מאמר שיטה

פיתוח גשושית ביו-היברידית מבוססת מיקרוסקופ כוח אטומי מבוסס יתושים

DOI:

10.3791/66675

⸱

26 באפריל 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, McGill University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים כמותיים ומבוקרים של התנהגויות עקיצת חרקים חיוניים לגיבוש אסטרטגיות יעילות למאבק במחלות המועברות על ידי וקטורים. בהקשר זה מוצגת שיטה לייצור מיקרוסקופ כוח אטומי ביו-היברידי (AFM).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יתושים, הידועים לשמצה כבעלי החיים הקטלניים ביותר לבני אדם בשל יכולתם להעביר מחלות, מהווים אתגר מתמשך לבריאות הציבור. אסטרטגיית המניעה העיקרית הנמצאת בשימוש כיום כוללת חומרים דוחי כימיקלים, אשר לעתים קרובות מתגלים כלא יעילים מכיוון שיתושים מפתחים עמידות במהירות. כתוצאה מכך, המצאת שיטות מניעה חדשות היא חיונית. פיתוח כזה תלוי בהבנה מעמיקה של התנהגויות עקיצת יתושים, מה שמחייב מערך ניסויי שמשכפל במדויק תרחישי עקיצה אמיתיים עם פרמטרים של בדיקה נשלטת ומדידות כמותיות. כדי לגשר על פער זה, הונדס מיקרוסקופ כוח אטומי ביו-היברידי (AFM), הכולל עוקץ ביולוגי - במיוחד, לברום יתושים - כקצהו. בדיקה ביו-היברידית זו, התואמת למערכות AFM סטנדרטיות, מאפשרת סימולציה כמעט אותנטית של התנהגויות חדירת יתושים. שיטה זו מסמנת צעד קדימה במחקר הכמותי של מנגנוני עקיצה, מה שעשוי להוביל ליצירת מחסומים יעילים נגד מחלות המועברות על ידי וקטורים (VBDs) ולפתוח אפיקים חדשים במאבק במחלות המועברות על ידי יתושים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ארגון הבריאות העולמי (WHO) דיווח כי מחלות המועברות על ידי וקטורים (VBDs) מהוות מעל 17% מכלל המחלות הזיהומיות, הגורמות ליותר מ -7,00,000 מקרי מוות בשנה ברחבי העולם. לדוגמה, כחיה הקטלנית ביותר בעולם, יתושים מפיצים פתוגנים רבים, כגון דנגי, מלריה וזיקה, באמצעות פרוקי רגליים הניזונים מדם, וכתוצאה מכך 700 מיליון זיהומים מדי שנה1. מחקרים לקראת פיתוח אמצעים יעילים למניעת VBDs הם בעלי חשיבות מכרעת, כולל חיקוי התנהגויות החדירה של יתושים כדי לחקור את מנגנוני העקיצה שלהם ומחקרים על חסמים פוטנציאליים כדי להוכיח את יעילותם במניעת חדירה. אתגר מרכזי אחד הוא לפתח גישות מתאימות לביצוע חקירות כאלה. נעשו מאמצים בספרות, כולל פיתוח מחטים בקנה מידה זעיר הדומות לגיאומטריה של עוקץ יתושים; עם זאת, רבים מהחומרים המשמשים לייצור מיקרו-מחטים אלה (כלומר, חומרים ויסקו-אלסטיים2, סיליקון (Si), זכוכית, קרמיקה3 וכו ') הם בעלי תכונות מכניות שונות מאשר החומר הביולוגי של היתוש. החומרים המהונדסים יכולים להיות שבירים ונוטים לשבר ואבזמים 3,4, בעוד שחוטמו של היתוש יכול לעמוד בשבר או באבזם טוב יותר4. היתרון של בדיקה ביו-היברידית המשתמשת בלברום של יתוש במקום בחומרים מהונדסים הוא שהיא יכולה להיות ייצוג מדויק יותר של מנגנון הפירסינג של יתושים. כמו כן, יש לשלב כלים מיוחדים עם מחטי מיקרו לביצוע מחקרים כמותיים, כגון מדידה מדויקת של כוח5, שאינה ניתנת להשגה בקלות עם הגדרות מותאמות אישית באמצעות מיקרו-מחטים מהונדסות.

הגישה המבוססת על מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מבטיחה בכך שהיא פועלת על ידי שימוש במקל עם קצה דק במיוחד הממוקם בזהירות קרוב לפני השטח של הדגימה. הקצה יכול לסרוק לרוחב או להילחץ לכיוונ/לתוך משטח, חווה כוחות מושכים או דוחים משתנים עקב האינטראקציות שלו עם מדגם6. אינטראקציות אלה מובילות לסטייה של הקנטילבר, אשר עוקבת על ידי השתקפות של קרן לייזר מראש הקנטיליבר אל פוטו-גלאי6. הרגישות יוצאת הדופן לתנועה של המערכת מאפשרת ל-AFM לבצע מגוון רחב של מדידות, כולל, אך לא רק, מיפוי מורפולוגי בדיוק פיקומטר, מדידות כוח החל מפיקוניוטון ועד מיקרוניוטון, וחקירות מולטיפיזיקליות מקיפות7. לדוגמה, ניתן לבצע הזחות AFM כדי להעריך במדויק את התגובה לכוח המופעל של מדגם וגם כדי למדוד את הקשיות, האלסטיות ותכונות מכניות אחרות של מדגם על ידי צימוד עם מודלים אנליטיים מתאימים8. הגשושית של AFM עשויה לרוב מסיליקון (Si) או סיליקון ניטריד (Si3N4)8 באורך של 20-300 מיקרומטר9 ורדיוס קצה בסדר גודל של כמה עד עשרות ננומטרים10. רדיוס קצה קנה המידה הננומטרי יכול להיות אידיאלי עבור יישומים כגון הדמיה ברזולוציה גבוהה; עם זאת, אין לו את המאפיינים של עוקצים ביולוגיים למחקרים המנסים לחקות התנהגויות חדירה במונחים של נוקשות, רדיוס, צורה ויחס גובה-רוחב. לדוגמה, מבנה המיקרו-מחט של יתוש הוא הפשיקל, שיש לו יחס גובה-רוחב של ~6011 (אורך ~ 1.5 מ"מ עד 2 מ"מ; קוטר ~ 30 מיקרומטר)12. בעוד שניתן להניח שגשושית AFM קונבנציונלית דומה לעקיצות ביולוגיות כמו לברום, התכונות והממדים החומריים הייחודיים שלה לא ישקפו את המצב האמיתי במהלך נשיכה.

כדי לאפשר חקירה כמותית של התנהגויות חדירה המחקות עקיצות ביולוגיות של חרקים או בעלי חיים אחרים עם עוקץ, כאן מפותח תהליך לייצור מכלי AFM ביו-היברידיים עם עוקץ ביולוגי כקצהו. כמקרה בוחן, הודגם בהצלחה מקל AFM עם קצה לברום יתוש מחובר. תוך רתימת מידע קיים מהספרות על כוחות ההחדרה האופייניים שיתוש משתמש בהם כדי לחדור דרך עורו של קורבן12,13, AFM ביו-היברידי זה יכול לאפשר חיקוי כמעט אמיתי של עקיצות יתושים תחת AFM רגיל. הפרוטוקול של מינוף עוקצים מיקרו-ביולוגיים לייצור מיכלי AFM ביו-היברידיים יכול להיות מיושם גם בפיתוח של מכלי AFM ביו-היברידיים חדים אחרים מבוססי עוקץ חד לחקירות כמותיות של מגוון מנגנוני נשיכה.

טרמינולוגיות
סכמה של חוטם ומרכיבי העניין שלו מוצגים באיור 1, וההגדרות שלהם הן: (1) פרובוסקיס: חלק גוף מפיו של יתוש המאפשר ליתוש להאכיל את עצמו, עם מבנה של קליפת ליבה המורכב מהפשקוויל (הליבה) והלאביום (קונכייה), (2) לאביום: הכיסוי החיצוני הכהה והקהה של חוטם2, (3) פשקוויל: קבוצה של מחטים דקות הכלולות בתוך הלביום, כולל שתי מקסילות, שתי לסתות, היפופרינקס ולברום2, (4) היפופרינקס: אחראי על הפרשת רוק למחזור הדם של הפונדקאי2, (5) מקסילה: חבר משונן המסייע במנגנון ההזנה2, (5) מנדבלים: בדומה למקסילה, הם מסייעים ליתוש במנגנון ההזנה ויש להם קצה חד2, (6) לברום: האיבר העיקרי לחדירה לעור הקורבן, שהוא הרבה יותר גדול מהמקסילה, הלסת התחתונה וההיפופרינקס. יש לו גם מבנים חושיים המאפשרים לו למצוא כלי דם ותעלות פנימיות מתחת לעור2, (7) מניפולטור: הרכבה עם שלוש דרגות חופש ודיוק בקנה מידה מיקרוני למיקום, המאפשר תנועה בכיווני XYZ, (8) הרכבת מהדק: מהדק 2 חלקים בהתאמה אישית המורכב על המניפולטור המשמש להידוק ה- AFM חסר הקצה במהלך הניסוי.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מין היתושים המשמש לפרוטוקול זה הוא נקבה בוגרת לא נגועה Aedes aegypti (A. aegypti), שקיבלה הקפאה ואוחסנה במקפיא של -20 מעלות צלזיוס. המין סופק על ידי NIH/NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center להפצה באמצעות BEI Resources, NIAID, NIH: Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. לנתח את labium מן proboscis

  1. בעזרת פינצטה, הניחו יתוש מת על מגלשת זכוכית מתחת למיקרוסקופ וודאו שיש קצה מחודד בקצה החוטם (איור 2A).
  2. בזמן שאתם שומרים את היתוש על מגלשת הזכוכית, הניחו להב אזמל בעדינות מעל הלביום ליד ראשו של היתוש (איור 2B).
  3. ממשיכים לבצע חתך לאורך כל החצי העליון של הלביום (חתך של כ 80 מיקרומטר) עם עומק חדירה רדוד דרך עובי הלביום. הקפידו להפעיל לחץ קל על הלהב כדי לחתוך רק את הלביום אך לא את הפאשקוויל שנמצא מתחת.
  4. בעזרת זוג פינצטה, החזיקו היטב את ראש היתוש, ובעזרת זוג פינצטה מדויק נוסף, צבטו קלות את הלביום בכל מיקום בין הקצה המחודד למיקום החתך (איור 2B).
    1. משכו את הפינצטה שמחזיקה את הלביום לכיוון הקצה המחודד (איור 2C). המשיכו למשוך את הפינצטה עד שהלביום נקרע והוסר לחלוטין מהפשקוויל.
  5. הניחו את היתוש מתחת למיקרוסקופ ובדקו אם קצה הלברום קיים. אפשר לזהות זאת על-ידי נוכחות של קצה מחודד על הפשקוויל (איור 2D).

2. הפרדת קצה הלברום משאר חברי הפשקוויל

  1. מהדקים וסוגרים את הקצוות של סט פינצטות מדויקות ומניחים את קצה הפינצטה ממש ליד הלברום ליד קצהו.
  2. השתמשו בקצה הפינצטה כדי להפעיל כוח עדין על הלברום בכיוון המאונך לאורך הפאשקוויל (איור 3A).
  3. המשיכו לדחוף את הלברום על פני מגלשת הזכוכית עד שתושג הפרדה של הלברום משאר חברי הפשקוויל.
  4. בדקו את הדגימה תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהושגה הפרדה נכונה בין הלברום לבין חברי פשקוויל אחרים (איור 3, משמאל). אם ההפרדה נכשלה, עיין שוב בשלב 2.1.

3. חיתוך קצה הלברום

  1. בזמן שהלברום עדיין על מגלשת הזכוכית, הניחו להב אזמל מעל הלברום במרחק של כ~200 מיקרומטר מקצה הלברום (איור 4A). הפעילו בעדינות לחץ מספיק וחתכו את קצה הלברום עד הסוף. בעוד קצה הלברום צריך להיות קצר ככל האפשר, ~ 200 מיקרומטר הוא הטוב ביותר שהגישה הנוכחית יכולה להתמודד איתו.
  2. מדדו את אורך הלברום החתוך כדי לוודא שאורכו אינו עולה על 300 מיקרומטר (איור 4B) באמצעות כל תוכנת מדידה דיגיטלית. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש ב- ImageJ14.

4. תופסים את קצה הלברום

  1. בעזרת זוג פינצטות מדויקות, אתרו ובודדו את קצה הלברום במגלשת הזכוכית. השליכו את כל החלקים שנותרו על מגלשת הזכוכית מלבד קצה הלברום.
  2. עם אותה פינצטה מדויקת, צובטים לאט ובקלילות את הלברום כך שהקצה החתוך חופשי וללא הפרעה על ידי הפינצטה. כמו כן, יש לוודא שהכיוון של הלברום מקביל לכיוון אורך הפינצטה והקצה החתוך של הלברום מצביע הרחק מגוף הפינצטה.
  3. לאחר שהדגימה נצבטה היטב, הסירו את כוח ההידוק המחזיק את קצות הפינצטה יחד. קצה הלברום יידבק לאחד מקצות הפינצטה.
  4. תחת מיקרוסקופ, בדקו את קצות הפינצטה וודאו שקצה הלברום נמצא על אחד מקצות הפינצטה (איור 5). אם קצה הלברום אינו נמצא בפינצטה, יש לחזור לשלב 4.2, ואם קצה הלברום אינו על הפינצטה וגם לא על מגלשת הזכוכית, יש לחזור לשלב 1.

5. מריחת אפוקסי על קרן הקצוות

  1. הניחו טיפה (~0.05 מ"ל) אפוקסי על קצה מגלשת זכוכית חדשה על ידי הטלת הדבק ישירות מהבקבוק/מיכל המקורי שלו. הניחו את מגלשת הזכוכית המכילה אפוקסי מתחת לתחנת הבדיקה והתמקדו בה.
  2. הרכיבו את מכלול המהדק ללא קצה על מכלול המהדק על ידי אבטחת הבסיס (כלומר, הקצה הגדול יותר), והותירו את קצה הפתח חופשי ותלוי בחלל. ודא שהחלק התחתון של מזנון AFM פונה כלפי מטה.
  3. הרכיבו את המניפולטור על תחנת הבדיקה.
  4. הרם את ציר Z של המניפולטור למצב שבו הקנטייבר חסר הקצה נמצא כמה מילימטרים מעל מגלשת הזכוכית המכילה אפוקסי.
  5. הזז ידנית את המניפולטור כך שהמעצור חסר הקצה יהיה גלוי בתצוגת השדה של המצלמה בתחנת הבדיקה.
  6. באמצעות המניפולטור, הזיזו את ה-AFM לאורך כיווני X ו-Y עד שקצה המזנון מונח ישירות מעל האפוקסי בקצה מגלשת הזכוכית.
  7. בעזרת המניפולטור שוב, הורידו באיטיות את המזנון חסר הקצה בכיוון Z מעבר לקצה מגלשת הזכוכית.
  8. כאשר המזנון מונמך ומתקרב למגלשת הזכוכית, המשיכו להוריד את המזנון לאט מאוד עד שהוא נוגע לראשונה באפוקסי. אין להנמיך את המגן עוד.
  9. בזהירות, הפעילו את המניפולטור כדי להזיז את הקנטיל באיטיות בכיוון X או Y והסירו את הקנטיל ממאגר האפוקסי על ידי הזזת הקנטיל ברציפות בכיוון שנבחר עד שהקנטיל מופרד לחלוטין מהאפוקסי במגלשת הזכוכית. למיכל חסר הקצה צריכה להיות בועה מיניאטורית של אפוקסי בקצהו, הנראית מתחת לתחנת הבדיקה.
  10. הרם את המגן בכיוון Z באמצעות המניפולטור.

6. הצמדת קצה הלברום לקורה ללא קצה

  1. סובב את המניפולטור על הציר הארוך של הקנילטור ב -90 מעלות והנח את המניפולטור על תחנת הבדיקה על צידו. בתצורה זו, העוביים לאורך ה-AFM הוא בכיוון האנכי.
  2. מקם את הפינצטה המדויקת המכילה את קצה הלברום מתחת למצלמת תחנת הבדיקה, כך שכל אורך קצה הלברום יהיה גלוי על צג המחשב.
  3. מקם את מכלול המניפולטור המחזיק את המהדק ואת הקנטליבר חסר הקצה מתחת למצלמת תחנת הגשוש, כך שכל אורכו של המהדק ללא קצה נראה על צג המחשב.
  4. מקדו את המיקרוסקופ של תחנת הגשושית על קצה הלברום ועל הקנטיליבר חסר החוד.
  5. כיוון את המזנון בניצב לקצה הלברום על-ידי סיבוב זהיר וידני של המניפולטור (איור 6A).
  6. באמצעות דרגות החופש של המניפולטור, הזיזו באיטיות את הקנטיליבר חסר הקצה בכיווני XY כך שהדבק שעל הקנטיל ייגע בקצה החתוך של קצה הלברום (איור 6B).
  7. לרפא את אפוקסי, מצק את המפגש בין cantilever ו יתושים labrum.
  8. לאחר שהאפוקסי נרפא, הפעילו בעדינות את המניפולטור בכיווני XY והרחיקו את המזנון מהפינצטה, תוך אימות שקצה הלברום עומד כעת על קרן הקנטיל חסרת הקצה (איור 6C).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמונות של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של גשושית AFM ביו-היברידית מפוברקת ניתן למצוא באיור 7. קצה הלברום הודבק בהצלחה לקורה חסרת החוד. בשל העקמומיות הטבעית של עוקץ יתושים ואת הפעולה הידנית של הפרוטוקול המוצג, קשה מאוד להשיג cantilever עם קצה עוקץ בניצב לחלוטין cantilever. הזווית הלא מרכזית בין העוקץ לקו מרכז דמיוני בניצב למקל היא בדרך כלל ~10 מעלות. למרות שזו נראית בעיה נפוצה בעת הרכבת גשושית לכלי AFM15, יש לקחת בחשבון את הנטייה הבלתי מכוונת בעת ביצוע ניתוח כוח/מתח. יהיה מעניין שמחקרים עתידיים יתמקדו בשיפור פרוטוקול הייצור ויבצעו מחקרים באמצעות הגשושית הביו-היברידית. זהו הניסיון הראשון ליצור גשושית AFM ביו-היברידית באמצעות עוקץ של חרק.

figure-results-1
איור 1: סכמה של פרובוסקיס של יתוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הסרת הלביום של יתוש (A) יתוש עם חוטם מלא המראה נוכחות של קצה מחודד שלם. (B) מיקום חתך הלביום ומיקום הפינצטה על הלאביום בתהליך הסרת הלאביום. (C) כיוון משיכת הפינצטה במהלך הסרת הלביום. (D) הפאשק הסופי שנותח עם קצה שלם לאחר הסרת הלביום, כאשר קצה הלברום המחודד עדיין קיים ושלם. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הפרדת הלברום מחברי פשיל לא רצויים. (A) מיקום הפינצטה וכיוון דחיפת הפינצטה כטכניקה להפרדת איברי ה-proboscis fascicle. (B) חוטם לאחר מניפולציה כדי להפריד את הלברום מחברים פשקווילים אחרים. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: בידוד של קצה הלברום הרצוי להרכבה על מכלי AFM. (A) מיקום חתך הלברום להסרת קצה הלברום. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (B) קצה הלברום, לאחר שנחתך מגוף הלברום, הוא בערך 200-300 מיקרומטר אורך. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: הרכבת קצה הלברום לפינצטה לפני תהליך ההדבקה. קצה הלברום נדבק לקצה של אחת הפינצטה, כאשר הקצה הלא חתוך של הלברום חופשי ומצביע הרחק מגוף הפינצטה. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: רצף להרכבת קצה הלברום לקנטיליבר חסר החוד. (A) כיוון הקנטיליבר חסר הקצה במצב ניצב ביחס ללברום. (B) מיזוג הדבק חסר החוד עם הלברום וריפוי דבק האפוקסי המשמש למיצוק המפרק בין שני המרכיבים. (C) הגשושית הביו-היברידית AFM האחרונה שנרפאה מבלי שהלברום נתמך על ידי הטוויטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: תמונות SEM של גשושית AFM ביו-היברידית. (A) מבט גלובלי על קצה הלברום ועל הקנטיליבר חסר הקצה. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (B) תצוגה מוגדלת של קצה הלברום. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלב 1 של הפרוטוקול נועד לנקות את הדגימה הביולוגית של הלביום הלא רצוי. כדי להשיג זאת, מבצעים חתך על הלביום, אבל לא על הפשקוויל, שנמצא ישירות מתחת ללאביום (איור 1). מכיוון שהפאשיל והלביום אינם מחוברים זה לזה בממשק שלהם (כלומר, הלביום חופשי להחליק לאורך הפאשקוויל ונשמר במקומו רק על ידי חיבורו לראש היתוש), החתך המבוצע נועד להפריד חלק מהלביום מראשו של היתוש, ובכך להקל על הסרת הכיסוי החיצוני. כאשר הלביום נשלף מהדגימה, הטכנאי אמור לחוות התנגדות קלה הנגרמת על ידי החצי התחתון של הלביום שעדיין מחובר ליתוש. צפוי שכוח התנגדות זה ישתחרר בקלות יחסית מכיוון שהחתך יקדם התפשטות סדק של החומר הביולוגי, ובכך יגרום למקטע הלא חתוך של הלביום להיקרע ויגרום ללביום כולו להחליק מהפאשקוויל במהלך פעולת המשיכה. אם נעשה חתך לא מספיק, הטכנאי עלול לחוות התנגדות מוגזמת במהלך המשיכה ומומלץ לנסות חתך נוסף לפני שימשיך בפרוטוקול.

חשוב לתרגל מגע רך וסבלנות בשלב 1 ו -4 בעת מניפולציה של הלברום באמצעות צביטה בפינצטה. למרות שהלברום עמיד יחסית, הוא עדיין עלול לחוות נזק אם הוא נדחס על ידי הפינצטה בצורה אגרסיבית מדי. הטכנאי מונחה לצבוט קלות את הלביום/לברום, כלומר עליו להפעיל את כמות הכוח המינימלית הדרושה בפינצטה כדי להחזיק את הלביום/לברום. הערכת נוכחות הנזק יכולה להתבצע בסוף שלב 1 ושלב 4 בעת בדיקת הדגימה תחת המיקרוסקופ. מומלץ לבדוק את החוטם עבור כל חריגות לאורך שלה (כלומר, שקעים, קרעים, הפרדות במקטעים). אם יש חשד שדגימה פגומה בקצה הלברום, השליכו אותה והפעילו מחדש את הפרוטוקול.

שלבי תהליך מרכזיים של הפרוטוקול, כגון שלב 3 ושלב 6, דורשים טיפול מיוחד. כדי לבצע את שלב 3, יש לחתוך את קצה הלברום באופן ידני באמצעות אזמל. חיתוך קצר מדי יהפוך את שאר הניסוי לקשה יותר באופן אקספוננציאלי מכיוון שהוא יכול להיות קטן מדי למניפולציה. נהפוך הוא, אם אורך החוד עולה על 300 מיקרומטר, הוא הופך להיות ארוך מדי להרכבה על מכלי AFM בגלל הקיזוז הניצב המוגזם המוכנס בין קצה הלברום לקנטיליבר AFM. היסט זה מונע על ידי פגמים בתהליך ההרכבה ו / או עקמומיות שעשויה להיות נוכחת בדגימה, אשר שניהם הופכים בעייתיים באורכי לברום גדולים יותר. כמו כן, cantilevers עם קצוות ארוכים מאוד יהיה קשה מאוד לשימוש תחת AFM גם כן. במהלך שלב 3, חשוב לציין כי כל סגנונות הפשקוויל (לברום, מקסילה, לסת והיפופרינקס) צפויים להיחתך בהליך זה. הלברום יהיה ממוקם ומבודד בקלות מהסטילטים הנותרים בשלב 4 בגלל ההפרדה הידנית שבוצעה במהלך שלב 2. בשלב 6, למרות שכמעט בלתי אפשרי לוודא שהקצה תקין לחלוטין למיקרוסקופ אופטי, עדיין יש צורך למזער את זווית הנטייה כדי למנוע תנאי העמסה לא רצויים בשימוש עתידי.

חשוב גם לבחור את האפוקסי הנכון לחיבור העוקץ למיכל AFM. נבדקו אפוקסי שני חלקים שונים בעלי ריפוי איטי, אשר הוכחו מאוחר יותר כלא אידיאליים מכיוון שכל רטט קטן של רצפת המעבדה במהלך תהליך הריפוי יכול לגרום לניסוי להיכשל. לפיכך, אפוקסי הניתן לריפוי UV אומץ בסופו של דבר. הדבק המשמש הוא אפוקסי בצמיגות נמוכה, ריפוי מהיר המסוגל לרפא בתוך 5 שניות של חשיפה UV. עם התמצקותו, הדבק הופך להיות קשיח מאוד ובעל חוזק מצוין, מה שגורם לגשושית הלברום המפוברקת להתנהג כגוף אחד ולא להיכשל או להתעוות במקום ההדבקה. אפשרות זו סיפקה מספיק זמן לפני הריפוי כדי להגדיר את ההתקנה במיקום הנכון להיצמדות העוקץ למגן AFM (שלב 6.3) תוך ביטול בעיות הקשורות לתנודות סביבתיות עקב התנהגות הריפוי שלו בפקודה.

שאר הציוד החיוני בפרוטוקול זה הוא תחנת הבדיקה, הפינצטה החדה והקנטילבר. תחנת הבדיקה המשמשת מצוידת בעדשת 5x המותקנת על המצלמה; עם זאת, אין זה הכרחי להשתמש במודל תחנת בדיקה מדויק זה עבור פרוטוקול זה. בעת בחירת תחנת הגשושית, העדיפות היחידה היא להבטיח ראות ברורה וקלה של מזנון AFM והלברום. הפינצטה החדה בה נעשה שימוש הייתה בגודל קצה של 0.5 מ"מ על 0.1 מ"מ. חובה להשתמש בפינצטה בממד קצה זה או דומה לו מכיוון ששימוש במלקחיים בעלי עדינות נמוכה יותר עלול להוביל לקושי במהלך המניפולציה של הלברום. הקנטייבר המשמש בפרוטוקול זה מתקבל ממקור מסחרי (ראה טבלת חומרים). דגם זה נבחר בשל קשיחותו הגבוהה מכיוון שיש להעביר כוח גדול לקצה הגשושית על מנת לחקות חדירת עור בחיים האמיתיים. באופן כללי, עבור כל הגשושיות המבוססות על עוקץ, מקל AFM אינו יכול להיות רך מדי מכיוון שחוסר קשיחות יוביל לכיפוף של הקנטיליבר במהלך בדיקת AFM, מה שבתורו יוביל לחוסר התפתחות לחץ בקצה הגשושית העוקץ. זה יגרום לגשושית לחקות באופן לא מדויק את תהליך הצריבה, ובכך להפוך את מכלי AFM קשיחים מאוד ללא קצה לדרישה עבור פרוטוקול זה.

לסיכום, יש יתרונות ייחודיים לשימוש בבדיקת AFM ביו-היברידית מבוססת עוקץ למחקרי חדירה/עקיצות מכניים כמותיים בהשוואה לשיטות אחרות הדורשות יתושים חיים ומתנדבים אנושיים 4,11,12 לבצע מחקרים דומים. רזולוציית החישה הגבוהה במיוחד של AFM יכולה לאפשר מדידה בדיוק חסר תקדים, והגשושית הביו-היברידית מאפשרת חיקוי כמעט מציאותי של תרחישי נשיכה אמיתיים, תוך שילוב מספר מובהק סטטיסטית של מדידות ללא צורך במתנדבים אנושיים 4,11,12. בנוסף, החומרים המשמשים לייצור מיקרו-מחטים מהונדסות, נוטים בדרך כלל לשבר או לאבזם 3,4, שאינו מייצג את הפרובוסקיס של היתוש. שימוש בחלקי היתוש עצמם דומה יותר לתרחיש העקיצות האמיתי. פרוטוקול זה יכול להיות מפותח עוד יותר ואוטומטי לייצור בתפוקה גבוהה. לבסוף, הפרוטוקול שפותח יכול לשמש לייצור גשושיות AFM ביו-היברידיות אחרות באמצעות עוקצים של בעלי חיים שונים למחקרים כמותיים של התנהגויות נשיכה/חדירה שונות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגוד עניינים להצהיר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים על תמיכת המימון של קרן הגבולות החדשים במחקר של קנדה (NFRF), תוכנית גילוי מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC), ומלגות ההכשרה לתואר שני Fonds de Recherche du Québec Nature et Technologies (FRQNT). המחברים גם רוצים להודות לקבוצתו של פרופ' יאויאו ז'או במקגיל על תמיכתם הטכנית בהדפסה תלת-ממדית של רכיבים מסוימים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
  5-SA-SE פינצטה מחודדת במיוחד מחודדתExceltaN/Aלמניפולציה/ניתוח של החרטום.
תחנת בדיקה C-4DEverbeing Int' l קורפ לא זמיןמשמש להרכבת AFM.
מצב הקשה ללא טיפ שלוחהNanoAndMore ארה"TL-NCHAFM שלוחה המשמשת להרכבת הלברום.
המפרט מוצג כאן:

<חזק>צורה: קרן
<חזק>קבוע כוח: 42 N/m (10 - 130 N/m)
<חזק>תדר תהודה: 330 קילו-הרץ (204 - 497 קילו-הרץ)
<חזק>אורך: 125 ומיקרו; M (115 - 135 ומיקרו; m)
<חזק>רוחב: 30 ומיקרו; m (22.5 - 37.5 & מיקרו; m)
<חזק>עובי< / חזק>: 4 ומיקרו; M ( 3 - 5 ומיקרו; m)
UV ExpoxyLet's resinALR00146לחיבור עוקץ.
ב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. Global vector control response 2017–2030. World Health Organization. , (2017).
  2. Gurera, D., Bhushan, B., Kumar, N. Lessons from mosquitoes’ painless piercing. J Mech Behav Biomed Mater. 84, 178-187 (2018).
  3. Ma, G., Wu, C. Microneedle, bio-microneedle and bio-inspired microneedle: A review. Journ of Contr Relea. 251, 11-23 (2017).
  4. Kong, X., Wu, C. Micronano structure and mechanics behavior of mosquito’s proboscis biomaterials with applications to microneedle design. Advan Mater Res. 299-300, 376-379 (2011).
  5. Li, A. D. R., Putra, K. B., Chen, L., Montgomery, J. S., Shih, A. Mosquito proboscis-inspired needle insertion to reduce tissue deformation and organ displacement. Sci Rep. 10 (1), 12248(2020).
  6. Meyer, E., Hug, H. J., Bennewitz, R. Introduction to Scanning Probe Microscopy. Scanning Probe Microscopy. 1, 1-13 (2004).
  7. García, R., Peréz, R. Dynamic atomic force microscopy methods. Surf Sci Rep. 47 (6), 197-301 (2002).
  8. Thurner, P. J. Atomic force microscopy and indentation force measurement of bone. WIREs Nanomed and Nanobio. 1 (6), 624-649 (2009).
  9. Müller, D. J., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat Nanotech. 3 (5), 261-269 (2008).
  10. Hussain, D., Ahmad, K., Song, J., Xie, H. Advances in the atomic force microscopy for -critical dimension metrology. Meas Sci Technol. 28 (1), 012001(2017).
  11. Kong, X. Q., Wu, C. W. Mosquito proboscis: An elegant biomicroelectromechanical system. Phys Rev E. 82 (1), 011910(2010).
  12. Kong, X. Q., Wu, C. W. Measurement and prediction of insertion force for the mosquito. J Bionic Eng. 6 (2), 143-152 (2009).
  13. Ramasubramanian, M. K., Barham, O. M., Swaminathan, V. Mechanics of a mosquito bite with applications to microneedle design. Bioinspir Biomim. 3 (4), 046001(2008).
  14. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij/docs/guide (2012).
  15. Dai, G., et al. Nanoscale surface measurements at sidewalls of nano- and micro-structures. Measur Sci and Technol. 18 (2), 334-341 (2007).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

AFM

מאמרים קשורים