פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של כונדרוציטים, כונדרופרוגניטורים שמקורם בבדיקת הידבקות פיברונקטין (FAA-CPs), וכונדרופרוגניטורים נודדים (MCPs) מסחוס מפרקי אנושי. הוא מכסה עיכול אנזימטי, הידבקות פיברונקטין ומבחנים מבוססי נדידה לבידוד ואפיון תאים אלה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד כונדרוציטים וכונדרופרוגניטורים באמצעות הידבקות פיברונקטין ובדיקת נדידה
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי כונדרופרוגניטור (CPCs), שזוהו לאחרונה כתת-אוכלוסייה מובחנת, מציגים הבטחה בשל תכונותיהם המזנכימליות, כונדרוגנזה מוגברת ותכונות היפרטרופיות מוגבלות. העשרת האבות מושגת באמצעות הידבקות דיפרנציאלית של פיברונקטין ובדיקות אקספלנט מבוססות נדידה, כאשר כונדרופרוגניטורים שמקורם בבדיקת הידבקות פיברונקטין (FAA-CPs) וכונדרופרוגניטורים נודדים (MCPs) מדגימים פוטנציאל מעולה בהשוואה לכונדרוציטים. מאמר זה מתעמק בפרטים של בידוד תאים שמקורם בסחוס תושבים, כלומר כונדרוציטים וכונדרופרוגניטורים. בעוד שתובנות חשובות ממחקר כונדרוציטים תורמות להבנתנו את תיקון הסחוס, מאמצים מתמשכים מופנים לשימוש בכונדרופרוגניטורים ולחקר הפוטנציאל שלהם כגישה טיפולית אלטרנטיבית. בנוסף, מאמר מתודולוגיה זה מספק פרוטוקול מפורט צעד-אחר-צעד לבידוד שלושה סוגי תאים ספציפיים מסחוס: כונדרוציטים, FAA-CPs ו-MCPs. על ידי ביצוע נהלים סטנדרטיים, פרוטוקול זה מקל על מיצוי מוצלח של תת-סוגי תאים אלה. המאמר מבוסס על מחקר מקיף, ומתמקד בטכניקות המורכבות המשמשות לבידוד תת-הקבוצות השונות ובתנאי התרבות האופטימליים הנדרשים להרחבה ותחזוקה של התרבויות שלהם. המתודולוגיה כוללת בידוד אנזימטי של כונדרוציטים שמקורם בסחוס מפרקי אנושי, הידבקות פיברונקטין דיפרנציאלית לאחר עיכול אנזימטי רציף, ובדיקות אקספלנט מבוססות נדידה להשגת תאים תושבי סחוס.
מבוא
הופעתו של טיפול רגנרטיבי מבוסס תאים מייצגת גישה משמעותית לטיפול במחלות הקשורות לסחוס, כגון דלקת מפרקים ניוונית (OA) ומומים כונדרליים1. הפרעות אלו, המאופיינות בפירוק או פגיעה של סחוס במפרקים, מהוות אתגרים משמעותיים במהלך הטיפול. התיקון העצמי של הסחוס המפרקי מדווח כמוגבל בשל הארכיטקטורה העצבית, האווסקולריות והפעילות המיטוטית הנמוכה שלו2.
התאים הנפוצים ביותר להתחדשות רקמת סחוס הם תאי גזע מזנכימליים (MSCs) וכונדרוציטים3. עם זאת, מספר מחקרים דיווחו על מגבלות בשימוש בתאים אלה להתחדשות4. מגבלות אלו כוללות התמיינות סופית....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול אושר ועומד בתקנות ובהנחיות המתאימות של ועדת הביקורת המוסדית (ועדת מחקר ואתיקה). לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב, מפרקים טיביו-פמורליים אנושיים נרכשים מחולי דלקת מפרקים ניוונית (OA) (ציון רדיולוגי של קלגרן-לורנס 4)30 הזקוקים להחלפת ברך מלאה כחלק מהטיפול שלהם. המפרקים של חולים עם סימנים כלשהם של גידולים, זיהומים או דלקת מפרקים דלקתית (כגון דלקת מפרקים שגרונית או גאוט) לא נכללו במחקר. מובטח שכל ההליכים מבוצעים בתנאים סטריליים, תוך הקפדה על פרוטוקולי מעבדה סטנדרטיים לאורך כל תהליך הניסוי.
1. השגת מפרקים טיביו-פמורליים
- השג מפרקי ברכיים (מפרקים טיביו-פמורלי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מתוך 86.9 מ"ג של פרוסות סחוס, נצפתה תפוקת תאי כונדרוציטים של 1.72 x 105 תאים. עם הטעינה, כונדרוציטים נדבקים מיד, מציגים מראה ראשוני מעוגל של אבן מרוצפת והופכים למצב פיברובלסטי עם התרחבות נוספת (איור 1 A,B). זריעת כונדרוציטים אלה על צלחות פיברונקטין מביאה בדרך כלל להידבקות של 2%, כאשר כל תא עובר צמיחה משובטת (איור 2 C,D), ומגיע להכפלת האוכלוסייה של 5 בימים 10-12 (32 תאים לשיבוט). השיבוטים בשטח של 10 סמ"ר משולבים ומורחב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ההתחדשות הפוטנציאלית של הסחוס המפרקי, המכיל רקמת היאלין, עשויה להיות מושגת באמצעות אופטימיזציה של שני סוגי התאים המקוריים שלו: כונדרוציטים וכונדרופרוגניטורים. בעוד שמחקר מקיף על כונדרוציטים סיפק תובנות חשובות לגבי תפקידם בתיקון סחוס, שאלות לגבי אופי הרקמה המתחדשת הניעו מאמצים לשפר את הפנוטיפ שלהם ולחקור טיפולים אלטרנטיביים3. כונדרופרוגניטורים, המזוהים כתת-אוכלוסייה תאית חדשה יחסית, מראים הבטחה בשל תכונותיהם המזנכימליות הטבועות, כונדרוגנזה מוגברת ותכונות היפרטרופיו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
ברצוננו להודות לגב' בהוויני קרישנאן ולגב' מרין מרי זכריה על תרומתן האינטלקטואלית ולמרכז לחקר תאי גזע (יחידה של inStem בנגלור), המחלקה לפיזיולוגיה, המכללה הרפואית הנוצרית, ולורה, על תמיכתם בתשתיות. הפרויקטים המתמשכים נתמכים על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה (BT/PR32777/MED/31/415/2019), ממשלת הודו, מועצת המחקר למדע והנדסה (CRG/2022/004277), ממשלת הודו ומענקי מחקר נוזלים, המכללה הרפואית הנוצרית, ולור.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| להב 22-אזמל | טנדר | ||
| צלחת 6 בארות | קורנינג | 3516 | |
| אלסיאן כחול | THERMO SCIENTIFIC | J6012 | |
| אליזרין אדום | SIGMA | 130223 | |
| אמפוטריצין-B (2 μ גרם/מ"ל). | GIBCO | 15240062 | |
| חומצה אסקורבית (62 μ גרם / מ"ל) | SIGMA ALDRICH | A4544-25G | |
| BC ציטומטר זרימה CytoFLEX LX | תוכנת BECKMAN | COULTER CYTExpert גרסה 2.5 | |
| CaCl2 | SIGMA ALDRICH | C34006 | |
| CD105-FITC | BD BIOSCIENCE | ||
| CD106-APC | BD BIOSCIENCE | ||
| CD14-FITC | BD BIOSCIENCE | ||
| CD29-APC | BD BIOSCIENCE 559883 | ||
| CD34-PE | BD BIOSCIENCE 348057 | ||
| CD45-FITC | BD BIOSCIENCE | ||
| CD49b-FITC | מילטניל ביוטק& | nbsp; MACS 130/100337 | |
| CD49e-PE | BD BIOSCIENCE | ||
| CD73-PE | BD BIOSCIENCE 550257 | ||
| CD90-PE | BD BIOSCIENCE | 561970 | |
| מונה תאים | DE NOVIX | Cell Drop BF | |
| מסננת תאים | HIMEDIA | TCP024 | |
| צנטריפוגה | בקמן קולטר | אלגרה X-30R | |
| חממת CO2 | THERMO SCIENTIFIC | MODEL-371 | |
| קולגן מסוג X (COL10A1), גורם שעתוק הקשור ל-Runt (RUNX2), גורם שעתוק SRY-Box 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN) וקולגן מסוג II (COL2A1) | EUROGENTEC, בלגיה | ||
| קולגנאז סוג II | WORTHINGTON | LS004176 | |
| DMEM F-12 (Dubbecco's Modified Eagle's Medium F-12) | SIGMA ALDRICH | D8900-1L | |
| ELISA קורא צלחות | מכשירים מולקולריים | SpectraMax i3x קורא | |
| מהיר | ירוק FISHER SIENTIFIC | 2353459 | |
| סרום בקר עוברי | GIBCO | 10270106 | |
| FGF2 | CLOUD CLONE CORP | APA551Hu01 | |
| פיברונקטין (10 ומיקרו; L/mL) | SIGMA ALDRICH | F1141 | |
| מערכת סינתזה של גדיל ראשון | TAKARA BIO | 6110A | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | |
| Hematoxylin | QUALIGENS | Q39411 | |
| MgCl2 | SIGMA ALDRICH | M8787 | |
| שמן אדום O | SIGMA | 1320065 | |
| PBS (מי מלח חוצץ פוספט) | GIBCO | 10010023 | |
| PCR thermocycler | אפלייד ביוסיסטמס | Quantstudio 12K Flex thermocycler | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (100 יחב"ל/מ"ל) | GIBCO | 15240062 | |
| Picrosirius Red | ALFA AESAR | 2610108 | |
| נוגדן ראשוני (קולגן עכבר סוג II) | DSHB | DSHB II II6B3 | |
| פרונאז | ROCHE | 10165913103 | |
| מגיב Quant-iT Picogreen dsDNA | THERMO SCIENTIFIC | P7589 | |
| מקרר | ELANPRO | ||
| RNeasy MiniKit | QIAGEN | 74104 | |
| Safranin O | QUALIGENS | Q39962 | |
| נוגדן משני (נוגדן IgG נגד עכבר עזים, מצומד HRP) | THERMO SCIENTIFIC | 31430 | |
| אמבט מים רועדים | REMI | ||
| StemPro | בקבוק GIBCO | 1007201, A1007001 ו-A1007101 | |
| T-25 | קורנינג | 430639 | |
| TakyonTM Low Rox SYBR מאסטר מיקס dTTP כחול | EUROGENTEC | UF-LSMT-B0701 | |
| TGF ובטא; | ABCAM | ab277760 | |
| תרבית רקמות פטרידיש | TARSONS | 960010 | |
| כחול טולואידין | QUALIGENS | 2040 | |
| כחול טריפאן | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | GIBCO | 25200072 |
מקורות
- Muthu, S., Visawanathan, V., Chellamuthu, G., Thabrez, M. Clinical effectiveness of various treatments for cartilage defects compared to microfracture: A network meta-analysis of randomized controlled trials. J Cartilage Joint Preserv. 4 (2), 100163(2023).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
