פרוטוקול זה מתאר מערכת פרוטופלסט יעילה של מזופיל כרוב. נבדקו טיפולים שונים למחסור בחמצן, והמערכת הראתה שפעול גבוה של גנים המגיבים להיפוקסיה, מה שאפשר מחקרים על המנגנונים הגנטיים והמולקולריים של עמידות להצפה בירקות Brassicaceae .
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פיתוח מערכת פרוטופלסט כרוב לחקר סבילות להיפוקסיה בברסיקה
במאמר זה
סיכום
תקציר
ככל ששינויי האקלים מביאים גשמים כבדים יותר, כרוב, ירק מפתח של Brassicaceae , מתמודד עם הפסדי יבול משמעותיים עקב לחץ היפוקסיה הנגרם על ידי הצפות. כדי לזהות מנגנונים של עמידות להצפה בכרובים, יש צורך בפלטפורמה רב-תכליתית למחקרים פונקציונליים גנטיים כדי להתגבר על טבעם הסרבן של הכרובים. במחקר זה פותחו מערכת ביטוי חולפת של פרוטופלסט כרוב ופרוטוקול אינדוקציה מקביל של היפוקסיה פרוטופלסט. פרוטוקול זה השיג תפוקה גבוהה ושלמות של בידוד פרוטופלסטים מעלי כרוב, עם יעילות טרנספקציה העולה על 40% באמצעות תנאים אנזימטיים אופטימליים. כדי להקל על השפעה היפוקסית פוטנציאלית לפני הטיפולים, תמיסת W5 בעבעה עם גז חמצן כדי להעלות את רמות החמצן המומס. נבדקו מספר כימיקלים להתאמת רמות החמצן וטיפולים פיזיולוגיים לסילוק חמצן, כולל EC-Oxyrase, OxyFluor, נתרן סולפיט וחבילת סופגי חמצן. בדיקות לוציפראז כפול הראו כי מקדמי הגנים לתגובת נשימה אנאירובית BoADH1 ו- BoSUS1L הופעלו בפרוטופלסטים של כרוב לאחר טיפולי היפוקסיה, כאשר רמת האינדוקציה הגבוהה ביותר נצפתה לאחר הטיפול בחבילת סופג החמצן. לסיכום, מערכת הביטוי הארעית פרוטופלסט כרוב בשילוב טיפול בהיפוקסיה מדגימה פלטפורמה יעילה ונוחה. פלטפורמה זו יכולה להקל על מחקרים של תפקוד גנים ומנגנונים מולקולריים הקשורים לתגובות היפוקסיה בכרובים.
מבוא
שינויי האקלים העולמיים החריפו את השיטפונות, שהפכו לנושא קריטי יותר ויותר ברחבי העולם. בעשורים האחרונים אנו עדים למגמת עלייה בתדירות אירועי השיטפונות, וכתוצאה מכך הפסדי יבול משמעותיים 1,2. כרוב (Brassica oleracea var. capitata L.), ירק בעל חשיבות עולמית משמעותית, רגיש להשפעות השליליות של גשמים כבדים, המחייבים פיתוח של זני כרוב עמידים לשיטפונות כדי להבטיח ייצור בר קיימא לנוכח אירועי מזג אוויר קיצוניים. לכן, הבנת המנגנונים המולקולריים הקשורים לעקה הצפה בכרוב חיונית כדי לעמוד באתגר זה.
כדי להבין מנגנוני ויסות גנים בצמחים בתנאים שקועים, קווים טרנסגניים נמצאים בשימוש נרחב עבור מחקרים פונקציונליים גנטיים. עם זאת, גישה זו מוגבלת על ידי עלויות גבוהות, טרנספורמציה עתירת זמן ותהליכי תת-תרבות, כמו גם יעילות טרנספורמציה נמוכה במינים רבים של יבולים, המחייבת פיתוח מתודולוגיות חלופיות. מערכות ביטוי ארעיות מבוססות פרוטופלסטים יושמו באופן נרחב במחקר המולקולרי של הצמח כחלופה רב-תכליתית ויעילה. מערכות אלה מאפשרות לחקור את פעילות המקדם, מסלולי איתות בתגובה לרמזים סביבתיים, אינטראקציות חלבון-חלבון או חלבון-דנ"א, ולוקליזציה תת-תאית3. הקמת מערכות ביטוי ארעיות פרוטופלסטיות דווחה לא רק בצמחי מודל 4,5 אלא גם בגידולים חשובים מבחינה כלכלית כגון קנה סוכר6, ציפורן7, סחלבי פלאנופסיס 8 וחציל9. יתר על כן, מערכות אלה יושמו בהצלחה בצמחים עציים, כולל Camellia oleifera10ו- Populus trichocarpa11. עם זאת, הפרוטוקולים ליישום מערכות פרוטופלסט לחקר ירקות עליים תחת לחץ היפוקסיה הנגרם על ידי שקיעה מוגבלים. לכן, פותח פרוטוקול משולב בעבודה זו עבור אלה המעוניינים לחקור תגובות היפוקסיה בירקות עליים באמצעות מערכת ביטוי חולפת פרוטופלסט כרוב.
כדי לבצע את תגובת ההיפוקסיה הנגרמת על ידי שקיעה ברמה התאית, מספר מתודולוגיות לניקוי חמצן שימשו במחקרים קודמים כדי לדמות סביבות היפוקסיות. אלה כוללים את השימוש EC-Oxyrase, OxyFluor, נתרן סולפיט, ושקיות צריכת חמצן. EC-Oxyrase משמש בדרך כלל לטיפול אנאירובי בשורות תאים אנושיים12 ו Arabidopsis protoplasts13. OxyFluor נמצא יעיל בהפחתת הלבנה הנגרמת על ידי מיני חמצן תגובתי במהלך הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים14,15. נתרן סולפיט שימש בטיפול אנאירובי בנמטודות16, ולאחרונה, בפרוטופלסטים של אורז, בשילוב עם טכניקות כגון מבחני כרומטין חיסוניים (ChIP)17. חבילות בולמי חמצן, המשמשות בעיקר לתרבית חיידקים אנאירובית18, הוכיחו גם יעילות בגרימת הפעלה של מקדמי ZmPORB1 בפרוטופלסטים של תירס בתנאים אנאירוביים19.
העבודה הנוכחית שואפת להקים צינור איתן לבידוד פרוטופלסטים של כרוב וביטוי ארעי. לאחר מכן, הוערכה יעילותם של טיפולים שונים להתאמת חמצן על ידי הערכת הפעילות המקדמת של גנים לתגובה אנאירובית באמצעות בדיקות לוציפראז כפולות. הפרוטוקול שפותח במחקר זה צפוי להיות בעל ערך למחקר עתידי הקשור לשקיעה או לחץ היפוקסיה במערכות Brassica .
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
במחקר זה נעשה שימוש בשני זנים מסחריים של כרוב (B. oleracea var. capitata): 'Fuyudori' ו-'228'. ייצוג גרפי של זרימת העבודה של הפרוטוקול מוצג באיור 1. פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת שתילי כרוב
- זרעו זרעי כרוב 'פויודורי' ו'228' באמצעות מצע צמחי מסחרי לתוך חורים עגולים בצורת ריבוע (עומק 4.5 ס"מ x גובה 4.5 ס"מ) של מגשי תקע 48 בארות (אורך 49 ס"מ x רוחב 28 ס"מ x גובה 5 ס"מ). הטמיעו את הזרעים בעומק של כ-1 ס"מ לתוך מצע הגידול.
- לגדל שתילי כרוב בחדר צמיחה ב 22 °C (75 °F) עם מחזור בהיר-כהה 16/8 שעות. שמור על עוצמת אור של 100 μmol m-2·s-1 (צינור פלואורסצנטי לבן) במהלך שלב האור.
- לאחר 2-3 שבועות של צמיחה, השתמשו בשתילי כרוב בשלב 2 העלים לבידוד נוסף של מזופיל פרוטופלסט.
הערה: הגודל המוצע של שתילי כרוב הוא שלב של 2 עלים, שבו העלה האמיתי השני מורחב במלואו, אך העלה האמיתי השלישי אינו מורחב, ואורכו קצר מ-1 ס"מ (איור 2A). כדי לסנכרן את שלבי ההתפתחות של שתילי הכרוב, יש לזרוע זרעי 'פויודורי' כיומיים מוקדם יותר מזרעי '228' בשל קצב הצמיחה השונה שלהם. התאמה זו מבטיחה צמיחה ובשלות אחידה בין צמחי הכרוב בשלב הרצוי.
2. בידוד פרוטופלסטים של כרוב
- הכינו 12.5 מ"ל של תמיסת אנזים (טבלה 1) לפני כל בידוד פרוטופלסט.
- חממו מראש תמיסה עם 10 mM MES (pH 5.7) ו 0.6 M של מניטול ב 55 ° C. המשיכו לחמם את התמיסה בטמפרטורה של 55°C למשך 10 דקות לאחר הוספת 1.5% צלולאז R10 ו-0.75% Macerozyme R10.
- לאחר שתמיסת האנזים מתקררת לטמפרטורת החדר (25°C), הוסיפו 10 mM של CaCl2 ו-0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA). סננו את תמיסת האנזים המוכנה לצלחת פטרי בקוטר 9 ס"מ באמצעות מסנן מזרקים בקוטר 0.22 מיקרומטר.
הערה: חימום מקדים של התמיסה מגביר את מסיסות האנזים ומנטרל פרוטאז. השפעות העיכול משתנות בהתאם לסוגים השונים של אנזימי צלולאז. השילוב של צלולאז R10 ומקרואנזים R10 מתאים לבידוד פרוטופלסטים של כרוב.
- אספו את העלים האמיתיים המורחבים השניים מחמישה עד שמונה שתילי כרוב, וחתכו אותם לרצועות 0.5-1.0 מ"מ בעזרת סכין גילוח חד. העבירו מיד את רצועות העלים לתמיסת אנזים טרייה.
הערה: בחירת עלים בריאים וייעודיים מכרוב בשלב הנכון היא קריטית. העלים האמיתיים השניים שהורחבו לאחרונה משתילי כרוב בשלב 2 העלים מספקים את יעילות בידוד הפרוטופלסטים הגבוהה ביותר. צמחים בוגרים מדי, קוטילדונים או עלים מיושנים אינם מומלצים לבידוד פרוטופלסט. חמישה עד שנים עשר עלים אמיתיים מורחבים היטב יכולים להניב בהצלחה פרוטופלסטים של כרוב ב -12.5 מ"ל של תמיסת אנזים. מספר העלים הדרוש לבידוד פרוטופלסטים תלוי בכמות הרצויה של הפרוטופלסטים הדרושים. בדרך כלל, פרוטופלסטים המתקבלים מחמישה עד שמונה עלים מספיקים להליכים ניסיוניים הבאים. - לאחר חדירת ואקום בחושך במשך 30 דקות (איור 2B), שמרו את רצועות עלי הכרוב שקועות בתמיסת האנזים (איור 2C) בחושך בטמפרטורת החדר למשך 4-16 שעות נוספות.
הערה: זמן עיכול האנזים עשוי להשתנות בין זני כרוב ויש למטב אותו בהתאם לגנוטיפ הספציפי. לדוגמה, 'Fuyudori' דורש זמן עיכול ארוך יותר (16 שעות) לעומת '228' (4 שעות) בשל עלים עבים יותר של 'Fuyudori'. - דללו את התמיסה המכילה פרוטופלסטים בנפח שווה של תמיסת W5, המורכבת מ-2 מילימטר של MES (pH 5.7), 154 מילימול של NaCl, 125 מילימול של CaCl2, 5 מילימול של KCl ו-5 מילימול של גלוקוז (ראו טבלה 1 להכנה), כדי לעצור את העיכול האנזימטי.
- שחררו את מתלה הפרוטופלסט על ידי ערבול עדין או באמצעות שייקר מסלולי. סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.
הערה: הפרוטופלסטים המבודדים מסוגלים לעבור דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר, בעוד שפסולת צמחית לא מעוכלת נשמרת על ידי המסננת ולאחר מכן מוסרת מהמתלה. ניתן לעשות שימוש חוזר במסננות תאים ולשמור אותן באתנול 75% לאחר השטיפה, אך יש צורך לשטוף באופן מלא את מסננות התאים בתמיסת W5 כדי להסיר שאריות אתנול לפני השימוש. - צנטריפוגה את פתרון protoplasts עם 150 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן בזהירות להסיר את supernatant. שטפו בעדינות את הפרוטופלסטים הכדוריים על ידי הוספת 10 מ"ל של תמיסת W5 לאורך דופן הצינור החרוטי בקצב זרימה משוער של 1 מ"ל·s-1. צנטריפוגה את הצינור ב 150 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C, ולחזור על הליך כביסה זה שוב כדי להבטיח הסרה מלאה של תמיסת האנזים.
- השהה מחדש את הפרוטופלסטים בתמיסת W5 והנח אותם על קרח למשך 30 דקות. לאחר דגירה בקרח, מסירים את הסופרנאטנט על ידי פיפטה 1 מ"ל בכל פעם עד שכל הסופרנאטנט מוסר.
- השהה מחדש את הפרוטופלסטים בתמיסת MMG מקוררת לפני קרח המורכבת מ-4 מילימטר של MES (pH 5.7), 0.4 מטר של מניטול ו-15 מילימטר של MgCl2 (ראה טבלה 1 להכנה).
- מדוד את ריכוז הפרוטופלסט באמצעות המוציטומטר והתאם את הריכוז הסופי ל- 4 x 105 protoplasts·mL-1 באמצעות תמיסת MMG.
3. טרנספקציה פרוטופלסטים
- מערבבים נפח כולל של 10 μL פלסמיד (5-10 מיקרוגרם) (קובץ משלים 1) עם 100 μL של פרוטופלסטים (4 x 10,4 פרוטופלסטים) ומניחים על קרח למשך 10 דקות.
הערה: לטיהור פלסמיד ברמת טרנספקציה, נעשה שימוש בערכת פלסמיד זמינה מסחרית בהתאם להוראות היצרן. כ 4 x 104 protoplasts משמשים בדרך כלל בבדיקת כתב לוציפראז כפול. עבור ניסויים בקנה מידה גדול יותר, כמות גבוהה יותר של פרוטופלסטים זמינה עבור transfection. באופן ספציפי, סביב 2 x 105 protoplasts נגועים עם 10 מיקרוגרם של פלסמיד להציג יעילות transfection מוכח נע בין 30% ל 40%. - הוסף נפח שווה (110 μL) של תמיסת PEG טרייה (ראה טבלה 1 להכנה) המכילה 40% פוליאתילן גליקול 4000 (PEG4000), 0.1 M של CaCl2 ו- 0.2 M של מניטול לתמיסת הפרוטופלסט וערבבו בעדינות.
- יש לדגור על תערובת הפרוטופלסטים בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10 דקות, ולאחר מכן להוסיף 440 μL של תמיסת W5 כדי לסיים את התגובה.
- צנטריפוגה את הפרוטופלסטים הנגועים ב 150 x גרם למשך 2 דקות ב 4 ° C ולהשהות מחדש את הגלולה ב 750 μL של תמיסת W5 מועשרת בחמצן. מעבירים את הפרוטופלסטים המרחפים מחדש לצלחת תרבית רקמה בת 6 בארות המצופה מראש ב-1% BSA.
הערה: תמיסת W5 המשמשת לדגירת תאים חייבת להיות מבעבעת עם חמצן באמצעות רכז חמצן (~90% חמצן) המחובר לאבן אוויר למשך 5 דקות (איור 2D). בעקבות תהליך חמצון זה, ריכוז החמצן המומס הסופי בתמיסת W5 עלה מ-7.84 מ"ג· L-1 ± 0.05 מ"ג· L-1 עד 29.18 מ"ג· L-1 ± 0.43 מ"ג· L-1, כפי שנמדד באמצעות מד חמצן מומס. נפח תמיסת W5 להשעיה של פרוטופלסט נגוע תלוי בסוג צלחת תרבית תאי הרקמה בה נעשה שימוש. עבור לוחות תרבית תאים של 12 בארות או 24 בארות, מומלץ להפחית את נפח תמיסת W5 כדי להפחית את לחץ ההיפוקסיה במהלך הדגירה בשל העומק העמוק יותר בתוך הבארות. עבור ציפוי BSA, כל באר של צלחת התרבית קיבלה 1 מ"ל של 1% תמיסת BSA, אשר הורשה לצפות את הבארות במשך 10 שניות. לאחר מכן הושלכה תמיסת BSA מכל באר, ולאחר מכן מולאו הבארות בתמיסת W5. הליך זה נועד ליצור משטח זמני שאינו נדבק באמצעות BSA, ולמעשה למנוע מהפרוטופלסטים להידבק למשטח הפלסטיק של צלחת התרבית במהלך שלבי הניסוי הבאים.
4. טיפול היפוקסיה על פרוטופלסטים כרוב
- בצע טיפולים כימיים או פיזיים hypoxia מיד לאחר transfection protoplast.
הערה: מומלץ להחיל טיפול בהיפוקסיה מיד לאחר טרנספקציה של פרוטופלסט. דגירה ממושכת של פרוטופלסטים עשויה להפחית את תגובת ההיפוקסיה שלאחר מכן.- להיפוקסיה כימית על פרוטופלסטים של כרוב, הוסיפו OxyFluor, EC-Oxyrase ונתרן סולפיט לתמיסת W5 protoplast.
הערה: שימוש ב-0.6 יחידות·mL-1 EC-oxyrase, 0.6 יחידות·mL-1 OxyFluor, ו-1 גרם·mL-1 נתרן סולפיט ב-W5 היו התנאים שנבדקו המסוגלים לגרום למקדם BoADH1 ו-BoSUS1L (איור 3A) עם נזק נמוך לשלמות הפרוטופלסטים בשני זני הכרוב שנבדקו. - להיפוקסיה הנגרמת על ידי שקית הנגרמת על ידי שקית צריכת חמצן, הניחו שתי חבילות בולמי חמצן בצנצנת אנאירובית בנפח 3.5 ליטר כדי ליצור סביבה היפוקסית.
- להיפוקסיה כימית על פרוטופלסטים של כרוב, הוסיפו OxyFluor, EC-Oxyrase ונתרן סולפיט לתמיסת W5 protoplast.
- קצור פרוטופלסטים שטופלו בהיפוקסיה על ידי צנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C. הקפיאו את הפרוטופלסטים שנאספו באמצעות חנקן נוזלי ואחסנו אותם במקפיא בטמפרטורה של -80°C לבדיקות הבאות.
5. בדיקת לוציפראז כפולה
- בצע את בדיקת הכתב כפול luciferase על פי הוראות היצרן עם שינוי קל.
- השהה מחדש פרוטופלסטים של כרוב ב 50 μL של 1x חיץ ליזה פסיבי ומערבולת במשך 10 שניות.
- לדגור על פרוטופלסטים משובשים על קרח במשך 10 דקות ולאסוף את הסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- הוסף 20 μL של ליזט התא לכל באר של microplate. יש לפזר 100 μL של מגיב בדיקת לוציפראז II לבארות ולמדוד את פעילות הלוציפראז של הגחלילית באמצעות קורא מיקרו-פלטות.
- הוסף 100 μL של מגיב הבדיקה הזמין מסחרית לכל באר ולמדוד את פעילות Renilla luciferase באמצעות קורא microplate.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עבודה זו פיתחה בהצלחה מערכת ביטוי ארעי המשתמשת בפרוטופלסטים של כרוב (ראו איור 1 לזרימת עבודה). פרוטופלסטים בודדו מעלי כרוב אמיתיים בני שבועיים עד שלושה שבועות בגודל מתאים (איור 2A) מזני כרוב מסחריים 'Fuyudori' ו-'228' באמצעות עיכול צלולאז/מקרוזים וחדירת ואקום כהה (איור 2B,C). כדי למתן את התנאים ההיפוקסיים שחווים פרוטופלסטים שקועים במהלך הדגירה, תמיסת W5 חומצנה באמצעות בועת אבן אוויר המחוברת למכונת חמצן (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה לבידוד פרוטופלסטים משני זני כרוב מסחריים. יעילותה של שיטה זו מוערכת בעיקר באמצעות שני פרמטרים קריטיים של בקרת איכות: התשואה של פרוטופלסטים ברי קיימא והיעילות של טרנספקציה של פרוטופלסט. יישום פרוטוקול זה הביא לתנובה העולה על 4.00 x 106 פרוטופלסטים·g−1· FW של רקמת מזופיל משני זני הכרוב (איור 2E,F). יבול זה דומה לאלה שדווחו במינים אחרים, כולל חצילים, ציפורן, קנה סוכר וקמליה אוליפרה, שם ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין אינטרס מתחרה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה (MOST 111-2313-B-002-029- ו- NSTC 112-2313-B-002-050-MY3). עבור איור 1, הסמלים הניסיוניים נלקחו מ-BioRender.com.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2-(N-morpholino) חומצה אתנסולפונית (MES) | PhytoTech Labs | M825 | להכנת תמיסת אנזים |
| 228 זרעי כרוב | Takii & Co., Ltd. (קיוטו, יפן) | ||
| 50 מ"ל צינור חרוטי | SPL מדעי החיים | 50050 | להכנת תמיסת אנזים |
| צלחת תרבית רקמות 6 בארות | אלפא פלוס | 16106 | לדגירת פרוטופלסט |
| 70 μ מסננת תאים m | Sorfa | SCS701 | לסינון פרוטופלסט |
| צלחת פטרי 9 ס"מ | אלפא פלוס | 16001 | לעיכול |
| אנזימטי צנצנת אנאירובית | HIMEDIA | צנצנת אנאירובית 3.5 | ליטר לטיפול בהיפוקסיה |
| אלבומין סרום בקר | Sigma-Aldrich | A7906 | להכנת תמיסת W5 וציפוי צלחת תרבית |
| סידן כלורי | J.T.Baker | 131301 | להכנת תמיסת W5 ותמיסת PEG |
| Cellulase R10 | Yakult | להכנת תמיסת אנזים | |
| Desiccator | Tarsons | 402030 | לחדירת ואקום |
| D-גלוקוז | ביושופ | GLU501 | להכנת תמיסת W5 |
| מד חמצן מומס | תרמו מדעי | אוריון כוכב A223 | למדידת חמצן |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M1902 | לתמיסת אנזים, תמיסת PEG והכנת תמיסת MMG |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | לבדיקת מדווח לוציפראז כפול |
| EC-Oxyrase | Oxyrase Inc. | EC-0005 | לטיפול בהיפוקסיה |
| זרעי כרוב Fuyudori | Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, יפן) | ||
| צנטריפוגה מקוררת במהירות גבוהה | היטאצ'י | CR21GIII | לקציר פרוטופלסט |
| Macerozyme R10 | Yakult | להכנת תמיסת אנזים | |
| מגנזיום כלוריד | אלפא Aesar | 12315 | להכנת תמיסת MMG |
| מיקרוצנטריפוגה | היטאצ'י | CT15RE | לקציר פרוטופלסט |
| Microplate | Greiner | 655075 | לבדיקת מדווח כפול לוציפראז |
| מיקרופלייט קורא | מכשירים מולקולריים | SpectraMax Mini | עבור בדיקת מדווח לוציפראז כפול |
| Millex 0.22 μ מסנן מזרק | m Merck | SLGP033RS | להכנת תמיסת אנזים |
| משאבת ואקום ללא שמן | רוקר Rocker | נדנדה 300 | לחדירת ואקום |
| OxyFluor | Oxyrase Inc. | OF-0005 | לטיפול בהיפוקסיה |
| חבילת בולם חמצן | מיצובישי גז כימיקלים החברה | AnaeroPack, MGCC1 | לטיפול בהיפוקסיה |
| רכז חמצן | UTMOST | PERFECT AII-X | לבעבוע חמצן בתמיסת W5 |
| מצע צמח | Klasmann-Deilmann | Potgrond H מצע | להכנת שתילי כרוב |
| פלסמיד מידי ערכת | QIAGEN | 12145 | לטיהור DNA פלסמיד בדרגת טרנספקציה |
| פוליאתילן גליקול 4000 | פלוקה | 81240 | להעברת פרוטופלסט |
| אשלגן כלורי | J.T.Baker | 304001 | להכנת תמיסת W5 |
| סכין גילוח | ג'ילט | להכנת רצועות עלי כרוב | |
| נתרן | כלורי ביושופ | SOD002 | להכנת תמיסת W5 |
| נתרן סולפיט | סיגמא-אולדריץ' | S0505 | לטיפול בהיפוקסיה |
| אמבט מים | Yihder | BU-240D | להכנת תמיסת אנזים |
מקורות
- Tanoue, M., Hirabayashi, Y., Ikeuchi, H. Global-scale river flood in the last 50 years. Sci Rep. 6 (1), 36021(2016).
- Voesenek, L. aC. J., Bailey-Serres, J. Flood adaptive traits and processes: An overview. New Phytol. 206 (1), 57-73 (2015).
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127 (4), 1466-1475 (2001).
- Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defense gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
- Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Wang, Q., et al. Optimization of protoplast isolation, transformation, and its application in sugarcane (Saccharum spontaneum L). Crop J. 9 (1), 133-142 (2021).
- Adedeji, O. S., et al. Optimization of protocol for efficient protoplast isolation and transient gene expression in carnation. Sci Hortic. 299, 111057(2022).
- Lin, H. -Y., Chen, J. -C., Fang, S. -C. A protoplast transient expression system to enable molecular, cellular, and functional studies in Phalaenopsis orchids. Front Plant Sci. 9, (2018).
- Wang, Y., et al. A highly efficient mesophyll protoplast isolation and PEG-mediated transient expression system in eggplant. Sci Hortic. 304, 111303(2022).
- Lin, Z., et al. Development of a protoplast isolation system for functional gene expression and characterization using petals of Camellia oleifera. Plant Physiol Biochem. 201, 107885(2023).
- Guo, J., et al. Highly efficient isolation of Populus mesophyll protoplasts and its application in transient expression assays. PLOS One. 7 (9), e44908(2012).
- Gottschald, O. R., et al. TIAR and TIA-1 mRNA-binding proteins co-aggregate under conditions of rapid oxygen decline and extreme hypoxia and suppress the HIF-1α pathway. J Mol Cell Biol. 2 (6), 345-356 (2010).
- Cho, H. -Y., Chou, M. -Y., Ho, H. -Y., Chen, W. -C., Shih, M. -C. Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2. Sci Adv. 8 (22), eadm7863(2022).
- Boudreau, C., et al. Excitation light dose engineering to reduce photo-bleaching and photo-toxicity. Sci Rep. 6 (1), 30892(2016).
- Shcherbakova, D. M., Cox Cammer, N., Huisman, T. M., Verkhusha, V. V., Hodgson, L. Direct multiplex imaging and optogenetics of Rho GTPases enabled by near-infrared FRET. Nat Chem Biol. 14 (6), 591-600 (2018).
- Jiang, B., et al. Sodium sulfite is a potential hypoxia inducer that mimics hypoxic stress in Caenorhabditis elegans. J Biol Inorg Chem. 16 (2), 267-274 (2011).
- Lin, C. -C., et al. SUB1A-1 anchors a regulatory cascade for epigenetic and transcriptional controls of submergence tolerance in rice. PNAS Nexus. 2 (7), pgad229(2023).
- Zhang, X., et al. Bis-molybdopterin guanine dinucleotide modulates hemolysin expression under anaerobiosis and contributes to fitness in vivo in uropathogenic Escherichia coli. Mol Microbiol. 116 (4), 1216-1231 (2021).
- Liu, N., et al. The light and hypoxia-induced gene zmPORB1 determines tocopherol content in the maize kernel. Sci China Life Sci. 67 (3), 435-448 (2024).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
