פרוטוקול זה מציג שיטה מקיפה ויעילה לניתוח תיקון עצם המנדיבולרית. אנו מתארים טכניקה הניתנת לשחזור עבור שבר מנדיבולרי לא מיוצב במודל עכבר, המאפשר ניתוח של תהליך תיקון עצם אנדוכונדרלית עם נזק מינימלי לרקמות ואובדן עצם.
מאמר שיטה
פרוטוקול זה מציג שיטה מקיפה ויעילה לניתוח תיקון עצם המנדיבולרית. אנו מתארים טכניקה הניתנת לשחזור עבור שבר מנדיבולרי לא מיוצב במודל עכבר, המאפשר ניתוח של תהליך תיקון עצם אנדוכונדרלית עם נזק מינימלי לרקמות ואובדן עצם.
ניתן לבצע שברים לא מיוצבים באתרים מנדיבולריים בעכברים, ובכך לאפשר לנתח את תיקון העצם באמצעות מצב אוסיפיקציה אנדוכונדרלי. כדי לשקף בצורה המדויקת ביותר את התהליך הזה in vivo, יש צורך בפרוטוקול סטנדרטי כדי למנוע אובדן עצם מוגזם ונזק לרקמות רכות, במיוחד באתר המנדיבולרי, אתר אנטומי המאופיין בגישה מינימלית. למיטב ידיעתנו, אנו מתארים לראשונה פרוטוקול פחות פולשני של שבר מנדיבולרי לא מיוצב בעכברים. עכברים בוגרים מורדמים עם isoflurane ומקבלים מינון טרום הניתוח של buprenorphine על ידי הזרקה תת עורית. גישה submandibular מבוצעת, עם חתך העור נעשה לאורך הגבול התחתון של הלסת התחתונה. שריר המסה מורם במישור תת-פריאוסטאלי לאורך הרמוס המנדיבולרי עם מעלית פריאוסטיאלית. שבר אנכי ושלם של הרמוס מבוצע מהגבול הבזילרי לחריץ הקורונואיד (בין תהליכים קונדילריים וקורונואידים), באמצעות מכשיר ניתוח עצם פיאזואלקטרי תחת השקיה בסרום מלוחים בקצה הבזילרי ומספריים להשלמת השבר של הרמוס המנדיבולרי. גישת העור סגורה על ידי תפרי משי. הליך מפורט זה עבור שברים מנדיבולרים שאינם מיוצבים מציע הליך יעיל המאפשר אובדן עצם מינימלי ונזק לרקמות רכות. טכניקה זו מבטיחה תוצאות מוצלחות ועקביות כדי לשקף במדויק את תהליך תיקון העצם האנדוכונדרלית במודלים של עכברים.
תיקון עצם מרמז על תהליכי אוסיפיקציה קרומיים ואנדוכונדרליים, בהתאם לשבר או לייצוב אוסטאוטומיה. תיקון עצם לאחר אוסטאוטומיה או שברים בעצמות מיוצבות מסתמך על אוסטיאוטומיה קרומית, בעוד ששברים לא מיוצבים או אוסטאוטומיות לא מיוצבות מתגבשים על פי מצב של אוסטיאומיה אנדוכונדרלית1. תיקון עצם ממברנית מאופיין בהיווצרות עצם על ידי התמיינות ישירה של תאים מזנכימליים לאוסטאובלסטים, ואילו תיקון עצם אנדוכונדרלי כרוך בהיווצרות תבנית סחוס חולפת, המתמיינת לאוסטאובלסטים ליצירת יבלת עצם2.
תיקון עצם תלוי באינטראקציות מרובות רקמות ותאיות; הוא מושפע גם מגורמים ספציפיים לאתר ומהכוח המופעל על יבלת3. עצם מנדיבולרית היא עצם ניידת התומכת בכוחות מסטיקטוריים, הנוצרת בעיקר על ידי עצם קליפת המוח. תהליך תיקון העצם המנדיבולרית מושפע מהאתר וכיוון השבר. ידוע היטב כי פציעות שרירים ופריאוסטאום עלולות להשפיע על גיבוש העצם, כמו גם אובדן עצם חשוב באתר השבר 4,5,6.
ניתוח תיקון עצם מנדיבולרית אנדוכונדרלית מרמז על פרוטוקולים סטנדרטיים וניתנים לשחזור להשוואות יקרות ערך ולא מוטות. באשר לספרות, רק מחברים מעטים מדווחים על פרוטוקולים לשברים מנדיבולרים לא מיוצבים בעכבריםמודלים 3,7, ובעיקר עם כיוון קדמי ברמה מולרית8. על ידי פיתוח טכניקה זו, אנו שואפים למנוע פציעות שרירים ו periosteum ולהגביל אובדן עצם באתר השבר כדי לנתח בצורה הטובה ביותר את התהליך של תיקון עצם endochondral ללא גורמים מבלבלים. בנוסף, מטרת פיתוח טכניקה חדשה לשבר מנדיבולרי בעכברים הייתה למזער כאבים לאחר ניתוח ומוות שכיח של בעלי חיים בניתוחים כאלה בבעלי חיים קטנים. לראשונה אנו מתארים פרוטוקול פחות פולשני לשבר מנדיבולרי לא מיוצב ברמת הרמוס בעכברים. פרוטוקול in vivo זה מונע נזק מוגזם לשרירים ולפריאוסטאום או אובדן עצם באתר השבר ומסייע להפחית את רמת הכאב לאחר הניתוח ואת הסיכון למוות של החיה.
פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים של מכון אימג'ין ואומת על ידי ועדות אתיות והמשרד הצרפתי (APAFIS 26995).
1. בעלי חיים
2. הליך כירורגי
3. טיפול לאחר הניתוח
באשר להליכים כירורגיים in vivo , כדי לבצע בצורה אופטימלית הליך זה של שבר מנדיבולרי לא מיוצב במודל עכבר, נדרשים למידה והכשרה ספציפיים.
טכניקה זו לשבר מנדיבולרי לא מיוצב מאפשרת ללמוד את תהליך תיקון העצם האנדוכונדרלית. לאחר המתת חסד נאספו דגימות מנדיבולאריות ב-4% פרפורמלדהיד (24 שעות). לאחר הסתיידות מלאה עם EDTA pH 8, חלקים הוטמעו בפרפין. מקטעי קשת סדרתיים בוצעו, פורקו בתמיסת דה-פראפיניזציה, ולאחר מכן התייבשו לפני צביעת סירוס אדום/כחול אלקיאני, תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים. התמונות ההיסטולוגיות אישרו היווצרות של יבלת רכה עם תבנית סחוס (איור 5). ריפוי העצם מסתיים לאחר 4 שבועות לאחר השבר, כפי שמוצג על ידי ניתוח micro-CT. אנו מציעים ללמוד את תהליך תיקון העצם בנקודות מפתח שונות מתחילת היווצרות היבלות (למשל, כל 7 ימים (יום 7, 14, 21) או יותר בהתאם למטרת המחקר) ועד סוף ריפוי העצם (כלומר, יום 28), עם ניתוחים היסטומורפולוגיים ומיקרו-CT מורפומטריים.
בהתבסס על ניתוח רטרוספקטיבי של הליך זה שבוצע על 58 עכברי בר (רקע C57BL/6J), שיעור ההצלחה של הפרוטוקול הוא 86.3% ושיעור הרחקה של 13.7%. ההדרה נבעה ממוות ספונטני בטרם עת בתקופה המוקדמת שלאחר הניתוח (3%), מהחלטה על המתת חסד לעכברים שהציגו ציון קריטי (1%; ציון > 3 ו/או במקרה של ירידה במשקל > 20%), או במקרה של מיקום לא תקין של האוסטאוטומיה, עם פיצול חריג של זווית הלסת (5%), או כאשר השבר היה ברמה המולרית (n=1/58). זיהום נצפה במקרה האחרון, עם פיצול חריג של השבר ברמה המולרית (n = 1/58; טבלה 2).

איור 1: תמונה של הגישה העורית התת-לסתית של הענף העולה המנדיבולרי. הגבול התחתון של הלסת התחתונה נשבר עם תוספת piezotome, המאפשר אובדן עצם מינימלי (חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: צביעה של לסת העכבר. מבט רוחבי על לסת עכבר פראית בת 6 שבועות (מוכתמת בכתמים בצבע אדום אליזרין / כחול אלסי): 1. קונדיל, 2. תהליך קורונואידי, 3. חריץ קורונואידי, 4. תהליך זווית, 5. גבול אחורי של הרמוס, 6. גבול בזילרי (או נחות) של הלסת התחתונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: צילום רנטגן של גולגולת העכבר. צילומי רנטגן רוחביים של גולגולת עכבר פראי בן 6 שבועות (מבט קשת) המראים את אספקט הלסת של עכבר לא שבור (משמאל) ואת אספקט הלסת התחתונה של עכבר שבור ואת כיוון השבר המנדיבולרי הלא מיוצב (חיצים), מהגבול התחתון לחריץ הקורונואיד, ממוקם קדמית לקונדיל (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4. צילום רנטגן של גולגולת העכבר בתנאים תת-אופטימליים. צילומי רנטגן רוחביים של גולגולת עכבר פראי בן 6 שבועות (מבט סגיטלי) המראים שבר חריג בזווית המנדיבולרית (חיצים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים 5: תוצאות מייצגות. תוצאות ביום 14 לאחר שבר בעכבר מסוג פרא (C57BL/6J). תצוגות קורונליות תלת ממדיות מייצגות של סריקת μCT משוחזרת של אתר השבר המנדיבולרי, המראה את יבלת העצם (חיצים לבנים). תמונות מייצגות של סחוס היבלות (צבע אדום סירוס / כחול אלקיאני) המאשרות את נוכחותו של תהליך תיקון עצם אנדוכונדרלי. קיצורים: B = עצם, C = סחוס. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| 0 | 1 | 2 | |
| היבט חייתי | רגיל | הפחתת שירותים | שערות פרועות, גב מקושת |
| התנהגות | רגיל | תת-ניידות | hypomobility, הפחתת צריכת מזון, ירידה במשקל > 10% |
| סימנים קליניים | רגיל | דלקת צלקת | צלקת פתוחה, זיהום |
טבלה 1. סולם ציוני רווחה לאחר הניתוח.
| n = 58 עכברים | |
| אחוזי הצלחה | 86.3 % |
| שיעור אי הכללה: | 13.7 % |
| מוות ספונטני בטרם עת | 3% |
| ציון קריטי < 3, ו / או ירידה במשקל > 20 % | 1% |
| שבר חריג מפוצל לזווית המנדיבולרית | 5% |
| פיצול שבר חריג, ברמה המולרית | 1.7 % |
טבלה 2. אחוזי הצלחה והדרה של הפרוטוקול.
הטכניקה מאפשרת מימוש שברים מנדיבולרים לא מיוצבים במודל עכבר בגישה פתוחה מינימלית בזמן פרוצדורה קצר (כ-10 דקות או פחות). הליך קצר מועד זה מגביל את הסיכון לתחלואה ומוות של בעלי חיים, במיוחד בבעלי חיים קטנים כמו עכברים. כדי להשיג תוצאות דומות בניתוח תהליך תיקון העצם האנדוכונדרלי, יש להקפיד במיוחד לבצע את השברים המנדיבולריים באותו כיוון ללא פיצול חריג של הזווית המנדיבולרית, שכן השפעה בלתי רצויה זו יכולה להגדיל באופן חריג את נפח יבלת העצם ולעכב את תקופת האיחוד. פרוטוקול זה לשבר מנדיבולרי אינו משפיע על צמיחת החותכת המנדיבולרית לאחר הניתוח. כדי לשפר את היעילות של פרוטוקול זה, אנו ממליצים לנסיין להתאמן תחילה על בעלי חיים מורדמים בגיל דומה ולנתח מיד לאחר שבירת הלסת התחתונה כדי לדמיין ישירות את כיוון השבר במידת הצורך.
אבות מזנכימליים הנודדים משרירים סמוכים אל היבלת תורמים לתיקון העצם6. הוכח כי periosteum ופגיעה בשרירים משפיעים על גיבוש עצם 5,6. בנוסף, קטעי שרירים נרחבים מובילים לסיכון מוגבר לדימום ועלולים להוביל לזיהום לאחר הניתוח. Piezosurgery פותחה במידה רבה בתחום ניתוחי עצם גולגולתיים; דווח על שיעורים נמוכים יותר של פגיעה ברקמות רכות וכאבים לאחר הניתוח בהשוואה לאוסטאוטומיות קונבנציונליות 7,9. כדי למזער את הפגיעה בשריר המסה ובפריאוסטאום, השתמשנו בפיזוכירורגיה כדי ליזום את השבר בגבול התחתון של הלסת התחתונה והשלמנו את השבר עם מספריים במפלס העליון של הרמוס כדי למנוע חתך נרחב של שריר המסה. משמעות הדבר היא שליטה במיקום הגבול האחורי של הלסת התחתונה והחריץ הקורונואיד לפני שבירת החלק העליון של הרמוס עם המספריים. לא נתקלנו בקושי להשלים את השבר בעזרת מספריים קטנים וישרים לאחר שהתחלנו אותו בניתוח פיאזוכירורגי בקצה התחתון של הלסת התחתונה. חווינו הליך זה בעכברים בוגרים עם רקע גנטי שונה (C57BL/6J, CD1 (התוצאות לא מוצגות)), עם צפיפות עצם שונה וגדלי לסת שונים (פרוגנתיזם, מיקרוגנתיה). עם זאת, מומלץ לבדוק כי אורך המספריים מתאים לשבירת הרמוס העליון פעם אחת בלבד כדי למנוע פיצולים חריגים של שבר.
הסיכון לדימום ממוזער בהליך זה בשל גישה פתוחה מינימלית זו. במקרה של דימום מוגזם שעלול להתרחש במהלך התרוממות שרירים, דחיסה קצרה של האתר הכירורגי עם גזה מפסיק את הדימום. סיכון פוטנציאלי לזיהום באתר הניתוח עלול להתרחש במקרה של שבר בשן טוחנת כאשר שבר מנדיבולרי ממוקם קדמית מדי; השפעה שלילית זו יכולה להיות מזוהה על צילומי רנטגן לרוחב לאחר הניתוח. במקרה זה, יש להוציא את החיה מהמחקר. זיהום לאחר הניתוח של אתר ההפעלה עשוי להיות גם בשל המטומה; ניתן למנוע זאת על ידי ביצוע תפרים עוריים מופרדים, המאפשרים פינוי ספונטני כאשר דימום חריג מתרחש לפני הניתוח. הרדמה כללית עם איזופלורן לעומת הזרקה תוך צפקית מונעת שיעורי תמותה מופרזים הקשורים להשפעות הטראומטיות השליליות של זריקות תוך צפקיות. מניסיוננו, לא ראינו מוות של בעלי חיים הקשור ישירות להרדמה כללית עם איזופלורן.
עכברים עשויים להציג הפחתה לאחר הניתוח של צריכת מזון. במקרה של צריכת מזון לא מספקת או עלייה לא מספקת במשקל, ניתן להוסיף אבקת כופתיות מנופות לג'ל. כדי לשפר את צריכת המזון לאחר הניתוח, אנו ממליצים לתת תוסף תזונה ג'ל עם כופתיות לפחות 1 שבוע לפני הליך הלינה. מומלץ לבצע צילומי רנטגן נוספים במהלך המעקב (כל שבוע, במהלך המעקב) ובזמן ההקרבה כדי להעריך תזוזה אפשרית של השבר. בתנאים לא פתולוגיים, איחוד העצם הושלם 4 שבועות לאחר השבר.
מספר מחברים תיארו פרוטוקולים שונים לשברים לא מיוצבים של הלסת התחתונה בעכברים 3,10,11. המכשירים המשמשים לביצוע האוסטאוטומיה יכולים להיות שונים, כלומר, מקדחות, פינצטה כירורגית וכו '. עם זאת, השימוש במקדחות עלול להוביל לאובדן עצם גדול יותר ולפציעות ברקמות רכות. למיטב ידיעתנו, הליך זה של שברים מנדיבולריים לא מיוצבים הוא הראשון לקשר בין פיאזוכירורגיה למספריים להשלמת האוסטאוטומיה. לטכניקה זו יש את היתרון של שימור רקמות רכות תוך מתן אפשרות לאוסטאוטומיה מדויקת עם אובדן עצם מינימלי.
באשר לכל הטכניקות, שיטה זו יש כמה מגבלות. העדפנו לבצע את השבר באמצעות מספריים לאחר חניכתו עם החדרת ניתוח פיאזואלקטרי כדי למנוע חתך שריר מעסה מורחב ופגיעה בפריאוסטאום שעלולה להחמיר עיכוב קונסולידציה פוטנציאלי ו/או היווצרות פסאודרתרוזיס. עם זאת, טכניקה זו מרמזת על שליטה במיקום של חריץ קורונואיד ללא הדמיה מוחלטת של ramus mandibular לבצע את השבר באותו כיוון. לכן צפויה עקומת למידה, בהתאם לניסיון הניתוחי. בנוסף, כיוון השבר המנדיבולרי בצילומי רנטגן עשוי להיות קשה לדמיין בהתאם למכשיר הרנטגן. לא השתמשנו במיקרו-CT in vivo כדי לאשר את כיוון השבר, מכיוון שהוא עלול לסכן את התאוששות העכבר בגלל משך הזמן המוגבר של הרדמה כללית.
לימוד תהליך תיקון העצם האנדוכונדרלי מרמז על מימוש שברים לא מיוצבים, ובכך מאפשר הבנה טובה יותר של תהליך תיקון העצם. צעד זה נחוץ אם ברצוננו לשקול ניסויים פרה-קליניים במודלים של עכברים עם פגמים בתיקון עצם במטרה לפתח יישומים קליניים חדשים לטיפול בתיקון עצם פגומה ובפסאודארתרוזיס בחולים בהקשר של מחלות גנטיות או במקרה של sequelae פוסט טראומטית או פוסט-גידולית.
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
המחקר נתמך בחלקו על ידי המחלקה לפילנתרופיה של Mutuelles AXA באמצעות כיסא הראש והלב ו- ANR BonyBrain. אנו מודים לכל חברי פלטפורמת SFR Necker INSERM US24, LEAT Imagine, פריז, צרפת, על תרומתם למימוש ההליך.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| בופרנורפין: Buprecare 0.3 מ"ג/ק"ג | OBWEGESER | ||
| רוחב 6 מ"מ אורך 17,5 ס"מ | מלקחיים של Collin Medical | HA 5905 | |
| צלחת כרית MORIA 11 ס"מ N° 5 | MORIA | 9906 | |
| שולחן חימום Bioseblab 55 ס"מ x 33 ס"מ | Bioseblab | 707 | |
| מחזיק מחט Micro Halsey - מתכת | לבודרם | 21,100 | |
| ניאו קליר | Merck Millipore, Darmstadt, גרמניה | 109843 | |
| Ocry Gel Tube 10 גרם (חומר סיכה לעיניים) | tvm lab | 3.70045E+12 | |
| Piezotome 2 ASS FINAL | ACTEON | X57402 | |
| Piezotome הכנס Piezocision PZ3 | ACTEON | F87574 | |
| מספריים מיקרו | MORIA | MC52 | |
| תפרי משי PERMA HAND SEIDE / MERSILK | ETHICON | REF 18501G | |
| מספריים ישרים | MORIA | 4877A | |
| Vetflurane (איזופלורן) 250 מ"ל | VIRBAC | VET066 (Centravet) |
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה