מאמר שיטה

בידוד תאי גזע מזנכימליים שמקורם בחבל הטבור עם יבולים גבוהים ונזק נמוך

5.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66835

⸱

5 ביולי 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3Obstetrical Department, Longgang District Maternity & Child Healthcare Hospital of Shenzhen City, 4Longgang Maternity and Child Institute of Shantou University, Medical College

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מציג הליך דיסקציה קהה ייחודי לשמירה על שלמות הג'לי של וורטון (WJ), וכתוצאה מכך WJ פחות פגום וכמות וכדאיות גדולה יותר של תאי גזע מזנכימליים שנקטפו (MSC). השיטה מפגינה תפוקה ויכולת שגשוג גבוהות בהשוואה לשיטות דיסקציה חדות קונבנציונליות.

תקציר

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הם אוכלוסייה של תאים רב-פוטנטיים בעלי תכונות רגנרטיביות ואימונומודולטוריות יוצאות דופן. הג'לי של וורטון (WJ) מחבל הטבור (UC) זכה להתעניינות גוברת בתחום הביו-רפואי כמקור יוצא מן הכלל של MSCs. עם זאת, התעוררו אתגרים כגון היצע מוגבל וחוסר סטנדרטיזציה בשיטות הקיימות. מאמר זה מציג שיטה חדשנית לשיפור תפוקת MSC על ידי ניתוח WJ שלם מחבל הטבור. השיטה משתמשת בדיסקציה קהה כדי להסיר את שכבת האפיתל, תוך שמירה על שלמות ה- WJ כולו וכתוצאה מכך כמות וכדאיות מוגברת של MSCs שנקטפו. גישה זו מפחיתה באופן משמעותי את פסולת WJ בהשוואה לשיטות דיסקציה חדות קונבנציונליות. כדי להבטיח את טוהר WJ-MSCs ולמזער את ההשפעה התאית החיצונית, בוצע הליך המשתמש במתח פנימי כדי לקלף את האנדותל לאחר היפוך UC. בנוסף, צלחת הפטרי הפכה לזמן קצר במהלך תרבית הצמחים כדי לשפר את ההתקשרות ואת צמיחת התאים. ניתוח השוואתי הראה את עליונותה של השיטה המוצעת, והראה תשואה גבוהה יותר של WJ ו- WJ-MSCs עם כדאיות טובה יותר מאשר שיטות מסורתיות. המורפולוגיה ודפוס הביטוי הדומים של סמני פני התא בשתי השיטות מאשרים את אפיונם וטוהרם עבור יישומים שונים. שיטה זו מספקת גישה בעלת תפוקה גבוהה וכדאיות גבוהה לבידוד WJ-MSC, ומדגימה פוטנציאל גדול ליישום קליני של MSCs.

מבוא

מאז הבידוד הראשון של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) מהג'לי של וורטון (WJ) בשנת 1991, תאי גזע רב-פוטנטיים אלה זכו לתשומת לב משמעותית מצד חוקרים בשל תכונות ההתחדשות שלהםויכולת התמיינות רב-שושלות 1. MSCs ניתן לבודד ממקורות שונים, כולל מח עצם, דם היקפי, מוך השן, רקמת שומן, עובר (הפלה אנושית), ורקמות הקשורות ללידה2. חבל הטבור (UC) התגלה כמאגר מבטיח בשל אופיו הלא פולשני, תפוקת התאים השופעת ויכולת ההתמיינות שלו, המציג קצב גבוה של התפשטות, פוטנציאל התמיינות ותכונות אפנון חיסוני3. MSCs עובריים מפגינים גבעול חזק ותכונות חיסוניות, מה שהופך אותם למוקד העיקרי של ניסויים קליניים ומחקר בסיסי שנערך בשני העשורים האחרונים 2,4,5. MSCs הנגזרים מ- UC הם בעלי פוטנציאל טיפולי מעולה בהשוואה למקורות אחרים של MSC, כגון מח עצם או רקמת שומן 6,7.

UC מורכב אפיתל מי שפיר, שלושה כלי דם (שני עורקים ווריד אחד), ואת החומר הג'לטיני המכונה WJ3. באופן מסקרן, UC מהווה כלי דם פשוט, המורכב רק אנדותל ומזותליום, אבל לא טוניקה adventitia; WJ אינו מכיל לימפה או עצבים8. UC מציג מבנה ייחודי אידיאלי להפרדה מגזרית. UC-MSCs ממוקמים בעיקר ב- WJ. MSCs יכולים להיות מבודדים ממדורים שונים של WJ, כולל מי שפיר, subamnion (מי השפיר והתת-אמניון המוגדרים גם כאזור רירית הטבור), והאזור הפרי-וסקולרי של WJ8. לכל אזור ב-WJ יש מבנה משלו, מאפיינים אימונוהיסטוכימיים ותפקוד 3,6.

MSCs שבודדו מה- WJ של UC נחשבים באופן נרחב כבעלי תועלת קלינית טובה יותר בהשוואה לאלה מאזורים אחרים3. WJ-MSCs נחקרו בהרחבה במסגרות פרה-קליניות וקליניות לטיפול במחלות שונות בשל פוטנציאל ההתמיינות הרב-קווי שלהם, תכונות אימונומודולטוריות, השפעות פרקריניות, השפעות אנטי דלקתיות ותכונות חסויות חיסון 2,3. WJ-MSCs הוכחו כמבטיחים בטיפול במגוון מחלות, כולל מחלת השתל נגד המאכסן (GvHD), דחיית שתלים, מחלת קרוהן, מחלות אוטואימוניות ומחלות לב וכלי דם 9,10,11,12,13,14. ככל שהביקוש הקליני ל-WJ-MSCs ממשיך לגדול, היצע המחסור בחבל הטבור מהווה כיום מכשול ליישומים הנרחבים שלהם.

התפוקה של WJ-MSCs תלויה בשיטה המשמשת לחילוץ תאים15. בעוד WJ-MSCs ניתן לבודד באמצעות תרבית explant או עיכול אנזימים, השיטה האחרונה יש זמן התפשטות ארוך יותר שעלול להגדיל את הסיכון של נזק לתאים ולהפחית את הכדאיות התא16. עם זאת, מחקרים רבים הראו כי שיטת תרבית explant מגבירה את תפוקת התאים ואת הכדאיות, וכי גורמים paracrine שוחרר רקמות explant גם לעזור לקדם את התרבות תאים17,18.

מחקר זה יישם גישת דיסקציה ייחודית להשגת WJ שלם, והניב MSCs עם יכולת שגשוג משופרת, כדאיות וכמות, תוך מזעור הנזק ל- WJ. שיטה חדשנית זו מציעה אסטרטגיה יעילה לבידוד WJ-MSCs, תוך מתן מענה לצרכים קריטיים ביישומי MSC.

פרוטוקול

דגימות נלקחו מהתורמים הבריאים בהסכמה מבית החולים לבריאות יולדות וילדים במחוז שנג'ן לונגגנג, גואנגדונג, סין. השימוש בדגימות אנושיות למחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים שנזן, אוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית (SZLDH2020LSYM-095) וועדת האתיקה הרפואית של בית החולים ליולדות וילדים במחוז שנג'ן לונגגנג (LGFYYXLLS-2020-005). כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות שאושרו. פרטי הריאגנטים והציוד בו נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. איסוף חבל הטבור האנושי

  1. יש להשיג דגימות חבל טבור אנושי מבית החולים השיתופי בתנאים סטריליים.
    הערה: בחר תורם מתחת לגיל 35, רצוי פרימיפרה, ללא היסטוריה של הפטיטיס, מחלות המועברות במגע מיני או הפרעות גנטיות. תוצאות בדיקת הקבלה עבור וירוס הפטיטיס B, וירוס הפטיטיס C וציטומגלווירוס צריכות להיות שליליות. בחר ניתוח קיסרי כמצב הלידה.
  2. בחר פיסת UC ישרה ושלמה באורך של כ-10-15 ס"מ.
  3. סוגרים את שני הקצוות במלקחיים המוסטטיים וסוגרים קשרים כירורגיים בקצה הפנימי בין המלקחיים מיד לאחר לידת יילוד מלא בניתוח קיסרי. (UC נאסף כפי שמוצג באיור 1, שלב 1).
    הערה: הפעלת הניתוח הקיסרי מבטיחה שהאיסוף יהיה סטרילי. השתמש בקשרים כירורגיים בתפר בגודל 0 או 2-0 לחוזק מתיחה טוב יותר.
  4. חתכו את חבל הטבור הקשור בין המלקחיים לקשרים באמצעות מספריים כירורגיים (איור 1, שלב 1).
  5. שטפו אותו בתמיסת מלח כדי להסיר קרישי דם מזהמים על פני השטח והעבירו מיד לצינור פלסטיק סטרילי של 50 מ"ל המכיל 20 מ"ל של מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS).
    הערה: לא נעשה שימוש באנטיביוטיקה במהלך ההעברה.
  6. אטמו את הצינור. הניחו אותו על קרח בקופסת פוליסטירן ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C לפני העברתו למעבדה.
    הערה: נתח את הכבל תוך 4 שעות מרגע האיסוף.

2. בידוד הג'לי של וורטון מחבל הטבור

  1. עבד את חבל הטבור לפי השלבים הבאים:
    1. הכינו מגש מעוקר עם כלי ניתוח, כלים ארוזים אספטית בקוטר 90 מ"מ, פיפטות 1000 מיקרוליטר, PBS סטרילי, תמיסת אתנול 75% ומדיום תרבית MSC אנושי נטול קסנו.
      הערה: המלקחיים עם השיניים ומהדקי היתושים מאפשרים לטפל בכבל החלקלק ביעילות.
    2. יש לטהר את הפריטים הנדרשים ואת אזור העבודה לפני הנחת הפריטים בתוך ארון הבטיחות הביולוגית.
      הערה: אפשר לאוויר באזור העבודה להתנקות למשך מספר דקות לפני תחילת העבודה.
    3. יש לחטא את פני השטח של הצינור ולהסיר את הדגימה לתוך צלחת פטרי בארון הבטיחות הביולוגית. טבלו את הדגימה עם הקשרים באתנול 75% למשך 30 שניות ולאחר מכן שטפו אותה מספר פעמים עם PBS סטרילי בצלחת פטרי חדשה.
      הערה: יש לקשור את הכבל לפני טבילה באתנול 75%, ויש להגביל את זמן הטבילה ל-30 שניות עד דקה כדי לחטא את הכבל במלואו ללא נזק.
    4. חותכים את הקשרים וחותכים את החוט בין שני קשרים לרוחב לחתיכות קצרות באורך של כ-2 ס"מ בעזרת מספריים ומלקחיים כירורגיים.
      הערה: יש להיפטר מקצות הכבל עם קשרים. אורך ה- UC לא צריך להיות ארוך מדי או קצר מדי; שני התנאים עשויים להגביר את הקושי של הניתוח.
    5. מחוררים את הווריד (כלי גדול יותר) עם PBS באמצעות פיפטות 1000 μL עד שהנוזל היוצא מהקצה השני של החוט הופך לשקוף לחלוטין19.
  2. לנתח את חבל הטבור.
    1. מעבירים את אחת החתיכות שכבר נחתכו לצלחת פטרי חדשה.
      הערה: שני עורקים ווריד אחד צריכים להיות חשופים באופן גלוי בחתך8 (איור 2B).
    2. הוסף את הכמות המתאימה של PBS כדי לשמור על הכבל רטוב לאורך כל הפעולה.
    3. אחזו בחוט במלקחיים ומשכו את העורקים לאורך צירו הראשי בעזרת מלחציים ליתושים.
      הערה: נסה למשוך מהקצה השני של החוט אם העורק נקרע, מכיוון שלדופן העורק יש גמישות רבה.
    4. קבע את הכבל אופקית כאשר הצד העבה פונה כלפי מעלה על ידי הכנסת להב אחד של המלקחיים לווריד הטבור ולאחר מכן הידוק חזק, תוך הקפדה על הידוק המלקחיים בצד העבה יותר.
    5. בצעו חתך ליניארי בשכבת אפיתל מי השפיר מקצה אחד לשני לאורך קצה הלהב השני של המלקחיים באמצעות אזמל (איור 3).
      הערה: שמור על שלמות הג'לי של וורטון על ידי חיתוך WJ קטן ככל האפשר.
    6. התחילו בפינה אחת של מרווח החיתוך. הרימו את פינת אפיתל מי השפיר עם מלחציים בשיניים והמשיכו לחתוך אופקית עוד קצת עם מספריים בקרנית לאורך המשטח הפנימי של האפיתל.
      1. להפריד את הג'לי של וורטון ואת אפיתל מי השפיר עם מלחציים ובהדרגה להרחיב לכל המעגל של קצה אחד של UC. קלפו את שכבת האפיתל לאורכה (איור 3).
        הערה: הג'לי של וורטון הוא רקמת חיבור רירית המוקפת באפיתל מי השפיר הצפוף8. הפעולה כולה צריכה להיות חלקה, אך ניתן להשתמש במלחציצי יתושים לדיסקציה קהה אם נתקלים בקשיים במהלך הקילוף.
    7. הכניסו את שני הלהבים של המלקחיים לתוך הווריד, הדקו חלק מ-WJ, ואז הפכו אותו מבפנים החוצה כדי לחשוף את האפיתל של וריד הטבור (איור 3).
    8. קלפו את אפיתל הווריד בקלות, שכן המתח הפנימי יוצר הפרדה בין אפיתל הווריד לבין ה-WJ הפריווסקולרי (איור 3).
  3. נתח את UC באמצעות השיטה המקובלת להשוואה20.
    1. בחרו דגימה נוספת שכבר נחתכה במשקל כמעט זהה לזה של החוט הקודם והעבירו אותה לצלחת פטרי חדשה.
    2. חותכים לאורך וריד הטבור לאורכו עם מספריים ומפיצים את UC כדי לחשוף את כלי הדם ואת WJ.
    3. הסר את וריד הטבור ושני עורקים, והסר את ה- WJ משכבת האנדותל בעזרת מספריים ואזמל.

3. בידוד ותרבות של UC-MSCs

  1. מניחים את WJ שנאסף בצלחת פטרי 90 מ"מ מסומנת מראש וחותכים אותו לחתיכות 1-3 מ"מ עם מספריים ומלקחיים.
  2. הפכו את המנה עם המכסה בתחתית והניחו אותה באינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות כדי לחזק את החיבור בין החתיכות למשטח הפלסטיק.
  3. הופכים את המנה, ומוסיפים בעדינות כמות מתאימה של מדיום תרבית MSC אנושי לתרבית נוספת.
    הערה: השתמש במהירות הנמוכה ביותר כדי לוודא שהחלקים עדיין מחוברים.
  4. שנה את מדיום התרבות האנושי של MSC כל 3 ימים. להחליף שני שלישים של המדיום ולראות את המראה של outgrowth של תאים סיביים כל 2 ימים ב 7 הימים הראשונים, לשנות את המדיום המלא, ולצפות בו על בסיס יומי לאחר מכן.
    הערה: הימנעו מהזזת צלחת הפטרי במשך 7 הימים הראשונים. הצמיחה המובחנת של תאים דמויי פיברובלסטים נצפתה תוך כ -4 ימים.
  5. תת-תרבות עד שהמפגש מגיע ל-80%.
    הערה: שלב זה נמשך 7-10 ימים.
    1. חממו מראש את PBS, 0.25% טריפסין, ותרבית MSC אנושית נטולת קסנו בינונית ל-37°C באמבט מים.
    2. יש לשטוף עם PBS לאחר שאיפת הסופרנטנט עם פיפטה, ולנתק את התאים עם 0.25% טריפסין שחומם מראש עד שניתן יהיה לעקור את התאים על ידי הקשה על צלחת הפטרי.
    3. נטרל את הטריפסין על-ידי ערבוב מדיום תרבית MSC שחומם מראש ביחס של 4:1, אסוף את מתלה התא ואת הצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
      הערה: תאים אלה נחשבים למעבר 0 (P0).
    4. יש להשליך את הסופרנאטנט עם פיפטה, להשהות מחדש את התאים בתווך תרבית MSC האנושי, ולחסן לצלחות פטרי חדשות בצפיפות זריעה של 1x104 תאים לסמ"ר2 לצורך התפשטות.
  6. באמצעות המוציטומטר, ספור את מספר התא הכולל של שתי השיטות לאחר הגברה במעבר הראשון, השני והשלישי. קבע את המורפולוגיה של התא תחת המיקרוסקופ במעברים הראשון, השלישי והחמישי.
    הערה: המורפולוגיה של תאים אלה צריכה להיות דומה לתאי P0.
  7. השתמש בתאים במעבר החמישי עבור ציטומטריית זרימה וניסויים אחרים.

4. ביטוי סמני פני התא על ידי ציטומטריית זרימה

  1. נתק תאי מעבר 5 (P5) עם 0.25% טריפסין, שטוף את התאים עם חיץ צביעת תאים, וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השהה מחדש את הכדוריות עם חיץ צביעת התא ל 100 μL כל אחת.
  2. סמן כל צינור והוסף את הכמויות המתאימות של נוגדנים, אשר צומדו עם Allophycocyanin (APC), fluorescein isothiocyanate (FITC) או phycoerythrin (PE): CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE בהתאם להוראות היצרן21. יש לדגור במשך 15-20 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
  3. צנטריפוגו את התאים המוכתמים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, לשאוף את supernatant עם פיפטה, ולשטוף פעם אחת עם חיץ צביעת התא.
  4. חזור על הצנטריפוגה וההשעיה של התאים עם 300 μL של חיץ צביעת התא.
  5. הריצו את התאים דרך ציטומטר הזרימה ונתחו את התאים המוכתמים בנוגדנים בהתאם להוראות היצרן.

5. קביעת עקומת גדילת תאים בשיטת ספירת התאים

  1. הכינו תרחיף חד-תאי של תאי P5 בשתי שיטות על ידי דילולם במדיום תרבית MSC אנושי.
  2. זרעו 8,000 תאים לבאר בצלחת בת 24 בארות, ובסך הכל נזרעו 21 בארות מכל שיטה.
    הערה: מערבבים את התאים בעדינות על ידי ניפוח ויניקה עם פיפטות לפני הזריעה.
  3. קציר תאים משלוש בארות לאחר 24 שעות של זריעה. בצע ספירת תאים באמצעות המוציטומטר כדי לחשב את הערך הממוצע.
    הערה: נער את הצלחת לפני ספירת התא. ניתן להאריך את משך הרעידות כדי למנוע היווצרות של צברי תאים.
  4. חזור על ספירת התאים כל 24 שעות למשך זמן כולל של 7 ימים. התווה עקומת גדילה באמצעות זמן (d) על ציר X וספירת תאים (x104/mL) על ציר Y.

תוצאות

הנהלים לאיסוף וטיפוח UC-MSCs, כמו גם הניתוח הבא שלהם, מסוכמים באיור 1. ה-UC חולק בצורה מסודרת למספר חלקים בשיטה הייחודית; תרשים הפעולה הספציפי של ההליכים העיקריים מתואר באיור 2. צמיחתם של תאים מתרביות צמחים נוטרה ותועדה באופן שגרתי. תאים דבקים בצורת ציר נצפו כ -4 ימים לאחר תרבית הצמחים וזחלו יותר ויותר לצורת מערבולת. תאים אלה זוהו גם כ-P0 והמשיכו להתרבות לאחר מכן תוך שמירה על גודל ומורפולוגיה אחידים במהלך ההתרבות והמעבר. השיטות הקונבנציונליות והשיטות הנוכחיות הציגו הבדלים זניחים במונחים של גודל התא והמורפולוגיה (איור 3).

שיטת הדיסקציה הקונבנציונלית כוללת גירוד של WJ הרחק מכלי הדם ומהאפיתל הפנימי של UC. תשואת WJ ייצגה הבדל משמעותי בין שתי השיטות על ידי התאמת משקל. ניתן לחשב את התפוקה של WJ על ידי מדידת אחוז המשקל של WJ בחוט 2 ס"מ (2.4 גרם ± 0.2 גרם). השוואת היחס בין תשואת WJ בין השיטה הנוכחית לשיטה המסורתית הראתה עלייה משמעותית בתשואת WJ באמצעות הגישה החדשנית (איור 4A). ניתוח נוסף על-ידי ספירת הכמות הכוללת של WJ-MSCs שנקצרו בשתי השיטות מהמשקל המקביל של UC בו זמנית, הראה פער בולט בכמות התאים עם מספרי מעבר הולכים וגדלים (איור 4B). עקומת הגידול הצביעה על כך שקצב ההתפשטות של MSCs בשיטה החדשנית היה גבוה משמעותית מאשר בשיטה הרגילה באותה צפיפות חיסון לאחר יומיים (איור 4C). ניסויים אלה מדגימים את יתרונות השיטה הנוכחית, המאפשרת דרך יעילה להגדיל את האספקה היעילה של אותו חומר.

בעקבות הקריטריונים המינימליים של האגודה הבינלאומית לתרפיה תאית וגנטית (ISCT) להגדרת MSCs, האימונופנוטיפ של MSCs מדגים ביטוי חיובי של CD105, CD44, CD90, CD73 (יותר מ -95%), בעוד שהוא נעדר CD45, CD19, CD34, CD11b ו- HLA-DR (פחות מ -2%)22. MSCs שמקורם ב-WJ נחקרו באמצעות ציטומטריית זרימה כמותית (איור 5); התאים שבודדו בשתי השיטות היו חיוביים מאוד עבור האנטיגנים CD105, CD44, CD90 ו- CD73 (כולם מעל 99%), כאשר הביטוי של מולקולות פני השטח CD45, CD19, CD34, CD11b ו- HLA-DR בוטאו מתחת לרמות הניתנות לזיהוי (הנתונים לא מוצגים). בהתבסס על התוצאות של סמני פני השטח של התא, תאים דבקים יכולים להיחשב דק MSCs, ואת זיהויים ואת טוהר שלהם ניתן להבטיח.

figure-results-1
איור 1: ייצוג סכמטי של דיסקציה ובידוד של WJ-MSCs מחבל הטבור. שלב 1: דגימת חבל הטבור האנושי נאספת מהיילוד ונשטפת בתמיסת מלח, ואחריה זילוח של הווריד. לאחר מכן חותכים את החוט לחתיכות של 2 ס"מ. שלב 2: ג'לי טהור של וורטון (WJ) מתקבל בשיטה הנוכחית, הכוללת הפרדה של העורקים, אפיתל מי השפיר ואפיתל הוורידים. השיטה המסורתית משמשת גם להשוואה. חבל הטבור מנותח בהתאם. שלב 3: ה-WJ המנותח נחתך לחתיכות של 1-3 מ"מ, והצלחת מונחת הפוכה באינקובטור למשך 30 דקות כדי לחזק את החיבור בין החתיכות למשטח הפלסטיק. לאחר מכן מתרבתים את חתיכות WJ ומועברות בצפיפות זריעה של 1 x 104 תאים לס"מ2 עד שהן מגיעות למפגש של 80%. שלב 4: ציטומטריית זרימה משמשת לאפיון תאי P5 על ידי ניתוח סמני פני השטח של תאי גזע מזנכימליים (MSC). שלב 5: יכולת ההתרבות של התאים נקבעת על ידי התוויית עקומת גדילת תאים באמצעות שיטת ספירת התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אנטומיה של חבל הטבור והדגמה סכמטית של דיסקציה. (A) חתך הרוחב של UC, הדגשת עורקים (A), וריד (V), הג'לי של וורטון (WJ), והדיסקציה שלאחר מכן מפרידה את UC לתאים שונים. (B) הדגמה סכמטית של הסרת שכבת אפיתל מי השפיר. החתך נעשה לאורך הקו המקווקו באפיתל מי השפיר, המפריד בין האפיתל החל מהפינה הצדדית של החבל. (C) הדגמה סכמטית של הסרת אפיתל הווריד. היפוך החוט מבפנים החוצה (כיוון החץ מציין את כיוון הכוח) חושף את אפיתל הווריד להסרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: מאפיינים מורפולוגיים של WJ-MSCs ראשוניים ומתורבתים. ניתן להבחין בצמיחת תאים פיברובלסטואידים מהצמחים סביב יום 4 (מסומן על ידי החיצים) ולהציג יותר ויותר דפוס צמיחה דמוי מערבולת. הצמחים הוסרו ועברו תרבית; התאים המבודדים היו הומוגניים מבחינת הגודל והמורפולוגיה המדומים. הבדל לא משמעותי נצפה בגודל ובמורפולוגיה של התאים בין שתי השיטות. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
תרשים 4: ניתוח גרפי השוואתי של תשואת WJ ומאפייני הצמיחה של MSCs מתורבתים. (A) השוואה של תפוקת WJ באמצעות UC של 2 ס"מ עם משקל התחלתי של 2.4 גרם ± 0.2 גרם בשתי השיטות. תשואת WJ = (משקל WJ) / (משקל התחלתי של הכבל הלא מעובד. היחס בין תשואת WJ (%) = (תשואת WJ) / (תשואת WJ ממוצעת בשיטה הנוכחית) × 100. (B) השוואה בין ספירת תאים לאחר תרבית ומעבר באותו מצב בשתי השיטות. (C) עקומות גדילה של תאי P5 בשתי השיטות. כל הניסויים כללו שלושה העתקים ביולוגיים, וההבדלים הסטטיסטיים נותחו בשיטת ANOVA הדו-כיוונית (***p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: ביטוי פני השטח של התא של MSC מנותח על-ידי ציטומטריית זרימה. תאי P5 שנאספו הן בשיטות קונבנציונליות והן בשיטות הנוכחיות נתונים לניתוח ציטומטריית זרימה. האנטיגנים של פני השטח CD44, CD105, CD90 ו- CD73 היו חיוביים מאוד (כולם מעל 99%), בעוד שהביטויים של מולקולות פני השטח CD45, CD19, CD34, CD11b ו- HLA-DR היו מתחת לגבול האיתור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

MSCs מייצגים תחום דינמי של מחקר עם השלכות עמוקות על רפואה רגנרטיבית22. תכונותיהם הייחודיות הופכות אותם למוקד מחקר מדעי וטומנים בחובם פוטנציאל לחולל מהפכה בטיפול במגוון רחב של מחלות ופציעות7. WJ-MSCs הם תת-קבוצה נפרדת של MSCs, אשר ניתן לקבל מרקמת החיבור הג'לטינית בתוך UC הממוקם בין אפיתל בין כלי הדם ומי השפיר23. היישום הקליני של MSCs טמון בהשגת מספר תאים מספיק24. עם זאת, ככל שמספר המעבר גדל, התאים החלו להראות מידה מסוימת של תופעת הזדקנות, ויכולת ההתרבות של MSCs ירדה בהדרגה לאחר P524. אופטימיזציה של שיטות לשיפור תשואת MSC היא, אם כן, הכרחית.

הדרך היעילה ביותר לבודד את WJ-MSCs היא לנתח את כל WJ תוך שמירה על שלמותו6. מחקרים מראים כי תאי גבול אלה מאזורי גבול חבל הטבור הם בעלי מאפיין הגירה גבוה יותר וקצב התפשטות גבוה יותר מאשר WJ-MSCs בין-וסקולרי23. עם זאת, האזורים והשיטות לניתוח WJ לא עברו סטנדרטיזציה, ועדיין לא ברור אם אוכלוסיות תאי גזע בתוך WJ-MSCs חולקות את אותן תכונות בשל היעדר גבולות היסטולוגיים ברורים בין מחיצות3.

מחקרים קודמים הצביעו על הבדלים משמעותיים בתכונות של WJ-MSCs שמקורם בתאים שונים של חבל הטבור, כאשר תאים הממוקמים קרוב לפני השטח של מי השפיר מפגינים יכולת שגשוג משופרת3. השיטה הייחודית הנוכחית לניתוח UC ולבידוד WJ-MSCs שואפת להפחית הן את אובדן ה-WJ של הרירית והן את הנזק לתאים, מה שמשפר את תפוקת התאים ואת הכדאיות שלהם. פרוטוקול זה מדגים שיטה שאפשרה את העיבוד של UC לתוך WJ כמעט שלם. השלב העיקרי של הפרוטוקול כולל הסרת שכבת האפיתל באמצעות קילוף ודיסקציה קהה. שלב החידוש הוא לקלף את שכבת האפיתל לאורכה בעזרת מלחציים ליתושים. גישה זו יעילה בהפחתת הנזק לתאים סמוכים הנגרם על ידי דיסקציה חדה קונבנציונלית עם מספריים25.

האנדותל של הווריד שביר וקשה להיפטר ממנו. לאחר הסרת אפיתל מי השפיר מווריד הטבור, חבל הטבור מתהפך דרך הווריד כדי לחשוף את האנדותל. מתח פנימי שנוצר על ידי WJ משמש לאחר מכן כדי לקלף את האנדותל של הווריד, ובכך למזער את ההפרעה מהפרעות של תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי (HUVECs) במהלך תהליכי תרבית התאים הבאים.

שיטת תרבית explant מאומצת מכיוון שיש לה יבול גבוה יותר בהשוואה לשיטות זמינות אחרות18. התאים הלא מחוברים יוסרו בהדרגה באמצעות החלפת מדיום תרבית MSC האנושי, וכתוצאה מכך יאבדו תאים26. הצמחים שאינם נצמדים לפלסטיק עלולים לעכב את צמיחת התאים בניסיון קודם. יש לקחת בחשבון את השפעת אדי המים הנפלטים מהרקמה עקב השינויים בין הטמפרטורה הפנימית והחיצונית של האינקובטור. כדי לשמור על המצב היבש של צלחת הפטרי, יושם צעד חדשני של הפיכת המנה למשך 30 דקות במהלך הדגירה עם המכסה בתחתית. היפוך זה של צלחת מנע עיבוי של אדי מים על המגע בין הרקמה לבין פני השטח של צלחת פטרי, אשר בתורו מאפשר חיבור טוב יותר של אקסוזומים למשטח הפלסטיק כדי לשפר את צמיחת התא.

השיטה הנוכחית מושווית לשיטת הניתוח הקונבנציונלית על ידי מדידת אחוז המשקל של WJ המתקבל וכמות MSCs מתורבתים ועוברים; יבול גבוה משמעותית של WJ וכמות נוספת של MSCs שנקטפו הוצגו בשיטה החדשה. למרות שכל פרוטוקול לבידוד אוכלוסיות תאי גזע מכל אחד ממדורים אלה נושא את הסיכון לזיהום תאים ממדורים אחרים, התוצאות הדגימו את טוהר MSCs מבודדים, המאופיינים בביטוי גבוה של סמנים מזנכימליים (כולם מעל 99%) וזיהוי מינימלי של סמנים המטופויטיים ואנדותליים (הנתונים אינם מוצגים). התוצאות הוכיחו כי WJ-MSCs טהורים ומתאימים ליישומים שונים, בהתאם להנחיות ISCT21. תאי MSC בתרבית הציגו תאים דמויי פיברובלסטים בתקופה קצרה, והתאים התגבשו יותר ויותר לתאים בצורת מערבולת, בעלי פוטנציאל רבייה גדול ותכונות נדידה.

הפרוטוקול המתואר במחקר זה מציג מספר חסרונות. ראשית, המיומנות הנדרשת למפעיל גבוהה, כפי שעולה מהפרדת אפיתל מי השפיר. זה עלול לעכב את האימוץ הנרחב שלה במחקר או יישומים קליניים. שנית, הפרוטוקול מסתמך במידה רבה על מניפולציה ידנית במהלך נתיחה, מה שעלול להציג חוסר עקביות בין ניסויים או מפעילים. סטנדרטיזציה של תהליך הנתיחה תשפר את האמינות והשכפול של פרוטוקול25. יתר על כן, היעדר השוואות אחרות לשיטה המקובלת מותיר שאלות ללא מענה.

לסיכום, השיטה הנוכחית מספקת דרך יעילה להפריד את WJ השלם מהאפיתל ומי השפיר וכלי הדם, וכתוצאה מכך יבול הכולל את הג'לי של וורטון פריווסקולרי ותת-שפיר. הכנסת שלב הדגירה ההפוך תורמת עוד יותר לשיפור ההתקשרות ל- MSC. ניתוח השוואתי בשיטות מסורתיות מדגים את היתרונות המשמעותיים של הפרוטוקול המוצע במונחים של השגת יבול WJ גבוה יותר וקצירת יותר MSCs עם יכולת שגשוג טובה יותר. הממצאים גם מדגישים את הטוהר של MSCs מבודדים, כפי שעולה מדפוס מובהק של ביטוי סמן פני התא. שיטה זו יכולה לשפר את תפוקת MSC ואת יכולת ההתפשטות, ומציעה שיטה חסכונית להגדלת ייצור MSC.

גילויים

המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82172107), הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג, סין (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), קרן המחקר הרפואי של שנזן (SMRF. D2301015), ועדת החדשנות העירונית למדע וטכנולוגיה של שנזן (JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031) והקרן המיוחדת של מחוז לונגגאנג לפיתוח כלכלי וטכנולוגי (LGKCYLWS2022007).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן CD44 אנטי אנושי APC ביולג'נד 
צלחות תרבית תאים 24 בארותThermo Scientific142475
APC אנטי-אנושי CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) נוגדן ביולג'נד 
עכבר APC IgG1, κ איזוטייפ Ctrl (FC) נוגדןBiolegend 
400122 אוטוקלאבHIRAYAMAHVE-50
אוטומטי מונה תאיםCountstarFL-CD
BAMBANKER פתרון שימור הקפאהWako302-14681
מאגר צביעת תאיםBiolegend 
420201 מכונה צנטריפוגליתEppendorf5424R
ספסל נקישנחאי ZhiChengC1112B
CO2 חממהתרמו מדעיתHERAcell 150i
D-PBSSolarbioD1040
תנור פיצוץ אלקטרו-תרמוסטטישנחאי JingHongDHG-9423A
נוגדן CD105 אנטי אנושי FITC ביולג'נד 
323204 נוגדן CD90 (Thy1) אנטי-אנושי של FITC ביולג'נד 
עכבר FITC IgG1, κ איזוטייפ Ctrl (FC) נוגדןBiolegend 400110
זרימה ציטומטריהבקמןCytoFLEX
המוציטומטרמעולה מרינפלד640410
מאגר שטיפת פרמיביליזציה תוך תאי (10&) ביולג'נד 
מיקרוסקופ ביולוגי הפוךZEISSAxio Vert. A1
מיכל אחסון חנקן נוזליThermo ScientificCY50935-70
תמיסת מלח רגילה (NS)MeilunbioMA0083
PBSSolarbioP1032
PE אנטי אנושי CD11b נוגדןBiolegend 
393112 נוגדן CD19 אנטי אנושי PE ביולג'נד 
PE אנטי-אנושי CD34 נוגדןBiolegend 
PE אנטי אנושי CD45 נוגדןBiolegend 368510
PE נוגדן HLA-DR אנטי אנושי ביולג'נד 
PE Mouse IgG1, κ איזוטייפ Ctrl (FC) נוגדןBiolegend 
PE Mouse IgG2a, κ איזוטייפ Ctrl (FC) נוגדןBiolegend 
דיוק אלקטרוני איזוןSatoriusPRACTUM313-1CN
מכונת קרח פתית שלגZIEGRA ZBE30-10
מעוקר 50 מ"ל צינור פלסטיקGreniner227270
אמבט מים תרמוסטטישנחאי YiHengHWS12
טריפסין 1:250SolarbioT8150
UltraGRO-AdvancedHelios 
HPCFDCGL50 מערכת טיהור מים טהורים וטהוריםבמיוחד Milli-QMilli-Q התייחסות
לתרבית MSC אנושית ללא קסנו מדיוםFUKOKU 
338806344006328108421002392506343606307606400114400214T2011301

מקורות

  1. Abbaszadeh, H., et al. Regenerative potential of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: A new horizon of stem cell therapy. J Cell Physiol. 235 (12), 9230-9240 (2020).
  2. Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Curr Res Transl Med. 68 (1), 5-16 (2020).
  3. Kim, D. -W., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: Phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  4. Drobiova, H., et al. Wharton's jelly mesenchymal stem cells: A concise review of their secretome and prospective clinical applications. Front Cell Dev Biol. 11, 1211217(2023).
  5. Joerger-Messerli, M. S., et al. Mesenchymal stem cells from Wharton's jelly and amniotic fluid. Best Pract Res Cl Ob. 31, 30-44 (2016).
  6. Pera, M., Subramanian, A., Fong, C. -Y., Biswas, A., Bongso, A. Comparative characterization of cells from the various compartments of the human umbilical cord shows that the Wharton's jelly compartment provides the best source of clinically utilizable mesenchymal stem cells. Plos One. 10 (6), 0127992(2015).
  7. Petrenko, Y., et al. A comparative analysis of multipotent mesenchymal stromal cells derived from different sources, with a focus on neuroregenerative potential. Sci Rep. 10 (1), 4290(2020).
  8. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise review: Wharton's jelly: The rich, but enigmatic, source of mesenchymal stromal cells. Stem Cells Transl Med. 6 (7), 1620-1630 (2017).
  9. Pan, Y., Wu, W., Jiang, X., Liu, Y. Mesenchymal stem cell-derived exosomes in cardiovascular and cerebrovascular diseases: From mechanisms to therapy. Biomed Pharmacother. 163, 114817(2023).
  10. Elshaer, S. L., Bahram, S. H., Rajashekar, P., Gangaraju, R., El-Remessy, A. B. Modulation of mesenchymal stem cells for enhanced therapeutic utility in ischemic vascular diseases. Int J Mol Sci. 23 (1), 249(2021).
  11. Wang, R., et al. Stem cell therapy for Crohn's disease: Systematic review and meta-analysis of preclinical and clinical studies. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 463(2021).
  12. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  13. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Wharton's jelly MSCs: Potential weapon to sharpen for our battle against DM. Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).
  14. Saleh, M., Fotook Kiaei, S. Z., Kavianpour, M. Application of Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells in patients with pulmonary fibrosis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 71(2022).
  15. Varaa, N., Azandeh, S., Khodabandeh, Z., Gharravi, A. M. Wharton's jelly mesenchymal stem cell: Various protocols for isolation and differentiation of hepatocyte-like cells; narrative review. Iran J Med Sci. 44 (6), 437-448 (2019).
  16. Hassan, G., Kasem, I., Soukkarieh, C., Aljamali, M. A simple method to isolate and expand human umbilical cord derived mesenchymal stem cells: Using explant method and umbilical cord blood serum. Int J Stem Cells. 10 (2), 184-192 (2017).
  17. Naeem, A., et al. A comparison of isolation and culture protocols for human amniotic mesenchymal stem cells. Cell Cycle. 21 (15), 1543-1556 (2022).
  18. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726(2013).
  19. Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (CFCs). J Vis Exp. (32), e1525(2009).
  20. Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. J Vis Exp. (122), e55224(2017).
  21. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2173-2185 (2017).
  23. Sypecka, M., Bzinkowska, A., Sulejczak, D., Dabrowski, F., Sarnowska, A. Evaluation of the optimal manufacturing protocols and therapeutic properties of mesenchymal stem/stromal cells derived from Wharton's jelly. Int J Mol Sci. 24 (1), 652(2022).
  24. Binato, R., et al. Stability of human mesenchymal stem cells during in vitro culture: Considerations for cell therapy. Cell Prolif. 46 (1), 10-22 (2012).
  25. Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
  26. Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Prolif. 50 (2), 12334(2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים