מאמר שיטה

מידול חוץ גופי של שקיעת שומן במחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי

DOI:

10.3791/66810

⸱

19 ביולי 2024

 ,  ,  ,  , 
1Inner Mongolia Medical University, 2Xilin Gol League Mongolian Medical Hospital, 3National and local Joint Mongolian Medicine R & D Engineering Center, 4Inner Mongolia Minzu University, 5Affiliated Hospital of Inner Mongolia Minzu University, 6Traditional Chinese & Mongolian Medical Research Institute of Inner Mongolia

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר את השימוש בתאי HepG2 הנגרמים על ידי חומצה אולאית כמודל למחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השכיחות של מחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי (MASLD) זינקה עקב שינויים בדפוסי הכלכלה ואורח החיים, מה שהוביל לאתגרים בריאותיים משמעותיים. דוחות קודמים בחנו את הקמתם של מודלים של בעלי חיים ותאיים עבור MASLD, תוך הדגשת ההבדלים ביניהם. במחקר זה, מודל תאי נוצר על ידי גרימת הצטברות שומן ב- MASLD. תאי HepG2 עוררו עם חומצת השומן הבלתי רוויה חומצה אולאית בריכוזים שונים (0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM) כדי לחקות MASLD. יעילות המודל הוערכה באמצעות בדיקות קיט-8 לספירת תאים, צביעת O אדום שמן וניתוח תכולת שומנים. מחקר זה נועד ליצור מודל תאי פשוט לתפעול עבור תאי MASLD. תוצאות ממבחני ערכת ספירת התאים 8 הראו כי הישרדותם של תאי HepG2 הייתה תלויה בריכוז חומצה אולאית, עם GI50 של 1.875 מילימול. כדאיות התאים בקבוצות 0.5 מילימטר ו-1 מילימטר הייתה נמוכה משמעותית מזו שבקבוצת הביקורת (P < 0.05). יתר על כן, בדיקת צביעת שמן אדום O וניתוח תכולת שומנים בחנו שקיעת שומן בריכוזים משתנים של חומצה אולאית (0.125 מילימול, 0.25 מילימול, 0.5 מילימול, 1 מילימול) על תאי HepG2. תכולת השומנים בקבוצות 0.25 mM, 0.5 mM ו- 1 mM הייתה גבוהה משמעותית מזו של קבוצת הביקורת (P < 0.05). בנוסף, רמות הטריגליצרידים בקבוצות OA היו גבוהות משמעותית מאלה בקבוצת הביקורת (P < 0.05).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי (MASLD) כוללת מגוון מצבים, כולל סטאטוזיס פשוט, סטיאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH), שחמת הכבד וקרצינומה הפטוצלולרית 1,2,3,4,5,6, כולם מיוחסים לגורמים אחרים מלבד צריכת אלכוהול7. MASLD היא מחלת הכבד הנפוצה ביותר הנגרמת על ידי פגיעה מטבולית בכבד, המשפיעה על כמעט רבע מאוכלוסיית העולם 8,9,10,11,12. בעוד שהפתוגנזה המדויקת של MASLD טרם הובהרה, תיאוריות שונות מנסות להסביר את התפתחותה. אחת התפיסות הרווחות מציעה סטייה מהתיאוריה הקלאסית של "שתי חבטות" לעבר מודל1 של "שתי חבטות". במרכז השערות אלה נמצא תפקידה של התנגודת לאינסולין, אשר מאמינים כי היא מרכזית בפתוגנזה MASLD13. מחקרים מצביעים על כך שתנגודת לאינסולין בהפטוציטים מובילה לרמות מוגברות של חומצות שומן חופשיות, וכתוצאה מכך יוצרת טריגליצרידים המאוחסנים בכבד14,15.

חוקרים השתמשו הן במודלים in vivo והן במודלים במבחנה כדי לדמות שקיעת שומן ב- MASLD; עם זאת, שכפול מלא של מנגנון הפתו-מנגנון שלו נותר מאתגר. למרות מגבלה זו, מודלים אלה סייעו בחקר מטרות טיפוליות פוטנציאליות עבור MASLD. עם זאת, פיתוח מודל יציב של MASLD הוא קריטי. בעוד מודלים של בעלי חיים הם יעילים, הם גוזלים זמן רב ויקרים, ובכך מדגישים את העניין הגובר במודלים תאיים חוץ גופיים . מודלים אלה משתמשים לעתים קרובות בחומצות שומן חופשיות בודדות או מרובות כגון חומצה אולאית (OA) וחומצה פלמיטית כדי ליצור מחדש MASLD המושרה על ידי דיאטה. בין אלה, קו תאי הפטובלסטומה האנושי HepG2 משמש לעתים קרובות כדי להקים מודלים תאיים במבחנה של MASLD.

אינדוקציה OA מגרה תאי HepG2 לשכפל שקיעת שומן בדומה ל- MASLD, שיטה עם היסטוריה מבוססת היטב. מטרת מחקר זה הייתה להדגים את הכדאיות, צביעת שמן אדום O (ORO), תכולת שומנים ורמת טריגליצרידים (TG) של תאי HepG2 שטופלו ב- 0.25 mM OA. מטרת ניסוי זה הייתה לספק ראיות נוספות לפיתוח מחקרי מודלים של MAFLD.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. תרבית תאים

  1. תאי תרבית HepG2 בצלוחיות תרבית המכילות את מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) (המכיל 10% נסיוב בקר עוברי [FBS], 100 יחידות / מ"ל פניצילין, וסטרפטומיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל). שמור על צלוחיות התרבית ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 .

2. השפעת חומצה אולאית על כדאיות התא כפי שנמדדה על ידי ערכת ספירת תאים-8

  1. להמיס נפח מסוים של OA בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להשיג ריכוז של 200 mM. אחסן את התמיסה בטמפרטורה של -20°C לשימוש עתידי.
  2. זרע תאי HepG2 בצלחת 96 בארות בצפיפות תאים של 6 × 103 תאים לכל באר. הוסף 100 μL של DMEM לכל באר. לדגור ולתרבת את התאים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 במשך 24 שעות. חלק את תאי HepG2 לשתי קבוצות:
    1. קבוצת ביקורת: הוספת מדיום תרבית תאים.
    2. קבוצת OA: הוסף OA למדיום תרבית התאים כדי להשיג ריכוזים סופיים של 0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM ו- 1 mM.
  3. לאחר 24 שעות של הדגירה הראשונית, יש להשליך את הסופרנאטנט מכל באר ולהוסיף OA בהתאם לקיבוץ שצוין, תוך הוספת 100 μL לכל באר. עבור קבוצת הביקורת, הוסף 100 μL של מדיום תרבית תאים לכל באר. ממשיכים לדגור על התאים עוד 24 שעות.
    הערה: ודא שלכל קבוצה יש שש בארות משוכפלות. כדי למנוע אידוי, הוסף 100 μL של מלוחים חוצצי פוספט (PBS) לטבעת החיצונית של בארות בלוח 96 בארות.
  4. לאחר 24 שעות של דגירה, הוסיפו 10 מיקרוליטר של ערכת ספירת תאים-8 (CCK-8) לכל באר, ערבבו בעדינות ודגרו במשך שעתיים בחושך. הסר את הצלחת בעלת 96 הקידוחים מהאינקובטור, מקם אותה בקורא המיקרו-צלחות ומדד את ערך הספיגה ב-450 ננומטר (A450). ערכי GI50 נספרו על פי OD.

3. שמן אדום O צביעה כדי לצפות היווצרות טיפות שומנים תאית

  1. זרע תאי HepG2 בצלחות תרבית תאים של 6 בארות בצפיפות של 5 × 105 תאים לבאר ותגדל את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה קבועה למשך 24 שעות. עיינו באיור 1 לקבלת ייצוג חזותי של השלבים המתוארים.
  2. לאחר 24 שעות של תרבית תאים, הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבית תאים המכיל OA לכל באר, וקבל ריכוזים סופיים של 0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, ו 1 mM. לאחר 24 שעות נוספות, הסר את מדיום תרבית התאים מכל באר ושטוף פעמיים עם PBS. מוסיפים 1 מ"ל של קיבוע ORO לכל באר ודגרים במשך 30 דקות.
  3. הכינו את תמיסת הצביעה ORO על ידי ערבוב תמיסת צביעה A עם תמיסת צביעה B ביחס של 3:2. הניחו לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחר מכן סננו אותה פעם אחת דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר. יש לאחסן את התמיסה המסוננת בצינור צנטריפוגה המוגן מפני אור עד לשימוש.
  4. יש להשליך את הקיבוע ולשטוף פעמיים במים מזוקקים. מוסיפים 1 מ"ל של 60% איזופרופנול לכל באר ודגרים במשך 30 שניות. יש להשליך 60% מתמיסת האיזופרופנול ולהוסיף 1 מ"ל של תמיסת כתמים ORO טרייה לכל באר לפני הדגירה למשך 20 דקות. יש להשליך את תמיסת הצביעה ORO, להוסיף 1 מ"ל של 60% איזופרופנול לכל באר, ולדגור במשך 30 שניות. יש לשטוף 5 פעמים במים כדי להסיר עודפי צבע.
  5. מכסים את התאים במים מזוקקים ומתבוננים תחת מיקרוסקופ. לאחר איסוף התמונות, השליכו את הנוזל שבצלחת והניחו לו להתייבש. לאחר מכן, להוסיף 2 מ"ל של isopropanol לכל באר ולנער את הצלחת על שייקר מסלול במשך 10 דקות. מעבירים את הנוזל לצלחת חדשה בת 96 בארות, עם 16 בארות בכל קבוצה, ומוסיפים 100 מיקרוליטר לכל באר. חשב את תכולת השומנים על ידי מדידת הצפיפות האופטית (OD) של כל באר באמצעות קורא microplate ב 510 ננומטר (A510).

4. השפעות ריכוזים שונים של חומצה אולאית על סך הטריגליצרידים בסופרנאטנט תאי HepG2

  1. אזנו את הערכה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות והכינו את הצלחות הדרושות לניסוי.
  2. אספו את הסופרנאטנט והצנטריפוגה של התא ב-1,570 × גרם למשך 10 דקות. קביעת בארות סטנדרטיות ובדיקת בארות לדוגמה. הוסף 50 μL של ריכוז סטנדרטי ([S0 → S5] ואחריו 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 mmol / L) לבארות סטנדרטיות. בנוסף לבארות הריקות והסטנדרטיות, הוסף 10 μL של דגימות שונות לבארות הדגימה, ולאחר מכן הוסף 40 μL של מדלל דגימה לכל באר. מוסיפים 100 מיקרוליטר של נוגדן-חזרת לגילוי פרוקסידאז לכל באר, אוטמים עם קרום צלחת ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת בתנור בטמפרטורה קבועה.
  3. השליכו את הסופרנטנט, ייבשו כתם על נייר נטול אבק, ושטפו כל באר בתמיסת כביסה אחת. השאירו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך דקה. חזרו על תהליך הכביסה 5x.
  4. הוסף 50 μL של מצע A ו 50 μL של מצע B לכל באר. מערבבים בעדינות ודגרים במשך 15 דקות ב-37°C. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת סיום לכל באר ומדוד את ערך OD של כל באר ב- 450 ננומטר (A 450) תוך 15 דקות.
  5. התווה את ריכוז התקן לאורך ציר x ואת ערך הבליעה המתאים (OD) לאורך ציר y כדי לבצע רגרסיה ליניארית וגזור את משוואת העקומה כדי לחשב את ערך הריכוז של כל דגימה.

5. ניתוח סטטיסטי

  1. לקבוע הבדלים משמעותיים בנתונים כמותיים.
  2. חשב את הממוצע ± סטיית תקן (SD) וייצג באופן גרפי את הנתונים. שקול P < 0.05 להיות מובהק סטטיסטית.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השפעת חומצה אולאית על כדאיות התא
תאי HepG2 נחשפו לריכוזים משתנים של OA (0 מילימול, 0.125 מילימול, 0.25 מילימול, 0.5 מילימול, 1 מילימול), וכתוצאה מכך חלה ירידה בשיעורי הישרדות התאים ב-0.125 מילימול, 0.25 מילימול, 0.5 מילימטר ו-1 מילימטר בהשוואה ל-0 מילימול. מובהקות סטטיסטית נצפתה ב 0.5 mM (P < 0.05) ו 1 mM (P < 0.05) בהשוואה ל- 0 mM. התוצאות של השפעת OA על כדאיות התא, כפי שהוערכו על-ידי ערכת CCK-8, מוצגות באיור 2. ערך GI50 עבור תאי HepG2 שטופלו ב- OA חושב כ- 1.875 mM.

שמן אדום O צביעה כדי לצפות היווצרות טיפות שומנים תוך תאיים
צביעת ORO היא שיטה נפוצה להדמיית שומנים16,17. כתוצאה מכך, היווצרות טיפות השומנים בתאי HepG2 שהודגרו עם OA במשך 24 שעות נצפתה תחת מיקרוסקופ לאחר צביעת ORO. כפי שניתן לראות באיור 3 ובאיור 4, עוצמת הצביעה האדומה בתאים שטופלו ב-OA הייתה גבוהה יותר מאשר בתאים שלא טופלו. טיפות שומנים אדומות היו נוכחות בפלזמה של תאי HepG2 לאחר טיפול OA, כאשר כמויות טיפות השומנים והשומנים גדלו עם עליית ריכוזי OA (איור 5).

השפעות ריכוזים שונים של חומצה אולאית על סך הטריגליצרידים בסופרנאטנט תאי HepG2
ממצאי הניסוי, כפי שמודגמים באיור 6, גילו כי בהשוואה לקבוצת הביקורת, טיפול בתאי HepG2 עם ריכוזים משתנים של OA (0.125 מילימול, 0.25 מילימול, 0.5 מילימול, 1 מילימול) הביא לעלייה משמעותית בתכולת TG של סופרנאטנט התא בקבוצת OA (P < 0.05).

figure-results-1
איור 1: תרשים זרימה עבור צביעת O אדום שמן. קיצורים: OA = חומצה אולאית; OD = צפיפות אופטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ההשפעה של חומצה אולאית על כדאיות התא, מוערכת באמצעות בדיקת קיט-8 לספירת תאים. כל סרגל מייצג את הממוצע ± SD (n = 6). *P < 0.05. קיצור: OA = חומצה אולאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תמונות צביעת O בצבע אדום שמן של נקודות זמן מרובות (כיווני השעה 3, 6, 9 ו-12). היווצרות טיפות שומנים זוהתה באמצעות מיקרוסקופ הפוך לתרבית תאים בהגדלה של פי 40. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ההשפעה של חומצה אולאית על טיפות שומנים בתאים, מוערכת באמצעות צביעת שמן אדום O. היווצרות טיפות שומנים זוהתה באמצעות מיקרוסקופ הפוך לתרבית תאים בהגדלה של פי 40. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: ההשפעה של חומצה אולאית על תכולת השומנים בתאים, המוערכת על-ידי הערך של צפיפות אופטית. שינויי קיפול יחסיים מוצגים בערכי הצפיפות האופטית בקבוצות שונות. כל עמודה מייצגת את הממוצע ± SD (n = 16). *P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: השפעות של ריכוזים שונים של חומצה אולאית על רמות הטריגליצרידים הכוללות בסופרנטנט של תאי HepG2. שינויים יחסיים בקיפול מוצגים בערך רמות הטריגליצרידים בקבוצות שונות. כל עמודה מייצגת את הממוצע ± SD (n = 3). *P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MASLD היא תסמונת קלינופתולוגית המאופיינת בתצהיר שומן תוך תאי מוגזם בהפטוציטים עקב גורמים מעבר לאלכוהול וסוכנים מזיקים אחרים לכבד18. MASLD קשור באופן מורכב לפגיעה בכבד בלחץ מטבולי נרכש, הקשורה בעיקר לתנגודת לאינסולין ולרגישות גנטית. כדי לחקור ולסנן ביעילות תרופות עבור MASLD, חיוני לבחור מודל ניסיוני מתאים. ביסוס מודל התא חיוני במיוחד במחקר MASLD, ומאפשר הבנה עמוקה יותר של מנגנונים פתולוגיים והערכה של השפעות תרופות חדשות.

פרוטוקול זה מתאר מודל במבחנה של MASLD שהוקם באמצעות תאי HepG2 המושרים על ידי OA. צביעת ORO וניתוח תוכן שומנים משמשים כשיטות קריטיות ליצירת מודל זה. בנוסף, הערכת כדאיות התא ותכולת TG הכוללת בסופרנאטנטים של תאים חיונית להערכת ריכוז OA המתאים. קריטריון האבחון עבור MASLD כולל נוכחות של מעל 5% TG מאוחסן בתאי כבד19,20. מודלים של תאי MASLD מסתמכים בעיקר על תאי HepG2 21,22,23,24,25,26,27,28, הידועים בניצולם המוצלח בבניית מודלים לניוון כבד שומני במחקרים מקומיים ובינלאומיים שונים. למרות שמקורם בתאי הפטומה, תאי HepG2 חולקים מאפיינים פנוטיפיים רבים עם הפטוציטים והם מעובדים ומופצים בקלות29,30. בדיקות כגון ערכת CCK-8, צביעת ORO, תכולת שומנים ומדידות TG כוללות מציעות גישות פשוטות, אובייקטיביות וסבירות להערכת כדאיות התא, הצטברות שומן ותכולת שומנים בנבדקי המחקר. בהקשר זה, OA מיישר קו עם הפתוגנזה של MASLD31, שבו אנרגיה עודפת מאוחסנת בצורה של שומנים כאשר צריכת האנרגיה עולה על הצריכה.

חוקרים השתמשו ב-OA 23,28,31,32,33, חומצה פלמיטית 34,35 ושילובים של חומצה אולאית/פלמיטית26,36 כדי לשכפל את מודל MASLD. הן חומצה פלמיטית והן OA תורמות לניוון שומן בכבד ולהצטברות TG. חומצה פלמיטית, חומצת השומן הרוויה הנפוצה ביותר בגוף האדם, מפגינה רעילות ליפוטוקסית משמעותית, המובילה להצטברות שומנים בהפטוציטים, רדיקלים תגובתיים תוך תאיים מוגברת, ומוות תאים או נמק37. לעומת זאת, OA מוביל לשקיעת TG תוך-תאית בולטת יותר (איור 6) ופחות אפנון תאי38. לכן, חוקרים משתמשים לעתים קרובות בתאי HepG2 הנגרמים על ידי OA כדי לבסס מודלים של MASLD במבחנה. כמתואר בשלב 2.2.2 של הפרוטוקול, חיוני לחמם את תמיסת OA בעת הוספתה. במחקר זה, צביעת ORO וניתוח תכולת שומנים התבססו על שקיעת שומנים של תאי HepG2, מה שתמך ביעילות בחקר מודלים חוץ גופיים של MASLD עם מנגנונים מורכבים והפחתת הזמן והעלות הנדרשים למחקר.

ORO נקשר בקלות ל-TG בצורת טיפה, ומייצר כתמים כתומים עד אדומים המעידים על שומן, עם עוצמת צבע התלויה בריכוז השומנים. עם זאת, פתרון הצביעה של ORO אינו יציב ונוטה למשקעים, ולכן אינו מתאים להכנה מראש. לכן, תמיסת הצביעה של ORO הוכנה לאחר שלב 3.2 של הפרוטוקול, תוך נקיטת אמצעי זהירות למניעת חשיפה לאור במהלך ההכנה והדגירה (שלבי פרוטוקול 3.2, 3.3). בשלב 3.5 של הפרוטוקול, בחירת תמונות במספר נקודות זמן (כיוונים 3, 6, 9 ו-12) מייצגת שינוי מרכזי של הניסוי החיוני לשיפור דיוק התוצאות. למרות שריכוזי OA גבוהים משפיעים על הישרדות התא, ובכך מייצגים מגבלה של שיטה זו, הוכח כי ריכוז OA מתאים מבטיח את קיום התא.

מחקר זה השתמש בגישה מקיפה, תוך שימוש בערכת CCK-8, צביעת ORO, ניתוח תכולת שומנים ומדידת TG כוללת כדי לבסס ולאמת את המודל של MASLD. ערכת CCK-8 שימשה להערכת ההשפעה של תרופות על כדאיות התא, ושימשה כשלב אימות מכריע. בעתיד, מודל זה טומן בחובו הבטחה לסינון תרופות ומחקר מנגנונים שמטרתם להבין פתוגנזה של MASLD ולזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות. כדי להבטיח עוד יותר את איכות אמינות התיקוף, רמות הביטוי של חלבוני המטרה המעורבים במודל ינותחו באמצעות ניתוח תגובת שרשרת פולימראז מערבי וכמותי.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי הוענק על ידי "מחקר על סוגיות המפתח של ההשפעה המרפאת של Koumiss על מחלות אזוריות של הרפואה המונגולית" בשנת 2018 פרויקט נתמך של תוכנית המדע והטכנולוגיה של המחלקה למדע וטכנולוגיה של האזור האוטונומי מונגוליה הפנימית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 ומיקרו; m מסנןMillex
0.25% טריפסין-EDTA (1x) טריפסין-EDTAGibco25200-056
0.45 ומיקרו; m filterMillex
2 מ"ל בקבוקונים קריגנייםCORNING430659
25 ס"מ2 בקבוק תרבית תאיםCORNING430639
צלחת תרבית תאים 6 בארותCORNING3516
צלחת תרבית תאים 96 בארותCORNING3599
צלחת ספירת דםשנחאי ג'ינג ג'ינג מגיב ביוכימי & חברת אינסטרומנט
02270113 מבחני ערכת ספירת תאים -8בייג'ינג Solarbio מדע & טכנולוגיה ושות', בע"מ חממת CA1210-1000T
CO2NUAIRENU-5710E
  DMSO דימתיל סולפוקסיד בייג'ינג Solarbio מדע & טכנולוגיה ושות', בע"מ D8371
Modified Eagle MediumGibco8122691
ציוד תיוג אנזימיםTecanSpark
סרום בקר עוברי,Gibco10099141
HepG2בייג'ינג צפון סין Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)221031
טריגליצרידים אנושיים (TG) ELISA הדרכהמכון נאנג'ינג ג'יאצ'נג לביו-הנדסה20170301
מיקרוסקופ הפוך לתרבית תאיםLeicaDMi1 
איזופרופנולטיאנג'ין Zhiyuan מגיב כימי ושות'
ערכת כתמים אדומים בשמן 2021030141, לתאים מתורבתיםבייג'ינג Solarbio מדע & טכנולוגיה ושות', בע"מ G1262
חומצה אולאית סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ
Penicillin StreptomycinGibco15140122
SPSS 24.0תוכנה
קו תאי מוסמך A502071 סטטיסטית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alisi, A., Feldstein, A. E., Villani, A., Raponi, M. Pediatric nonalcoholic fatty liver disease: a multidisciplinary approach. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (3), 152-161 (2012).
  2. Anania, C., Perla, F. M., Olivero, F., Pacifico, L., Chiesa, C. Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 24 (19), 2083-2094 (2018).
  3. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cell Mol Life Sci. 76 (1), 99-128 (2019).
  4. Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update. Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).
  5. European Association for the Study of the Liver (EASL); European Association for the Study of Diabetes (EASD); European Association for the Study of Obesity (EASO). EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the Management of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease. Obes Facts. 9 (2), 65-90 (2016).
  6. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
  7. Díaz, L. A., Arab, J. P., Louvet, A., Bataller, R., Arrese, M. The intersection between alcohol-related liver disease and nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 20 (12), 764-783 (2023).
  8. Cotter, T. G., Rinella, M. Nonalcoholic fatty liver disease 2020: The state of the disease. Gastroenterology. 158 (7), 1851-1864 (2020).
  9. Lonardo, A., et al. Metabolic mechanisms for and treatment of NAFLD or NASH occurring after liver transplantation. Nat Rev Endocrinol. 18 (10), 638-650 (2022).
  10. Papatheodoridi, M., Cholongitas, E. Diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): Current concepts. Curr Pharm Des. 24 (38), 4574-4586 (2018).
  11. Van Herck, M. A., Vonghia, L., Francque, S. M. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease-a starter's guide. Nutrients. 9 (10), 1072(2017).
  12. Wieckowska, A., Feldstein, A. E. Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease: invasive versus noninvasive. Semin Liver Dis. 28 (4), 386-395 (2008).
  13. Stein, L. L., Dong, M. H., Loomba, R. Insulin sensitizers in nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis: Current status. Adv Ther. 26 (10), 893-907 (2009).
  14. Milić, S., Lulić, D., Štimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
  15. Neuschwander-Tetri, B. A., Caldwell, S. H. Nonalcoholic steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference. Hepatology. 37 (5), 1202-1219 (2003).
  16. Du, J., Zhao, L., Kang, Q., He, Y., Bi, Y. An optimized method for Oil Red O staining with the salicylic acid ethanol solution. Adipocyte. 12 (1), 2179334(2023).
  17. Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by Oil Red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nat Protoc. 8 (6), 1149-1154 (2013).
  18. Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
  19. Watkins, P. A., Ellis, J. M. Peroxisomal acyl-CoA synthetases. Biochim Biophys Acta. 1822 (9), 1411-1420 (2012).
  20. Heeren, J., Scheja, L. Metabolic-associated fatty liver disease and lipoprotein metabolism. Mol Metab. 50, 101238(2021).
  21. Kim, S. H., et al. Effect of isoquercitrin on free fatty acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells. Molecules. 28 (3), 1476(2023).
  22. Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice. Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).
  23. Li, J., et al. Hesperetin ameliorates hepatic oxidative stress and inflammation via the PI3K/AKT-Nrf2-ARE pathway in oleic acid-induced HepG2 cells and a rat model of high-fat diet-induced NAFLD. Food Funct. 12 (9), 3898-3918 (2021).
  24. Li, Y., et al. Protopanaxadiol ameliorates NAFLD by regulating hepatocyte lipid metabolism through AMPK/SIRT1 signaling pathway. Biomed Pharmacother. 160, 114319(2023).
  25. Liu, H., et al. Zeaxanthin prevents ferroptosis by promoting mitochondrial function and inhibiting the p53 pathway in free fatty acid-induced HepG2 cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1868 (4), 159287(2023).
  26. Mun, J., et al. Water extract of Curcuma longa L. ameliorates non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 11 (10), 2536(2019).
  27. Park, M., Yoo, J. H., Lee, Y. S., Lee, H. J. Lonicera caerulea extract attenuates non-alcoholic fatty liver disease in free fatty acid-induced HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Nutrients. 11 (3), 494(2019).
  28. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomed Pharmacother. 118, 109287(2019).
  29. Alkhatatbeh, M. J., Lincz, L. F., Thorne, R. F. Low simvastatin concentrations reduce oleic acid-induced steatosis in HepG(2) cells: An in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. Exp Ther Med. 11 (2), 1487-1492 (2016).
  30. Cui, W., Chen, S. L., Hu, K. Q. Quantification and mechanisms of oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells. Am J Transl Res. 2 (1), 95-104 (2010).
  31. Guo, X., Yin, X., Liu, Z., Wang, J. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) pathogenesis and natural products for prevention and treatment. Int J Mol Sci. 23 (24), 15489(2022).
  32. Rafiei, H., Omidian, K., Bandy, B. Dietary polyphenols protect against oleic acid-induced steatosis in an in vitro model of NAFLD by modulating lipid metabolism and improving mitochondrial function. Nutrients. 11 (3), 541(2019).
  33. Tie, F., et al. Kaempferol and kaempferide attenuate oleic acid-Induced lipid accumulation and oxidative stress in HepG2 cells. Int J Mol Sci. 22 (16), 8847(2021).
  34. Fang, K., et al. Diosgenin ameliorates palmitic acid-induced lipid accumulation via AMPK/ACC/CPT-1A and SREBP-1c/FAS signaling pathways in LO2 cells. BMC Complement Altern Med. 19 (1), 255(2019).
  35. Wu, X., et al. MLKL-dependent signaling regulates autophagic flux in a murine model of non-alcohol-associated fatty liver and steatohepatitis. J Hepatol. 73 (3), 616-627 (2020).
  36. Scavo, M. P., et al. The oleic/palmitic acid imbalance in exosomes isolated from NAFLD patients induces necroptosis of liver cells via the elongase-6/RIP-1 pathway. Cell Death Dis. 14 (9), 635(2023).
  37. Chavez-Tapia, N. C., Rosso, N., Tiribelli, C. Effect of intracellular lipid accumulation in a new model of non-alcoholic fatty liver disease. BMC Gastroenterol. 12, 20(2012).
  38. Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. J Gastroenterol Hepatol. 24 (5), 830-840 (2009).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HepG2Oil Red OMASLD In Vitro

מאמרים קשורים