מטריצת קרום מרתף צבירת תאים עטופה לחקר היווצרות רקמת טחול מורין

סיכום

מאמר זה מתאר פרוטוקול לצבירה ומעטפת של תאי טחול בתוך מטריצת קרום מרתף מוצקה למחצה. מבני מטריצת קרום מרתף יכולים לשמש בתרבית תלת ממדית לחקר התפתחות אורגנואידים, או למחקרי השתלות in vivo והתחדשות רקמות.

תקציר

הטחול הוא איבר חיסוני הממלא תפקיד מפתח בתגובות חיסוניות המועברות בדם. אובדן אנטומי או פונקציונלי של רקמה זו מגביר את הרגישות לזיהומים חמורים בדם ואלח דם. השתלה אוטומטית של פרוסות טחול שימשה קלינית להחלפת רקמות שאבדו ולשיקום תפקוד מערכת החיסון. עם זאת, המנגנון המניע התחדשות חזקה ומתפקדת אימונולוגית של רקמת הטחול לא הובהר במלואו. כאן, אנו שואפים לפתח שיטה לצבירה ומעטפת של תאי טחול בתוך מטריצה מוצקה למחצה על מנת לחקור את הדרישות התאיות להיווצרות רקמת הטחול. מבני תאים עטופים במטריצת קרום מרתף מקובלים הן על תרבית רקמת מבחנה של אורגנואידים תלת מימדיים והן על השתלה תחת קפסולת הכליה כדי להעריך ישירות את היווצרות רקמת vivo . על ידי מניפולציה של תאי הקלט לצורך צבירה ואנקפסולציה, אנו מראים כי תאי סטרומה ילודים PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- שמקורם בשתלים נדרשים להתחדשות רקמת הטחול תחת מודלים של השתלות בעלי חיים.

מבוא

קרע טראומטי של הטחול והופעת גושים טחול מרובים בגוף היה אחד הסימנים הראשונים לכך שרקמת הטחול הייתה בעלת יכולת התחדשות ^1,2. השתלות אוטומטיות של טחול הוכנסו מאוחר יותר למרפאה כדי לשמר את רקמת הטחול בחולים הזקוקים לכריתת טחול דחופה³. עם זאת, למרות היותו חלק מהפרקטיקה הקלינית במשך עשרות שנים, מעט מאוד ידוע על האופן שבו הטחול מתחדש. מודלים להשתלות בעלי חיים סיפקו תובנה לגבי פרמטרים רבים של התחדשות הטחול ותפקוד מערכת החיסון ^4,5. בפרט, שינויים ניסיוניים בשיטת הכנת השתל אפשרו להתחדשות רקמות להיחקר בפירוט רב יותר ברמה התאית והמולקולרית.

השתלות המערבות פרוסות טחול שלמות עוברות שלב של נמק המוני לפני שמבנה טחול חדש נבנה מחדש⁶. השלב הראשוני של נמק השתל מצביע על כך שרוב הרקמה המושתלת מורכבת בעיקר מתאי דם אדומים ולבנים והיא מיותרת להתחדשות הטחול. זה נחקר באופן ניסיוני על ידי אי הכללת תאים hematopoietic משתלי טחול לפני ההשתלה תחת כמוסת הכליה עכבר. כאן, החלק שאינו לויקוציטים / לא אריתרוציטים של הטחול, הכולל תאי סטרומה ואנדותל, הוכח כמספיק כדי לגרום להיווצרות רקמת דה נובו ⁷. רקמת סטרומה של הטחול יכולה להיות מעובדת עוד יותר לתרחיף של תא יחיד, מה שיאפשר שימוש בטכנולוגיות מיון תאים כדי לתפעל את הרכב השתל התאי. על ידי הסרה סלקטיבית של סוגי תאים מועמדים, זוהו שתי אוכלוסיות ^{תאי סטרומה} CD45-TER-119 שהיו חיוניות לפיתוח שתלים: אוכלוסיית תאים דמוית אנדותל CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ ואוכלוסיית תאים מזנכימליים PDGFRβ⁺ מוגדרת באופן רחב יותר⁸.

בניית שתלים מתאי הטחול משתנה מבחינת חומרי תמיכה ותהליכי העמסת תאים. טחול מהונדס רקמות הוכנו בעבר על ידי העמסת יחידות ספלניות על פיגום פולימרי חומצה פוליגליקולית/חומצה לקטית^{פולי-L 5,9}. באופן מעניין, תאי סטרומה של הטחול שנספגו בספוג קולגן לא הצליחו להיקלט, בעוד שתאי סטרומה שהצטברו והועמסו על יריעת קולגן סייעו להתחדשות הטחול⁸. השעיה של תאי סטרומה בטחול בתוך מטריצת מטריג'ל הוכחה גם כגורמת לצבירת תאים בתנאי תרבית תלת ממדית¹⁰. עם זאת, שיטה זו לא נבדקה לשימוש במודלים להשתלה. המטרה הכוללת של הפרוטוקול הנוכחי היא לצבור ולעטוף בכוח תאי סטרומה של הטחול ישירות בתוך מטריצת קרום המרתף, אשר לאחר מכן יכולים להיות מועברים למערכת תלת-ממדית של תרביות רקמה חוץ גופית או לשמש ככלי להשתלות מודל של בעלי חיים (איור משלים 1).

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים נערכו על פי פרוטוקולים ניסיוניים שאושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת קווינסלנד (UQBR/079/19).

1. איסוף רקמות והכנת תאי סטרומה

1. יש להרדים עכברים תורמי יילודים בני 0.5-1.5 יום ו/או נקבה BALB/c על ידי השראת היפותרמיה על ידי עטיפת בעלי חיים בתוך נייר הטישו והנחתם תחת קרח כתוש למשך >10 דקות.
   הערה: פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לזני עכברים שונים, לגילאים שונים ולמספר בעלי החיים.
2. הכינו כלי ניתוח סטריליים.
3. הנח את העכבר במצב צדדי ימני. יש לספוג את העור עם 80% אתנול ולבצע חתך של 1 ס"מ עם מספריים כירורגיים של איריס כדי לחשוף את דופן הצפק.
4. בצע חתך שני של 0.5 ס"מ מעל הטחול והשתמש בזוג מלקחיים עדינים כדי להרים בעדינות את הרקמה למעלה. השתמש זוג מספריים כירורגיים לחתוך את כלי הדם ואת הבלו את הרקמה. מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי המכילה מלח חוצץ פוספט קר כקרח (PBS). הסר את כל רקמת החיבור שנותרה המחוברת לטחול.
   הערה: סטריאומיקרוסקופ יכול לסייע לתנועות מוטוריות עדינות הדרושות למניפולציה של כלי ניתוח.
5. כדי לנתק רקמות שלמות, להעביר טחול ילודים (בריכות של 10 או פחות) לתוך השפה הפנימית של כובע צינור חרוטי הפוך 14 מ"ל. משבש באופן מכני רקמות בתנועת לחיצה באמצעות הקצה האחורי הפלסטי של בוכנה מזרק 1 מ"ל.
6. מניחים ומהדקים את המכסה היטב מעל צינור חרוטי 14 מ"ל המכיל 10 מ"ל PBS קר. הפוך את הצינור 5x כדי לשטוף את כל הרקמה המשובשת מהפקק לתוך הצינור.
7. חזור על שלב 1.6 עבור כל רקמה שנותרה.
8. השאירו את הצינור על קרח למשך דקה אחת כדי לתת לרקמה להתיישב לתחתית הצינור.
9. יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט (המכיל תאים המטופויטיים) על ידי העברת התמיסה דרך מסננת תאים הפיכה של 70 מיקרומטר.
10. שחזר את מקטע הסטרומה הלא מסיס על ידי היפוך המסננת ושטיפת רקמת סטרומה בחזרה לתוך צינור חרוטי 14 מ"ל באמצעות 2 מ"ל טריים שהוכנו על ידי Dulbecco's Modified Eagle Medium (sDMEM) המכיל 1 מ"ג / מ"ל Collagenase IV, 40 מיקרוגרם / מ"ל DNase I וסרום בקר עוברי 2% (FBS).
    אזהרה: Collagenase IV ו-Collagenase D הם חומרים מסוכנים ויש לטפל בהם בתוך ארון בטיחות ביולוגית עם ציוד מגן אישי מתאים.
11. כדי להכין תרחיף תא בודד, לעכל אנזימטית רקמות מאוגמות (עד 20) במשך 10 דקות ב 37 ° C עם סיבוב קבוע.
12. הוסף 4 מ"ל של sDMEM טרי מוכן המכיל 1 מ"ג / מ"ל Collagenase D, 40 מיקרוגרם / מ"ל DNase I, ו 2% FBS ישירות לצינור המכיל רקמת סטרומה. דגירה במשך 10 דקות נוספות ב 37 ° C עם סיבוב קבוע.
13. לעצור את העיכול על ידי הוספת 8 מ"ל של PBS קר כקרח. אסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
14. השליכו את הסופרנטנט, ושטפו תאים פעמיים על ידי השעיה מחדש ב-1 מ"ל של PBS קר וצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C. שמור תאים על קרח.
    הערה: ניתן לספור תאים ולהתאים אותם לריכוז הרצוי. זה עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור אוכלוסיות תאים שונות. באמצעות פרוטוקול זה, 0.5 x 10⁶- 1 x 10⁶ תאי סטרומה / טחול מחלימים בדרך כלל, בהתאם לגיל העכברים התורמים. ניתן באופן אופציונלי לצבוע תאים ולמיין FACS בשלב זה כדי להגדיר את הרכב התא.

2. אנקפסולציה מטריצה של צברי תאים

1. קצוות פיפטה סטריליים P200 מצננים מראש בתוך מקפיא בטמפרטורה של -20°C.
2. חותכים סרט מעבדה גמיש (למשל, Parafilm) לחתיכות בגודל 1 ס"מ x 2 ס"מ ומעקרים על ידי טבילה באתנול 80% למשך 10 דקות, ולאחר מכן PBS למשך 10 דקות. ניתן להכין מראש סרט מעבדה ולאחסן סטרילי.
3. הכן 0.5 x 10 6-2.5 x 10⁶ תאים על ידי צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות לשאוף את supernatant, משאיר כ 20 μL של נפח PBS הנותר. שמור את גלולת התא על קרח.
   הערה: ניתן לשאוף בעדינות את ה-PBS הנותרים מבלי להפריע לכדורית התא כדי לאשר את עוצמת הקול.
4. שאפו 2 μL של מטריצת קרום מרתף קרה כקרח לתוך קצה פיפטה P200 מקורר מראש, באמצעות פיפטור P20.
   הערה: מטריצת קרום מרתף מרוכזת מאוד (לדוגמה, Corning Matrigel Matrix High Concentration) מסייעת ביצירת תקע מוצק חזק.
5. סובבו בעדינות כדי להוציא את קצה הפיפטה. מותחים רצועה מעוקרת מראש של סרט המעבדה ומניחים אותה על קצה קצה הפיפטה, תוך הקפדה שלא לחדור את הסרט. ממשיכים לעטוף את החוד בסרט כדי לאטום את קצה הפיפטה. בזהירות מניחים את הקצה האטום ישירות על קרח, נזהרים לא לקרוע את הסרט.
6. השהה מחדש את גלולת התא ב- PBS הנותרת ושכב את התמיסה בעדינות מעל מטריצת קרום המרתף. שמור את המבנה על קרח.
7. הכן צינור צנטריפוגה על ידי הצבת צינור אשכול 1.2 מ"ל בתוך צינור חרוטי 14 מ"ל.
8. הניחו את קצה הפיפטה בתוך תצורת הצינור המקונן והצנטריפוגה בטמפרטורה של 400 x גרם ו-4°C למשך 5 דקות.
9. מקמו את הצינור החרוטי בנפח 14 מ"ל בכיוון אנכי ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות כדי לאפשר למטריצת קרום המרתף להתמצק בתוך קצה הפיפטה.
   הערה: ניתן להניח את הצינור החרוטי בנפח 14 מ"ל על קרח עד שיידרש ליישום במורד הזרם.

3. תרבות אורגנואידים תלת מימדית

1. בזהירות להסיר את הסרט מעבדה מן פיפטה קצה.
2. הכנס בוכנה דקה מנירוסטה דרך הפתח הגדול יותר של קצה הפיפטה.
3. יש לסלק את תקע המטריצה עד לשחרור דרך הקצה לבאר אחת של צלחת תרבית רקמה 6 בארות שאינה מטופלת המכילה 2 מ"ל של sDMEM בתוספת 10% FBS, 1x גלוטמקס, 1x חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 10 μM מעכב סלעים, 10 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, ו-50 מיקרומטר β-מרקפטואתנול.
   הערה: ניתן לכוונן את כלי תרבית הרקמה ואת נפח המדיה המתאים לפי הצורך.
   זהירות: NEAA, פניצילין/סטרפטומיצין ו-β-מרקפטואתנול הם חומרים מסוכנים ויש לטפל בהם בתוך ארון בטיחות ביולוגית עם ציוד מגן אישי מתאים.
4. תרבית אורגנואידים בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ ו-95% לחות למשך 4-12 שבועות.
5. החליפו חצי מהמדיום כל 5 ימים.
   הערה: אם אורגנואידים מתחילים להיצמד לצלחת תרבית הרקמה, מעבירים לבאר טרייה.

4. השתלת כמוסת כליה

1. הכינו כלי ניתוח סטריליים.
2. ביצוע השתלת כליה תת-קפסולרית של תקע מטריצת קרום המרתף:
   1. יש להרדים עכברה מושתלת BALB/c בת 8 שבועות עם איזופלורן בהתאם להנחיות האתיות של בעלי חיים מוסדיים.
      אזהרה: איזופלורן הוא חומר מסוכן. יש לסלק פסולת גז כדי למנוע כניסה לסביבת העבודה.
   2. הנח את העכבר במצב צדדי ימני.
   3. יש לגלח את השיער ממקום הניתוח ולחטא את העור בהתאם להנחיות המוסדיות.
      הערה: מומלץ לחטא את אתר הניתוח שלוש פעמים בתנועה מעגלית עם פילינג לסירוגין על בסיס יוד או על בסיס כלורהקסידין ואלכוהול.
   4. בצע חתך של 2 ס"מ בעור בניצב לעמוד השדרה כדי לחשוף את דופן הצפק.
      הערה: מספריים כירורגיים עדינים או להב אזמל יכולים לשמש לחתך בעור. על המשתמשים לפעול בהתאם להנחיות אתיות מוסדיות של בעלי חיים או לנוהלי הפעלה סטנדרטיים.
   5. בצע חתך קטן יותר של 0.5 ס"מ בקיר הצפק מעל הכליה.
      הערה: החתך צריך להיות משוער לרוחב הכליה כדי להבטיח שהכליה תישאר חיצונית במהלך ההשתלה.
   6. החלק החיצוני של הכליה דרך פתח הצפק על ידי הפעלת לחץ כלפי מטה באמצעות האגודל והאצבע המורה. ניתן להשתמש בזוג פינצטות טבעתיות כדי לסייע ליציאה החוצה. ודא שהכליה לחה לאורך כל ההליך על ידי יישום PBS סטרילי באופן קבוע באמצעות צמר גפן.
   7. תחת סטריאומיקרוסקופ, צבטו את השומן ההיקפי של כמוסת הכליה עם זוג מלקחיים עדינים במיוחד בקוטב אחד של הכליה. השתמש בזוג שני של מלקחיים עדינים במיוחד כדי לקרוע בעדינות את קרום קפסולת הכליה כלפי מעלה בכיוון מנוגד, וליצור פתח קטן.
   8. בזהירות להכניס את השיניים של מלקחיים אחד מתחת לקרום הקפסולה. השתמש בתנועת טאטוא איטית כדי להפריד את קרום הקפסולה מהפרנכימה של הכליות.
   9. הכינו את תקע מטריצת קרום המרתף להשתלה על ידי הסרת סרט מעבדה מקצה הפיפטה.
   10. הרימו את קפסולת הכליה באמצעות שן אחת של המלקחיים והכניסו את קצה הפיפט דרך הפתח, תוך דחיפתו לכיוון הקוטב הנגדי של הכליה.
   11. הכנס בוכנה חוטית לקצה פיפטה והרחק את תקע המטריצה תוך משיכת קצה הפיפטה מהכליה.
   12. להרטיב את הכליה עם PBS ולהפנים מחדש.
   13. סגור את דופן הצפק עם תפר אחד 5-0 Vicryl וסגור את העור עם שני autoclips.
   14. מתן משכך כאבים (בופרנורפין במינון 0.05-0.1 מ"ג/ק"ג תת עורית או בהתאם להנחיות האתיקה המוסדיות של בעלי חיים).
       אזהרה: בופרנורפין הוא חומר מסוכן ויש לטפל בו עם ציוד מגן אישי מתאים.
3. כבה את זרימת האיזופלורן אך שמור על זרימת החמצן דולקת כדי לאפשר לעכבר לנשום חמצן טהור עד שהוא מתחיל לצבור הכרה.
4. החזירו את העכבר לכלוב שלו. שמור על חום בעל החיים במהלך ההתאוששות על ידי הנחת הכלוב באופן חלקי על גבי כרית חימום או מתחת למנורת חום, ועקוב עד שהעכבר מתאושש לחלוטין מההרדמה.
5. יש לעקוב אחר ההתאוששות לאחר הניתוח בשבועיים הראשונים או לפי דרישת ההנחיות המוסדיות.

תוצאות

צבירת תאים חשובה לקידום מגע ואיתות בין תאים. עטיפת צברי תאים בתוך מטריצת קרום המרתף תמכה בשתי התרביות התלת-ממדיות ליצירת אורגנואידים של רקמת מבחנה והקלה על העברה מכנית של תאים לתוך קפסולת הכליה להשתלת שתל. כדי לבסס מבנים אלה, מטריצת קרום המרתף נשמרה תחילה במצב נוזלי בתנאים קרים כקרח. צבירת תאים הושגה לאחר מכן על ידי שכבות של תרחיף תאים מרוכז מעל ושימוש בכוח צנטריפוגלי כדי לדחוף תאים דרך המטריצה בעלת הצפיפות הגבוהה. אופטימיזציה של מהירות הצנטריפוגה (200-2000 x גרם) נדרשה כדי להשיג מיקום תא בשכבה האמצעית ...

דיון

הצבירה של תאי טחול בילודים בתוך תווך מוצק למחצה מייצגת שיטה בת קיימא ליצירת מבני טחול. פרוטוקולים דומים מבוססי ממברנות מרתף שימשו ליזום תרביות טחול תלת ממדיות¹⁰. כאן, אנו מראים כי מבני הטחול מתאימים באותה מידה למערכות תרבית אורגנואידים במבחנה , כמו גם למודלים של השתלת in vivo . יש לציין כי השתלת אורגנואידים של טחול בתרבית חוץ גופית טרם נבדקה, אך יהיה מעניין לקבוע את היכולת להתחדשות מלאה או חלקית של רקמת הטחול. פרוטוקול זה יורש גם טכניקות צבירת תאים שתוארו במחקרי השתלת טח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
96 באר פוליפרופילן 1.2 מ"ל צינורות אשכול	קורנינג		CLS4401 להצבה בתוך צינור חרוטי של 14 מ"ל
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	מלאי 55 מ"מ, השתמש ב-50 uM
קולגנאז D	Roche	11088858001
קולגנאז IV	סיגמא-אולדריץ'	C5138	מ-Clostridium histolyticum
deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I מלבלב בקר, סוג II-S, אבקה ליופילית, חלבון ו-ge; 80%, ≥ 2,000 יחידות/מ"ג חלבון
Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 מ"ג/ליטר גלוקוז, L-גלוטמין וסודיום ביקרבונט, ללא נתרן פירובט, נוזל. סטרילי מסונן.
תמיסת מלח פוספט בופר (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	ללא סידן כלורי ומגנזיום כלוריד,
Eclipse 200 &mu בסינון סטרילי; l טיפים לפיפטה	Labcon	1030-260-000	נקודת שיפוע
(FBS)	Gibco	26140-079	Lot # 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, השתמש ב-1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix קרום בסיס בריכוז גבוה, Lot # 7330186
MEM חומצות אמינו לא חיוניות	Gibco	11140076	מלאי 100X, שימוש ב-1X
פניצילין/סטרפטומיצין	Gibco	15140122	מלאי 10,000 יחידות/מ"ל פניצילין, 10,000 ug/ml סטרפטומיצין
מסננת תאים הפיכה	STEMCELL Technologies	27216	70 μ m
פינצטת טבעת	NAPOX	A-26	גודל טבעת: 3 מ"מ
מעכב סלעים (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R צנטריפוגה	Thermofisher		מהירויות האצה והאטה הוגדרו ל-8
פינצטה עדינה במיוחד	EMS	78340-51S	סגנון 51S. פינצטה מפלדה אוסטניטית SA נמוכה פחמן אנטי מגנטית/אנטי חומצה עמידה בפני קורוזיה. גימור סאטן נגד סנוור.
Vicryl 5/0 תפר Ligapak סליל	Ethicon	J283G
Wiretrol II בוכנת חוט ארוך	Drummond	5-000-2002-L	בוכנת נירוסטה, 25 & 50 & mu; L/WRTL II, ארוך
קליפ פצע אפלייר	MikRon	427630
קליפס פצע	MikRon	427631	9 מ"מ

של Dulbecco סרום בקר עוברי