פיתוח מערכת פרוטופלסט כרוב לחקר סבילות להיפוקסיה בברסיקה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר מערכת פרוטופלסט יעילה של מזופיל כרוב. נבדקו טיפולים שונים למחסור בחמצן, והמערכת הראתה שפעול גבוה של גנים המגיבים להיפוקסיה, מה שאפשר מחקרים על המנגנונים הגנטיים והמולקולריים של עמידות להצפה בירקות Brassicaceae .

תקציר

ככל ששינויי האקלים מביאים גשמים כבדים יותר, כרוב, ירק מפתח של Brassicaceae , מתמודד עם הפסדי יבול משמעותיים עקב לחץ היפוקסיה הנגרם על ידי הצפות. כדי לזהות מנגנונים של עמידות להצפה בכרובים, יש צורך בפלטפורמה רב-תכליתית למחקרים פונקציונליים גנטיים כדי להתגבר על טבעם הסרבן של הכרובים. במחקר זה פותחו מערכת ביטוי חולפת של פרוטופלסט כרוב ופרוטוקול אינדוקציה מקביל של היפוקסיה פרוטופלסט. פרוטוקול זה השיג תפוקה גבוהה ושלמות של בידוד פרוטופלסטים מעלי כרוב, עם יעילות טרנספקציה העולה על 40% באמצעות תנאים אנזימטיים אופטימליים. כדי להקל על השפעה היפוקסית פוטנציאלית לפני הטיפולים, תמיסת W5 בעבעה עם גז חמצן כדי להעלות את רמות החמצן המומס. נבדקו מספר כימיקלים להתאמת רמות החמצן וטיפולים פיזיולוגיים לסילוק חמצן, כולל EC-Oxyrase, OxyFluor, נתרן סולפיט וחבילת סופגי חמצן. בדיקות לוציפראז כפול הראו כי מקדמי הגנים לתגובת נשימה אנאירובית BoADH1 ו- BoSUS1L הופעלו בפרוטופלסטים של כרוב לאחר טיפולי היפוקסיה, כאשר רמת האינדוקציה הגבוהה ביותר נצפתה לאחר הטיפול בחבילת סופג החמצן. לסיכום, מערכת הביטוי הארעית פרוטופלסט כרוב בשילוב טיפול בהיפוקסיה מדגימה פלטפורמה יעילה ונוחה. פלטפורמה זו יכולה להקל על מחקרים של תפקוד גנים ומנגנונים מולקולריים הקשורים לתגובות היפוקסיה בכרובים.

מבוא

שינויי האקלים העולמיים החריפו את השיטפונות, שהפכו לנושא קריטי יותר ויותר ברחבי העולם. בעשורים האחרונים אנו עדים למגמת עלייה בתדירות אירועי השיטפונות, וכתוצאה מכך הפסדי יבול משמעותיים ^1,2. כרוב (Brassica oleracea var. capitata L.), ירק בעל חשיבות עולמית משמעותית, רגיש להשפעות השליליות של גשמים כבדים, המחייבים פיתוח של זני כרוב עמידים לשיטפונות כדי להבטיח ייצור בר קיימא לנוכח אירועי מזג אוויר קיצוניים. לכן, הבנת המנגנונים המולקולריים הקשורים לעקה הצפה בכרוב חיונית כדי לעמוד באתגר זה.

כדי להבין מנגנוני ויסות גנים בצמחים בתנאים שקועים, קווים טרנסגניים נמצאים בשימוש נרחב עבור מחקרים פונקציונליים גנטיים. עם זאת, גישה זו מוגבלת על ידי עלויות גבוהות, טרנספורמציה עתירת זמן ותהליכי תת-תרבות, כמו גם יעילות טרנספורמציה נמוכה במינים רבים של יבולים, המחייבת פיתוח מתודולוגיות חלופיות. מערכות ביטוי ארעיות מבוססות פרוטופלסטים יושמו באופן נרחב במחקר המולקולרי של הצמח כחלופה רב-תכליתית ויעילה. מערכות אלה מאפשרות לחקור את פעילות המקדם, מסלולי איתות בתגובה לרמזים סביבתיים, אינטראקציות חלבון-חלבון או חלבון-דנ"א, ולוקליזציה תת-תאית³. הקמת מערכות ביטוי ארעיות פרוטופלסטיות דווחה לא רק בצמחי מודל ^4,5 אלא גם בגידולים חשובים מבחינה כלכלית כגון קנה סוכר⁶, ציפורן⁷, סחלבי פלאנופסיס ⁸ וחציל⁹. יתר על כן, מערכות אלה יושמו בהצלחה בצמחים עציים, כולל Camellia oleifera¹⁰ו- Populus trichocarpa¹¹. עם זאת, הפרוטוקולים ליישום מערכות פרוטופלסט לחקר ירקות עליים תחת לחץ היפוקסיה הנגרם על ידי שקיעה מוגבלים. לכן, פותח פרוטוקול משולב בעבודה זו עבור אלה המעוניינים לחקור תגובות היפוקסיה בירקות עליים באמצעות מערכת ביטוי חולפת פרוטופלסט כרוב.

כדי לבצע את תגובת ההיפוקסיה הנגרמת על ידי שקיעה ברמה התאית, מספר מתודולוגיות לניקוי חמצן שימשו במחקרים קודמים כדי לדמות סביבות היפוקסיות. אלה כוללים את השימוש EC-Oxyrase, OxyFluor, נתרן סולפיט, ושקיות צריכת חמצן. EC-Oxyrase משמש בדרך כלל לטיפול אנאירובי בשורות תאים אנושיים¹² ו Arabidopsis protoplasts¹³. OxyFluor נמצא יעיל בהפחתת הלבנה הנגרמת על ידי מיני חמצן תגובתי במהלך הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים^14,15. נתרן סולפיט שימש בטיפול אנאירובי בנמטודות¹⁶, ולאחרונה, בפרוטופלסטים של אורז, בשילוב עם טכניקות כגון מבחני כרומטין חיסוניים (ChIP)¹⁷. חבילות בולמי חמצן, המשמשות בעיקר לתרבית חיידקים אנאירובית¹⁸, הוכיחו גם יעילות בגרימת הפעלה של מקדמי ZmPORB1 בפרוטופלסטים של תירס בתנאים אנאירוביים¹⁹.

העבודה הנוכחית שואפת להקים צינור איתן לבידוד פרוטופלסטים של כרוב וביטוי ארעי. לאחר מכן, הוערכה יעילותם של טיפולים שונים להתאמת חמצן על ידי הערכת הפעילות המקדמת של גנים לתגובה אנאירובית באמצעות בדיקות לוציפראז כפולות. הפרוטוקול שפותח במחקר זה צפוי להיות בעל ערך למחקר עתידי הקשור לשקיעה או לחץ היפוקסיה במערכות Brassica .

פרוטוקול

במחקר זה נעשה שימוש בשני זנים מסחריים של כרוב (B. oleracea var. capitata): 'Fuyudori' ו-'228'. ייצוג גרפי של זרימת העבודה של הפרוטוקול מוצג באיור 1. פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת שתילי כרוב

1. זרעו זרעי כרוב 'פויודורי' ו'228' באמצעות מצע צמחי מסחרי לתוך חורים עגולים בצורת ריבוע (עומק 4.5 ס"מ x גובה 4.5 ס"מ) של מגשי תקע 48 בארות (אורך 49 ס"מ x רוחב 28 ס"מ x גובה 5 ס"מ). הטמיעו את הזרעים בעומק של כ-1 ס"מ לתוך מצע הגידול.
2. לגדל שתילי כרוב בחדר צמיחה ב 22 °C (75 °F) עם מחזור בהיר-כהה 16/8 שעות. שמור על עוצמת אור של 100 μmol ^m-2·^s-1 (צינור פלואורסצנטי לבן) במהלך שלב האור.
3. לאחר 2-3 שבועות של צמיחה, השתמשו בשתילי כרוב בשלב 2 העלים לבידוד נוסף של מזופיל פרוטופלסט.
   הערה: הגודל המוצע של שתילי כרוב הוא שלב של 2 עלים, שבו העלה האמיתי השני מורחב במלואו, אך העלה האמיתי השלישי אינו מורחב, ואורכו קצר מ-1 ס"מ (איור 2A). כדי לסנכרן את שלבי ההתפתחות של שתילי הכרוב, יש לזרוע זרעי 'פויודורי' כיומיים מוקדם יותר מזרעי '228' בשל קצב הצמיחה השונה שלהם. התאמה זו מבטיחה צמיחה ובשלות אחידה בין צמחי הכרוב בשלב הרצוי.

2. בידוד פרוטופלסטים של כרוב

1. הכינו 12.5 מ"ל של תמיסת אנזים (טבלה 1) לפני כל בידוד פרוטופלסט.
   1. חממו מראש תמיסה עם 10 mM MES (pH 5.7) ו 0.6 M של מניטול ב 55 ° C. המשיכו לחמם את התמיסה בטמפרטורה של 55°C למשך 10 דקות לאחר הוספת 1.5% צלולאז R10 ו-0.75% Macerozyme R10.
   2. לאחר שתמיסת האנזים מתקררת לטמפרטורת החדר (25°C), הוסיפו 10 mM של CaCl₂ ו-0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA). סננו את תמיסת האנזים המוכנה לצלחת פטרי בקוטר 9 ס"מ באמצעות מסנן מזרקים בקוטר 0.22 מיקרומטר.
      הערה: חימום מקדים של התמיסה מגביר את מסיסות האנזים ומנטרל פרוטאז. השפעות העיכול משתנות בהתאם לסוגים השונים של אנזימי צלולאז. השילוב של צלולאז R10 ומקרואנזים R10 מתאים לבידוד פרוטופלסטים של כרוב.
2. אספו את העלים האמיתיים המורחבים השניים מחמישה עד שמונה שתילי כרוב, וחתכו אותם לרצועות 0.5-1.0 מ"מ בעזרת סכין גילוח חד. העבירו מיד את רצועות העלים לתמיסת אנזים טרייה.
   הערה: בחירת עלים בריאים וייעודיים מכרוב בשלב הנכון היא קריטית. העלים האמיתיים השניים שהורחבו לאחרונה משתילי כרוב בשלב 2 העלים מספקים את יעילות בידוד הפרוטופלסטים הגבוהה ביותר. צמחים בוגרים מדי, קוטילדונים או עלים מיושנים אינם מומלצים לבידוד פרוטופלסט. חמישה עד שנים עשר עלים אמיתיים מורחבים היטב יכולים להניב בהצלחה פרוטופלסטים של כרוב ב -12.5 מ"ל של תמיסת אנזים. מספר העלים הדרוש לבידוד פרוטופלסטים תלוי בכמות הרצויה של הפרוטופלסטים הדרושים. בדרך כלל, פרוטופלסטים המתקבלים מחמישה עד שמונה עלים מספיקים להליכים ניסיוניים הבאים.
3. לאחר חדירת ואקום בחושך במשך 30 דקות (איור 2B), שמרו את רצועות עלי הכרוב שקועות בתמיסת האנזים (איור 2C) בחושך בטמפרטורת החדר למשך 4-16 שעות נוספות.
   הערה: זמן עיכול האנזים עשוי להשתנות בין זני כרוב ויש למטב אותו בהתאם לגנוטיפ הספציפי. לדוגמה, 'Fuyudori' דורש זמן עיכול ארוך יותר (16 שעות) לעומת '228' (4 שעות) בשל עלים עבים יותר של 'Fuyudori'.
4. דללו את התמיסה המכילה פרוטופלסטים בנפח שווה של תמיסת W5, המורכבת מ-2 מילימטר של MES (pH 5.7), 154 מילימול של NaCl, 125 מילימול של CaCl₂, 5 מילימול של KCl ו-5 מילימול של גלוקוז (ראו טבלה 1 להכנה), כדי לעצור את העיכול האנזימטי.
5. שחררו את מתלה הפרוטופלסט על ידי ערבול עדין או באמצעות שייקר מסלולי. סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.
   הערה: הפרוטופלסטים המבודדים מסוגלים לעבור דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר, בעוד שפסולת צמחית לא מעוכלת נשמרת על ידי המסננת ולאחר מכן מוסרת מהמתלה. ניתן לעשות שימוש חוזר במסננות תאים ולשמור אותן באתנול 75% לאחר השטיפה, אך יש צורך לשטוף באופן מלא את מסננות התאים בתמיסת W5 כדי להסיר שאריות אתנול לפני השימוש.
6. צנטריפוגה את פתרון protoplasts עם 150 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן בזהירות להסיר את supernatant. שטפו בעדינות את הפרוטופלסטים הכדוריים על ידי הוספת 10 מ"ל של תמיסת W5 לאורך דופן הצינור החרוטי בקצב זרימה משוער של 1 מ"ל·^s-1. צנטריפוגה את הצינור ב 150 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C, ולחזור על הליך כביסה זה שוב כדי להבטיח הסרה מלאה של תמיסת האנזים.
7. השהה מחדש את הפרוטופלסטים בתמיסת W5 והנח אותם על קרח למשך 30 דקות. לאחר דגירה בקרח, מסירים את הסופרנאטנט על ידי פיפטה 1 מ"ל בכל פעם עד שכל הסופרנאטנט מוסר.
8. השהה מחדש את הפרוטופלסטים בתמיסת MMG מקוררת לפני קרח המורכבת מ-4 מילימטר של MES (pH 5.7), 0.4 מטר של מניטול ו-15 מילימטר של MgCl₂ (ראה טבלה 1 להכנה).
9. מדוד את ריכוז הפרוטופלסט באמצעות המוציטומטר והתאם את הריכוז הסופי ל- 4 x 10⁵ protoplasts·^mL-1 באמצעות תמיסת MMG.

3. טרנספקציה פרוטופלסטים

1. מערבבים נפח כולל של 10 μL פלסמיד (5-10 מיקרוגרם) (קובץ משלים 1) עם 100 μL של פרוטופלסטים (4 x 10,⁴ פרוטופלסטים) ומניחים על קרח למשך 10 דקות.
   הערה: לטיהור פלסמיד ברמת טרנספקציה, נעשה שימוש בערכת פלסמיד זמינה מסחרית בהתאם להוראות היצרן. כ 4 x 10⁴ protoplasts משמשים בדרך כלל בבדיקת כתב לוציפראז כפול. עבור ניסויים בקנה מידה גדול יותר, כמות גבוהה יותר של פרוטופלסטים זמינה עבור transfection. באופן ספציפי, סביב 2 x 10⁵ protoplasts נגועים עם 10 מיקרוגרם של פלסמיד להציג יעילות transfection מוכח נע בין 30% ל 40%.
2. הוסף נפח שווה (110 μL) של תמיסת PEG טרייה (ראה טבלה 1 להכנה) המכילה 40% פוליאתילן גליקול 4000 (PEG4000), 0.1 M של CaCl₂ ו- 0.2 M של מניטול לתמיסת הפרוטופלסט וערבבו בעדינות.
3. יש לדגור על תערובת הפרוטופלסטים בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10 דקות, ולאחר מכן להוסיף 440 μL של תמיסת W5 כדי לסיים את התגובה.
4. צנטריפוגה את הפרוטופלסטים הנגועים ב 150 x גרם למשך 2 דקות ב 4 ° C ולהשהות מחדש את הגלולה ב 750 μL של תמיסת W5 מועשרת בחמצן. מעבירים את הפרוטופלסטים המרחפים מחדש לצלחת תרבית רקמה בת 6 בארות המצופה מראש ב-1% BSA.
   הערה: תמיסת W5 המשמשת לדגירת תאים חייבת להיות מבעבעת עם חמצן באמצעות רכז חמצן (~90% חמצן) המחובר לאבן אוויר למשך 5 דקות (איור 2D). בעקבות תהליך חמצון זה, ריכוז החמצן המומס הסופי בתמיסת W5 עלה מ-7.84 מ"ג· ^L-1 ± 0.05 מ"ג· ^L-1 עד 29.18 מ"ג· ^L-1 ± 0.43 מ"ג· ^L-1, כפי שנמדד באמצעות מד חמצן מומס. נפח תמיסת W5 להשעיה של פרוטופלסט נגוע תלוי בסוג צלחת תרבית תאי הרקמה בה נעשה שימוש. עבור לוחות תרבית תאים של 12 בארות או 24 בארות, מומלץ להפחית את נפח תמיסת W5 כדי להפחית את לחץ ההיפוקסיה במהלך הדגירה בשל העומק העמוק יותר בתוך הבארות. עבור ציפוי BSA, כל באר של צלחת התרבית קיבלה 1 מ"ל של 1% תמיסת BSA, אשר הורשה לצפות את הבארות במשך 10 שניות. לאחר מכן הושלכה תמיסת BSA מכל באר, ולאחר מכן מולאו הבארות בתמיסת W5. הליך זה נועד ליצור משטח זמני שאינו נדבק באמצעות BSA, ולמעשה למנוע מהפרוטופלסטים להידבק למשטח הפלסטיק של צלחת התרבית במהלך שלבי הניסוי הבאים.

4. טיפול היפוקסיה על פרוטופלסטים כרוב

1. בצע טיפולים כימיים או פיזיים hypoxia מיד לאחר transfection protoplast.
   הערה: מומלץ להחיל טיפול בהיפוקסיה מיד לאחר טרנספקציה של פרוטופלסט. דגירה ממושכת של פרוטופלסטים עשויה להפחית את תגובת ההיפוקסיה שלאחר מכן.
   1. להיפוקסיה כימית על פרוטופלסטים של כרוב, הוסיפו OxyFluor, EC-Oxyrase ונתרן סולפיט לתמיסת W5 protoplast.
      הערה: שימוש ב-0.6 יחידות·^mL-1 EC-oxyrase, 0.6 יחידות·^mL-1 OxyFluor, ו-1 גרם^·mL-1 נתרן סולפיט ב-W5 היו התנאים שנבדקו המסוגלים לגרום למקדם BoADH1 ו-BoSUS1L (איור 3A) עם נזק נמוך לשלמות הפרוטופלסטים בשני זני הכרוב שנבדקו.
   2. להיפוקסיה הנגרמת על ידי שקית הנגרמת על ידי שקית צריכת חמצן, הניחו שתי חבילות בולמי חמצן בצנצנת אנאירובית בנפח 3.5 ליטר כדי ליצור סביבה היפוקסית.
2. קצור פרוטופלסטים שטופלו בהיפוקסיה על ידי צנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C. הקפיאו את הפרוטופלסטים שנאספו באמצעות חנקן נוזלי ואחסנו אותם במקפיא בטמפרטורה של -80°C לבדיקות הבאות.

5. בדיקת לוציפראז כפולה

1. בצע את בדיקת הכתב כפול luciferase על פי הוראות היצרן עם שינוי קל.
   1. השהה מחדש פרוטופלסטים של כרוב ב 50 μL של 1x חיץ ליזה פסיבי ומערבולת במשך 10 שניות.
   2. לדגור על פרוטופלסטים משובשים על קרח במשך 10 דקות ולאסוף את הסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
   3. הוסף 20 μL של ליזט התא לכל באר של microplate. יש לפזר 100 μL של מגיב בדיקת לוציפראז II לבארות ולמדוד את פעילות הלוציפראז של הגחלילית באמצעות קורא מיקרו-פלטות.
   4. הוסף 100 μL של מגיב הבדיקה הזמין מסחרית לכל באר ולמדוד את פעילות Renilla luciferase באמצעות קורא microplate.

תוצאות

עבודה זו פיתחה בהצלחה מערכת ביטוי ארעי המשתמשת בפרוטופלסטים של כרוב (ראו איור 1 לזרימת עבודה). פרוטופלסטים בודדו מעלי כרוב אמיתיים בני שבועיים עד שלושה שבועות בגודל מתאים (איור 2A) מזני כרוב מסחריים 'Fuyudori' ו-'228' באמצעות עיכול צלולאז/מקרוזים וחדירת ואקום כהה (איור 2B,C). כדי למתן את התנאים ההיפוקסיים שחווים פרוטופלסטים שקועים במהלך הדגירה, תמיסת W5 חומצנה באמצעות בועת אבן אוויר המחוברת למכונת חמצן (איור 2D). תהליך זה העלה משמעותית את ריכוז החמצן המומס בתמיסת W5 מ-7.84 מ"ג· ^L-1 ± 0.05 מ"ג· ^L-1 עד 29.18 מ"ג· ^L-1 ± 0.43 מ"ג· ^L-1 לאחר 5 דקות של חמצן מבעבע. לאחר תהליך הבידוד, היבול של פרוטופלסטים היה 1.04 x 10⁷ עבור 'Fuyudori' ו 4.00 x 10⁶ protoplasts·g⁻¹ משקל טרי עבור '228' לאחר תקופת עיכול לילה (איור 2E). לאחר מכן, GFP שימש כגן מדווח כדי להעריך את יעילות הטרנספורמציה של שיטת הטרנספקציה בתיווך PEG, מה שהוכיח שיעילות הטרנספקציה של פרוטופלסט בכרוב הייתה מעל 40% בשני הזנים (איור 2F), ובכך אישר את הכדאיות של מערכת זו.

יתר על כן, מבנים מקדמים של גנים לתגובת נשימה אנאירובית של כרוב, BoADH1p::Luc ו-BoSUS1Lp::Luc וקטורים (איור 3A), הוכנסו לפרוטופלסטים של כרוב ככתבים כדי להעריך את השפעות האינדוקציה ההיפוקסית של מספר טיפולים. טיפולים שונים לכוונון חמצן יושמו גם על מערכת מודל ביטוי חולף זו. התוצאות הראו שכל הטיפולים לניקוי חמצן, למעט נתרן סולפיט, גרמו בהצלחה לתגובת היפוקסיה בפרוטופלסטים של כרוב (איור 3B). באופן ספציפי, פעילות המקדם של BoADH1 גדלה בערך פי 2.6 ופי 3.2 בהשוואה לקבוצת הביקורת לאחר הטיפול ב-EC-Oxyrase וב-OxyFluor, בהתאמה, ובעיקר פי 7.0 עם טיפול בחבילת סופגי חמצן (איור 3B). באופן דומה, פעילות מקדם BoSUS1L עלתה בערך פי 1.7 ופי 1.8 עם טיפול EC-Oxyrase ו- OxyFluor, בהתאמה, בעוד שטיפול בחבילות בולמי חמצן גרם לעלייה משמעותית של יותר מפי 5.6 (איור 3B). תוצאות אלה מצביעות על כך שחבילת סופגי החמצן מדגימה יעילות מעולה ביצירת סביבה היפוקסית במערכת ניסוי זו של פרוטופלסט כרוב.

איור 1: ייצוג גרפי של זרימת העבודה של בידוד פרוטופלסט. איור זה ממחיש את התהליך שלב אחר שלב הכרוך בבידוד פרוטופלסטים מרקמת עלי כרוב. זרימת העבודה מתוארת באופן חזותי כדי לספק הבנה ברורה של ההליך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: בידוד פרוטופלסטים מרקמת העלה של כרוב. (A) מוצגת הופעתם של זני כרוב מסחריים 'Fuyudori' ו-'228' בשלב הגידול המומלץ. העלים האמיתיים השניים שהורחבו במלואם (מסומנים על ידי ראש החץ) של כרוב בשלב 2 העלים נבחרים לבידוד פרוטופלסט. סרגל קנה מידה: 2 ס"מ. (B) משאבת ואקום ומייבש משמשים לתהליך חדירת ואקום של רצועות עלי כרוב, עם חדירה של 30 דקות המבוצעת לפני עיכול אנזימטי. (C) מתואר מצבן של רצועות עלי הכרוב במהלך העיכול האנזימטי. עיכול מלא של רקמת העלה דורש סך של 4-16 שעות. סרגל קנה מידה: 3 ס"מ. (D) תמונות מדגימות שימוש במחולל חמצן המחובר לאבן אוויר כדי להעלות את ריכוז החמצן המומס בתמיסת W5. סרגל קנה מידה: 5 ס"מ. (E) מעל 4.00 x 10⁶ פרוטופלסטים מזופילים לגרם של משקל טרי (FW) התקבלו משני זני הכרוב 'Fuyudori' ו- '228' ונצפו תחת מיקרוסקופ. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (F) יעילות הטרנספקציה של פרוטופלסטים משני גנוטיפים של כרוב, באמצעות כתב GFP מבוטא באופן קונסטיטוטיבי, מוצגת כמעל 40%. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תגובת היפוקסיה של פרוטופלסטים של כרוב בתנאים של מחסור בחמצן. (A) מבני גנים של תגובת היפוקסיה, מקדמי BoADH1 ו-BoSUS1L , משמשים ככתבים להערכת תגובת ההיפוקסיה בפרוטופלסטים של כרוב 'פויודורי'. (B) סך של 5 מיקרוגרם של פלסמידים כתבים מועתקים לפרוטופלסטים של כרוב 'פויודורי', אשר מודגרים בתמיסת W5 מבעבעת חמצן לפני חשיפה לטיפולי היפוקסיה במשך 4 שעות. רמות החמצן מופחתות במהלך הדגירה על ידי הוספת EC-oxyrase (0.6 יחידות·^mL-1), OxyFluor (0.6 יחידות·^mL-1), ונתרן סולפיט (1 g·^mL-1) לתמיסת W5. הטיפול בחבילת סופגי החמצן מתבצע על ידי הנחת שתי שקיות בולמי חמצן בצנצנת אנאירובית בנפח 3.5 ליטר. קבוצת "CK" מייצגת את קבוצת הביקורת ללא כל טיפול בהיפוקסיה. לאחר הטיפול, protoplasts נקצרים עבור מבחן לוציפראז כפול. כל ערך מייצג את הממוצע ± SD, עם n = 4. אותיות שונות מצביעות על הבדלים משמעותיים (P < 0.05) בהתבסס על ANOVA חד-כיווני עם LSD לאחר הבדיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הכנת תמיסת אנזים, תמיסת W5 ותמיסת MMG. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

קובץ משלים 1: פרטי פלסמיד לטרנספקציה פרוטופלסט. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה לבידוד פרוטופלסטים משני זני כרוב מסחריים. יעילותה של שיטה זו מוערכת בעיקר באמצעות שני פרמטרים קריטיים של בקרת איכות: התשואה של פרוטופלסטים ברי קיימא והיעילות של טרנספקציה של פרוטופלסט. יישום פרוטוקול זה הביא לתנובה העולה על 4.00 x 10⁶ פרוטופלסטים·g^−1· FW של רקמת מזופיל משני זני הכרוב (איור 2E,F). יבול זה דומה לאלה שדווחו במינים אחרים, כולל חצילים, ציפורן, קנה סוכר וקמליה אוליפרה, שם יבולי הפרוטופלסטים נעו בין 2.5 x 10⁶ ל 1.4 x 10⁷ פרוטופלסטים·g^−1· FW 6,7,9,17. תוצאות אלה מצביעות על הישימות הפוטנציאלית של הפרוטוקול על פני רקע גנטי מגוון עם B. oleracea.

הצלחת הפרוטוקול תלויה במספר גורמים קריטיים. בראש ובראשונה ניצול עלים מוגדרים משתילי כרוב בריאים בשלב צמיחה מתאים (איור 2A). שימוש בצמחים מבוגרים או לא בריאים עלול לגרום לפרוטופלסטים באיכות ירודה. כמו כן, חשוב לחתוך בזהירות את רקמת העלה לרצועות 0.5-1.0 מ"מ ולהימנע מריסוק עם להב קהה. תהליך עיכול האנזים, שנמשך בין 4-16 שעות, הוא שלב קריטי נוסף. תקופות עיכול קצרות מ-4 שעות עלולות להוביל לעיכול לא מלא, ואילו תקופות עיכול העולות על 16 שעות עלולות להוביל לעיסה תאית. יש לציין כי גנוטיפים בעלי עלים עבים יותר, כגון 'פויודורי', עשויים להפיק תועלת מזמני עיכול ארוכים יותר כדי למקסם את תפוקת הפרוטופלסט. לעומת זאת, '228' דרש רק 4 שעות לעיכול מלא. בנוסף, טווח רחב של זמני עיכול יכול לספק גמישות רבה יותר בתזמון ניסיוני. לדוגמה, עיכול של 4 שעות מאפשר בידוד פרוטופלסטים ובדיקות ארעיות עוקבות להסתיים תוך יום אחד. לעומת זאת, עיכול של 16 שעות מאפשר התחלה של עיכול אנזים בערב ומאפשר השלמת השלבים הבאים ביום המחרת, מה שיכול לשפר את הנוחות בעת יישום פרוטוקול זה. יתר על כן, חיוני לטפל בפרוטופלסטים בעדינות לאורך כל תהליך בידוד הפרוטופלסטים בשל שבריריותם ורגישותם ללחץ מכני.

כדי לדמות תנאים אנאירוביים המייצגים עקה של הצפה, פרוטוקול זה השתמש בחומרים נפוצים לניקוי חמצן ובשקיות צורכות חמצן כדי ליצור סביבות היפוקסיות. כדי לשפר את יעילות המערכת, משתמשים במכונת חמצן כדי לחמצן את תמיסת W5 (איור 2D), במטרה להפחית את אותות התגובה ההיפוקסית ברקע בפרוטופלסטים של כרוב במהלך תקופת הדגירה שלפני הטיפול. תהליך חמצון של 5 דקות מעלה משמעותית את רמת החמצן המומס מ-7.84 מ"ג· ^L-1 ± 0.05 מ"ג· ^L-1 עד 29.18 מ"ג· ^L-1 ± 0.43 מ"ג· ^L-1, המציין השפעה בולטת בהקלה על תנאים היפוקסיים. מבין שיטות ניקוי החמצן ששימשו במחקר זה, חבילות סופגי החמצן הציגו ביצועים מעולים, וגרמו לפעילות המקדם הגבוהה ביותר בשני גנים של ליבה של תגובה אנאירובית (איור 3). יתר על כן, שיטה זו מציעה יתרון נוסף של מדרגיות, ומאפשרת טיפול בו זמנית במספר דגימות באמצעות שימוש בשקיות צורכות חמצן בצנצנת אנאירובית אחת, בניגוד ליישום פרטני של חומרי נבלות חמצן לכל צלחת תרבית תאים. לסיכום, מארזי סופגי החמצן מספקים פלטפורמה נוחה ויעילה המתאימה להערכת התגובה של פרוטופלסטים של כרוב בתנאים היפוקסיים.

בעוד פרוטוקול זה מדגים מספר יתרונות, חשוב להכיר במגבלותיו, במיוחד יעילות ההעברה הצנועה יחסית של פרוטופלסטים כרוב. אף על פי שיעילות זו אינה מגיעה ל-90% שדווחו עבור Arabidopsis⁵, היא עדיין מספיקה למחקרים מוצלחים הבאים על פעילות המקדם (איור 3), מה שמצביע על פוטנציאל משמעותי לניתוח פונקציונלי במערכת זו.

בהתחשב בחשיבות הגלובלית של הכרוב כגידול ירקות עיקרי, השילוב של פרוטוקול זה עם טיפולי היפוקסיה וטכניקות ניתוח גנטי מבטיח לקבל תובנות נוספות לגבי מנגנוני הבקרה בכרוב בתנאי הצפה. תובנות כאלה עשויות להאיץ את התפתחותם של זני כרוב עמידים לשיטפונות, ולענות על צורך קריטי לנוכח מזג אוויר קיצוני ואירועי שיטפונות מתגברים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-(N-morpholino) חומצה אתנסולפונית (MES)	PhytoTech Labs	M825	להכנת תמיסת אנזים
228 זרעי כרוב	Takii & Co., Ltd. (קיוטו, יפן)
50 מ"ל צינור חרוטי	SPL מדעי החיים	50050	להכנת תמיסת אנזים
צלחת תרבית רקמות 6 בארות	אלפא פלוס	16106	לדגירת פרוטופלסט
70 μ מסננת תאים m	Sorfa	SCS701	לסינון פרוטופלסט
צלחת פטרי 9 ס"מ	אלפא פלוס	16001	לעיכול
אנזימטי צנצנת אנאירובית	HIMEDIA	צנצנת אנאירובית 3.5	ליטר לטיפול בהיפוקסיה
אלבומין סרום בקר	Sigma-Aldrich	A7906	להכנת תמיסת W5 וציפוי צלחת תרבית
סידן כלורי	J.T.Baker	131301	להכנת תמיסת W5 ותמיסת PEG
Cellulase R10	Yakult		להכנת תמיסת אנזים
Desiccator	Tarsons	402030	לחדירת ואקום
D-גלוקוז	ביושופ	GLU501	להכנת תמיסת W5
מד חמצן מומס	תרמו מדעי	אוריון כוכב A223	למדידת חמצן
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	לתמיסת אנזים, תמיסת PEG והכנת תמיסת MMG
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	לבדיקת מדווח לוציפראז כפול
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	לטיפול בהיפוקסיה
זרעי כרוב Fuyudori	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, יפן)
צנטריפוגה מקוררת במהירות גבוהה	היטאצ'י	CR21GIII	לקציר פרוטופלסט
Macerozyme R10	Yakult		להכנת תמיסת אנזים
מגנזיום כלוריד	אלפא Aesar	12315	להכנת תמיסת MMG
מיקרוצנטריפוגה	היטאצ'י	CT15RE	לקציר פרוטופלסט
Microplate	Greiner	655075	לבדיקת מדווח כפול לוציפראז
מיקרופלייט קורא	מכשירים מולקולריים	SpectraMax Mini	עבור בדיקת מדווח לוציפראז כפול
Millex 0.22 μ מסנן מזרק	m Merck	SLGP033RS	להכנת תמיסת אנזים
משאבת ואקום ללא שמן	רוקר Rocker	נדנדה 300	לחדירת ואקום
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	לטיפול בהיפוקסיה
חבילת בולם חמצן	מיצובישי גז כימיקלים החברה	AnaeroPack, MGCC1	לטיפול בהיפוקסיה
רכז חמצן	UTMOST	PERFECT AII-X	לבעבוע חמצן בתמיסת W5
מצע צמח	Klasmann-Deilmann	Potgrond H מצע	להכנת שתילי כרוב
פלסמיד מידי ערכת	QIAGEN	12145	לטיהור DNA פלסמיד בדרגת טרנספקציה
פוליאתילן גליקול 4000	פלוקה	81240	להעברת פרוטופלסט
אשלגן כלורי	J.T.Baker	304001	להכנת תמיסת W5
סכין גילוח	ג'ילט		להכנת רצועות עלי כרוב
נתרן	כלורי ביושופ	SOD002	להכנת תמיסת W5
נתרן סולפיט	סיגמא-אולדריץ'	S0505	לטיפול בהיפוקסיה
אמבט מים	Yihder	BU-240D	להכנת תמיסת אנזים