מאמר שיטה

גישה לבניית קהילות ביופילם רב-מינים מאדמת ריזוספרה

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66926

⸱

24 במאי 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Provincial Key Lab for Solid Organic Waste Utilization, Key lab of organic-based fertilizers of China, Jiangsu Collaborative Innovation Center for Solid Organic Wastes, Educational Ministry Engineering Center of Resource-saving fertilizers, Nanjing Agricultural University, 2National Key Laboratory of Agricultural Microbiology and College of Resources and Environment, Huazhong Agricultural University

במאמר זה

סיכום

כאן מוצג הליך מהיר וסטנדרטי להקמת קהילות ביופילם סינרגטיות מרובות מינים מקרקעות ריזוספרה שונות. זהו פרוטוקול ייחודי שנועד לחקור ולדמות את המיקרוביוטה המורכבת של קרקע ריזוספרה.

תקציר

הביופילם הרב-מיני הוא אורח חיים טבעי ודומיננטי של חיידקים בטבע, כולל באדמת ריזוספרה, אם כי ההבנה הנוכחית שלו מוגבלת. כאן, אנו מספקים גישה להקמת קהילות ביופילם סינרגטיות של מינים מרובים. הצעד הראשון הוא לחלץ תאים מאדמת ריזוספרה בשיטת הצנטריפוגה הדיפרנציאלית. לאחר מכן, תאי אדמה אלה מחוסנים לתוך מדיום התרבית כדי ליצור ביופילם כדורי. לאחר 36 שעות של דגירה, הרכב החיידקים של הביופילם והתמיסה שמתחתיו נקבעים באמצעות שיטת ריצוף הגן rRNA 16S. בינתיים, בידוד חיידקים בתפוקה גבוהה מביופילם כדורי מתבצע בשיטת הדילול המגביל. לאחר מכן, 5 טקסי החיידקים המובילים נבחרים עם השפע הגבוה ביותר בנתוני ריצוף הגן rRNA 16S (דגימות ביופילם pellicle) לשימוש נוסף בבניית קהילות ביופילם מרובות מינים. כל השילובים של 5 טקסי החיידקים נקבעו במהירות באמצעות צלחת בת 24 בארות, שנבחרה עבור יכולת היווצרות הביופילם החזקה ביותר על ידי בדיקת צביעת הקריסטל הסגול, וכומתה על ידי qPCR. לבסוף, קהילות הביופילם הסינתטיות החזקות ביותר של חיידקים מרובי מינים הושגו באמצעות השיטות לעיל. מתודולוגיה זו מספקת הדרכה אינפורמטיבית לביצוע מחקר על ביופילם מרובה מינים של ריזוספרה וזיהוי קהילות מייצגות לחקר העקרונות השולטים באינטראקציות בין מינים אלה.

מבוא

ביופילמים מייצגים קהילות מיקרוביאליות מורכבות המודבקות על משטחים או מקושרות לממשקים. קיימת הכרה רחבה בכך שרוב החיידקים שנתקלים בהם בסביבות שונות, כגון סביבות טבעיות, סביבות קליניות והקשרים תעשייתיים, שורדים בתוך קהילות ביופילם1. באדמה, הריזוספרה – המקיפה את פני השטח של השורש ואת האזור הסמוך לו בעובי 2 מ"מ – יוצרת נישה אקולוגית עם זמינות מוגברת של חומרי מזון. חיידקים ספציפיים פיתחו אסטרטגיות לניצול נישה זו, טיפוח התרבות מיקרוביאלית וטיפוח היווצרות קהילות ביופילם בריזוספרה2.

מיקרובים ריזוספרה נחשבים ל"גנום השני" של צמחים3. מיקרואורגניזמים מעודדי גדילה של צמחים (PGPM) עוסקים בסימביוזה הדדית עם צמחים, ומספקים פונקציות משמעותיות לקידום צמיחה ובקרה ביולוגית4. מצד אחד, PGPM יכול לספק חומרים מזינים לשורשי הצמח, לשפר את ספיגת החומרים המזינים, להגן מפני פתוגנים ולפרק מזהמים באדמת הריזוספרה5. מצד שני, PGPM משתמש בהפרשה של שורשי צמחים כמקור תזונתי לצמיחה ואבולוציה, ובכך משפיע על אדמת הריזוספרה ועל מערכת השורשים באמצעות חילוף החומרים שלהם. ראוי לציין כי התנאי המוקדם לכל הפונקציות הללו הוא התיישבות יעילה של PGPM בריזוספרה הצמח, יצירת ביופילמים יציבים6.

ביופילם ריזוספרה משפיע על תהליך ההרכבה של מיקרובים ריזוספרה, והמאפיינים הרקתיים והמרחביים של הרכבת מיקרובי ריזוספרה קשורים קשר הדוק לאינטראקציה שלביופילם 7 של מינים מרובים. הוא משמש כמרכז של אינטראקציות צמחים-מיקרוביום, ומספק להם נישה יציבה ונשלטת לאינטראקציה יעילה. לכן, חקר ביופילם של ריזוספרה הוא גם כיוון חשוב להשגת תובנה לגבי האינטראקציה בין צמחים למיקרובים.

עם זאת, כיום יש מעט מחקר על ביופילמים מרובי מינים של ריזוספרה. המורכבות הגבוהה של הרכב המיקרוביום מקשה לענות על שאלות אקולוגיות בסיסיות סביב קהילות מיקרוביאליות טבעיות8. בתהליך הניסויים יש לקחת בחשבון תנאים רבים, כגון סוג הקרקע, סוג הצמח והמספר הגדול של קהילות מיקרוביות. גורמים שונים מגבילים את המחקר של ביופילמים מרובי מינים של ריזוספרה.

כדי להמשיך ולחקור קהילות ביופילם רב-מינים מאדמת ריזוספרה, כגון אינטראקציות סינרגטיות בין מינים או הזנה צולבת של מטבוליטים8, רצוי לבנות באופן מלאכותי קהילה מיקרוביאלית סינתטית פשוטה, מייצגת, יציבה וניתנת להסרה בתנאי מעבדה 9,10. כאן, פרוטוקול סטנדרטי משלב כמה מהטכניקות המיקרוביולוגיות והביואינפורמטיות העדכניות ביותר.

פרוטוקול

פרוטוקול זה ישים בדרך כלל למיקרוביוטה של קרקע ריזוספרה מצמחים שונים. כאן, מלפפון משמש כדוגמה. פרטים על הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. בידוד חיידקים

  1. בידוד קרקע ריזוספרה
    1. תרבות מלפפונים
      1. יש לחטא זרעי מלפפון בתמיסת 75% אתנול ונתרן היפוכלוריט 2% (NaClO), ולאחר מכן לשטוף אותם במים סטריליים11.
      2. להנביט את הזרעים בתנאים סטריליים ולבחור את אלה המגיעים לשלב שני העלים12. לאחר מכן, השתילו את שתילי המלפפון המונבטים באופן עקבי בעציצים המכילים 2 ק"ג אדמה שחורה.
        הערה: שני סוגים של אדמה שחורה ממקומות שונים בצפון מזרח סין משמשים להפחתת טעויות שיטתיות.
    2. הכנת תרחיף קרקע
      1. הכן חיץ PBS-S באמצעות הנוסחה: 6.33 גרם של NaH2PO4· H2O, 16.5 גרם של Na2HPO4·7H2O, 200 μL של סילווט L-77, ו-1 ליטר מים מזוקקים.
      2. כאשר השתילים מגיעים לשלב12 בעל ארבעת העלים, הופכים את העציץ ומבודדים את השורשים יחד עם אדמת ריזוספירה בעובי 2 מ"מ באמצעות כפפות מעוקרות.
      3. מקם את השורשים בחיץ PBS-S של 30 מ"ל בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. לאחר ניעור של 20 דקות, סננו את המתלה דרך מסנן תאי ניילון בגודל 100 מיקרומטר כדי להסיר שורשים ומשקעים גדולים.
      4. מעבירים את התסנין לצינור צנטריפוגה נוסף של 50 מ"ל, צנטריפוגות אותו ב 3200 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ומאחסנים אותו באופן זמני ב -4 מעלות צלזיוס.
  2. מיצוי של תאי חיידקים בקרקע ריזוספרה.
    הערה: מתודולוגיה זו מאמצת את שיטת הצנטריפוגה הדיפרנציאלית13, אם כי שיטת הצנטריפוגה ההדרגתית של צפיפות Nycodenz14 חלה גם על שלב זה.
    1. דללו את תרחיף הקרקע בתמיסת 0.2% Na4P2O7 ל-500 מ"ל וצנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 10 דקות כדי להפריד תחילה אורגניזמים מהקרקע.
    2. הומוגניזציה מחדש של המשקע, צנטריפוגה אותו באותה מהירות נמוכה במשך 60 שניות, ולחזור על התהליך שלוש פעמים. ערבבו את הסופרנאטנטים, צנטריפוגו אותם במהירות של 12,000 x גרם למשך 20 דקות, ואז השליכו את הסופרנאטנט.
    3. להשהות מחדש את המשקע ב 50 מ"ל של חיץ PBS-S, המהווה את השעיית תאי חיידקי הקרקע ריזוספרה.

2. ריצוף וזיהוי מיקרוביוטה של ביופילם ריזוספירה

  1. הכנת מדיה
    הערה: מרק סויה טריפטי (TSB) וחומרים עם מינימום מלחים גליצרול גלוטמט (MSgg) זמינים באופן מסחרי. הניסוחים שלהלן הם לעיון בלבד.
    1. הכן TSB בינוני באמצעות הנוסחה הבאה: 15 מיקרוגרם / מ"ל טריפטון, 5 מיקרוגרם / מ"ל פפטון סויה, 5 מיקרוגרם / מ"ל NaCl, pH = 7.
    2. הכן מדיום MSgg באמצעות הניסוח הבא: 5 mM KH2PO4, 100 mM 3-(N-morpholino) פרופאן חומצה סולפונית (MOPS), 2 mM MgCl2, 700 μM CaCl2, 50 μM MnCl2, 50 μM FeCl3, 1 μM ZnCl2, 2 μM תיאמין, 0.5% גליצרול, 0.5% גלוטמט, 50 מיקרוגרם / מ"ל טריפטופן, 50 מיקרוגרם / מ"ל פנילאלנין, pH = 7.
    3. כדי להכין מדיית TSB-MSgg, ערבב מדיית TSB עם מדיית MSgg ביחס של 1:1 (v/v)15.
  2. קוקולטורה של ביופילם פליקל
    1. לדגור על תרחיף התא בתווך TSB ב 30 ° C במשך הלילה (בדרך כלל 12 שעות) כדי להפעיל את החיידקים.
    2. מניחים מסנני תאי ניילון בגודל 100 מיקרומטר על צלחות 24 בארות. לדגור על החיידקים במדיה TSB ולהגדיר שלוש חזרות. לטפח את biofilm pellicle במשך 36 שעות ב 30 ° C.
      הערה: אם הביופילם הכדורי מהשלב האחרון אינו מעובד היטב, מדיום TSB-MSgg הוא תחליף יעיל למדיום TSB.
    3. הסר את המסנן המכיל את הביופילם הכדורי. הוסף 2 מ"ל של חיץ PBS-S לצלחת תא חדשה של 24 בארות, מקם לתוכו את מסנן 24 הבארות כדי לשטוף את הביופילם, והסר את התאים החופשיים. חזרו על תהליך הכביסה שלוש פעמים.
  3. מיצוי DNA של ביופילם כדורי
    1. חלץ את גנום הביופילם באמצעות ערכת DNA בהתאם להוראות היצרן.
  4. ריצוף בתפוקה גבוהה
    הערה: חברות ביוטכנולוגיה יכולות לסייע בהשלמת ניסויי ריצוף עבור רוב המעבדות. אם יש צורך בהרכב מיקרוביאלי בתמיסה הנותרת, רצף אותו בשלב זה. שלב הרצף משתנה בהתאם למכשירים. פעל בהתאם להוראות היצרן. שלב 2.4.1 מיועד להמחשה בלבד.
    1. להגביר את אזורי V3-V4 של הגן 16S rRNA בהתבסס על מסד הנתונים עם רצפי גנים 16S rRNA באורך מלא. צור OTUs של מינים לפי מספר הרצפים המינימלי לכל מדגם16. קבץ את ביאורי סיווג המינים ורכוש את הרכבי הקהילות מכל מדגם.
    2. בהתבסס על נתוני הריצוף, בחרו את חמשת הזנים המובילים מבחינת השפע היחסי שלהם.
  5. בידוד חיידקים בתפוקה גבוהה ותרבית
    הערה: שלב זה מתוכנן על פי המתודולוגיה המיקרוביולוגית והביואינפורמטית העדכנית ביותר17. שיטת הצלחת המצופה בדילול זמינה כאן לבידוד חיידקים, אם כי היא גוזלת יותר זמן ופחות ממוקדת בהשוואה לטכניקות בעלות תפוקה גבוהה.
    1. מערבבים את הביופילם המתורבת. השתמשו בדילול מגביל כדי להבטיח שלא יותר מ-30% מהבארות בצלחת בת 24 הקידוחים יראו צמיחת חיידקים.
      הערה: כדי לקבוע את הדילול המתאים ביותר, בצע ניסויים מקדימים באמצעות מגוון רחב של קצבי דילול. הדילול האופטימלי צריך להכיל לא יותר משני חיידקים למיליליטר, המייצגים דגירה חיידקית בפחות מ -30% מהבארות.
    2. הגבירו את גן ה-rRNA 16S של החיידקים תוך הוספת תוויות לבארות וללוחות וריצוף שלהם באמצעות פלטפורמת Illumina בעלת התפוקה הגבוהה17.
    3. בצע ניתוחים ביואינפורמטיים באמצעות תוכנה זמינה מסחרית כדי לקבל מידע טקסונומי על טוהר ומינים עבור כל תרבות.
    4. טפחו את חמשת החיידקים הטהורים השופעים ביותר על ידי תרבית קו רציף והשתמשו בגליצרול כדי לשמר את החיידקים בטמפרטורה של -80°C.

3. בניית קהילות מיקרוביאליות סינתטיות

  1. תרבות ביופילם משוחזרת
    הערה: לקבלת פרטים, עיין ב- Ren et al.18. 5 הזנים מתאימים ל-31 שילובים סינתטיים, כולל 5 מינים בודדים, 10 שני מינים, 10 שלושה מינים, 5 ארבעה מינים וקונסורציום אחד של חמישה מינים.
    1. דוגרים על 5 הזנים בתווך TSB עד שה-OD600 שלהם מגיע ל-1 כדי להפעיל אותם.
    2. הכינו מספר צלחות 24 בארות עם TSB בינוני והניחו עליהן מסנני תאי ניילון בגודל 100 מיקרומטר.
      הערה: אם הביופילם מהשלב האחרון אינו מעובד היטב, מדיום TSB-MSgg הוא תחליף יעיל למדיום TSB.
    3. לדגור על 31 שילובים של קהילות סינתטיות במדיום. ודא שמספר החיידקים החיסוני עקבי בכל באר. הגדר שלוש חזרות לכל שילוב.
    4. טפחו את הביופילם בטמפרטורה של 30°C למשך 36 שעות.
  2. כימות של ביופילם כדורי
    1. בצע את אותו הליך כמו בשלב 2.2.3.
    2. מעבירים את הביופילם לצלחת חדשה בת 24 בארות המכילה 180 מיקרוליטר של תמיסת קריסטל סגול ומכתימים אותה למשך 20 דקות.
    3. העבירו את הדגימה המוכתמת לצלחת אחרת בת 24 בארות המכילה 200 מיקרוליטר של 96% אתנול, פזרו אותה למשך 30 דקות ומדדו OD590.

4. כימות מספר תא פליקל

הערה: כדי לקבוע את היחס של כל מין ואת ספירת התאים בתמיסה הכדורית והנותרת, יש צורך ב- PCR כמותי. לקבלת פרטים, עיין ב- Sun et al.16.

  1. תכננו פריימרים ספציפיים לזנים עבור קהילות החיידקים הסינתטיים שנבחרו.
  2. השתמש ברוארי כדי לבצע השוואות גנום ולגלות את הגנים הספציפיים לזן של עותק יחיד של כל מבודד. ודא כי פריימרים ממוקדים לגנים אלה.
  3. ליגזה את השברים המוגברים לפלסמידים PMD19T. צור עקומות סטנדרטיות באמצעות פלסמידים המכילים מקטעים מתאימים כתבניות.
  4. בצע את אותם השלבים שהוזכרו בשלב 2.2.
  5. הכן רכיבי תגובה באופן הבא: 7.2 μL של H2O, 10 μL של 2x qPCR Master mix, 0.4 μL של 10 μM של כל פריימר, ו- 2 μL DNA של תבנית.
  6. בצע PCR עם מכשיר PCR בזמן אמת בתנאים הבאים: 95 ° C למשך 10 דקות, 40 מחזורים של 95 ° C עבור 30 שניות, ו- 60 ° C במשך 45 שניות, ולאחר מכן קטע עקומת התכה סטנדרטי.
  7. בצע שישה שכפולים ביולוגיים עבור כל טיפול.

תוצאות

בעקבות ההליך שהוזכר, נצפים שיפועים משמעותיים ביכולת יצירת הביופילם ממיקרוביוטת הקרקע של ריזוספרה מלפפון (איור 1). ריצוף אמפליקון ביופילם אישר את המין בכדורית (איור 2). בהתבסס על מיפוי החום של נתוני ריצוף, נבחרו חמשת מיני החיידקים המובילים שהשפע שלהם בכדורית גדול מזה שבשאר התמיסה (איור 3). כאן נלקחה כדוגמה קבוצה טיפוסית של קהילות סינתטיות. צביעת קריסטל סגול ו-PCR כמותי ממחישים ישירות את ההבדלים בביומסה הכדורית ואת השפע היחסי של כל מין בקהילות. ביומסה מוגברת של חקלאות משותפת מצביעה על ההצלחה של בניית קהילות ביופילם סינרגטיות מרובות מינים מאדמת ריזוספרה (איור 4 ואיור 5).

התוצאות מראות כי Bacillus velezensis SQR9, Acinetobacter baumannii XL-1 ו-Burkholderia cenocepacia XL-2 יכולים ליצור קונסורציום סינרגטי בולט, כאשר הקהילה החזקה ביותר מורכבת מכל שלושת המינים. הם צפויים להפגין סינרגיזם חזק בהיווצרות ביופילם. ראוי גם לציין כי XL-1 משמש כ'מקדיש'. הוא מקדם את היווצרות הביופילם של XL-2 ו-SQR9, למרות הצמיחה הדלה והשפע המינימלי שלו במאגדים (איור 5). בעוד שמספר ביופילמים של קוקולטורה מרובת מינים מייצגים פנוטיפ סינרגטי, מינים מסוימים, כמו Chryseobacterium sp., תמיד קשורים באופן שלילי לזנים אחרים על-ידי הפחתת הביומסה של ביופילם סינתטי (איור 2). למרות שתופעה זו אינה קשורה למטרה של פרוטוקול זה, ייתכן שהיא תהיה שווה חקירה נוספת בעתיד.

figure-results-1
איור 1: היווצרות ביופילם של קהילות סינתטיות שונות (SynComs). כאן, הדגימות הן בצלחות סטנדרטיות של 24 בארות. הצילומים מצולמים ללא כל הגדלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הרכב חיידקים בכדוריות ובתמיסה. הגרפים מבוססים על נתוני ריצוף 16S rRNA gene amplicon, המוזכרים בשלב 2.3 של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: מפת חום של יכולת יצירת ביופילם בכדוריות ובתמיסה. אדום מייצג את השפע בביופילם, שהוא גבוה יותר מהפתרון, וכחול מייצג את ההפך. הסוג לא הראה שום הבדל לא מוצגים. מינים של 5 השפע העליון מסומנים בצד שמאל. BB: ביופילם שחור; BS: פתרון שחור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: כימות ביומסה של ביופילם של קהילות סינתטיות באיור 1. הנתונים הם מכימות סגול קריסטלי עם OD = 590 ננומטר. הנתונים המוצגים הם הממוצע ± SD, n = 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: מספר התאים והשפע היחסי של מינים של קהילות סינתטיות באיור 1. הנתונים הם מ-PCR כמותי. הנתונים המוצגים הם הממוצע ± SD, n = 6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

בהתאם לפרוטוקול, נבנות סדרה של קהילות ביופילם סינתטיות חזקות המבוססות על המיקרוביוטה באדמת ריזוספרה מצמחים שונים. באמצעות טכניקות PCR כמותיות, הרכב כל קהילה מפוענח בבירור. הביומסה של הביופילם מצביעה על עוצמת האינטראקציות המטבוליות הפוטנציאליות שלהם, אם כי תכונות ומנגנונים שונים מאחורי שיתוף הפעולה לא יכלו להתגלות כאן19. בהתחשב בגודל ובמורכבות של קהילות מיקרוביאליות טבעיות, קהילות סינתטיות (SynComs) מייצגות מערכת מודל להתגברות על מכשולים קיימים14. פרוטוקול זה מדגיש את המתודולוגיה השיטתית והיסודית של בניית קהילות ביופילם סינתטיות ממיקרוביוטה מורכבת של קרקע ריזוספרה.

מהחלק האחרון ניכר כי SQR9, XL-1 ו-XL-2 מראים פוטנציאל חזק להתיישבות יציבה בריזוספירה בפועל. חוקרים יכולים להתחיל לחקור את היחסים המטבוליים ואת מנגנוני הקולוניזציה המשותפת המבוססים על זנים אלה. מחקר עוקב על חיסונים מיקרוביאליים למלפפון נגיש גם לאחר מכן.

למרות היתרונות שהוזכרו, חשוב לא להתעלם מהחסרונות של הפרוטוקול. בשל הבדלים בין תרבית מעבדה לבין תנאים באתרם , התוצאות של כל קהילה סינתטית עשויות שלא לייצג במדויק את המיקרוביוטה באדמת ריזוספרה אמיתית20. יש צורך באישור באמצעות חיסון ריזוספירה נוסף. בנוסף, יכולת השחזור של תוצאות אלה נמוכה יחסית. ייתכן שמיני ביופילם של פליקל במעבדה עברו מוטציות במשך דורות רבים בהשוואה לטיפוסי בר בקרקע, מה שהוביל לאי דיוקים בלתי נשלטים.

ישנן מספר חלופות לשלבים מסוימים בפרוטוקול. לדוגמה, בשלב 1.2, שיטת הצנטריפוגה של שיפוע צפיפות Nycodenz יעילה יותר יחסית לאיסוף דגימות תאי קרקע13. בנוסף, בשלב 2.4, הטיפוח והזיהוי האחרונים של חיידקים בתפוקה גבוהה מגדילים באופן משמעותי את יעילות הניסוי, אם כי בעלות גבוהה יותר. לכן, שיטת הצלחת המסורתית המצופה דילול נשארת מתאימה לבחירת כמה מינים. לבסוף, בשלב 3.2, ניתן להעריך את הביומסה של ביופילם מתורבת הן על ידי צביעה סגולה גבישית והן על ידי שקילתה ישירות על איזון אנליטי.

פרוטוקול זה משתרע מעבר ליצירת חומרי ניסוי בסיסיים למחקר מיקרוביאלי וסביבתי. זיהוי קהילות הביופילם הסינתטיות החזקות ביותר של חיידקים מרובי מינים הוא רק הצעד הראשון בחשיפת המערכת האקולוגית הפתוחה והמורכבת של ריזוספרה. על ידי התמקדות בזני הליבה של SynComs, חוקרים יכולים לקבל תובנה לגבי מצבים אמיתיים באתרם בצורה ממוקדת ומהירה יותר. גישה זו עשויה גם להציע נקודת מבט חדשה לחקר ביופילמים בקנה מידה גדול יותר, כגון אגרגטים של קרקע ריזוספרה, ולניהול מדויק של קהילות מיקרוביאליות של ריזוספרה לצורך גדילה ובריאות של צמחים21.

חשוב מכל, מתודולוגיה זו תשפוך אור על מחקר נוסף על אינטראקציות בין מינים השולטות במכלול ובדינמיקה של מיקרוביוטת קרקע ריזוספרה. לדוגמה, כאשר עוסקים בקהילת ריזוספירה מורכבת, שיטות אנליטיות אחרות כגון ניתוח רשת התרחשות משותפת או מודלים מטבוליים בקנה מידה גנומי15 משולבות לעתים קרובות עם צעדים בסיסיים אלה כדי לבנות באופן מלאכותי קהילת ביופילם מייצגת. זה כולל שיקולים של יחסים בין מינים.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (42307173 ו-42107328) והתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח (2022YFD1500202 ו-2022YFF1001800). P.W, Z.X עיצבו את המחקר. P.W, B.X, Z.C, J.X ו-N.Z ניתחו את הנתונים ויצרו את הנתונים. פ"ו כתב את הטיוטה הראשונה של כתב היד. Z.X., R.Z. ו-Q.S. תיקנו את כתב היד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.2% Na4P2O7 תמיסהSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.20041418משמש לדילול מתלה האדמה.
100 μ מ ניילון תא מסנןסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מF613463-0001משמש לסינון תמיסת תרבית ולהפרדת ביופילם פליקל.
2% פתרון NaClOסינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מL03336903משמש לעיקור הזרעים.
24 בארותפלייט מרק ושות', בע"מPSRP010משמש לגידול מיקוביאלי והפרדת ביופילם פליקל.
3-(N-morpholino) פרופאן חומצה סולפונית (MOPS)Bioolook Scientific Research 2360010 מיוחדמשמש להכנת מדיה MSgg.
צינור צנטריפוגה 50 מ"לבייג'ינג Su-bio Biotech Co., Ltd.62.547.254צינורות צנטריפוגה בגודל מתאים לפרוטוקול שלנו.
75% C2H5OH פתרוןסינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מ801769680משמש לעיקור הזרעים.
Acinetobacter baumannii XL-1האוניברסיטה החקלאית של נאנג'ינגN/Aזנים מבודדים מאדמת ריזוספרה.
Bacillus velezensis SQR9האוניברסיטה החקלאית של נאנג'ינגN/Aזנים מבודדים מאדמת ריזוספרה.
ערכת DNA חיידקיםנאנג'ינג דינסי ביוטכנולוגיה ושות', בע"מD3350020000K04U021משמש לחילוץ DNA חיידקי.
אדמה שחורה Iהאוניברסיטה החקלאית של נאנג'ינגN/Aאדמה שחורה ממחוז ג'ילין.
אדמה שחורה IIהאוניברסיטה החקלאית של נאנג'ינגN/Aאדמה שחורה ממחוז היילונג-ג'יאנג.
Burkholderia cenocepacia XL-2האוניברסיטה החקלאית של נאנג'ינגN/Aזנים מבודדים מאדמת ריזוספרה.
CaCl2Xilong Scientific Co., Ltd.10035048משמש להכנת מדיית MSgg.
צנטריפוגהסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מG508009-0001צנטריפוגה מהירה.
ChamQ SYBR qPCR מאסטר מיקסVazyme ביוטק ושות', בע"מQ311-02משמש להגברת DNA ב-qPCR.
ספסל נקיSuzhou Antai Airtech Co., Ltd.NB026143משמש לפעולה אספטית.
חממת טמפרטורה קבועהShangHai CIMO מכשיר רפואי ושות', בע"מGNP-9080BS-figure-materials-1משמש לגידול מיקרוביאלי.
קריסטל סגול צבעסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מA600331משמש לצביעה וכימות של ביופילם פליקל.
זרעי מלפפוןהאוניברסיטה החקלאית נאנג'ינגN/A"Jinchun I" זרעי מלפפון.
Culturome v 1.0המכון לגנטיקה וביולוגיה התפתחותית של האקדמיה הסינית למדעיםN/Aמשמש לגידול וזיהוי חיידקי קרקע בריזוספרה בתפוקה גבוהה
FeCl3Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10011918משמש להכנת מדיה MSgg.
מקררHefei Midea מקרר ושות', בע"מBCD-556WKPM(Q)משמש לשימור זנים.
גלוטמטביולוק מחקר מדעי מיוחד2180020משמש להכנת מדיה MSgg.
גליצרולסינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מ10010618משמש להכנת מדיה MSgg.
סל שתילה הידרופוניחנות רהיטים Yulv6526262626משמש להידרופוניקה של מלפפון.
KH2PO4Xilong Scientific Co., Ltd.10017618משמש להכנת מדיית MSgg.
MgCl2Xilong Scientific Co., Ltd.7791186משמש להכנת מדיית MSgg.
MnCl2Xilong Scientific Co., Ltd.10400101משמש להכנת מדיית MSgg.
Msgg בינונישנחאי Bioesn ביוטכנולוגיה ושות', בע"מBES20791KBמדיום תרבית ביופילם פליקל.
Na2HPO4· 7H2OMerck & Co., Inc.S9390-100Gמשמש להכנת מדיית TSB.
NaCIChinasun מוצרים מיוחדים ושות', בע"מHS0416משמש להכנת מדיית TSB.
NaH2PO4· H2OMerck & Co., Inc.S9638-25Gמשמש להכנת מדיית TSB.
PBS-S מאגרסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מE607008-0001חיץ בסיסי לרקמות חיות.
פנילאלניןRYONRT3486L005משמש להכנת מדיה MSgg.
פיפטבייג'ינג Labgic טכנולוגיה ושות', בע"מBS-1000-Tמשמש לחיסון מתח.
PMD19T פלסמידTakara טכנולוגיה ביו-רפואית (בייג'ינג) ושות', בע"מD102Aמשמש ליצירת עקומות סטנדרטיות qPCR.
סירסינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מYHHWS2401משמש לתרבות אדמת מלפפון.
פריימר עבור qPCRSangon Biotech (שנחאי) ושות', בע"מN/Aמשמש להגברת DNA ב-qPCR.
מכשיר PCR בזמן אמתתרמו פישר סיינטיפיק (סין) ושות', בע"מ4484073משמש לביצוע qPCR על ביופילם פליקל נבחר.
RoaryThe Wellcome Trust SangerInstituteN/Aמשמש לעיצוב פריימרים של qPCR
ShakerShanghai Zhichu Instrument Co., LtdZQTY-50Sהמשמש לערבוב פתרונות וגידול מיקרוביאלי.
סילווט L-77Cytiva ביוטכנולוגיה (האנגג'ואו) ושות', בע"מSL77080596משמש להכנת מדיית TSB.
פפטון סויהצ'ינגדאו היי-טק פארק תעשייתי תקווה ביו-טכנולוגיה ושות', בע"מHB8275משמש להכנת מדיה TSB.
ספקטרופוטומטרשנחאי Yidian ניתוח מכשיר ושות', בע"מ76713100010משמש לכימות סגול קריסטל ביופילם
מים סטרילייםסינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מSW150302משמש לשטיפת הביופילם של הפליקל.
כפפות ניטריל מעוקרותבייג'ינג Labgic טכנולוגיה ושות', בע"מ223016852LLZAמשמש לפעולות ניסוי בסיסיות.
תבנית DNAסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מN/Aמשמש להגברת DNA ב-qPCR.
ThiamineBioolook Scientific Research 2180020 מיוחדמשמש להכנת מדיה MSgg.
TryptoneThermo Fisher ScientificLP0042Bמשמש להכנת מדיה TSB.
2190020מיוחד למחקר מדעישל Tryptophanמשמש להכנת מדיית MSgg.
TSB בינוניגואנגדונג Huankai מדע מיקרוביאלי & Tech. ושות', בע"מ024048מדיום חיידקי רחב ספקטרום.
TSB-Msgg MeidiumNanjing Agricultural UniversityN/Aמדיום מעורב לתרבית ביופילם פליקל עם תחולה רחבה יותר.
ZnCl2Nanjing Chemical Reagent Co., LtdC0310520123משמש להכנת מדיה MSgg.
פליקל. Bioolook

מקורות

  1. Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).
  2. Campbell, R., Greaves, M. P., Lynch, J. Anatomy and community structure of the rhizosphere. Rhizosphere. , 11-34 (1990).
  3. Berendsen, R. L., Pieterse, C. M., Bakker, P. A. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends Plant Sci. 17 (8), 478-486 (2012).
  4. Lugtenberg, B., Kamilova, F. D. Plant-growth-promoting rhizobacteria. Annu Rev Microbiol. 63, 541-556 (2009).
  5. Compant, S., Clément, C., Sessitsch, A. Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization. Soil Biol Biochem. 42, 669-678 (2010).
  6. Bais, H. P., Fall, R. R., Vivanco, J. M. Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production. Plant Physiol. 134 (1), 307-319 (2004).
  7. Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health. Nat Rev Microbiol. 18, 607-621 (2020).
  8. Sun, X., et al. Bacillus velezensis stimulates resident rhizosphere Pseudomonas stutzeri for plant health through metabolic interactions. ISME J. 16, 774-787 (2021).
  9. Pandhal, J., Noirel, J. Synthetic microbial ecosystems for biotechnology. Biotechnol Lett. 36, 1141-1151 (2014).
  10. Grosskopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Curr Opin Microbiol. 18, 72-77 (2014).
  11. Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana. root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
  12. Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528, 364-369 (2015).
  13. Bakken, L. R. Separation and purification of bacteria from soil. Appl Environ Microbiol. 49 (6), 1482-1487 (1985).
  14. Yang, O., et al. Direct cell extraction from fresh and stored soil samples: Impact on microbial viability and community compositions. Soil Biol Biochem. 155, 108178(2021).
  15. Ren, D., et al. High-throughput screening of multispecies biofilm formation and quantitative PCR-based assessment of individual species proportions, useful for exploring interspecific bacterial interactions. Microb Ecol. 68, 146-154 (2013).
  16. Sun, X., et al. Metabolic interactions affect the biomass of synthetic bacterial biofilm communities. mSystems. 8, e01045-e01123 (2023).
  17. Zhang, J., et al. High-throughput cultivation and identification of bacteria from the plant root microbiota. Nat Protoc. 16, 988-1012 (2021).
  18. Ren, D., Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burnolle, M. High prevalence of biofilm synergy among bacterial soil isolates in cocultures indicates bacterial interspecific cooperation. ISME J. 9, 81-89 (2015).
  19. Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48 (1), 066(2024).
  20. Palková, Z. Multicellular microorganisms: Laboratory versus nature. EMBO Rep. 5, 470-476 (2004).
  21. Xu, Z., et al. Chemical communication in plant-microbe beneficial interactions: a toolbox for precise management of beneficial microbes. Curr Opin Microbiol. 72, 102269(2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

16S rRNA
גישה לבניית קהילות ביופילם רב-מינים מאדמת ריזוספרה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.