בידוד כונדרוציטים וכונדרופרוגניטורים באמצעות הידבקות פיברונקטין ובדיקת נדידה

סיכום

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של כונדרוציטים, כונדרופרוגניטורים שמקורם בבדיקת הידבקות פיברונקטין (FAA-CPs), וכונדרופרוגניטורים נודדים (MCPs) מסחוס מפרקי אנושי. הוא מכסה עיכול אנזימטי, הידבקות פיברונקטין ומבחנים מבוססי נדידה לבידוד ואפיון תאים אלה.

תקציר

תאי כונדרופרוגניטור (CPCs), שזוהו לאחרונה כתת-אוכלוסייה מובחנת, מציגים הבטחה בשל תכונותיהם המזנכימליות, כונדרוגנזה מוגברת ותכונות היפרטרופיות מוגבלות. העשרת האבות מושגת באמצעות הידבקות דיפרנציאלית של פיברונקטין ובדיקות אקספלנט מבוססות נדידה, כאשר כונדרופרוגניטורים שמקורם בבדיקת הידבקות פיברונקטין (FAA-CPs) וכונדרופרוגניטורים נודדים (MCPs) מדגימים פוטנציאל מעולה בהשוואה לכונדרוציטים. מאמר זה מתעמק בפרטים של בידוד תאים שמקורם בסחוס תושבים, כלומר כונדרוציטים וכונדרופרוגניטורים. בעוד שתובנות חשובות ממחקר כונדרוציטים תורמות להבנתנו את תיקון הסחוס, מאמצים מתמשכים מופנים לשימוש בכונדרופרוגניטורים ולחקר הפוטנציאל שלהם כגישה טיפולית אלטרנטיבית. בנוסף, מאמר מתודולוגיה זה מספק פרוטוקול מפורט צעד-אחר-צעד לבידוד שלושה סוגי תאים ספציפיים מסחוס: כונדרוציטים, FAA-CPs ו-MCPs. על ידי ביצוע נהלים סטנדרטיים, פרוטוקול זה מקל על מיצוי מוצלח של תת-סוגי תאים אלה. המאמר מבוסס על מחקר מקיף, ומתמקד בטכניקות המורכבות המשמשות לבידוד תת-הקבוצות השונות ובתנאי התרבות האופטימליים הנדרשים להרחבה ותחזוקה של התרבויות שלהם. המתודולוגיה כוללת בידוד אנזימטי של כונדרוציטים שמקורם בסחוס מפרקי אנושי, הידבקות פיברונקטין דיפרנציאלית לאחר עיכול אנזימטי רציף, ובדיקות אקספלנט מבוססות נדידה להשגת תאים תושבי סחוס.

מבוא

הופעתו של טיפול רגנרטיבי מבוסס תאים מייצגת גישה משמעותית לטיפול במחלות הקשורות לסחוס, כגון דלקת מפרקים ניוונית (OA) ומומים כונדרליים¹. הפרעות אלו, המאופיינות בפירוק או פגיעה של סחוס במפרקים, מהוות אתגרים משמעותיים במהלך הטיפול. התיקון העצמי של הסחוס המפרקי מדווח כמוגבל בשל הארכיטקטורה העצבית, האווסקולריות והפעילות המיטוטית הנמוכה שלו².

התאים הנפוצים ביותר להתחדשות רקמת סחוס הם תאי גזע מזנכימליים (MSCs) וכונדרוציטים³. עם זאת, מספר מחקרים דיווחו על מגבלות בשימוש בתאים אלה להתחדשות⁴. מגבלות אלו כוללות התמיינות סופית של כונדרוציטים במהלך התרחבות מבחנה מורחבת כדי להשיג את ספירת התאים הנדרשת ואת הנטייה ההיפרטרופית של MSCs. גורמים אלה יכולים לגרום להיווצרות רקמת תיקון עם שילוב לא אופטימלי של סחוס פיברובי והיאלין 5,6,7,8.

הגילוי של תאי כונדרופרוגניטור (CPCs) נבע מהחיפוש אחר תאים חלופיים בסחוס מפרקי⁹. הם עוררו עניין עצום בשל הדמיון שלהם ל-MSCs והפוטנציאל הכונדרוגני המעולה שלהם, כל זאת תוך הפגנת היפרטרופיה מופחתת - שילוב הכרחי המבוקש^10,11. בניגוד לכונדרוציטים, אוכלוסיות אבות אלה דווחו כמציגות פעילות שכפול וטלומראז מוגברת, כמו גם ביטוי מוגבר של חלבון הומולוג 1 (NOTCH-1) וגורם שעתוק SRY-box 9 (SOX-9)12,13,14,15. ישנן שתי שיטות סטנדרטיות לבידוד CPCs המדווחות הן מסחוס והן ממניסקוס, כולל אחת המבוססת על ביטוי קולטן האינטגרין שלהם (CD49e/CD29), המבודד באמצעות בדיקת הידבקות פיברונקטין - Chondroprogenitors שמקורם בבדיקת הידבקות פיברונקטין (FAA-CPs), והשנייה מבוססת על פוטנציאל הנדידה המוגבר שלהם מצמחי סחוס - כונדרופרוגניטורים נודדים (MCPs)11,13,16,17,^18,19. מחקרים רבים במבחנה מדגימים את העליונות הכונדרוגנית וההיפרטרופיה המופחתת של FAA-CPCs ו-MCPs בהשוואה לכונדרוציטים ומח עצם (BM)-MSCs 20,21,22,23.

מחקרים אחרונים במבחנה המשווים FAA-CPCs ל-MCPs הדגימו את יכולת התחדשות הסחוס המשופרת של אוכלוסיית האב האחרונה בתנאי חמצן רגילים²⁴. התוצאות האופטימיות הללו במבחנה מציגות התחדשות דמוית היאלין, ומעודדות ניסויים נוספים in vivo. עם זאת, שתי האוכלוסיות של CPCs דווחו כמתקנים ומחדשים ביעילות סחוס בדלקת מפרקים ניוונית והפרעות אוסטאוכונדרליות אחרות במודלים של בעלי חיים 25,26,27,28,29.

המעבדה שלנו תרמה באופן פעיל לסטנדרטיזציה של טכניקות בידוד CPC והשוואת המאפיינים הפנוטיפיים שלהן עם כונדרוציטים ו-MSCs. מאמר זה יספק פרוטוקול מפורט המסביר את השלבים הכרוכים בבידוד ותרבית תאים תושבים בסחוס, כלומר כונדרוציטים, FAA-CPCs ו-MCPs.

פרוטוקול

הפרוטוקול אושר ועומד בתקנות ובהנחיות המתאימות של ועדת הביקורת המוסדית (ועדת מחקר ואתיקה). לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב, מפרקים טיביו-פמורליים אנושיים נרכשים מחולי דלקת מפרקים ניוונית (OA) (ציון רדיולוגי של קלגרן-לורנס 4)³⁰ הזקוקים להחלפת ברך מלאה כחלק מהטיפול שלהם. המפרקים של חולים עם סימנים כלשהם של גידולים, זיהומים או דלקת מפרקים דלקתית (כגון דלקת מפרקים שגרונית או גאוט) לא נכללו במחקר. מובטח שכל ההליכים מבוצעים בתנאים סטריליים, תוך הקפדה על פרוטוקולי מעבדה סטנדרטיים לאורך כל תהליך הניסוי.

1. השגת מפרקים טיביו-פמורליים

1. השג מפרקי ברכיים (מפרקים טיביו-פמורליים) מתורמים אנושיים הזקוקים לקטיעה מעל הברך כחלק מהטיפול או מאלה עם דלקת מפרקים ניוונית^{דרגה 4 30} (ראיות רדיולוגיות המראות הפחתה ניכרת של חלל המפרק עם טרשת כונדרלית) העוברים החלפת ברך מלאה.
   הערה: ודא שהסכמה מדעת מתקבלת מהמטופלים בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי. להבטיח עמידה בכללי ועדת האתיקה וועדת הביקורת המוסדית.
2. אל תכלול מפרקים המראים תסמינים של זיהום או דלקת.

2. עיבוד מפרקים שנקטפו

1. הנח את המפרקים הטיביו-פמורליים שנקטפו בתמיסת מלח 1x עם חוצץ פוספט (PBS) בתנאים סטריליים.
2. הכן אזור סטרילי מתחת למכסה המנוע על ידי הנחת כרית תחתונה סטרילית. העבירו את המפרקים שנקטפו אל המשטח התחתון.
3. ייצב את המפרקים הטיביו-פמורליים החתוכים על ידי החזקת העצם התת-כונדרלית כשהסחוס פונה כלפי מעלה.
4. בעזרת להב אזמל (מס' 22), קצור שבבי סחוס בצורת מלבני מהאזורים שאינם נושאי משקל לחולי OA תוך 1-2 שעות מקבלת המפרק.
5. קצרו את קטעי הסחוס בגודל 8 מ"מ על 10 מ"מ מהשכבה השטחית לשכבה העמוקה יותר.
6. שוטפים את פרוסות הסחוס בתמיסת PBS 1x ומניחים אותן בצלחת פטרי המכילה 1-2 מ"ל של מדיום DMEM רגיל.
7. טוחנים את פרוסות הסחוס יפה לגודל של פחות מ -1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ בעזרת להב אזמל (מס '22).
   הערה: ודא שפרוסות הסחוס או הסחוס הטחון לא יתייבשו; מקם אותם במדיום תרבותי או PBS נטול סרום.

3. בידוד כונדרוציטים

1. מניחים את הסחוס הטחון בבקבוק T-25 זקוף המכיל 10 מ"ל של Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) עם 0.15% קולגנאז מסוג II לעיכול אנזימטי. השאירו את הבקבוק ללא הפרעה למשך 12-14 שעות בחממת CO₂ , תוך הבטחת תנאי תרבות סטנדרטיים³¹.
   הערה: יש להשתמש במדיום DMEM-F12 רגיל ללא עקבות של סרום, מכיוון שסרום משבית את הפעולה האנזימטית.
2. לאחר עיכול לילה, העבירו את המדיום המכיל את התאים המשוחררים לצינור צנטריפוגה טרי וסטרילי המכיל נפח שווה של DMEM-F12 + 10% סרום בקר עוברי (FBS), באמצעות מסננת תאים כדי להפריד את התאים מהפסולת. התאים המשוחררים הם ה"כונדרוציטים".
3. צנטריפוגה את התאים המסוננים במהירות של 1200 x g למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
4. השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. הרכיבו מחדש את הגלולה שהתקבלה ב-1 מ"ל של מדיום וספרו את התאים ברי הקיימא ששוחררו באמצעות בדיקת אי הכללה כחולה של טריפאן.
5. טען את הכונדרוציטים בבקבוק T-25 בריכוז של 10,000 תאים/סמ"ר והרחיב למספר המעבר הנדרש באמצעות DMEM-F12 המכיל 10% FBS. רכיבים נוספים במדיום כוללים חומצה אסקורבית (62 מיקרוגרם/מ"ל), L-גלוטמין (2.5 מ"מ/ליטר), פניצילין-סטרפטומיצין (100 יחב"ל/מ"ל) ואמפוטריצין-B (2 מיקרוגרם/מ"ל).
6. רענן את המדיום כל 3 ימים וקצור תאים בתת-מפגש באמצעות 0.125% טריפסין המכיל חומצה אתילנדיאמין טטראצטית (EDTA).

4. בידוד של כונדרופרוגניטורים שמקורם בבדיקת הידבקות פיברונקטין (FAA-CPs)

1. 12 שעות לפני שחרור הכונדרוציטים, הכינו 10 מ"ל של 1x PBS המכילים 1 מ"מ של MgCl₂ (10 מיקרוליטר) ו-1 מ"מ של CaCl₂ (10 מיקרוליטר), ו-100 מיקרוליטר של פיברונקטין (10 מיקרוליטר / מ"ל)³².
2. מצפים את מספר הבארות הנדרש של צלחת 6 בארות (1.5 מ"ל/9.3 ס"מ²) באמצעות התמיסה המוכנה.
3. אוטמים היטב את הצלחת ומכניסים למקרר למשך הלילה ל-4 מעלות צלזיוס.
4. בנוסף, השג שבבי סחוס באופן דומה לזה המוסבר לבידוד כונדרוציטים (שלבים 2.1-2.5).
5. חשפו את שבבי הסחוס לעיכול אנזימטי רציף למשך הלילה (0.2% פרונאז למשך 3 שעות; ואחריו 0.04% קולגנאז מסוג II למשך 12 שעות) באמבט מים רועדים שנשמר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס להשגת כונדרוציטים בודדים.
6. למחרת, הוציאו מהמקרר את צלחת 6 הבארות המצופה פיברונקטין והוציאו עודפי פיברונקטין.
   הערה: יש להסיר עודפי פיברונקטין לאט ובעדינות מבלי להפריע לציפוי בתחתית הבאר. נוכחותם של MgCl₂ (10 מיקרוליטר) ו-1 מ"מ של CaCl₂ היא חיונית כדי להבטיח את הצמדת התאים.
7. הוסף 2-3 מ"ל של מדיום DMEM-F12 רגיל לבארות המצופות.
8. זרעו את הכונדרוציטים המשוחררים על הבארות המצופות בצפיפות העמסה של 4000 תאים לבאר והשאירו את הצלחת ללא הפרעה לתקופה של 20 דקות.
9. לאחר הדגירה, הסר את עודפי המדיה והתאים שאינם נדבקים. הוסף 2-3 מ"ל של מצע גידול סטנדרטי המשמש לכונדרוציטים (DMEM-F12 + 10% FBS).
10. שמור על התאים הדבקים בתנאי תרבית סטנדרטיים למשך 10-12 ימים כדי להשיג שיבוטים של CPC (מושבות של >32 תאים).
11. בודד באמצעות 0.125% טריפסין-EDTA למשך 180 שניות, צלח מחדש את השיבוטים ביחס של 1 שיבוט / 5 סמ"ר, והרחיב את ה-CPs הפוליקלונליים המועשרים למפגש הנדרש. תאים אלה המתקבלים מכונים "FAA-CPCs".
12. תרבית נוספת של התאים במדיום DMEM-F12 + 10% FBS + גורם גדילה טרנספורמטיבי בטא 2 (TGFβ2: 1 ננוגרם/מ"ל) + גורם גדילה פיברובלסטים (FGF2: 5 ננוגרם/מ"ל).
    הערה: הדגירה של תאים על צלחות מצופות פיברונקטין לא תעלה על 20 דקות, מכיוון שגם כונדרוציטים עשויים להתחיל להידבק. במהלך תקופת ההדבקה של 20 דקות, המדיום חייב להיות נטול סרום. לאחר מכן, יש לגדל את התאים הנצמדים ליצירת שיבוטים במדיום המכיל בנוסף FBS. יש לבודד את השיבוטים רק לאחר שווידאתם שלכל שיבוט יש יותר מ-32 תאים; זאת כדי להימנע ממגברי מעבר. הרחבה נוספת של השיבוטים לאחר טריפסיניזציה צריכה לכלול את גורמי הגדילה הנוספים שהוזכרו. צפיפות העמסה של 4000 כונדרוציטים / 9.3 ס"מ^רבוע של צלחת מצופה פיברונקטין, לאחר דגירה של 20 דקות ואחריה שטיפה, מביאה להידבקות של 80-100 תאים בסך הכל. מתוכם, כ-20 שיבוטים יתקדמו לגדול ולהגיע להכפלת אוכלוסייה של 5 תוך 10-12 ימים.

5. בידוד של כונדרופרוגניטורים נודדים

1. גלחו את צמחי הסחוס (10 מ"מ x 5 מ"מ x 1 מ"מ) מהמפרק המפרקי שנקטף והניחו אותם בצלחת סטרילית של 6 בארות המכילה מדיה DMEM-F12 עם 10% FBS ו-10 מ"מ גלוטמקס (2-3 צמחים לבאר)³³.
2. השאירו את הצלחת עם האקספלנטים ללא הפרעה למשך 48 שעות בחממת CO₂ שנשמרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
3. לאחר יומיים, העבירו את הצמחים לצינור צנטריפוגה המכיל 10 מ"ל של תמיסת קולגנאז 0.1% לעיכול אנזימטי. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
   הערה: יש לשטוף את האקספלנטים עם 1x PBS לפני עיכול אנזימטי, מכיוון שעקבות של סרום יכולים להשבית את פעולת האנזים. לשטיפה, טובלים את הצמחים בכלי פטרי מלא ב 2-3 מ"ל של 1x PBS; זאת גם כדי להבטיח אי זיהום עם כונדרוציטים משוחררים. יש לשמור על הטיפול בצמחים למינימום, וזאת כדי להימנע מלחץ על האבות שהחלו לנדוד.
4. לאחר העיכול, שטפו את האקספלנטים עם 1x PBS והניחו אותם בחזרה באותן בארות של הצלחת המכילה מדיה DMEM-F12 טרייה עם 10% FBS ו-10 מ"מ של מדיום Glutamax.
5. שמור על הצלחת בתנאי תרבות סטנדרטיים בחממה. שימו לב לנדידת כונדרופרוגניטורים בימים שלאחר מכן.
6. בהגעה לתת-מפגש, קצרו את ה-MCPs באמצעות 0.125% של טריפסין המכיל EDTA.
7. הרחב את ה-MCPs באמצעות מדיום ההרחבה הסטנדרטי, הכולל את DMEM-F12, המכיל 10% FBS ו-10 מ"מ של Glutamax.

6. אפיון פנוטיפי של כונדרוציטים, FAA-CPs ו-MCPs

1. ניתוח ציטומטרי זרימה (FACS)
   הערה: השלבים הבאים מתבצעים לניתוח FACS של קבוצות התאים שנקטפו.
   1. טריפסין את התאים לפי פרוטוקול סטנדרטי באמצעות 0.125% טריפסין וצנטריפוגה בטמפרטורה של 1200 x גרם, 5 דקות, בטמפרטורת החדר כדי להשיג את גלולת התא.
   2. השליכו את ה-supernatant, שטפו והשעו מחדש את הגלולה עם 1x PBS.
   3. העבר את המתלה לצינורות מסומנים עבור FACS.
   4. חלקו את התרחיף באופן שווה לשני צינורות: צינור 'לא מוכתם' המשמש כבקרה (תרחיף תאים ללא נוגדן) וצינורות 'מוכתמים' המשמשים כבדיקות (תרחיף תאים עם נוגדן).
   5. עקוב אחר גיליון הנתונים הטכניים של נוגדנים בודדים/סמני אשכול התמיינות (CD) לצביעה. נוגדנים להשוואה כוללים CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (סמני ביטוי חיובי); CD34-PE, CD45-FITC ו-CD14-FITC (סמני ביטוי שליליים)^34,35; CD166-BB515 ו-CD146-PE (סמנים כונדרוגניים פוטנציאליים)^36,37.
      הערה: סמני תקליטורים רגישים לאור. כדי להבטיח שהשלבים נעשים בחושך.
   6. דגרו על תרחיף התאים עם נוגדן למשך 30 דקות בחושך.
   7. לאחר הצביעה, הוסף 1 מ"ל של 1x PBS לצינורות ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 1200 x גרם, 5 דקות, בטמפרטורת החדר כדי להשיג את גלולת התא.
   8. השליכו שלושה רבעים מהסופרנטנט. יש להשעות מחדש את הגלולה בתכולת העל-טבעית שנותרה על ידי טריטורציה עדינה.
   9. המשך לניתוח FACS.

7. qRT-PCR

הערה: ניתוח qRT-PCR של ביטוי גנים כולל הערכה של קולגן מסוג I (COL1A1), קולגן מסוג X (COL10A1) וגורם שעתוק הקשור ל-Runt (RUNX2) לביטוי היפרטרופי ו-SOX-9, Aggrecan (ACAN) וקולגן מסוג II (COL2A1) לכונדרוגנזה.

1. חלץ RNA מקבוצות התאים באמצעות ערכות זמינות מסחרית לפי הוראות היצרן.
2. לאחר המיצוי, הערך את יחס A₂₆₀/A₂₈₀ ואת ריכוז ה-RNA.
3. השתמש ב-280 ננוגרם של ה-RNA המופק לבניית DNA משלים (cDNA).
4. התחל qRT-PCR באמצעות Sybr Green, כל תגובה מכילה ריכוז סופי של 7 ננוגרם של cDNA על תרמו-סייקלר
5. לנרמל את ביטוי ה-mRNA היחסי של כל גן לגן משק הבית הייחוס GAPDH (ΔCt).
6. חשב את הביטוי היחסי של כל גן באמצעות טכניקת ^2-ΔΔCt על ידי השוואת ערך ה-ΔCt של כל גן בודד לזה של FAA-CPs (ΔΔCt)³⁷.

8. בידול רב שושלות

הערה: מדיה דיפרנציאלית זמינה מסחרית גורמת להתמיינות משולשת לשושלות אדיפוגניות, אוסטאוגניות וכונדרוגניות.

1. להתמיינות אדיפוגנית, תאי זרע בצפיפות העמסה של 1000 תאים^/סמ "ר בצלחת תרבית תאים ותרבית באמצעות מדיום התמיינות אדיפוגני (שינוי בינוני - אחת ל-3 ימים) עד תת-מפגש של 80% למשך 3 שבועות.
2. להתמיינות אוסטאוגנית וכונדרוגנית, עקוב אחר מערכת תרבית הגלולה ל-28 יום³⁸.
3. צנטריפוגה 0.5 x 10⁶ תאים ב-400 x גרם למשך 12 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ליצירת כדורים וליזום התמיינות באמצעות מדיום התמיינות אוסטאוגני וכונדרוגני.
4. תקן, הטמע וחתך את הכדורים לצביעה מאשרת (שלב 9).

9. מכתים מאשרים

1. במקרה של תאי שושלת אדיפוגניים, יש לתקן את התאים בפורמלין חוצץ, לשטוף ולהכתים עם שמן אדום O (0.5%). מכתים גם את הפקדים (מתורבתים על מדיום DMEM סטנדרטי עם 10% FBS).
2. התבונן במיקרוסקופ ורכוש את התמונות.
3. עבור תאי השושלת האוסטיאוגניים המובחנים, יש לצבוע באדום אליזרין (2%).
   הערה: פרוטוקולי צביעה מאשרים מרובים חלים על התאים הממוינים הכונדרוגניים.
4. צביעה בכחול אלציאן: צבעו את התאים הקבועים בכחול אלציאן למשך 5 דקות וצביעו באדום ניטרלי.
5. להערכת תכולת גליקוזאמינוגליקן (GAG), בצע צביעת ספרנין O: צבע את השקופיות עם המטוקסילין ברזל של Wiegert ואחריו דגירה לאחר מכן עם אלכוהול חומצי (1%), תמיסה ירוקה מהירה (0.05%), חומצה אצטית (1%) ותמיסת Safranin O (1%).
6. צביעת טולואידין כחול: מכתים את השקופיות בכחול טולואידין (0.1%) למשך 5 דקות.
7. צביעת PicroSirius אדום: מכתימים את השקופיות באדום פיקרוסיריוס (0.1%) וצביעה נגדית באמצעות צבע המטוקסילין.
   הערה: לאחר הצביעה, יש לייבש את השקופיות באמצעות אלכוהול מדורג ולנקות באמצעות קסילן. הרכיבו מגלשות באמצעות תושבת Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX), התבוננו בהן תחת מיקרוסקופ ורכשו תמונות.
8. עבור צביעה אימונוהיסטוכימית (קולגן מסוג II) של הגלולה המובחנת הכונדרוגנית, הכניסו את חלקי הגלולה לאחזור אנטיגן אנזימטי באמצעות האנזימים פרונאז (1 מ"ג/מ"ל) והיאלורונידאז (2.5 מ"ג/מ"ל).
9. דגרו את החלקים עם נוגדן אנטי-קולגן חד-שבטי ראשוני של עכבר מסוג II, ואחריו נוגדן אנטי-עכברי עיזים 1:250 משני עם תווית HRP.
10. צבעו את השקופיות בכרומוגן 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) וצבעו אותן באמצעות המטוקסילין.
11. התבונן במיקרוסקופ וצלם תמונות.

10. קביעת תכולת GAG/DNA

1. עכל את הכדורים המובחנים הכונדרוגניים באמצעות תמיסת פפאין-ציסטאין בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
2. העריכו את ריכוז ה-DNA באמצעות מגיב Picrogreen³⁸ ורכשו את עוצמת הקרינה באורכי גל - עירור: 480 ננומטר, פליטה: 520 ננומטר באמצעות קורא צלחות ELISA.
3. הערך את תכולת ה-GAG הכוללת באמצעות שיטת הצבע הכחול דימתיל מתילן³⁸.
4. מדוד צפיפות אופטית ב-525 ננומטר באמצעות קורא לוחות ELISA.
5. נרמל את ערכי ה-GAG לערכי ה-DNA וחשב את יחס ה-GAG/DNA הכולל.

תוצאות

מתוך 86.9 מ"ג של פרוסות סחוס, נצפתה תפוקת תאי כונדרוציטים של 1.72 x 10⁵ תאים. עם הטעינה, כונדרוציטים נדבקים מיד, מציגים מראה ראשוני מעוגל של אבן מרוצפת והופכים למצב פיברובלסטי עם התרחבות נוספת (איור 1 A,B). זריעת כונדרוציטים אלה על צלחות פיברונקטין מביאה בדרך כלל להידבקות של 2%, כאשר כל תא עובר צמיחה משובטת (איור 2 C,D), ומגיע להכפלת האוכלוסייה של 5 בימים 10-12 (32 תאים לשיבוט). השיבוטים בשטח של 10 סמ"ר משולבים ומורחבים למעבר הדרוש לייצור FAA-CPs. צמחי סחוס, שנמשכים בתרבית לאחר דגירה של קולגנאז, מציגים התרופפות מטריצה חוץ-תאית, והנדידה נצפית בדרך כלל^{כבר ביום} השביעי (איור 2E). גם FAA-CPs וגם MCPs מציגים מבנה בצורת ציר, מאפיין המקושר בדרך כלל ל-BM-MSCs, שרוכש מבנה דמוי חלת דבש לפני המפגש (איור 1E,F).

שלושת סוגי התאים המבודדים, כלומר כונדרוציטים, FAA-CPs ו-MCPs, מנוטרים מקרוב באמצעות הדמיית ניגודיות פאזה. ה-FAA-CPs מועברים רק לאחר אישור של חמש הכפלות אוכלוסייה.

אפיון פנוטיפי של התאים המבודדים והמורחבים כולל בדרך כלל ניתוח זרימה ציטומטרי עבור סמנים משוערים של כונדרוגנזה, כלומר CD146 ו-CD166, כמו גם ניתוח ביטוי גנים לסמנים של כונדרוגנזה (SOX-9, ACAN, COL2A1), סמן הפיברו-סחוס COL1A1, וסמני היפרטרופיה (RUNX2 ו-COL10A1). כל שלוש קבוצות התאים מציגות ביטוי גבוה (>95%) של CD105, CD73 ו-CD90; ביטוי נמוך עד שלילי של CD34 ו-CD45; וביטוי גבוה (>98%) של CD166, עם ביטוי מתון ותלוי תורם של CD146 (40%-75%) (איור 2A).

תוצאות qRT-PCR מראות ביטוי דומה וגבוה של SOX-9, ACAN, וגם COL1A1, סמן פיברו-סחוס, מכיוון שהתאים מתורבתים לפני ההערכה (איור 2B). לאישור כונדרוגנזה, נצפתה קליטה חיובית של קומפלקסים כתומים-אדומים באזורים המכילים GAG לאחר ספרנין O, וקומפלקסים כחלחלים עד ארגמניים בעקבות כחול אלציאן וכחול טולואידין בכל קבוצות התאים, עם שיעור גבוה יותר בקבוצות FAA-CP ו-MCP. ניתוח אימונוהיסטוכימיה של הכדורים המובחנים כונדרוגניים עבור קולגן מסוג II מראה ספיגה סיבית חומה בכל שלוש הקבוצות (איור 3). יתר על כן, ניתוח GAG/DNA הראה גם אישור של התמיינות כונדרוגנית עם קבוצות FAA-CP המציגות ביטוי גבוה יותר (איור 2C).

איור 1: בידוד ואפיון של כונדרוציטים וכונדרופרוגניטורים. אלגוריתם המחקר מתאר את הבידוד של שלוש קבוצות תאים ואת התכונות המורפולוגיות שלהן תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה מיד לאחר הבידוד ולאחר מספר ימים של התרחבות. (A) כונדרוציטים מבודדים טריים נצמדים לתרביות דבקות במהלך הימים הראשונים של התרבית, ורוכשים מראה פיברובלסטי עם התרחבות נוספת (B). (C) כונדרוציטים שעברו בדיקת הידבקות של פיברונקטין מראים גדילה משובטת, ומגיעים להכפלת האוכלוסייה של 5 ביום ה-10 (D). (E) כונדרופרוגניטורים נודדים מקצה האקספלנט ביום ה-10 של התרבית ומציגים דפוס גדילה בצורת ציר עם התרחבות נוספת (F). הגדלת תמונה בניגודיות פאזה: פי 10; פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: נתוני אפיון מולקולרי. (A) ניתוח ציטומטרי זרימה עבור סמני MSC חיוביים ושליליים וסמני כונדרוגנזה פוטנציאליים. (B) נתוני ביטוי RT-PCR עבור שלוש קבוצות התאים לניתוח ביטוי גנים של סמנים כונדרוגניים והיפרטרופיים. (C) ניתוח GAG/DNA כולל של הכדורים המובחנים הכונדרוגניים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: צביעה מאשרת לאחר התמיינות כונדרוגנית. ספרנין O וניתוח אימונוהיסטוכימי לקולגן מסוג II בין שלוש קבוצות התאים. פסי קנה מידה: להגדלה פי 10, 50 מיקרומטר; הגדלה פי 40, 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

ההתחדשות הפוטנציאלית של הסחוס המפרקי, המכיל רקמת היאלין, עשויה להיות מושגת באמצעות אופטימיזציה של שני סוגי התאים המקוריים שלו: כונדרוציטים וכונדרופרוגניטורים. בעוד שמחקר מקיף על כונדרוציטים סיפק תובנות חשובות לגבי תפקידם בתיקון סחוס, שאלות לגבי אופי הרקמה המתחדשת הניעו מאמצים לשפר את הפנוטיפ שלהם ולחקור טיפולים אלטרנטיביים³. כונדרופרוגניטורים, המזוהים כתת-אוכלוסייה תאית חדשה יחסית, מראים הבטחה בשל תכונותיהם המזנכימליות הטבועות, כונדרוגנזה מוגברת ותכונות היפרטרופיות מוגבלות¹². שתי הטכניקות העיקריות לקטיף ושיפור אבות כוללות הידבקות דיפרנציאלית של פיברונקטין ובדיקת אקספלנט מבוססת נדידה^18,32. הבידוד של FAA-CPs אנושיים תואר גם באמצעות רקמת מניסקוס, המדווח על פוטנציאל שגשוג ורב-פוטנטי גבוה^16,17. מחקרי אפיון במבחנה המשווים FAA-CPs ו-MCPs לכונדרוציטים מצביעים על פוטנציאל מעולה עבור FAA-CPs ו-MCPs להציג פנוטיפים כונדרוגניים גבוהים יותר והיפרטרופיים נמוכים יותר, המשקפים פרופיל חיובי עם הצטברות וייצור מוגברים של GAG 15,24,31,39. מחקרים מוגבלים in vivo מצביעים על כך שכונדרופרוגניטורים יכולים להחליש את התקדמות דלקת מפרקים ניוונית ולהפגין תוצאות מועילות בתיקון פגמים אוסטאוכונדרליים בשילוב עם פיגומים ביולוגיים. בשנים האחרונות נעשו מאמצי מחקר משמעותיים כדי לשפר ולחשוף את מלוא הפוטנציאל של כונדרופרוגניטורים.

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לבידוד תאים תושבי סחוס. התאים הראשוניים והנפוצים ביותר המשתחררים מהסחוס הם הכונדרוציטים. עם זאת, סחוס מעוכל אנזימטית הוא אוכלוסייה הטרוגנית של תאים המכילה לא רק כונדרוציטים אלא גם אבות בריכוז נמוך מאוד, הדורש העשרה בתנאי מבחנה .

תוך התבוננות בראיות נסיבתיות המצביעות על מעורבותם של תאים אלה בהנעת צמיחה אפוזיטיבית, Dowthwaite et al. לקחו על עצמם את הבידוד והאפיון של כונדרופרוגניטורים. אבות אלה נגזרו מהשכבה השטחית של הסחוס המפרקי באמצעות שימוש בבדיקת הידבקות פיברונקטין¹⁰. אוכלוסייה מובחנת זו הופקה מעגלים עובריים בתהליך הכולל הידבקות סלקטיבית לפיברונקטין. הוכח שיש לו גמישות פנוטיפית ויכולת גבוהה ליצירת מושבות, לצד ביטוי הגן בורר גורל התא Notch-1. מלבד חקירות ראשוניות אלה, אפיון אבות מסחוס מפרקי אנושי חשף רמות גבוהות של ביטוי SOX9 ו-Notch1, העדפה ל-CD49e/CD29, ופעילות מוגברת של טלומראז בהשוואה לכונדרוציטים בוגרים^12,32. פרוטוקול זה נקבע גם ברקמת סחוס אנושית אוסטאוארתריטיס, כאשר דיווחים מראים את נוכחותו לא רק בסחוס השטחי אלא גם בשכבות העמוקות יותר של הסחוס, כאשר קבוצות רבות משתמשות בתרביות רב-שבטיות לתרביות חד-שבטיות^11,12.

מצד שני, קולינג ועמיתיו חקרו את המעורבות הפוטנציאלית של כונדרופרוגניטורים בביות ובנדידה בתגובה לפגיעה בסחוס, ובכך תרמו לתיקון רקמות¹⁸. יתר על כן, Seol ואחרים הראו כי בתגובה לפגיעה בסחוס, אבות הפגינו נדידה מוגברת באמצעות חלבון Box 1 High Mobility Group (HMGB1) וכימוטקסיס מתווך RAGE¹⁹. Elsaesser et al. הבחינו גם ביכולת הנדידה המעולה של כונדרופרוגניטורים באף בהשוואה לכונדרוציטים ו-BM-MSCs²². מחקר שנערך על ידי Joos et al. מצא כי שחרור של גורם גדילה שמקורו בטסיות-BB (PDGF-BB) וגורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF-1) שיפר את הנדידה של כונדרופרוגניטורים, בעוד שאינטרלוקין 1 בטא (IL-1β) וגורם נמק גידול-אלפא (TNFα) עיכבו את תנועת האב לאחר פציעה⁴⁰. לאחרונה נערך דו"ח המשווה ארבע שיטות שונות לבידוד MCP מבחינת שיטות הבידוד ותנאי התרבית שלהן, והשיטה המומלצת מוסברת במאמר זה³³. הגישה של בידוד אבות על סמך יכולות הנדידה שלהם הביאה לתאים שלא רק הפגינו פוטנציאל כונדרוגני גבוה אלא גם הציגו מאפיינים דומים לתאי גזע מזנכימליים.

במעבדה, בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים, הושג בידוד מוצלח של כל שלושת תת-הסוגים. יתר על כן, מחקרים השוואתיים חלוציים הראו את התכונות המעולות של FAA-CPs בהשוואה לכונדרוציטים 12,15,41. השוואות בין כונדרופרוגניטורים נחקרו גם כן, וגילו כי MCPs מציגים פוטנציאל גבוה יותר²⁴. יש לזכור כי מכיוון ששלושת תת-הסוגים מבודדים מאותה רקמה והאב בצורתו המקורית נמוך מאוד בנוכחותו עם השחרור הראשוני מהסחוס המפרקי - המכיל בעיקר כונדרוציטים - יש צורך להעשיר אותם באמצעות תרביות מבחנה.

שיטות הערכה מקיפות כללו מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS), תגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך (RT-PCR), ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים, מחקרי טיטרציה של גורמי גדילה, טכניקות תיוג תאים, אימונופרופיל והערכת הפוטנציאל הטיפולי שלהם לטיפול בדלקת מפרקים ניוונית ומומים כונדרליים באמצעות מודלים in vivo 12,24,42.

הממצאים הנוכחיים מצביעים על כך שבידוד כל שלושת תת-הסוגים אפשרי גם ממפרקים אוסטאוארתריטיס, אם כי דורש משך התרחבות ממושך. יש לציין כי אנו מדגישים את החשיבות של הימנעות מהוספת גורמי גדילה במהלך גדילה משובטת, ומדגישים את הצורך החיוני בהכנסת גורמים נוספים במהלך התרחבות תאים אלה. שלבים מכריעים, כגון תזמון הדגירה על צלחות מצופות פיברונקטין, הוספת גורמי גדילה בנקודות זמן שונות וטיפול מינימלי בצמחים חיצוניים, בין שאר הדברים החיוניים שהוזכרו, ממלאים תפקיד משמעותי בתרבית ובהרחבה של התאים שנקטפו. כמו כן, חיוני להבטיח שהתאים יגיעו למפגש של לא יותר מ-75%-80% בכל נקודת זמן נתונה.

הפוטנציאל של כונדרופרוגניטורים זכה לעניין משמעותי בשל עליונותם על פני טיפולים מבוססי תאים נפוצים בתחום תיקון הסחוס, כלומר BM-MSCs וכונדרוציטים. אבות אלה מראים הבטחה, עם מספר ניסויים in vivo המדגימים את יעילותם בהחלפת סטנדרט הטיפול הנוכחי. כתת-קבוצה שהתגלתה לאחרונה, אפיון ומידע על הפנוטיפ שלהם עדיין בעיצומם, כאשר הניסוי הקליני הראשון המשתמש ב-FAA-CPs לטיפול במומים כונדרליים מתוכנן להתחיל ב-2024. לפיכך, בידוד והרחבה של תאים שמקורם בסחוס, במיוחד כונדרופרוגניטורים, הם חיוניים ומבטיחים לתיקון מבוסס תאים בתחום התחדשות הסחוס.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
להב 22-אזמל	טנדר
צלחת 6 בארות	קורנינג	3516
אלסיאן כחול	THERMO SCIENTIFIC	J6012
אליזרין אדום	SIGMA	130223
אמפוטריצין-B (2 μ גרם/מ"ל).	GIBCO	15240062
חומצה אסקורבית (62 μ גרם / מ"ל)	SIGMA ALDRICH	A4544-25G
BC ציטומטר זרימה CytoFLEX LX	תוכנת BECKMAN	COULTER CYTExpert גרסה 2.5
CaCl2	SIGMA ALDRICH	C34006
CD105-FITC	BD BIOSCIENCE
CD106-APC	BD BIOSCIENCE
CD14-FITC	BD BIOSCIENCE
CD29-APC	BD BIOSCIENCE 559883
CD34-PE	BD BIOSCIENCE 348057
CD45-FITC	BD BIOSCIENCE
CD49b-FITC	מילטניל ביוטק&	nbsp; MACS 130/100337
CD49e-PE	BD BIOSCIENCE
CD73-PE	BD BIOSCIENCE 550257
CD90-PE	BD BIOSCIENCE	561970
מונה תאים	DE NOVIX	Cell Drop BF
מסננת תאים	HIMEDIA	TCP024
צנטריפוגה	בקמן קולטר	אלגרה X-30R
חממת CO2	THERMO SCIENTIFIC	MODEL-371
קולגן מסוג X (COL10A1), גורם שעתוק הקשור ל-Runt (RUNX2), גורם שעתוק SRY-Box 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN) וקולגן מסוג II (COL2A1)	EUROGENTEC, בלגיה
קולגנאז סוג II	WORTHINGTON	LS004176
DMEM F-12 (Dubbecco's Modified Eagle's Medium F-12)	SIGMA ALDRICH	D8900-1L
ELISA קורא צלחות	מכשירים מולקולריים	SpectraMax i3x קורא
מהיר	ירוק FISHER SIENTIFIC	2353459
סרום בקר עוברי	GIBCO	10270106
FGF2	CLOUD CLONE CORP	APA551Hu01
פיברונקטין (10 ומיקרו; L/mL)	SIGMA ALDRICH	F1141
מערכת סינתזה של גדיל ראשון	TAKARA BIO	6110A
Glutamax	GIBCO	35050061
Hematoxylin	QUALIGENS	Q39411
MgCl2	SIGMA ALDRICH	M8787
שמן אדום O	SIGMA	1320065
PBS (מי מלח חוצץ פוספט)	GIBCO	10010023
PCR thermocycler	אפלייד ביוסיסטמס	Quantstudio 12K Flex thermocycler
פניצילין-סטרפטומיצין (100 יחב"ל/מ"ל)	GIBCO	15240062
Picrosirius Red	ALFA AESAR	2610108
נוגדן ראשוני (קולגן עכבר סוג II)	DSHB	DSHB II II6B3
פרונאז	ROCHE	10165913103
מגיב Quant-iT Picogreen dsDNA	THERMO SCIENTIFIC	P7589
מקרר	ELANPRO
RNeasy MiniKit	QIAGEN	74104
Safranin O	QUALIGENS	Q39962
נוגדן משני (נוגדן IgG נגד עכבר עזים, מצומד HRP)	THERMO SCIENTIFIC	31430
אמבט מים רועדים	REMI
StemPro	בקבוק GIBCO	1007201, A1007001 ו-A1007101
T-25	קורנינג	430639
TakyonTM Low Rox SYBR מאסטר מיקס dTTP כחול	EUROGENTEC	UF-LSMT-B0701
TGF ובטא;	ABCAM	ab277760
תרבית רקמות פטרידיש	TARSONS	960010
כחול טולואידין	QUALIGENS	2040
כחול טריפאן	GIBCO	15250061
Trypsin EDTA	GIBCO	25200072