הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הנדסה של תאים דמויי מיקרוגליה המושרים על ידי דם אנושי לחקר המוח בתרגום לאחור

2.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66819

⸱

6 בספטמבר 2024

 ,  ,  , 
1Department of Neuropsychiatry, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, 2Department of Functional Anatomy and Neuroscience, Asahikawa Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מתווה גישה חדשנית להקמת תאים דמויי מיקרוגליה (iMG) שמקורם במונוציטים אנושיים המאפשרים הערכה עקיפה של דלקת במוח. זה מציג מודל תאי שעשוי להועיל למחקר המתמקד בדלקת פוטנציאלית במוח ובהפרעות נוירופסיכיאטריות נלוות.

תקציר

מחקרים אחרונים שהשתמשו במודלים של בעלי חיים הדגישו את חשיבותם של תאי מיקרוגליה כמודולטורים אימונולוגיים חיוניים במחלות נוירופסיכיאטריות ופיזיות שונות. ניתוח מוח לאחר המוות והדמיית טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים הן שיטות מחקר מייצגות המעריכות הפעלת מיקרוגליאה בחולים אנושיים; הממצאים חשפו את הפעלת תאי המיקרוגליה במוחם של חולים המציגים הפרעות נוירופסיכיאטריות שונות וכאב כרוני. עם זאת, הטכניקה הנ"ל רק מקלה על הערכה של היבטים מוגבלים של הפעלת מיקרוגליה.

במקום ביופסיית מוח וטכניקת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, פיתחנו בתחילה טכניקה ליצירת תאים דמויי מיקרוגליה המושרים ישירות (iMG) ממונוציטים אנושיים טריים בדם היקפי על ידי השלמתם עם גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים ואינטרלוקין 34 למשך שבועיים. תאי iMG אלה יכולים לשמש לביצוע ניתוחים מורפולוגיים ומולקולריים דינמיים בנוגע לקיבולת פגוציטית ושחרור ציטוקינים לאחר גירוי מתח ברמת התא. לאחרונה, ניתוח שעתוק מקיף שימש כדי לאמת את הדמיון בין תאי iMG אנושיים לבין מיקרוגליה ראשונית במוח.

תאי iMG שמקורם במטופל עשויים לשמש כסמנים חלופיים מרכזיים לחיזוי הפעלת מיקרוגליאה במוחות אנושיים וסייעו בחשיפת פתופיזיולוגיה דינמית שלא הייתה ידועה בעבר של מיקרוגליה בחולים עם מחלת Nasu-Hakola, פיברומיאלגיה, הפרעה דו קוטבית ומחלת Moyamoya. לכן, הטכניקה מבוססת iMG משמשת ככלי רב ערך לתרגום לאחור ומספקת תובנות חדשניות להבהרת הפתופיזיולוגיה המולקולרית של תאי מיקרוגליה במגוון מחלות נפשיות ופיזיות.

מבוא

בשנים האחרונות הוצע כי דלקת במוח תופסת תפקידים מרכזיים בפתופיזיולוגיה של הפרעות מוח ונוירופסיכיאטריות שונות; תאי המיקרוגליה הודגשו כתאים אימונומודולטוריים מרכזיים על ידי ניתוח מוח אנושי לאחר המוות וטומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) המבוססות על טכניקות הדמיה ביולוגית 1,2,3,4. ניתוחי הדמיה של המוח וה-PET לאחר המוות מגלים ממצאים משמעותיים; עם זאת, גישות אלה אינן יעילות במונחים של לכידת הפעילות המולקולרית הדינמית של תאי מיקרוגליה אנושיים במוח בשלמותם. לכן, נדרשות אסטרטגיות חדשניות כדי לאפשר הערכה מקיפה של תפקודי מיקרוגליאה אנושיים ותפקוד לקוי ברמה המולקולרית והתאית.

בשנת 2014, הנדסנו במקור טכניקה חדשנית לייצור תאים דמויי מיקרוגליה (iMG)המושרים ישירות 5,6, לפני הפרסום הראשון של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם (iPSC) שמקורם בתאי מיקרוגליה בשנת 20167. תוך שבועיים בלבד, המרנו בהצלחה מונוציטים אנושיים היקפיים בדם לתאי iMG על ידי מיטוב הציטוקינים, גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) ואינטרלוקין 34 (IL-34). כאשר פיתחנו טכניקה זו, שיטת התכנות מחדש החדשנית של השראת תאים עצביים מתאי iPS או פיברובלסטים רק החלה לשרור בעולם 8,9,10,11. עם זאת, באותו זמן, שיטה להשראת תאי מיקרוגליאה שמקורם ב- iPS עדיין לא דווחה, ויצירת מודל מיקרוגליאה אנושי שמקורו בתאים סומטיים היה רצוי. מאחר שציטוקינים כגון GM-CSF ו-IL-34, גורם מגרה מושבת מקרופאגים, דווחו כנחוצים להתפתחות ולתחזוקה של מיקרוגליה 12,13,14,15, שיערנו כי שילוב של ציטוקינים אלה יכול להיות מיושם ישירות כדי ליצור מודל תאי מיקרוגליאה ממונוציטים בדם. לבסוף, הצלחנו לפתח מודל של מיקרוגליה שמקורו במונוציטים על ידי שילוב GM-CSF ו- IL-345. בנוסף, חלק מהשילובים האלה של ציטוקינים משמשים גם כדי לגרום לתאי מיקרוגליה מתאי iPS 7,16 ומניחים שהם גורם חשוב ברכישת תכונות מיקרוגליה.

בניגוד לשיטות iPSC, תאי iMG אינם דורשים כל שינוי גנטי וניתן ליצור אותם בזמן קצר מאוד על ידי אינדוקציה כימית פשוטה, וכתוצאה מכך זמן נמוך יותר ועלויות כספיות. יתר על כן, תאי iMG אינם דורשים תכנות מחדש גנטי, ולכן אנו מאמינים כי תאי iMG הם תאים חלופיים חזקים להעריך לא רק את התכונות אלא גם את מצבי מיקרוגליה אנושיים. במאמר הראשוני על טכניקת iMG בשנת 2014, אישרנו כי תאי iMG מציגים פנוטיפ של מיקרוגליה אנושית, אשר יכול להיות שונה מונוציטים ומקרופאגים. לדוגמה, תאי iMG הציגו יחס ביטוי יתר של קולטן כימוקין CX3C 1 (CX3CR1) וקולטן כימוקין C-C מסוג 2 (CCR2) בהשוואה למונוציטים וסמנים אופייניים למיקרוגליה, כולל חלבון טרנסממברנה 119 (TMEM 119) וקולטן פורינרגי P2RY12 5,17. לאחרונה, אימתנו כי תאי iMG היקפיים שמקורם בדם דומים למיקרוגליה במוח בפרופיל ביטוי הגנים שלהם של סמנים מיקרוגליאליים ידועים באותו מטופל שעבר ניתוחי מוח18. תאי iMG ניתנים לניתוח עבור תפקודים דינמיים ברמה המולקולרית, כגון פגוציטוזה וייצור ציטוקינים, והם צפויים לפצות על החסרונות של חקר המוח לאחר המוות ומחקרי PET.

גילינו מנגנונים פתופיזיולוגיים דינמיים שלא היו ידועים בעבר המערבים מיקרוגליה בחולים שאובחנו עם מחלת Nasu-Hakola5, פיברומיאלגיה19, הפרעה דו קוטבית20,21, או מחלת Moyamoya22. יתר על כן, בהתבסס על המתודולוגיה המקורית שלנו, מעבדות שונות השתמשו בתאי iMG (מעבדות מסוימות ייעדו שמות חלופיים לתאים אלה) ככלי מחקר חיוני לתרגום לאחור 23,24,25,26,27. Sellgren et al. יצרו בהצלחה תאי iMG בהתאם להמלצות שלנו וערכו ניתוח microarray אשר גילה כי תאים אלה דומים מאוד מיקרוגליה המוח האנושי23. לאחרונה אישרנו את הדמיון בין תאי iMG אנושיים לבין תאי מיקרוגליה ראשוניים במוח באמצעות ריצוף RNA18.

מחקר זה נועד לתעד את המתודולוגיה ליצירת תאי iMG מדם היקפי אנושי כדי להקל על מחקר תרגום לאחור המתמקד במחלות נוירופסיכיאטריות. טכניקה זו מציגה פוטנציאל ככלי אנליטי סביר שיכול לייצר ללא מאמץ מודלים תאיים מיקרוגליאליים בזמן קצר, אפילו במעבדות לא מצוידות שאין בהן מנגנון העברת גנים או כוח אדם מיומן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת קיושו ועמד בכל הוראות הצהרת הלסינקי. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המשתתפים, כולל מתנדבים בריאים וחולים, לנתח את דמם ולפרסם את נתונם. החומרים והציוד מפורטים בטבלת החומרים, והרכבי הפתרונות מפורטים בטבלה 1.

1. הכנת מדיה ובופרים לניסויים

  1. הכינו את מדיום הבידוד על ידי תוספת RPMI-1640 עם 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (56°C, 30 דקות) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
  2. הכינו את מאגר הבידוד על ידי השלמת תמיסת החיץ הבסיסית בתמיסת אלבומין בסרום בקר 0.5% (BSA) ועיקרו אותה באמצעות סינון (0.22 מיקרומטר).

2. בידוד תאים חד-גרעיניים מדם שלם

  1. העבר 15 מ"ל ממדיום שיפוע הצפיפות לצינור צנטריפוגה הדרגתי בצפיפות 50 מ"ל וצנטריפוגה ב- 1,000 × גרם למשך דקה אחת ב- 20 ° C.
    הערה: בודד 15 מ"ל דם לכל צינור צנטריפוגה הדרגתי בצפיפות של 50 מ"ל. הגדל את מספר הצינורות כאשר נפח הדם גבוה.
  2. הומוגניזציה של הדם שנאסף בצינורות הפרין על ידי היפוך ולהסיר את המכסה מצינור איסוף הדם עם פינצטה מעוקרת אש.
  3. יש לחלק נפח שווה (10-15 מ"ל) של דם למדיום שיפוע הצפיפות בצינור הצנטריפוגה של שיפוע הצפיפות.
  4. הגדר את רמת ההאטה של הצנטריפוגה ל- 1 מתוך 4 רמות ואת הצנטריפוגה ל- 1,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: בקצב האטה זה, מהירות סיבוב של 180 × גרם (1,000 סל"ד) נעצרת תוך 3 דקות.
  5. הכינו מספר שווה של צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל כמו צינורות הצנטריפוגות ההדרגתיות בצפיפות 50 מ"ל ומלאו כל צינור ב-10 מ"ל PBS (−).
  6. הסירו את שכבת הפלזמה העליונה עד כ-1 ס"מ מעל המעיל הנפוח לאחר הצנטריפוגה.
    הערה: יש להכניס פיפטה שואפת אנכית לתוך הצינור ולשאוף בזהירות ממרכז משטח הנוזל. אין לשאוף יתר על המידה כדי לא להפריע למעיל הבאפי.
  7. דקנו את כל הסופרנאטנט שנותר מצינור הצנטריפוגה בצפיפות של 50 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגה המכיל 10 מ"ל של PBS (−).
  8. אפס את רמת ההאטה של הצנטריפוגה ל-3 מתוך 4 רמות, ואת הצנטריפוגה ל-250 × גרם למשך 10 דקות ב-RT. במהלך שלב זה, הכינו צינור צנטריפוגה אחד של 50 מ"ל ושני צינורות צנטריפוגות של 15 מ"ל ומסננת תאים של 100 מיקרומטר.
  9. לאחר צנטריפוגה, לקבוע את הטמפרטורה של הצנטריפוגה ב 4 °C (75 °F). חפשו גלולה לבנה עם פריפריה אדומה בתחתית צינור הצנטריפוגה. מוציאים את הסופרנאטנט בשאיפה ומשחררים את הגלולה בעדינות על ידי הקשה.
  10. מקם מסננת תאים של 100 מיקרומטר על צינור חרוטי של 50 מ"ל באמצעות פינצטה מעוקרת אש.
  11. שלבו 13 מ"ל של אמצעי בידוד באחד הצינורות הצנטריפוגיים ושטפו את הדופן הפנימית כדי לאסוף את התאים כראוי. קח את מתלה התא ושטוף את הצינורות הצנטריפוגות הנותרים באופן רציף. לאחר איסוף התאים מכל הצינורות, מסננים את תרחיף התא דרך מסננת תאים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
    הערה: יש לקרר את אמצעי הבידוד לאורך כל תהליך הבידוד (שלבים 2.11-2.16).
  12. שטפו כל צינור שוב עם 13 מ"ל של אמצעי בידוד כמתואר בשלב 2.11. לאסוף סך של 26 מ"ל של השעיית התא.
  13. יש לחלק כמויות שוות לשני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל, לספור את התאים ולחשב את הריכוז המתאים של מאגר בידוד (60 מיקרוליטר חיץ לכל 107 תאים בסך הכל) לשלב 2.16.
    הערה: עדיף לעבוד עם הצינור החרוטי של 15 מ"ל מכיוון שנפח הנוזל קטן והנוזל מבעבע בקלות בעת פיפטציה בשלב 2.16.
  14. צנטריפוגה ב 250 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (75 °F).
  15. במהלך הצנטריפוגה, יש לחטא היטב את המעמד המגנטי (במיוחד את החלק הבא במגע עם העמוד) באתנול 70% ולהניח אותו על הספסל לייבוש באוויר. שמור את מאגר הבידוד על קרח.
  16. הסר את הסופרנאטנט על ידי שאיפה (בשלב זה, חפש כדורים אדומים ~ 1 מ"מ עובי בגלל נוכחות של כדוריות דם אדומות), להוסיף את הכמות המתאימה של חיץ בידוד, ולשחרר את הגלולה בעדינות על ידי pipetting ~ 20x.

3. בידוד מונוציטים באמצעות מיקרו-כדוריות CD11b

  1. מערבולת מגיב חסימת FcR אנושי למשך 10 שניות לפני היישום. לשלב את הכמות הנדרשת של מגיב (20 μL של מגיב חוסם FcR לכל 107 תאים סה"כ) ולדגור בתא ב 4 ° C במשך 5 דקות.
  2. מערבול את microbeads CD11b במשך 10 שניות לפני היישום. שלבו את הכמות הנדרשת של מגיב (20 מיקרו-כדוריות CD11b לכל 107 תאים בסך הכל), ודגרו בתא של 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות תוך כדי תסיסה ידנית כל 5 דקות.
  3. לאחר הדגירה, להוסיף 10 מ"ל של חיץ בידוד, להשהות על ידי pipetting עדין, צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  4. במהלך הצנטריפוגה, הניחו את העמוד המגנטי על המעמד המגנטי ושטפו אותו עם 3 מ"ל של מאגר בידוד.
    הערה: הימנע מלגעת בחלק המגנטי של העמוד ומקם את העמוד כראוי. אם בועות נכנסות לעמודה, הסר אותן עם פיפטה. חיץ הבידוד מחויב להיות מצונן לאורך כל תהליך הבידוד (שלבים 3.4-3.9).
  5. הסר את הסופרנאטנט שלאחר הצנטריפוגה על ידי שאיפה, שלב 1 מ"ל של חיץ בידוד, ערבב על ידי פיפטינג בעדינות, ולהחיל את המתלה על העמוד.
  6. שטף את העמודה 3x על-ידי הוספת 3 מ"ל של מאגר בידוד בכל פעם שמאגר העמודות ריק.
  7. מניחים את העמוד בצינור חרוטי של 15 מ"ל מבלי לגעת בחלק המגנטי; לשלב 5 מ"ל של חיץ בידוד לתוך העמוד ולאלץ את הנוזל החוצה דרך העמוד עם בוכנה מוכנס לתוך הצינור.
  8. צנטריפוגה את תרחיף התא שנאסף בצינור ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  9. לשאוף את supernatant ולהשהות מחדש את התאים בתווך בידוד. מכיוון ש~5-10% ממספר התאים שנספרו בשלב 2.13 ישוחזרו, התאימו את נפח התרחיף בהתאם למספר התאים.
    הערה: יש להשתמש במדיום בידוד ב-RT ולא לחמם אותו כדי למנוע שינוי טמפרטורה מהיר מ-4°C.
  10. לספור את התאים ו aliquot 500 μL של תרחיף תאים לתוך כל באר של לוחות 24 באר בריכוז של 40 × 104 תאים / מ"ל ולדגור לילה.
    הערה: יש לצבוע את מתלי התאים בהתאם לנפח הזריעה המותאם הנדרש עבור לוחות שונים. לדוגמה, 1 מ"ל עבור באר אחת בצלחת 12 בארות ו 250 μL עבור באר אחת בשקופית תא 8 באר.
  11. לבסוף, יש להשליך או לחטא את הציוד המזוהם בהתאם למדיניות הטיפול בפסולת זיהומית שנקבעה על ידי המתקן.

4. אינדוקציה של תאי iMG ממונוציטים

  1. הכינו את מדיום האינדוקציה על ידי תוספת מדיום השראות בסיסי עם תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית 1%, 10 ננוגרם/מ"ל רקומביננטי אנושי GM-CSF ו-100 ננוגרם/מ"ל IL-34 אנושי רקומביננטי.
  2. החליפו את אמצעי הבידוד מהזריעה של היום הקודם בתווך אינדוקציה. הטו את הצלחת קדימה ושאפו מיד את התווך המדולדל מהקצה הקדמי של תחתית הבאר בעזרת פיפטה של פסטר. החלף את המדיום בקצב של מקסימום 1 צלחת (= 24 בארות) בכל פעם, ומיד לשלב 500 μL של מדיום אינדוקציה בעדינות.
    הערה: יש לבחור מונוציטים מודבקים בשלב זה.
  3. לדגור על התאים במשך 14 יום כדי להשלים את הזירוז.
  4. החלף את המדיום שוב עם 500 μL של מדיום אינדוקציה לאחר 14 ימים. לאחר מכן, לתחזוקה שלאחר האינדוקציה של התאים, החלף את מדיום האינדוקציה ב- 500 מיקרוליטר של מדיום אינדוקציה טרי מדי שבוע.

5. אימונוציטוכימיה

  1. הסר את המדיום משקופית התא בעלת 8 הקידוחים שנזרעו עם תאים בשלב 3.10 על ידי שאיפה ושטוף עם PBS (−).
  2. תקן את התאים למשך 20 דקות ב- RT עם 4% paraformaldehyde.
  3. הסר את מגיב הקיבוע ושטוף את התאים במשך 3 x 5 דקות עם PBS (−).
  4. חדרו את התאים עם PBS (−) המכיל 0.1% Triton X-100 ב-RT.
  5. דגרו על התאים החדירים, עם תמיסת חסימה (3% BSA/PBS (−)) למשך שעה אחת ב-RT.
  6. לדגור את התאים לילה עם נוגדנים ראשוניים (טבלה של חומרים) ב 4 ° C.
    הערה: כל הנוגדנים מדוללים בתמיסת חסימה.
  7. שטוף את התאים במשך 3 x 5 דקות עם PBS (−) במשך 5 דקות כל אחד.
  8. לדגור על התאים השטופים עם הנוגדנים המשניים המתויגים באופן פלואורסצנטי המתאימים למשך שעה אחת ב- RT (טבלה של חומרים).
  9. שטוף את התאים במשך 3 x 5 דקות עם PBS (−) כדי להסיר את הנוגדנים המשניים.
  10. דגרו על התאים עם תמיסת DAPI (1:10,000) מדוללת ב-PBS (−) למשך 5 דקות ב-RT.
  11. שטוף את התאים במשך 3 x 5 דקות עם PBS (−).
  12. הרכיבו את הבאר באמצעות מדיום ההרכבה ודמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

חשוב לציין, יש הטרוגניות רבה ברמת האדם וברמת התזמון בתווים של תאי iMG כולל מורפולוגיות וביטויי גנים. תאי iMG אצל אנשים מסוימים מקבלים מראה מסתעף (איור 1A), בעוד שבאחרים הם נשארים כדוריים (איור 1B). מאפייני iMG עשויים להיות שונים אפילו בתוך אדם יחיד, מה שהופך את תאי iMG ככלי מרכזי לזיהוי סמנים ביולוגיים של מצב המחלה. לעומת זאת, בחינת הבדלים בין-אישיים אלה מצדיקה צמצום טעויות טכניות. תאי iMG מוגדרים כמונוציטים המושרים עם GM-CSF ו- IL-34 למשך 14 יום לפחות. כדי למזע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טכניקות אנליטיות המשתמשות בתאי iMG עשויות לשמש ככלי מחקר רבי עוצמה לתרגום לאחור 5,6. כדי לייצר כמויות מספיקות של תאי iMG אנושיים, הנסיינים צריכים לתכנן את מחקריהם תוך התחשבות בנושאים מסוימים. דגימות דם שמקורן בבני אדם הן רגישות ביותר; כתוצאה מכך, הדגימות המתקבלות מצדיקות עיבוד מהיר, וטיפול קפדני כדי למנוע זיהום. באופן ספציפי, יש להפריד דגימות דם מיד לאחר לקיחת הדם ולא להשאיר ללא השגחה לפרקי זמן ממושכים. ניסויים מתחילים בדרך כלל בתוך 3 שעות מאיסוף הדם כדי לאשר את ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מענקי הסיוע הבאים למחקר מדעי: (1) האגודה היפנית לקידום המדע (KAKENHI; JP18H04042, JP19K21591, JP20H01773 JP22H00494 ל- TAK, JP22H03000 ל- M.O.); (2) הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (AMED; JP21wm0425010 ל- TAK, JP22dk0207065 ל- M.O.) ו-(3) הסוכנות היפנית למדע וטכנולוגיה CREST (JPMJCR22N5 ל-TAK). הגופים המממנים לא לקחו על עצמם כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על פרסומם או בהכנת כתבי היד. ברצוננו להודות ל-Editage (www.editage.jp) על העריכה בשפה האנגלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.1% טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'30-5140-5
4% פרפורמלדהידנקלאי טסק09154-14
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (100x)gibco15240-062מתואר כ"תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית"
, תמיסת שטיפה autoMACSMiltenyi Biotec130-091-222מתואר כ"פתרון חיץ בסיסי" ומשמש ל"מאגר בידוד"
CD11b MicroBeadsMiltenyi Biotec130– 049-601
תמיסת DAPIDOJINDO28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Sasalt SaltNacalai Tesque14249-24מתואר כ-"PBS (−)"
סרום בקר עובריbiowestS1760-500
מגיב חוסם FCR אנושיMiltenyi Biotec130– 059-901
LeucosepGreiner Bio-One227290מתואר כ"צינור צנטריפוגה שיפוע צפיפות"עמודות
MACS LSMiltenyi Biotec130-042-401מתואר כ"עמודה מגנטית"
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376מתואר כ"פתרון מלאי אלבומין בסרום בקר (BSA)"MACS
MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303מתואר כ"מעמד מגנטי"
פניצילין-סטרפטומיציןנקלאי טסק26253– 84
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP10144מתואר כ"מדיה הרכבה"
רקומביננטי אנושי GM-CSFR& D Systems215-GM
רקומביננטי אנושי IL-34מו"פ D Systems5265-IL
RPMI 1640 Medium + תוסף GlutaMAX (מדיום מוסף מראש)Thermo Fisher Scientific61870036מתואר כ"מדיום אינדוקציה בסיסי"
RPMI-1640Nacalai Tesque30264-56
<נוגדנים חזקים>
נוגדנים נגד P2RY12Sigma-AldrichHPA014518נוגדן ראשוני, ארנב, 1:100
נוגדן נגד TMEM119Sigma-AldrichHPA051870נוגדן ראשוני, ארנב, 1:100
נוגדן משני נספג IgG (H+L) עז נגד ארנב, Alexa Fluor 568invitrogenA-11011נוגדן משני, ארנב, 1:1000

מקורות

  1. Steiner, J., et al. Immunological aspects in the neurobiology of suicide: elevated microglial density in schizophrenia and depression is associated with suicide. J Psychiatr Res. 42 (2), 151-157 (2008).
  2. Setiawan, E., et al. Association of translocator protein total distribution volume with duration of untreated major depressive disorder: a cross-sectional study. Lancet Psychiatry. 5 (4), 339-347 (2018).
  3. Holmes, S. E., et al. Elevated translocator protein in anterior cingulate in major depression and a role for inflammation in suicidal thinking: a positron emission tomography study. Biol Psychiatry. 83 (1), 61-69 (2018).
  4. Meyer, J. H., et al. Neuroinflammation in psychiatric disorders: PET imaging and promising new targets. Lancet Psychiatry. 7 (12), 1064-1074 (2020).
  5. Ohgidani, M., et al. Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease. Sci Rep. 4, 4957(2014).
  6. Method of producing microglial cells. France patent EP. , 3 092 305 B1 (2023).
  7. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  8. Mattis, V. B., Svendsen, C. N. Induced pluripotent stem cells: a new revolution for clinical neurology. Lancet Neurol. 10 (4), 383-394 (2011).
  9. Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
  10. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10343-10348 (2011).
  11. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  12. Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nat Immunol. 13 (8), 753-760 (2012).
  13. Aloisi, F., De Simone, R., Columba-Cabezas, S., Penna, G., Adorini, L. Functional maturation of adult mouse resting microglia into an APC is promoted by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interaction with Th1 cells. J Immunol. 164 (4), 1705-1712 (2000).
  14. Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6 (10), e26317(2011).
  15. Nandi, S., et al. The CSF-1 receptor ligands IL-34 and CSF-1 exhibit distinct developmental brain expression patterns and regulate neural progenitor cell maintenance and maturation. Dev Biol. 367 (2), 100-113 (2012).
  16. Douvaras, P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia. Stem Cell Rep. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  17. Yonemoto, K., et al. Heterogeneity and mitochondrial vulnerability configurate the divergent immunoreactivity of human induced microglia-like cells. Clin Immunol. 255, 109756(2023).
  18. Tanaka, S., et al. CD206 expression in induced microglia-like cells from peripheral blood as a surrogate biomarker for the specific immune microenvironment of neurosurgical diseases including glioma. Front Immunol. 12, 2424-2424 (2021).
  19. Ohgidani, M., et al. Fibromyalgia and microglial TNF-alpha: Translational research using human blood induced microglia-like cells. Sci Rep. 7 (1), 11882(2017).
  20. Ohgidani, M., et al. Microglial CD206 gene has potential as a state marker of bipolar disorder. Front Immunol. 7, 676(2016).
  21. Ohgidani, M., et al. A case of bipolar disorder with AIF1 (coding gene of Iba-1) deletion: A pilot in vitro analysis using blood-derived microglia-like cells. Psychiatry Clin Neurosci. 77 (2), 128-130 (2023).
  22. Shirozu, N., et al. Angiogenic and inflammatory responses in human induced microglia-like (iMG) cells from patients with Moyamoya disease. Sci Rep. 13 (1), 14842(2023).
  23. Sellgren, C. M., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Mol Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
  24. Sellgren, C. M., et al. Increased synapse elimination by microglia in schizophrenia patient-derived models of synaptic pruning. Nat Neurosci. 22 (3), 374-385 (2019).
  25. Banerjee, A., et al. Validation of induced microglia-like cells (iMG Cells) for future studies of brain diseases. Front Cell Neurosci. 15, 629279(2021).
  26. You, M. J., et al. A molecular characterization and clinical relevance of microglia-like cells derived from patients with panic disorder. Transl Psychiatry. 13 (1), 48(2023).
  27. Rocha, N. P., et al. Microglia activation in basal ganglia is a late event in Huntington disease pathophysiology. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 8 (3), e984(2021).
  28. Sargeant, T. J., Fourrier, C. Human monocyte-derived microglia-like cell models: A review of the benefits, limitations and recommendations. Brain Behav Immun. 107, 98-109 (2023).
  29. Lannes, N., et al. Interactions of human microglia cells with Japanese encephalitis virus. Virol J. 14 (1), 8(2017).
  30. Ryan, K. J., et al. A human microglia-like cellular model for assessing the effects of neurodegenerative disease gene variants. Sci Transl Med. 9 (421), 7635(2017).
  31. Etemad, S., Zamin, R. M., Ruitenberg, M. J., Filgueira, L. A novel in vitro human microglia model: characterization of human monocyte-derived microglia. J Neurosci Methods. 209 (1), 79-89 (2012).
  32. Bortolotti, D., Gentili, V., Rotola, A., Caselli, E., Rizzo, R. HHV-6A infection induces amyloid-beta expression and activation of microglial cells. Alzheimers Res Ther. 11 (1), 104(2019).
  33. Ormel, P. R., et al. A characterization of the molecular phenotype and inflammatory response of schizophrenia patient-derived microglia-like cells. Brain Behav Immun. 90, 196-207 (2020).
  34. Akiyama, H., et al. Expression of HIV-1 intron-containing RNA in microglia induces inflammatory responses. J Virol. 95 (5), e01386-e01420 (2021).
  35. Nielsen, M. C., Andersen, M. N., Moller, H. J. Monocyte isolation techniques significantly impact the phenotype of both isolated monocytes and derived macrophages in vitro. Immunology. 159 (1), 63-74 (2020).
  36. Kelly, A., Grabiec, A. M., Travis, M. A. Culture of human monocyte-derived macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 1-11 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מונוציטים מדם אנושימחקר תרגומי הפוךהפרעות נוירופסיכיאטריותבידוד תאיםמדרג צפיפותהפרדת תאים מגנטיתשחרור ציטוקיניםקיבולת פגוציטוזיתגורם גרנולוציט-מקרופאג
הנדסה של תאים דמויי מיקרוגליה המושרים על ידי דם אנושי לחקר המוח בתרגום לאחור
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.