מאמר שיטה

זיהוי יעיל של תאי אוכלוסיית צד Hoechst על ידי ציטומטריית זרימה

2.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67012

⸱

23 באוגוסט 2024

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Hematology, Department of Hematology, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, 2The Lab of Aging Research, State Key Laboratory of Biotherapy, National Clinical Research Center for Geriatrics, West China Hospital, Sichuan University, 3Precision Medicine Research Laboratory, West China Hospital, Sichuan University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מראים כי לייזרים בהספק גבוה של 375 ננומטר ו- 405 ננומטר יכולים לעורר ביעילות את Hoechst 33342 ולשמש חלופה בת קיימא ללייזר 355 ננומטר לזיהוי תאי אוכלוסיית צד (SP), ובכך להרחיב את טווח הלייזרים הזמינים ביישומי ציטומטריית זרימה.

תקציר

תאי אוכלוסיית הצד (SP) מזוהים באמצעות צביעת Hoechst 33342 ומנותחים באמצעות ציטומטריית זרימה (FCM). שיטת Hoechst SP משמשת לבידוד תאי גזע בהתבסס על תכונות שטף הצבע של מובילי קלטות קושרות ATP (ABC). השיטה שימשה בתחילה לזיהוי ובידוד של תאי גזע המטופויטיים (HSCs), אך כעת היא התפתחה להתמקד בעיקר בזיהוי ובידוד של תאי גזע סרטניים (CSC). שיטת הזיהוי המסורתית של FCM משתמשת בלייזר 355 ננומטר כדי לעורר את הצבע כדי לזהות תאי SP. באמצעות מחקר זה, זיהינו בהצלחה גישות חלופיות לעירור צבע שיכולות להחליף ביעילות את הזיהוי של תאי SP באמצעות לייזר 355 ננומטר. זה מושג באמצעות שימוש בלייזרים בהספק גבוה של 375 ננומטר או 405 ננומטר. זה מאפשר לנו לתרגל סלקטיביות משופרת בזיהוי תאי SP במקום להיות מוגבלים אך ורק לציטומטריית זרימת לייזר של 355 ננומטר.

מבוא

תאי אוכלוסיית הצד (SP) מזוהים באמצעות צביעת Hoechst 33342 ומנותחים באמצעות ציטומטריית זרימה (FCM). תאי SP מאופיינים בשאיבת צבע הדנ"א הפלואורסצנטי מתוך התאים דרך טרנספורטרקלטת קשירת ATP (ABC) 1,2. השיטה הוקמה במקור לבידוד תאי גזע המטופויטיים של מח עצם מורין (HSCs)1. תאי SP מח העצם הועשרו באוכלוסייה של HSCs המאופיינת בביטוינמוך CD117+Sca-1+Lin-Thy1 3,4. לאחר מכן, נעשה שימוש נרחב בשיטה כדי לבודד ולהעשיר תאי גזע מרקמות אחרות, כולל שריר הלב5, כבד6, ריאות7, כליות8 ומוח קדמי9. בפרט, השיטה יושמה לבידוד תאי גזע סרטניים (CSC) בעשור האחרון. CSCs מייצגים אוכלוסייה קטנה של תאים בעלי תכונות של התחלת גידול, התחדשות עצמית, עמידות לכימותרפיה ופוטנציאל גרורתי10. CSCs זוהו בתחילה בממאירויות המטופויטיות11 ולאחר מכן נצפו בגידולים מוצקים שונים כגון ערמונית12, שחלות13, קיבה14, שד15 וקרצינומה ריאות16. למרות זמינותן של טכניקות שונות לזיהוי CSC, טכניקת SP נותרה בחירה מועדפת בשל תחולתה הרחבה על פני רקמות וקווי תאים מגוונים. יתר על כן, זוהי טכניקה רבת ערך המבודדת CSCs באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS)16,17,18. ממצאי הניסוי מראים כי תאי SP מפגינים גידוליות בולטת ומציגים רמות ביטוי גבוהות של גנים הקשורים לתאי גזע19,20. המחקר הקודם שלנו21 הראה גם כי ניתוח שעתוק של תאי SP מבודדים במיאלומה נפוצה מגלה העשרה של מסלולי איתות הקשורים לתאי גזע, כגון מסלול הקיפוד. בינתיים, ביצענו ניתוחי העשרת מסלולים על הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בתאי SP של לוקמיה מיאלוגנית חריפה22. הגנים שהשתנו הועשרו במסלולים הקשורים לתאי גזע (Wnt/β-catenin, TGF-β, Hedgehog, Notch). מצאנו כי 1 x 105 תאי SP יכולים ליצור גידולים בעכברי BALB/c null22, בעוד שתאים שאינם SP לא יכולים, מה שמצביע על כך שלתאי SP היו מאפיינים של תאי גזע לוקמיה. יעילותה של שיטת Hoechst SP בזיהוי CSCs ניכרת.

פרוטוקול Hoechst SP שוכלל ושופר באמצעות התקדמות המחקר. הפרוטוקול כולל בקרה קפדנית של ריכוז הצבע, צפיפות התא, טמפרטורת הדגירה ומשך, הרכב החיץ וערך ה- pH. דגימות התאים שהוכנו בהתאם לפרוטוקול זה עברו אנליזה ציטומטרית של זרימה. בשל העירור של צבע Hoechst עם לייזר UV ב 355 ננומטר וזיהוי הפליטה הפלואורסצנטית שלו באמצעות מסנן 690/50 ננומטר (Hoechst אדום) ומסנן 450/50 ננומטר (Hoechst Blue), לייזר 350 ננומטר נדרש עבור FCM. עם זאת, לייזרים של 350 ננומטר אינם מצוידים בדרך כלל ברוב מכשירי FCM בגלל עלותם הגבוהה. לפיכך, ניסינו למצוא גישה חלופית לעירור צבע לזיהוי יעיל של תאי SP על ידי ציטומטריית זרימה. במחקר זה, היכולת של לייזרים 375 ננומטר ו 405 ננומטר בגילוי תאי SP הושוותה לזו של לייזר 355 ננומטר. הממצאים שלנו מראים דמיון מדהים בין תאי SP שזוהו על ידי לייזרים של 355 ננומטר, 375 ננומטר ו-405 ננומטר. תוצאות אלה מצביעות על כך שהלייזרים בעוצמה גבוהה של 375 ננומטר ו- 405 ננומטר יכולים לשמש כחלופות אפשריות ללייזר 355 ננומטר לזיהוי תאי SP. הכללת מקורות אור עירור נוספים עבור Hoechst 33342 מקלה על השימוש במודלים נוספים של ציטומטריית זרימה.

פרוטוקול

הניסויים במחקר זה השתמשו בסך הכל ב-10 עכברי C57BL/6 בגילאי 8 עד 12 שבועות. פעולות הניסוי נערכו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סצ'ואן (#201609309). חומרים ניסיוניים והפרמטרים של ציטומטריית זרימה המשמשים במאמר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. בידוד ואיסוף של תאי מח עצם עכבר

  1. יש להרדים עכברים בהתאם להנחיות המוסדיות. כדי לגרום לאובדן הכרה בעכבר, יש לתת חומרי הרדמה באינהלציה החל מ-2% איזופלורן, ולאחר מכן עלייה הדרגתית במינון ל-5% איזופלורן עד להפסקת הנשימה.
  2. נתחו את העכברים בחדר הניתוח או בארון האדים. נקו ועיקרו את העכברים עם 70% אתנול.
  3. חותכים את העור ואת שריר הרגל עם מספריים חדים לחלוטין לנתח את עצם הירך.
  4. מרסקים את עצם הירך בעדינות עם מוט שחיקה במכתש ושוטפים את תאי מח העצם עם מדיום DMEM עד שהעצם הופכת לבנה.
  5. סנן את תאי מח העצם המתקבלים עם מסנן 100 מיקרומטר לתוך צינורות 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  6. יש להשליך את שאריות תאי הדם האדומים של הסופרנאטנט והליז עם 1 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים למשך דקה אחת ב-4°C. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר צנטריפוגה, לשטוף שוב עם מדיום DMEM.
  7. להשעות מחדש את התאים ב 2 מ"ל של תמיסת הדגירה (DMEM בינוני + 5% FBS), לספור את התאים עם מונה תאים אוטומטי ולהתאים את ריכוז התא ל 1.0 x 106 תאים / מ"ל עם תמיסת הדגירה.

2. צביעה סלולרית

  1. תוספת 2 מ"ל של תרחיף תאי מח עצם מכל עכבר עם 5 מיקרוגרם / מ"ל Hoechst 33342. כדי עוד 1 מ"ל aliquot, להוסיף 100 μM verapamil כמו שליטה שלילית.
  2. יש לדגור באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 90 דקות עם תסיסה עדינה כל 30 דקות.
  3. לאחר הדגירה, מקררים את התאים על קרח למשך 5 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השהה מחדש את התאים בתמיסת ריצה קרה (HBSS + 2% FBS). צנטריפוגה ב 4 ° C למשך 5 דקות ו להשליך את supernatant.
  4. להשעות מחדש את גלולת התא המתקבלת ב 500 μL של פתרון פועל לכל דגימה. לפני ניתוח FCM, יש להשלים תאים עם 2 מיקרוגרם/מ"ל של פרופידיום יודיד (PI) ולהניח על קרח למשך כ-5 דקות.

3. ציטומטריית זרימה

הערה: לסיכום המערכות והתצורות השונות שבהן נעשה שימוש, ראה טבלה 1.

  1. לכייל את ערכי מקדם השונות (CV) של התעלות הנדרשות באמצעות פלואורוספירות בקרת איכות יומית (QC) ב- FCM ולבצע בדיקות מדגמיות לאחר סיום מוצלח של בקרת איכות.
    1. בחר את קיצור הדרך לשולחן העבודה של התוכנה והפעל את התוכנה.
    2. בחר Start QC/Standardization בתפריט QC/Standardization כדי לגשת לניסוי QC.
    3. הכנס את צינור הדגימה של פלואורוספירות QC למחזיק הצינור.
    4. בחר התחל כדי לטעון את הדגימה ולהתחיל להפעיל את הליך QC. FCM מוכנים לשימוש לאחר מעבר QC.
  2. עורר את צבע Hoechst 33342 של אותן דגימות עם לייזר 355 ננומטר, 375 ננומטר ו- 405 ננומטר, בהתאמה, לזיהוי אדום Hoechst בערוץ 690/50 ננומטר וכחול Hoechst בערוץ 450/50 ננומטר.
    1. צור ניסוי חדש באמצעות בחירה באפשרות 'ניסוי חדש ' בתפריט 'קובץ', ציין את נתיב הקובץ ושמור את הניסוי.
    2. בחרו 'הגדר ערוץ' בתפריט 'הגדרות'. בחר בתיבת הסימון אות ערוץ (Y585 , V450 , V660 , NUV450 , NUV660 , UV450 , UV660) ולאחר מכן הוסף את שם המגיב בעמודה תווית (585 יו': PI; V450: Hoechst Blue-405 ננומטר; V660: Hoechst אדום-405 ננומטר; NUV450: Hoechst Blue-375 ננומטר; NUV660: Hoechst Blue-375 ננומטר; UV450: Hoechst כחול-355nm; UV660: Hoechst Blue-355 ננומטר).
    3. לחצו על סמלי 'התחלות צבע מדומה ' באזור ההתוויה ליצירת חלקות רחצה. בחר שם ציר כדי לשנות את הערוץ המוצג.
    4. לחץ על הוסף צינור במסך מבחנה כדי ליצור מבחנות מדגם חדשות ולשנות את שמותיהן.
    5. בחר הפעל כדי לטעון את הדגימה, להציג את החלקות וליצור את השערים. התאם את הגדרות הרווח והסף. בחר הקלט כדי לשמור את הנתונים.
  3. עצב את לוגיקת הגדרת השער.
    1. עבור ההתוויה הראשונה, לחץ על ציר X כדי לבחור FSC-W ולחץ על ציר Y כדי לבחור FSC-A. בחר שער מצולע כדי לצייר את שער A כדי להקיף את התא הבודד ולא לכלול תאים דבקים (איור 1A).
    2. עבור ההתוויה השניה, לחץ על ציר X כדי לבחור FSC-A ולחץ על ציר Y כדי לבחור SSC-A. בחר שער מצולע כדי לצייר את שער B כדי להפריד תאים שאינם מקוטעים ולא לכלול פסולת תאית (איור 1B).
    3. עבור התרשים השלישי, לחץ על ציר X כדי לבחור PI-A ולחץ על ציר Y כדי לבחור SSC-A. בחר שער מצולע כדי לצייר את שער D. בחר תאים חיים המציגים PI שלילי (איור 1C) וצייר את שער C כדי לקבל תאים חיים.
    4. עבור ההתוויה הדו-ממדית הרביעית, לחץ על ציר X כדי לבחור Hoechst Red ולחץ על ציר Y כדי לבחור Hoechst Blue. לחץ לחיצה ימנית על התוויית ובחר מאפיין מהתפריט הנפתח. בחר 'עיצוב ליניארי' fאו גם ציר X וגם ציר Y. בחר שער מצולע כדי לצייר את שער SP כדי לקבל תאי SP (איור 1D).
  4. כדי להעריך את זכאות הדגימה, השתמש ב- 355 ננומטר של ציטומטר זרימה ספציפי23 לזיהוי תאי SP.
  5. השתמש בלייזרים 355 ננומטר (עוצמת לייזר: 20 mW) ו- 405 ננומטר (עוצמת לייזר: 80 mW) בו זמנית כדי לזהות הן את תאי הבקרה (עם תוספת verapamil) והן את תאי הניסוי.
  6. קבל אותות פלואורסצנטיים בתעלות 690/50 ננומטר ו- 450/50 ננומטר המתאימות לשני הלייזרים. שימו לב לגירוי היעיל של צבע Hoechst 33342 באמצעות לייזרים של 355 ננומטר ו-405 ננומטר עם תאי SP שקופים (איור 2B-C).
  7. עבור אותן דגימות, השתמש בלייזרים 375 ננומטר (עוצמת לייזר: 60 mW) ו- 405 ננומטר (עוצמת לייזר: 80 mW) לזיהוי תאים.

תוצאות

באיור 2, קבוצת הביקורת טופלה באמצעות verapamil, אשר חוסם טרנספורטרים ABC בתאי גזע כדי למנוע את חיסול Hoechst 33342. בכך, תאי הגזע בקבוצה הלא-וראפמילית מגרשים את Hoechst 33342 ויוצרים אוכלוסיית תאים שלילית הידועה בשם תאי SP. לייזר 355 ננומטר עורר ביעילות את הצבע Hoechst 33342, וכתוצאה מכך תצפית ברורה על תאי SP של מח עצם (איור 2A). תאי SP של אותן דגימות שזוהו על-ידי לייזר 355 ננומטר ולייזר 405 ננומטר נמצאו זהים במהותם (איור 2D).

מאיור 2 ומאיור 3 ראינו שגם מודלים אחרים של מדי זרימה לא מסורתיים יכולים לזהות תאי SP. התוצאות מצביעות על כך שגם לייזרים של 375 ננומטר וגם לייזרים של 405 ננומטר עוררו ביעילות את Hoechst 33342 כדי להשיג תאי SP (איור 3A-B). כאשר יש צורך לזהות או לבודד CSCs או HSCs, אנו יכולים לבחור לייזר 375 ננומטר או 405 ננומטר במקום לייזר 355nm.

figure-results-1
איור 1: לוגיקת הגדרת שער מבוססת ציטומטריה של זרימה לזיהוי תאי SP. (A) FSC-A ו-FSC-W שימשו להרחקת תאים דבקים. שער A מייצג את הצביר החד-תאי. (B) הפרמטרים של FSC-A ו-SSC-A שימשו לסילוק פסולת סלולרית. שער B מייצג את צביר התאים הלא-מקוטעים. (C) נבחרו תאים חיים המציגים יודיד פרופידיום שלילי (PI). שער C מייצג את אשכול התאים החיים. (D) אותות פלואורסצנטיים נקלטו דרך ערוצי 690/50 ננומטר (Hoechst-red) ו-450/50 ננומטר (Hoechst-blue). שער SP מייצג את אשכול תאי SP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: לייזר בעוצמה גבוהה של 405 ננומטר מזהה תאי SP באותה יעילות כמו לייזר של 355 ננומטר. (A) צבע Hoechst 33342 עורר על ידי לייזר 355 ננומטר מציטומטר זרימה קונבנציונלי כדי לזהות את תאי SP של מח העצם. (ב, ג) תאי SP של מח עצם זוהו על ידי לייזרים 355 ננומטר ו 405 ננומטר של אותו FCM. (D) תאי SP של אותן דגימות שזוהו על ידי לייזר 355 ננומטר ולייזר 405 ננומטר נמצאו זהים במהותם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: לייזרים בעוצמה גבוהה של 375 ננומטר ו-405 ננומטר מסוגלים לזהות תאי SP. (A) לייזר בעוצמה גבוהה של 375 ננומטר יכול לזהות תאי SP. (B) ניתן לזהות את תאי SP של מח עצם גם באמצעות לייזרים של 405 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סוג לייזראורך גל לייזר (nm)כוח לייזר (mW)מסנן אדום Hoechst (nm)המסנן הכחול Hoechst (nm)
Moflo Astrios EQגז ארגון355100692/75448/59
CytoFLEX LXמוליכים למחצה35520690/50450/50
40580690/50450/50
CytoFLEX Sמוליכים למחצה37560690/50450/50
CytoFLEX SRTמוליכים למחצה40580690/50450/50

טבלה 1: סיכום תצורות ציטומטר זרימה.

דיון

השתמשנו בפרוטוקול המתואר כדי לערוך שלושה ניסויים, כאשר כל ניסוי כלל 3-4 עכברים, והתוצאה הייתה בסך הכל 10 עכברים. חלקם של תאי SP נע בין 0.05% ל -0.76%. חשוב לציין כי נצפו וריאציות אינדיבידואליות בקרב העכברים. השתמשנו בארבעה ציטומטרים של זרימה כדי לנתח את דגימות Hoechst. נצפה כי עירור של צבע Hoechst על ידי לייזר 20 mW 355 ננומטר על הגרסה החדשה של ציטומטריית זרימה שווה לזה של לייזר 100 mW 355 ננומטר על ציטומטריית זרימה מיושנת. ניתן לייחס תופעה זו לשונות בסוגי הלייזר המשמשים בשתי המערכות. את הסיבה הפוטנציאלית להשפעה הנצפית של לייזרים של 375 ננומטר ו-405 ננומטר ניתן לייחס לתפוקת הכוח המשמעותית של שני הלייזרים בשילוב עם השימוש בגלאי פוטודיודת מפולת שלגים (APD). ערוץ Hoechst Red-A לכד את אורך הגל הארוך כמעט אדום של 690 ננומטר, כאשר יעילות ההמרה הפוטואלקטרית של צינור מכפיל האור (PMT) הייתה נמוכה יחסית. עם זאת, APD הוכיח יעילות המרה פוטואלקטרית גבוהה בערך פי עשרה מזו של PMT24. לכן, בשילוב עם לייזרים בעוצמה גבוהה של 375 ננומטר ו- 405 ננומטר, גלאי APD מבחינים ביעילות בין תאי SP. לייזר 405 ננומטר לא רק מזהה ביעילות תאי SP, אלא גם מציג יכולת מעולה להבחין בין תת-קבוצה של אוכלוסיות חיוביות אדומות חלשות בהשוואה ללייזר 355 ננומטר.

השלב הקריטי של הפרוטוקול הוא להשתמש בציטומטריית זרימה עם לייזר 375 ננומטר או לייזר 455 ננומטר כדי לזהות תאים עם ערוצים 690/50 ננומטר (Hoechst-red) ו-450/50 ננומטר (Hoechst-blue). בעוד שהטכניקה מזהה תאי SP עם לייזרים של 375 ננומטר ו- 405 ננומטר במקום לייזר 355 ננומטר (לייזר מסורתי לניתוח תאי SP1), הנפוצים יותר ב- FCM, נדרשים לייזרים בהספק גבוה של 375 ננומטר ו- 405 ננומטר. זה מוביל למגבלות של טכנולוגיה זו. משמעות השיטה היא להרחיב את טווח הלייזרים המשמשים לגילוי צבעי Hoechst כך שניתן יהיה להשתמש במודלים אחרים של ציטומטריית זרימה לזיהוי תאי SP.

גילויים

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים ל- J.H. מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '81800207). הסיוע של Beckman Coulter, Inc. במתן תמיכה עבור ציטומטריית זרימה וכיול פרמטרים מוערך מאוד. אנו מודים לג'יאו צ'ן ממעבדת המפתח הממלכתית למחלות אוראליות, בית החולים לסטומטולוגיה במערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן, ויו צ'י ממרכז המחקר לרפואה רגנרטיבית, בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן, על עזרתם ברכישת נתוני ציטומטריה של זרימה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מונה תאים אוטומטיCountstar1M1200
מסנן תאים (100 ומיקרו; m)BIOFILCSS-013-100
בקרת איכות יומית פלואורוספירותבקמן קולטרB5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז (מדיום DMEM)CORNING10-013-CVRC
סרום בקר עובריCORNING35-081-CV
HBSSHycloneSH30030.02
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261
Propidium iodide (PI)Sigma-AldrichP4170
מאגר ליזה של תאי דם אדומיםBeyotimeC3702
VerapamilSigma-AldrichV4629

מקורות

  1. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  2. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
  3. Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
  4. Challen, G. A., Boles, N. C., Chambers, S. M., Goodell, M. A. Distinct hematopoietic stem cell subtypes are differentially regulated by TGF-beta1. Cell Stem Cell. 6 (3), 265-278 (2010).
  5. Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
  6. Terrace, J. D., et al. Side population cells in developing human liver are primarily haematopoietic progenitor cells. Exp Cell Res. 315 (13), 2141-2153 (2009).
  7. Martin, J., et al. Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential. Cytotherapy. 10 (2), 140-151 (2008).
  8. Challen, G. A., Bertoncello, I., Deane, J. A., Ricardo, S. D., Little, M. H. Kidney side population reveals multilineage potential and renal functional capacity but also cellular heterogeneity. J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1896-1912 (2006).
  9. Mouthon, M. A., et al. Neural stem cells from mouse forebrain are contained in a population distinct from the 'side population'. J Neurochem. 99 (3), 807-817 (2006).
  10. Cordon-Cardo, C. Cancer stem cells. Ann Oncol. 21 (Suppl 7), 93-94 (2010).
  11. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  12. Yun, E. J., et al. Targeting cancer stem cells in castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 22 (3), 670-679 (2016).
  13. Lupia, M., Cavallaro, U. Ovarian cancer stem cells: still an elusive entity. Mol Cancer. 16 (1), 64(2017).
  14. Zhao, R., et al. AQP5 complements LGR5 to determine the fates of gastric cancer stem cells through regulating ULK1 ubiquitination. J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 322(2022).
  15. Liu, S., et al. A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties. J Hematol Oncol. 14 (1), 178(2021).
  16. Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
  17. Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
  18. Haraguchi, N., et al. Characterization of a side population of cancer cells from human gastrointestinal system. Stem Cells. 24 (3), 506-513 (2006).
  19. Zhou, J., et al. Activation of the PTEN/mTOR/STAT3 pathway in breast cancer stem-like cells is required for viability and maintenance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16158-16163 (2007).
  20. Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Sci. 107 (4), 433-443 (2016).
  21. Wang, F., et al. ALCAM regulates multiple myeloma chemoresistant side population. Cell Death Dis. 13 (2), 136(2022).
  22. Wang, F., et al. Homoharringtonine synergizes with quizartinib in FLT3-ITD acute myeloid leukemia by targeting FLT3-AKT-c-Myc pathway. Biochem Pharmacol. 188, 114538(2021).
  23. Dong, X. L., Wei, Y. Y., Xu, T., Tan, X. Y., Li, N. Analysis of side population in solid tumor cell lines. J Vis Exp. (168), e60658(2021).
  24. Bhowmick, D., Sheridan, R. T. C., Bushnell, T. P., Spalding, K. L. Practical guidelines for optimization and characterization of the Beckman Coulter CytoFLEX platform. Cytom Part A. 97 (8), 800-810 (2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Hoechst 33342ABC
זיהוי יעיל של תאי אוכלוסיית צד Hoechst על ידי ציטומטריית זרימה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.