber, R., Kravitz, E. A. Fighting fruit flies: a model system for the study of aggression. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (8), 5664-5668 (2002).
  31. Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly (Austin). 6 (1), 35-48 (2012).
  32. Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J Vis Exp. (2), e155(2007).
  33. Agrawal, P., Kao, D., Chung, P., Looger, L. L. The neuropeptide Drosulfakinin regulates social isolation-induced aggression in Drosophila. J Exp Biol. 223 (2), 207407(2020).
  34. Wang, L., Dankert, H., Perona, P., Anderson, D. J. A common genetic target for environmental and heritable influences on aggressiveness in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (15), 5657-5663 (2008).
  35. Simon, A. F., et al. A simple assay to study social behavior in Drosophila: Measurement of social space within a group. Genes Brain Behav. 11 (2), 243-252 (2012).
  36. Corthals, K., et al. Neuroligins Nlg2 and Nlg4 affect social behavior in Drosophilamelanogaster. Front Psychiatry. 8, 113(2017).
  37. Cao, H., Tang, J., Liu, Q., Huang, J., Xu, R. Autism-like behaviors regulated by the serotonin receptor 5-HT2B in the dorsal fan-shaped body neurons of Drosophilamelanogaster. Eur J Med Res. 27 (1), 1-15 (2022).
  38. Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophilamelanogaster behavior - A new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
  39. Shilpa, O., Anupama, K. P., Antony, A., Gurushankara, H. P. Lead (Pb)-induced oxidative stress mediates sex-specific autistic-like behaviour in Drosophilamelanogaster. Mol Neurobiol. 58 (12), 6378-6393 (2021).
  40. Dockendorff, T. C., et al. Drosophila lacking dfmr1 activity show defects in crcadian output and fail to maintain courtship interest. Neuron. 34 (6), 973-984 (2002).
  41. Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. J Neurogenet. 35 (1), 1-22 (2021).
  42. Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. J Vis Exp. (125), e55231(2017).
  43. Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, e34497(2018).
  44. Webb, S. J., et al. Toddlers with elevated autism symptoms show slowed habituation to faces. Child Neuropsychol. 16 (3), 255-278 (2010).
  45. Kleinhans, N. M., et al. Reduced neural habituation in the amygdala and social impairments in autism spectrum disorders. Am J Psychiatry. 166 (4), 467-475 (2009).
  46. Ethridge, L. E., et al. Reduced habituation of auditory evoked potentials indicate cortical hyper-excitability in Fragile X Syndrome. Transl Psychiatry. 6 (4), e787-e787 (2016).
  47. McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis. Neurosci Biobehav Rev. 80, 286-305 (2017).
  48. Kuiper, M. W. M., Verhoeven, E. W. M., Geurts, H. M. Stop making noise! Auditory sensitivity in adults with an autism spectrum disorder diagnosis: physiological habituation and subjective detection thresholds. J Autism Dev Disord. 49 (5), 2116-2128 (2019).
  49. McDiarmid, T. A., et al. Systematic phenomics analysis of autism-associated genes reveals parallel networks underlying reversible impairments in habituation. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (1), 656-667 (2020).
  50. Lyons-Warren, A. M., Herman, I., Hunt, P. J., Arenkiel, B. A systematic-review of olfactory deficits in neurodevelopmental disorders: From mouse to human. Neurosci Biobehav Rev. 125, 110-121 (2021).
  51. Kepler, L. D., McDiarmid, T. A., Rankin, C. H. Habituation in high-throughput genetic model organisms as a tool to investigate the mechanisms of neurodevelopmental disorders. Neurobiol Learn Mem. 171, 107208(2020).
  52. Huang, T. N., Yen, T. L., Qiu, L. R., Chuang, H. C., Lerch, J. P., Hsueh, Y. P. Haploinsufficiency of autism causative gene Tbr1 impairs olfactory discrimination and neuronal activation of the olfactory system in mice. Mol Autism. 10 (1), 1-16 (2019).
  53. Twick, I., Lee, J. A., Ramaswami, M. Chapter 1 - Olfactory habituation in Drosophila-odor encoding and its plasticity in the antennal lobe. Prog Brain Res. 208, 3-38 (2014).
  54. Das, S., et al. Plasticity of local GABAergic interneurons drives olfactory habituation. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (36), E646-E654 (2011).
  55. Devaud, J. M., Acebes, A., Ferrús, A. Odor exposure causes central adaptation and morphological changes in selected olfactory glomeruli in Drosophila. J Neurosci. 21 (16), 6274-6282 (2001).
  56. Ayyub, C., Paranjape, J., Rodrigues, V., Siddiqi, O. Genetics of olfactory behavior in Drosophilamelanogaster. J Neurogenet. 6 (4), 243-262 (1990).
  57. Michel, C. I., Kraft, R., Restifo, L. L. Defective neuronal development in the mushroom bodies of Drosophila fragile X mental retardation 1 mutants. J Neurosci. 24 (25), 5798-5809 (2004).
  58. Fernandez, M. P., Trannoy, S., Certel, S. J. Fighting flies: quantifying and analyzing Drosophila aggression. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 107985(2023).
  59. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  60. Simon, A. F., et al. Drosophila vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181 (2), 525-541 (2008).
  61. McNeil, A. R., et al. Conditions affecting social space in Drosophilamelanogaster. J Vis Exp. (105), e53242(2015).
  62. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  63. Drozd, M., Bardoni, B., Capovilla, M. Modeling Fragile X Syndrome in Drosophila. Front Mol Neurosci. 11, 124(2018).
  64. Trajković, J., et al. Drosophilamelanogaster as a model to study Fragile X-associated disorders. Genes (Basel). 14 (1), 87(2022).
  65. Gailey, D. A., Jackson, F. R., Siegel, R. W. Male courtship in Drosophila: the conditioned response to immature males and its genetic control. Genetics. 102 (4), 771-782 (1982).
  66. Cannon, R. J. C. Drosophila courtship behaviour. Courtship and Mate-finding Insects. , 1-13 (2023).
  67. von Philipsborn, A. C., Shohat-Ophir, G., Rezaval, C. Single-pair courtship and competition assays in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (7), 450-459 (2023).
  68. Keleman, K., Krüttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nat Neurosci. 10 (12), 1587-1593 (2007).
  69. Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. J Vis Exp. (124), e55808(2017).
  70. Fitzsimons, H. L., Scott, M. J. Genetic modulation of Rpd3 expression impairs long-term courtship memory in Drosophila. PLoS One. 6 (12), e29171(2011).
  71. Kubli, E. My favorite molecule. The sex-peptide. BioEssays. 14 (11), 779-784 (1992).
  72. Dierick, H. A. A method for quantifying aggression in male Drosophilamelanogaster. Nat Protoc. 2 (11), 2712-2718 (2007).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מודל אוטיזם בבצילומה (Drosophila)פרדיגמות התנהגותיותבדיקת מרחב חברתיבדיקת תוקפנותהתנהגות חיזורהתנהגות הדרשבהבדיקת הרגלההפרעות התפתחותיות נוירולוגיותהשתקה גנטית (Gene Knockdown)התנהגות חזרתית
פרדיגמות להערכה התנהגותית במודל דרוזופילה של הפרעת הספקטרום האוטיסטי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.