מאמר שיטה

הדמיה של תגובת נזק לדנ"א בתאי Purkinje באמצעות תרביות אורגנוטיפיות במוח הקטן

DOI:

10.3791/67167

⸱

27 בדצמבר 2024

 ,  , 
1The David and Inez Myers Laboratory for Cancer Genetics, Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Faculty of Health and Medical Sciences, School of Medicine, Tel Aviv University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי Purkinje במוח הקטן (PC) רגישים במיוחד לליקויים בתגובת הנזק לדנ"א. פרוטוקול מוצג להערכה חזותית של הדינמיקה של תגובת PC לנזק לדנ"א, הכוללת צביעת שרשראות פולי קשורות לחלבון (ADP-ריבוז) בתוך תרביות אורגנוטיפיות במוח הקטן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי Purkinje במוח הקטן (PC) מציגים יחסי גומלין ייחודיים של קצב חילוף חומרים גבוה, ארכיטקטורת כרומטין ספציפית ופעילות שעתוק נרחבת, מה שהופך אותם לפגיעים במיוחד לנזק ל- DNA. זה דורש תגובת נזק יעילה לדנ"א (DDR) כדי למנוע ניוון המוח הקטן, לעתים קרובות ביוזמת תפקוד לקוי או אובדן של המחשב. דוגמה בולטת היא תסמונת חוסר יציבות הגנום, ataxia-telangiectasia (A-T), המסומנת על ידי דלדול מתקדם של PC והידרדרות המוח הקטן. חקירת מנגנוני DDR במחשבים אישיים חיונית להבהרת המסלולים המובילים לניוון שלהם בהפרעות כאלה. עם זאת, המורכבות של בידוד וטיפוח מחשבים במבחנה מעכבת זה זמן רב את מאמצי המחקר. תרביות אורגנוטיפיות (פרוסות) של המוח הקטן (Murine cerebellar organotypic) מציעות חלופה אפשרית, המחקה באופן הדוק את סביבת הרקמה in vivo . עם זאת, מודל זה מוגבל למדדי DDR הניתנים להדמיה מיקרוסקופית. שכללנו את פרוטוקול התרבית האורגנוטיפית, והראינו כי הדמיה פלואורסצנטית של שרשראות פולי(ADP-ריבוז) הקשורות לחלבונים (PAR), אינדיקטור DDR מהיר ומוקדם, חושפת ביעילות דינמיקת DDR במחשבים אישיים בתוך תרבויות אלה, בתגובה לעקה גנוטוקסית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלמות הדנ"א התאי נמצאת תחת איום מתמיד מצד גורמים מזיקים לדנ"א, בעיקר תוצרי לוואי מטבוליים כמו מיני חמצן תגובתי, הגורמים לעשרות אלפי נגעי דנ"א בכל תא מדי יום1. שמירה מתמדת על יציבות הגנום חיונית להומאוסטזיס תאי 2,3. אבן הפינה של תחזוקה זו היא תגובת נזק לדנ"א (DDR) - רשת איתות מורכבת ושכבתית היוזמת מסלולי תיקון דנ"א ספציפיים תוך התאמה קפדנית של תהליכים תאיים רבים אחרים 4,5. ליקויים ב- DDR מתבטאים בדרך כלל כ"תסמונות אי יציבות גנומית", המסומנות על ידי חוסר יציבות כרומוזומלית, הידרדרות מתקדמת ברקמות, גדילה או התפתחות לקויה, נטייה לסרטן, ורגישות מוגברת לגורמים מסוימים המזיקים ל- DNA 6,7,8,9. יש לציין כי ניוון עצבי, הכולל לעתים קרובות ניוון המוח הקטן, הוא מאפיין מובהק של תסמונות רבות של חוסר יציבות גנומית 7,10,11,12.

הפרעה אוטוזומלית רצסיבית, ataxia-telangiectasia (A-T), היא דוגמה מתועדת היטב של הפרעת חוסר יציבות גנום 13,14,15. מצב זה נובע ממוטציות אפס בגן ATM (A-T, מוטציה), האחראי על קידוד החלבון המרכזי קינאז, ATM, הידוע בעיקר כמנייד DDR בתגובה לשברים דו-גדיליים של DNA (DSBs)16,17. A-T מתבטאת כהפרעה רב מערכתית, המאופיינת בעיקר בניוון המוח הקטן המתקדם, המוביל לליקויים מוטוריים חריפים, כשל חיסוני, ניוון גונדלי, נטייה לסרטן ורגישות קיצונית לקרינה מייננת. תאים בתרבית מאנשים עם A-T מראים חוסר יציבות כרומוזומלית ורגישות מוגברת לחומרים גנוטוקסיים, במיוחד אלה הגורמים ל- DSBs 15,18,19. חשוב לציין כי ל-ATM יש גם תפקיד בתיקון נגעי DNA אחרים, מה שמדגיש את חשיבותו הרחבה בשמירה על יציבות הגנום20,21,22.

למרות מחקר מעמיק על תפקידיו הרבים של ATM, המנגנון הספציפי המוביל לניוון המוח הקטן ב- A-T נותר נושא לדיון פעיל, עם מודלים שונים המוצעים כדי להבהיר תהליך זה 23,24,25,26,27,28,29,30. מודל28 שלנו מציע כי ניוון המוח הקטן בחולי A-T מתחיל עם תפקוד לקוי ובסופו של דבר אובדן של תאי Purkinje (PC). בהתחשב בתפקיד הקריטי של ATM בשמירה על יציבות הגנום לנוכח נזק מתמשך לדנ"א, מחשבים אישיים פגיעים במיוחד להיעדר ATM. אנו מייחסים פגיעות זו לשילוב של הפעילות המטבולית הגבוהה שלהם, מבנה הכרומטין הייחודי ופעילות השעתוק הנרחבת. בסופו של דבר, מוצע כי אובדן תפקוד המחשב, ומכאן, הניוון שלהם, נובע מהשבתה סטוכסטית ופונקציונלית של גנים, תוצאה של הפקת תעתיקים פגומים28.

המחקר של ביולוגיה של PC במעבדה מעוכב על ידי אתגרים בטיפוח מחשבים מבודדים, מכיוון שתאים אלה מסתמכים במידה רבה על הסביבה הטבעית שלהם ועל תאים שכנים להישרדות ולתפקוד, מה שהופך אותם לבלתי תואמים לגידול תרבית מנותקת. עם זאת, מחשבים אישיים יכולים להישאר בני קיימא לפרקי זמן ממושכים בתרביות פרוסות רקמה. תרביות אורגנוטיפיות של המוח הקטן, שהן פרוסות רקמה שמקורן בדרך כלל במכרסמים, שומרות על הארגון המבני של הרקמה ותומכות במניפולציות ניסיוניות שונות המקבילות לאלה האפשריות עם תאים בתרבית. לכן, תרבויות אלה מאפשרות מחקרים במוח הקטן במסגרת מבוקרת 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. באופן ספציפי, בהקשר של A-T, תרבויות אורגנוטיפיות של המוח הקטן הקטן הוכיחו את עצמן כחיוניות בחקר ה- DDR במחשבים עם מחסור ב- ATM 40,41,42,43. בעוד עכברים עם מחסור בכספומט מציגים רק פנוטיפ עדין של המוח הקטן 44,45,46,47, ככל הנראה בשל הבדלים בין הפיזיולוגיה של המוח הקטן האנושי לעכבר, ההנחה היא שתפקידי ATM נשמרים במידה רבה במינים אלה. רעיון זה נתמך על ידי התצפיות שלנו כי התגובה הלקויה ל- DSB DNA במחשבי Atm-/- murine תואמת לזו שנצפתה בסוגי תאים אחרים של מורין ו- ATM/ATM 40,41,42,43.

מגבלה בניתוח תגובות מחשב לגירויים או לחצים שונים בתוך תרבויות אורגנוטיפיות היא הצורך להסתמך על הדמיה מיקרוסקופית לצורך קריאות. ה- DDR נחקר בדרך כלל באמצעות קריאות ביוכימיות בתפזורת, אם כי משתמשים גם בסמנים אימונופלואורסצנטיים נפוצים, כגון מעקב אחר הדינמיקה של היווצרות ורזולוציה של מוקדים גרעיניים של היסטון H2AX זרחני (γH2AX) וחלבון 53BP1, הנחשבים אינדיקטורים של DSBs48,49. מדד רחב יותר הוא הדמיה פלואורסצנטית של היווצרות שרשרת פולי(ADP-ריבוז) (PAR) על חלבונים, תגובה מהירה וחזקה לנזק מוקדם לדנ"א, במיוחד לשבירת גדילים 7,50. שינינו את הפרוטוקול על ידי Komulainen et al.51 עבור צביעת PAR בתרבויות אורגנוטיפיות במוח הקטן. ראינו תגובת PAR בולטת בגרעינים הגדולים של מחשבים אישיים. מוצג כאן הפרוטוקול המעודן שלנו לביסוס תרביות אורגנוטיפיות של המוח הקטן ולדמיון תגובת PAR תחת לחץ גנוטוקסי.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ראה טבלת חומרים לפרטים על חומרים, ציוד ונוגדנים. נהלי בעלי חיים הופעלו על פי הנחיות האתיקה של ועדת האתיקה של אוניברסיטת תל אביב לאחר אישורם. ההליך מתבצע על גורי עכברים בני 10 ימים, ללא קשר למינם. במידת הצורך, גנוטיפ מבוצע ביום הקודם באמצעות ביופסיית זנב ובשיטות סטנדרטיות. התמיסות סטריליות ומאוחסנות בטמפרטורה של 4°C, אלא אם צוין אחרת; ראו טבלה 1.

1. הכנת תרבויות

הערה: יש לבצע את ההליך בסביבה סטרילית ולחטא מראש את משטח העבודה באמצעות אתנול 70%.

  1. הוסף 1 מ"ל של BME לכל באר של צלחות 6 באר. באמצעות מלקחיים סטריליים, הכניסו תרבית תא בודדת לכל באר ודגרו על הלוחות באינקובטור CO2 של 37°C/5% למשך שעתיים לפחות לפני הליך הנתיחה.
  2. הגדר אזור דיסקציה בתוך מכסה מנוע ביולוגי, המכיל את מסוק הרקמות, לוחות תרבית 30 מ"מ, מיקרוסקופ דו-עיני ומקור אור.
  3. לטבול את כלי הניתוח באתנול 70% לאורך כל התהליך. יש להשתמש בכוס שתן מלאה באתנול 70% לטבילה, ובכוס שתן נפרדת עם 1x PBS כדי לשטוף את האתנול לפני השימוש.
  4. עבור כל דיסקציה (כלומר, עבור כל מוח קטן), הכינו שתי צלחות תרבית בקוטר 30 מ"מ מלאות בתווך דיסקציה קר והשאירו אותן על קרח.
  5. רססו את בעל החיים באתנול 70%.
  6. בעזרת מספריים חדים, ערפו במהירות את ראשה של החיה. כדי לחשוף את המוח, לעשות חתך קטן עם מספריים הרחק המוח הקטן. בעזרת פינצטה עם קצוות מעוגלים, לקלף בעדינות את הגולגולת. הסר את הגולגולת בחתיכות קטנות כדי למנוע פגיעה ברקמת המוח הקטן.
  7. העבר מיד את המוח למדיום דיסקציה קר או הסר ישירות את המוח הקטן מתוך הגולגולת. כדי לעשות זאת, לחשוף את המוח הקטן ולהפריד את קליפת המוח הקטן מגזע המוח על ידי ניתוק שלושת זוגות הפדונקים, באמצעות מרית קשתית מעוקלת עדינה. כדי לזהות את הפדונקים, מבט מרוסטרל לקאודל: זוג הפדונקלים הצרבלריים העליונים מחברים את המוח התיכון לכל צד של המוח הקטן; הפדונקים הצרבלריים האמצעיים הזוגיים מחברים את הפונס לכל צד של המוח הקטן; וצמד הפדונקלים הצרבלריים הנחותים מתחברים למדולה לכל צד של המוח הקטן. ברגע שהמוח הקטן גלוי, הפרידו אותו מהמוח באמצעות אותה מרית: החליקו את המרית בין המוח הקטן, הקוליקולוס העליון וגזע המוח.
    הערה: אל תעשו מאמץ מיוחד להסיר את קרומי המוח מכיוון שהם מתנתקים בקלות לאחר חיתוך המוח הקטן.
  8. מניחים את מסוק הרקמה לעובי פרוסה של 350 מיקרומטר.
  9. לפני מיקום המוח הקטן על בסיס המסוק, יש להסיר את חיץ הניתוח העודף מהרקמה. זה ישפר את היצמדות הרקמה לבסיס המסוק.
  10. מקם את המוח הקטן על פלטפורמת חיתוך בכיוון אנכי ולבצע חיתוך parasagittal בעובי פרוסה של 350 מיקרומטר. מפרידים בעדינות את הפרוסות בעזרת מרית קשתית עדינה ומכניסים אותן לדיסקציה קרה.
  11. מעבירים את הרקמה החתוכה בחזרה למאגר דיסקציה קר טרי. השתמש בקצה של 1,000 μL כדי להנחות בעדינות את פרוסות הרקמה לתוך הצלחת המכילה חיץ דיסקציה קר.
  12. מתחת למשקפת השתמשו בשתי מריות קשתית מעוקלות כדי להפריד בזהירות את פרוסות הרקמה זו מזו. עבור תרביות, להשתמש פרוסות נגזר vermis cerebellar הממוקם באזור קורטיקו-גרעיני מדיאלי של האיבר.
  13. מעבירים כל פרוסת רקמה לתוספת תרבית בעזרת מרית רחבה ומעבירים כל תוספת נושאת פרוסת רקמה לבאר בצלחות 6 בארות המכילות את התווך שחומם מראש. השאירו את הצלחות באינקובטור.
  14. מחליפים את המדיום אחת ליומיים: שואפים את המדיום המשומש באמצעות פיפטת זכוכית סטרילית, ועם פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, מוסיפים 1 מ"ל MBE טרי כשקצה הפיפטה נשען על דופן הבאר. יש להקפיד לא לכוון את זרימת התווך אל הרקמה.
    הערה: פרוסת הרקמה תציג מראה דמוי דלקת במשך 5-7 הימים הראשונים בתרבית ותהיה מוכנה לניסויים ברגע שהתופעה תיעלם ועד שבועיים לאחר הקמת התרבית.

2. טיפול בחומרים מזיקים לדנ"א, קיבוע, צביעה והדמיה מיקרוסקופית

  1. הוסיפו כימיקלים מזיקים לדנ"א ישירות למדיום התרבית בריכוזים סופיים מתאימים, לפרקי זמן קבועים מראש. לאחר תקופת החשיפה, הסר את הכימיקלים על ידי החלפת המדיום במדיום תרבית טרי.
  2. אם קריאת ה- DDR כוללת צביעת PAR, הוסף מעכב של פולי(ADP-ריבוז) גליקוהידרולאז (PARG) למדיום התרבית בריכוז סופי של 10 מיקרומטר, 30 דקות לפני הקיבוע.
    הערה: טיפול זה הוא קריטי מכיוון ששינוי ה- PAR הוא קצר מועד ומתפרק ברציפות על ידי PARG.
  3. מיד לפני הקיבוע, לשאוף את המדיום ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של 0.1 M חיץ פוספט בטמפרטורת החדר.
    הערה: חיץ קר עלול לגרום לניתוק פרוסות הרקמה מהעלון.
  4. תקן מיד את הפרוסות על ידי החלפת החיץ בתערובת אצטון:מתנול מקוררת מראש (-20°C) (1:1) כך שפרוסת הרקמה תהיה שקועה בתערובת זו והשאר למשך 20 דקות בטמפרטורה של -20°C.
    הערה: ניתן לעצור בשלב זה ולהמשיך עם immunostaining מאוחר יותר. כדי לעשות זאת, לשטוף את הרקמות 3x עם חיץ פוספט 0.1 M מקורר מראש ל 4 ° C, לוודא את הרקמה שקועה בחיץ. ניתן לאחסן רקמות כעת במאגר פוספט 0.1M למשך עד שבועיים ב-4°C.
  5. מעבירים את פרוסת הרקמה לבאר בצלחת של 48 בארות.
  6. השתמש באזמל וקרש חיתוך כדי להסיר את שולי העלון, תוך חיתוך סביב פרוסת הרקמה. מניחים כל פרוסה בבאר של צלחת בת 48 בארות. הוסף 100 μL של חיץ פוספט 0.1 M.
  7. לחדירה, שואפים את החיץ, מוסיפים לבאר 100 μL של חיץ פוספט 0.1 M המכיל 1% Triton X-100, ומשאירים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. שאפו את התמיסה והוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת (ראו טבלה 1) לכל באר. יש לנער בעדינות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
  9. במהלך שלב החסימה, דלל את הנוגדן העיקרי או מגיב אנטי PAR (1:800) בתמיסת החסימה.
  10. הסר את הפתרון החוסם (אין צורך לשטוף) ולהוסיף 100 μL של תערובת נוגדנים ראשונית לכל באר. יש למרוח ניעור עדין במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  11. לדלל את הנוגדנים המשניים במאגר פוספט 0.1M המכיל 0.2% Triton X-100 (1:500) תוך מזעור חשיפתם לאור.
  12. יש לשאוף את תמיסת הנוגדנים הראשונית ולשטוף את הפרוסות 3X5 דקות עם חיץ פוספט באורך 0.1 מ' המכיל 0.2% טריטון X-100, בטמפרטורת החדר, תוך ניעור עדין.
  13. החלף את תמיסת השטיפה ב- 100 μL של תמיסת נוגדנים משנית (דילול 1:500). ממשיכים לנער בעדינות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחושך (מכסים את הצלחות ברדיד אלומיניום).
  14. כדי להכין תמיסת DAPI, דלל את תמיסת המלאי (2 מ"ג/מ"ל) ל-1 מיקרוגרם/מ"ל ב-1x PBS.
  15. עשרים דקות לפני תום הדגירה של שעתיים עם הנוגדן המשני, מוסיפים 20 מיקרוליטר של תמיסת DAPI הסופית לכל באר וממשיכים לרעוד במשך 20 דקות. שאפו את הנוזל ושטפו עם תמיסת הכביסה במשך 3X5 דקות בניעור עדין.
  16. להרכבה, הניחו את הרקמה על שקופית זכוכית במיקרוסקופ כשהרקמה פונה כלפי מעלה, הוסיפו אמצעי הרכבה וכסו בזכוכית כיסוי. הניחו את המגלשות על משטח ישר והניחו להן להתייבש למשך הלילה בחושך, בטמפרטורת החדר (הימנעו משימוש באמצעי הרכבה המכיל DAPI למניעת טשטוש).
  17. אחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4°C בקופסה אטומה לאור.
  18. צלם תמונות מיקרוסקופיות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ומסננים מתאימים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מדגים את המראה הכללי של התרבויות האורגנוטיפיות במוח הקטן. השורה העליונה באיור 1A מראה את עלווה המוח הקטן, אשר נשמרת בתרבית, בעוד שהשורה התחתונה מראה את המחשבים המוכתמים עבור Calbindin D-28k (ירוק) ואת הגרעינים העצביים מוכתמים עבור NeuN (אדום). באיור 1B, האסטרוציטים במחשבים האישיים (באדום) מוכתמים עבור GFAP (ירוק), חלבון ביניים מסוג III. איור 2 ואיור 3 מראים את צביעת ה-PAR שנצפתה לאחר טיפול בתרביות האלה בשני חומרים מזיקים לדנ"א, שניהם מחמצנים חזקים: אשלגן ברומט (ריכוז סופי של 10 מילימטר למשך 12 שעות) ופרקוואט. תגובת PAR סומנה במחשבים שטופלו בעלווה המוח הקטן בהשוואה לקבוצת הביקורת.

figure-results-1
איור 1: סקירה כללית של תרביות אורגנוטיפיות של המוח הקטן (murine cerebellar organotypic). (A) השורה העליונה מדגימה את העלווה של המוח הקטן, שנשמרת בתרבית. השורה התחתונה מתמקדת בשכבת המחשב. מחשבים מסומנים על-ידי Calbindin D-28k (ירוק). צביעת NeuN (באדום) מזהה גרעינים עצביים על פני השכבות. (B) מבט מקרוב על מחשבים אישיים (אדום). GFAP (ירוק), חלבון נימה בינוני מסוג III, אשר מדגיש אסטרוציטים. פסי קנה מידה = 968.8 מיקרומטר (A, שורה עליונה), 42.1 מיקרומטר (A, שורה שנייה), 72.7 מיקרומטר (B, שורה עליונה), 18.2 מיקרומטר (B, שורה שנייה). קיצורים: PC = תאי Purkinje; GFAP = חלבון גליה פיברילרי חומצי; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: צביעת PAR בפרוסה צרבלרית שטופלה באשלגן ברומט. פרוסת המוח הקטן טופלה באשלגן ברומט (KBrO3) - חומר מחמצן רב עוצמה, בריכוז סופי של 10 מילימטר למשך 12 שעות. פסי קנה מידה = 775 מיקרומטר. קיצורים: PAR = poly(ADP-ribose); DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תגובת PAR בפרוסות המוח הקטן שנחשפו לפרקוואט, יצרן חזק של אניונים סופראוקסידים. (A) מבט כללי על עלווה צרבלרית. שים לב לתגובת PAR החזקה, במיוחד במחשבים בהשוואה לפקד. (B) בחינה מדוקדקת יותר מראה את תגובת ה-PAR במחשבים אישיים ובסוגי תאים אחרים. פסי קנה מידה = 193.8 מיקרומטר (A), 18.2 מיקרומטר (B). קיצורים: PAR = poly(ADP-ribose); DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פתרונות ומאגרים
תמיסה  מרכיבים
אמצעי דיסקציהתמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) המכילה 0.5% D-גלוקוז. הוסף 0.5 מ"ל של 50% תמיסת D-גלוקוז ל- 50 מ"ל של HBSS ללא Mg2+ ו- Ca2+.
מדיום תרבות BMEערבבו 100 מ"ל של Basal Medium Eagle (BME) המכיל פנול אדום אך לא L-גלוטמין או HEPES, עם 50 מ"ל HBSS עם פנול אדום, 50 מ"ל של סרום סוס מומת חום, 2 מ"ל של 50% D-גלוקוז, ו-1 מ"ל של 200 מילימול L-גלוטמין. יש לערבב ולסנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר בסביבה סטרילית. יש לאחסן ב-4°C
פתרון חוסם עבור immunostainingבחיץ פוספט 0.1 מטר: יש להוסיף 0.5% טריטון X-100, 10% סרום עיזים
מאגר דילול נוגדנים משניחיץ פוספט 0.1 מטר, 0.2% טריטון X-100
חיץ כביסהחיץ פוספט 0.1 מטר, 0.2% טריטון X-100
פתרון קיבועActenoe:מתנול (1:1 v:v)
פתרון חדירהחיץ פוספט 0.1 מטר, 1% טריטון X-100
פתרון DAPIתמיסת מלאי (2 מ"ג/מ"ל) מדוללת ל-1 מיקרוגרם/מ"ל ב-1x PBS
מאגר פוספטיםהכינו שתי נפשות א' ו-ב' (ראו להלן). ערבבו תמיסות בהתאם ליחסים המפורטים להלן ליצירת חיץ פוספט של 0.2 M. לאחר מכן דלל את הפתרון 0.2M עם DDW (1: 1) כדי ליצור חיץ פוספט 0.1M (פתרון עבודה).
פתרון A (עבור 0.2 מטר)12 גרם נתרן פוספט מונובייסיק נטול מים (Na2HPO4 FW 141.96)
500 מ"ל של DDW
פתרון B (עבור 0.2 מטר)14.2 גרם נתרן פוספט דיאבייסיק נטול מים (Na2HPO4 FW 141.96)
500 מ"ל של DDW
פתרונות מעורבים לייצור 0.2 מ 'הכן 1 L: 230 מ"ל של פתרון A ו 770 מ"ל של פתרון B
חיץ פוספט 0.1 מטרלדלל את התמיסה המעורבת עם DDW (1:1)

טבלה 1: פתרונות והרכבם.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערות כלליות
היתרון העיקרי של מערכת התרבית האורגנוטיפית הוא שהיא מאפשרת מחקרים באמצעות רקמת קליפת המוח הקטן, ומשמרת את הארגון המבני שלה במשך מספר שבועות במערך צלחת התרבית. מערכת זו שימושית לביצוע ניתוחים מורפולוגיים מעמיקים של תאי Purkinje (PC), כולל בדיקות מפורטות של עמוד השדרה הדנדריטי ותכונות אולטרה-מבניות 52,53,54,55,56,57,58,59. התצפיות שלנו מצביעות על כך שתגובת הנזק לדנ"א (DDR) פעילה במיוחד במחשבים אישיים בתוך תרבויות אלה. עם זאת, מגבלותיה העיקריות של מערכת זו כוללות את משך השימוש המוגבל בה ואת הסתמכותה על הדמיה מיקרוסקופית לניטור תהליכים תאיים, מה שמדגיש את הצורך המתמשך לפתח או להתאים טכניקות הדמיה מתאימות.

מילת אזהרה נוספת נוגעת לחלק הקטן המנותח לצורך הכנת פרוסות הרקמה. ראינו כי אונות צרבלריות שונות יכולות להניב תרביות עם ארגון פנימי שונה במידה ניכרת ואיכות כוללת. לכן, אנו מעדיפים להקים תרבויות מפרוסות המתקבלות דרך חלקים midsagittal של vermis cerebellar. בפרוסות אלה, הפוליה של קליפת המוח הקטן נראית בנוחות.

מומלץ להשתמש בפרוסות רקמה המתקבלות מוורמיס המוח הקטן, המציגות את העלווה האופיינית של קליפת המוח הקטן. פרוסות אלה שומרות על המבנה הארגוני שלהן בתרבות במשך מספר שבועות. כמו כן, מומלץ להתחיל בהליכי ניסוי עם התרביות כ-7-12 ימים לאחר ההקמה. ניסוי טיפוסי שנועד להעריך את תגובת הנזק לדנ"א בתרבויות אלה כרוך בהתחלת נזק על ידי קרינה או על ידי הוספת כימיקלים המזיקים לדנ"א למדיום התרבית. לאחר מכן, קיבוע רקמות והכתמה מבוצעים במרווחי זמן שונים. כדי להעריך את ההתאוששות מנזק כימי, נכללת תקופת דגירה בתווך טרי. מומלץ ליזום ניסויים ארוכי טווח בהזדמנות המוקדמת ביותר, באופן אידיאלי סביב 7 ימים לאחר הקמת התרבות.

התרביות האורגנוטיפיות של המוח הקטן נשמרות בתווך נטול אנטיביוטיקה; לכן, שמירה על סביבה סטרילית במהלך הקמתם היא הכרחית. גיל הגורים מהם נקצרים הצרבלה הוא קריטי, עם טווח מומלץ של 9-12 ימים. טווח גילאים זה הוא אופטימלי מכיוון שקליפת המוח הקטן מפותחת מספיק לחתך. יש לציין כי אצל בעלי חיים מבוגרים, הרקמות נוטות להיצמד ללהב. חשוב לשמור על המוח הקטן שקוע בתמיסת דיסקציה קרה עד לנתיחה.

במהלך 5-7 הימים הראשונים בתרבית, פרוסות הרקמה עשויות להציג סימנים המזכירים דלקת, המאופיינים בנפיחות ושינוי צבע חלבי. תכונות אלה עשויות להשפיע על מדידת פרמטרים פיזיולוגיים ועל היעילות של טכניקות immunostaining.

מומלץ מאוד לא לחתוך את המוח הקטן דק יותר מ 350 מיקרומטר כדי למנוע חוסר עקביות בעובי במהלך החיתוך. יש לזכור כי רקמה של פרוסה של 350 מיקרומטר נעשית דקה הרבה יותר לאחר 7 ימים בתרבית לסביבות 90 מיקרומטר (בהתבסס על מדידת ערימת Z).

כאן, אנו מציגים צביעת PAR 7,50 לערכת הכלים המשמשת לחקר DDR במחשבים אישיים. קריאה זו מהירה, רגישה ולוכדת את האופי הדינמי של ה- DDR, והוכחה כשימושית במיוחד בניתוח שלנו של ה- DDR במחשבים מסוג פראי וחסר כספומט. הפרוטוקולים המתוארים כאן צריכים להיות מועילים במיוחד לחוקרים החוקרים תסמונות אי-יציבות גנומיות המשפיעות על המוח הקטן.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים הקשורים למחקר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה במעבדה שלנו נתמכת על ידי הקרן למחקר רפואי ע"ש ד"ר מרים ושלדון ג. אדלסון והאגודה הישראלית למאבק במחלת A-T.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>מגיב וציוד
150 x 30 ס"מ צלחת פטריקורנינג בע"מ.3261
35 x 10 מ"מ צלחת פטריקורנינג בע"מ3294
אצטוןInvitrogen25030081
אצטוןסיגמא-אולדריץ'270725-1L
שקופיות מיקרוסקופ דבקMarienfeld4818776 x 26 x 1 מ"מ
להבים למסוקTED PELLAדגם TC752-1  סכיני גילוח מסוגננים
BMEGIBCO41010-026 500 מ"ל. ללא L-Glut
תרבית תאים מוסיפהMillipore
Biological Indo.02-015-1A
HBSS w/o פנול אדוםסיגמא-אולדריץ'H-1138-500Lללא Ca+, ללא Mg+
HBSS עם פנול אדוםSartorius02-015-1A
סרום סוסים GIBCO26050088איריס מושבתים בחום
CellPathGZX-0100-00A130 מ"מ קהה
מרית איריסFST 10092-12
L-גלוטמין (200 מ"מ)Gibco41010026
מתנולסיגמא-אולדריץ'322412-1L
מתנול סיגמא-אולדריץ'G5767
מיקרוסקופאולימפוס
מדיום הרכבה ללאGRIGENE. בע"מ, ישראלK239320A
ParaquatSigma-Aldrich856177-250MGParaquat dichloride (מתיל ויולוגן)
PARG- מעכב גליקוהידרולאז פולי (ADP-ריבוז)Tocris Bioscience, בריטניהPDD 00017273רגיש לאור 
מאגר פוספטאינדו ביולוגי.02-018-1A
מספריים, רקמת
צלחות שש בארותקורנינג משולבCLS3516
דיסקי חיתוך רזרביים TED PELLAדגם 10180-01
קוצץ רקמותMcIlwainדגם TC75210180-220
פינצטה, כוסות שתן מחודדות
חזקות
>נוגדנים
Alexa fluor 488 חמור אנטי ארנב IgG 
Invitrogen		A212061:500; ab משני; מאגר דילול משני;   דגירה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר
פרוטיאן חומצי סיבי אנטי גליאליMilliphoreMAB34021:1500; ab ראשוני; חסימה; מארח:עכבר
Anti-calbindin-D-28KSwant CB3001:2000; ab ראשי; חסימה; מנחה: rabbit 
אנטי-קלבינדין-D-28KSwantCB-38a1:2000; ab ראשוני; חסימה 
מגיב אנטי-פאן-ADP-ריבוזMilliphoreMABE10161:800; ab ראשוני; חסימה; דגירה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)איתות תאים40841:1000; מאגר דילול משני; דגירה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר
PICM0RG50-D-Glucose מלקחיים משוננת עור<

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
  2. Negrini, S., Gorgoulis, V. G., Halazonetis, T. D. Genomic instability--an evolving hallmark of cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (3), 220-228 (2010).
  3. De Almeida, L. C., Calil, F. A., Machado-Neto, J. A., Costa-Lotufo, L. V. DNA damaging agents and DNA repair: From carcinogenesis to cancer therapy. Cancer Genet. 252-253, 6-24 (2021).
  4. Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: Three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a012724(2013).
  5. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair, and mutagenesis. Environ Mol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).
  6. Taylor, A. M. R., et al. Chromosome instability syndromes. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 64(2019).
  7. Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair and human genetic disease. Trends Cell Biol. 32 (9), 733-745 (2022).
  8. Tiwari, V., Wilson, D. M. 3rd DNA damage and associated DNA repair defects in disease and premature aging. Am J Hum Genet. 105 (2), 237-257 (2019).
  9. Rieckher, M., Garinis, G. A., Schumacher, B. Molecular pathology of rare progeroid diseases. Trends Mol Med. 27 (9), 907-922 (2021).
  10. Qing, X., Zhang, G., Wang, Z. Q. DNA damage response in neurodevelopment and neuromaintenance. FEBS J. 290 (13), 3300-3310 (2023).
  11. Scheijen, E. E. M., Wilson, D. M. 3rd Genome integrity and neurological disease. Int J Mol Sci. 23 (8), (2022).
  12. Welch, G., Tsai, L. H. Mechanisms of DNA damage-mediated neurotoxicity in neurodegenerative disease. EMBO Rep. 23 (6), e54217(2022).
  13. Perlman, S. L., Boder Deceased, E., Sedgewick, R. P., Gatti, R. A. Ataxia-telangiectasia. Handb Clin Neurol. 103, 307-332 (2012).
  14. Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: A review. Orphanet J Rare Dis. 11 (1), 159(2016).
  15. Amirifar, P., Ranjouri, M. R., Yazdani, R., Abolhassani, H., Aghamohammadi, A. Ataxia-telangiectasia: A review of clinical features and molecular pathology. Pediatr Allergy Immunol. 30 (3), 277-288 (2019).
  16. Shiloh, Y., Ziv, Y. The atm protein kinase: Regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (4), 197-210 (2013).
  17. Lee, J. H., Paull, T. T. Cellular functions of the protein kinase atm and their relevance to human disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (12), 796-814 (2021).
  18. Taylor, A. M., et al. Ataxia telangiectasia: A human mutation with abnormal radiation sensitivity. Nature. 258 (5534), 427-429 (1975).
  19. Shiloh, Y., Tabor, E., Becker, Y. Cellular hypersensitivity to neocarzinostatin in ataxia-telangiectasia skin fibroblasts. Cancer Res. 42 (6), 2247-2249 (1982).
  20. Shiloh, Y. Atm: Expanding roles as a chief guardian of genome stability. Exp Cell Res. 329 (1), 154-161 (2014).
  21. Shiloh, Y., Lederman, H. M. Ataxia-telangiectasia (a-t): An emerging dimension of premature ageing. Ageing Res Rev. 33, 76-88 (2017).
  22. Geng, A., et al. Sirt2 promotes base excision repair by transcriptionally activating ogg1 in an atm/atr-dependent manner. Nucleic Acids Res. 52 (9), 5107-5120 (2024).
  23. Biton, S., Barzilai, A., Shiloh, Y. The neurological phenotype of ataxia-telangiectasia: Solving a persistent puzzle. DNA Repair (Amst). 7 (7), 1028-1038 (2008).
  24. Kanner, S., et al. Astrocytes restore connectivity and synchronization in dysfunctional cerebellar networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (31), 8025-8030 (2018).
  25. Song, X., Ma, F., Herrup, K. Accumulation of cytoplasmic DNA due to atm deficiency activates the microglial viral response system with neurotoxic consequences. J Neurosci. 39 (32), 6378-6394 (2019).
  26. Levi, H., et al. Dysfunction of cerebellar microglia in ataxia-telangiectasia. Glia. 70 (3), 536-557 (2022).
  27. Bourseguin, J., et al. Persistent DNA damage associated with atm kinase deficiency promotes microglial dysfunction. Nucleic Acids Res. 50 (5), 2700-2718 (2022).
  28. Shiloh, Y. The cerebellar degeneration in ataxia-telangiectasia: A case for genome instability. DNA Repair (Amst). 95, 102950(2020).
  29. Lai, J., et al. Atm-deficiency-induced microglial activation promotes neurodegeneration in ataxia-telangiectasia. Cell Rep. 43 (1), 113622(2024).
  30. Woolley, P. R., et al. Regulation of transcription patterns, poly(adp-ribose), and rna-DNA hybrids by the atm protein kinase. Cell Rep. 43 (3), 113896(2024).
  31. Santos, G., Barateiro, A., Brites, D., Fernandes, A. S100b impairs oligodendrogenesis and myelin repair following demyelination through rage engagement. Front Cell Neurosci. 14, 279(2020).
  32. Iskusnykh, I. Y., Fattakhov, N., Buddington, R. K., Chizhikov, V. V. Intrauterine growth restriction compromises cerebellar development by affecting radial migration of granule cells via the jamc/pard3a molecular pathway. Exp Neurol. 336, 113537(2021).
  33. Gehmeyr, J., et al. Disabling vegf-response of purkinje cells by downregulation of kdr via mirna-204-5p. Int J Mol Sci. 22 (4), 2173(2021).
  34. Wolters, A., et al. Teriflunomide provides protective properties after oxygen-glucose-deprivation in hippocampal and cerebellar slice cultures. Neural Regen Res. 16 (11), 2243-2249 (2021).
  35. Gorter, R. P., Dijksman, N. S., Baron, W., Colognato, H. Investigating demyelination, efficient remyelination and remyelination failure in organotypic cerebellar slice cultures: Workflow and practical tips. Methods Cell Biol. 168, 103-123 (2022).
  36. Lamoureux, L., et al. Non-productive infection of glial cells with sars-cov-2 in hamster organotypic cerebellar slice cultures. Viruses. 14 (6), 1218(2022).
  37. Frontzek, K., et al. A conformational switch controlling the toxicity of the prion protein. Nat Struct Mol Biol. 29 (8), 831-840 (2022).
  38. Tellios, V., Maksoud, M. J. E., Nagra, R., Jassal, G., Lu, W. Y. Neuronal nitric oxide synthase critically regulates the endocannabinoid pathway in the murine cerebellum during development. Cerebellum. 22 (6), 1200-1215 (2023).
  39. Schroder, L. J., et al. Polysialic acid promotes remyelination in cerebellar slice cultures by siglec-e-dependent modulation of microglia polarization. Front Cell Neurosci. 17, 1207540(2023).
  40. Tzur-Gilat, A., Ziv, Y., Mittelman, L., Barzilai, A., Shiloh, Y. Studying the cerebellar DNA damage response in the tissue culture dish. Mech Ageing Dev. 134 (10), 496-505 (2013).
  41. Tal, E., et al. Inactive atm abrogates dsb repair in mouse cerebellum more than does atm loss, without causing a neurological phenotype. DNA Repair (Amst). 72, 10-17 (2018).
  42. Tal, E., Shiloh, Y. Monitoring the atm-mediated DNA damage response in the cerebellum using organotypic cultures. Methods Mol Biol. 1599, 419-430 (2017).
  43. Dar, I., et al. Investigation of the functional link between atm and nbs1 in the DNA damage response in the mouse cerebellum. J Biol Chem. 286 (17), 15361-15376 (2011).
  44. Barlow, C., et al. Atm-deficient mice: A paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86 (1), 159-171 (1996).
  45. Elson, A., et al. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (23), 13084-13089 (1996).
  46. Xu, Y., et al. Targeted disruption of atm leads to growth retardation, chromosomal fragmentation during meiosis, immune defects, and thymic lymphoma. Genes Dev. 10 (19), 2411-2422 (1996).
  47. Borghesani, P. R., et al. Abnormal development of purkinje cells and lymphocytes in atm mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (7), 3336-3341 (2000).
  48. Rahmanian, N., Shokrzadeh, M., Eskandani, M. Recent advances in gammah2ax biomarker-based genotoxicity assays: A marker of DNA damage and repair. DNA Repair (Amst). 108, 103243(2021).
  49. Furia, L., Pelicci, S., Scanarini, M., Pelicci, P. G., Faretta, M. From double-strand break recognition to cell-cycle checkpoint activation: High content and resolution image cytometry unmasks 53bp1 multiple roles in DNA damage response and p53 action. Int J Mol Sci. 23 (17), 10193(2022).
  50. Duma, L., Ahel, I. The function and regulation of adp-ribosylation in the DNA damage response. Biochem Soc Trans. 51 (3), 995-1008 (2023).
  51. Komulainen, E., et al. Parp1 hyperactivity couples DNA breaks to aberrant neuronal calcium signalling and lethal seizures. EMBO Rep. 22 (5), e51851(2021).
  52. Hendelman, W. J., Aggerwal, A. S. The purkinje neuron: I. A golgi study of its development in the mouse and in culture. J Comp Neurol. 193 (4), 1063-1079 (1980).
  53. Aggerwal, A. S., Hendelman, W. J. The purkinje neuron: Ii. Electron microscopic analysis of the mature purkinje neuron in organotypic culture. J Comp Neurol. 193 (4), 1081-1096 (1980).
  54. Hendelman, W. J., Jande, S. S., Lawson, D. E. Calcium-binding protein immunocytochemistry in organotypic cultures of cerebellum. Brain Res Bull. 13 (1), 181-184 (1984).
  55. Seil, F. J., Herndon, R. M., Tiekotter, K. L., Blank, N. K. Reorganization of organotypic cultures of mouse cerebellum exposed to cytosine arabinoside: A timed ultrastructural study. J Comp Neurol. 313 (2), 193-212 (1991).
  56. Tauer, U., Volk, B., Heimrich, B. Differentiation of purkinje cells in cerebellar slice cultures: An immunocytochemical and golgi em study. Neuropathol Appl Neurobiol. 22 (4), 361-369 (1996).
  57. Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. J Vis Exp. (61), 3637(2012).
  58. Sherkhane, P., Kapfhammer, J. P. The plasma membrane ca2+-atpase2 (pmca2) is involved in the regulation of purkinje cell dendritic growth in cerebellar organotypic slice cultures. Neural Plast. 2013, 321685(2013).
  59. Sherkhane, P., Kapfhammer, J. P. Chronic pharmacological blockade of the na(+) /ca(2+) exchanger modulates the growth and development of the purkinje cell dendritic arbor in mouse cerebellar slice cultures. Eur J Neurosci. 46 (5), 2108-2120 (2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Ataxia TelangiectasiaATM DeficiencyFluorescent ImagingPoly ADP RiboseGenome InstabilityProtein CorrelationCalbindin Staining

מאמרים קשורים