הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גזירה של אורגנואיד מוח אנושי עם התפתחות מיקרוגליה

2.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67491

⸱

17 בינואר 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Cancer Genetics and Comparative Genomics Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואיד מוח אנושי עם מיקרוגליה תושבת על ידי שילוב תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) בהתפתחות אורגנואידים.

תקציר

תרביות אורגנואידים תלת מימדיות (תלת מימדיות) במוח שמקורן בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) מספקות אלטרנטיבה חשובה לחקר התפתחות המוח האנושי ופתוגנזה של מחלות נוירולוגיות. עם זאת, היעדר שילוב של מיקרוגליה באורגנואידים במוח האנושי עדיין מהווה מכשול מרכזי עבור מודלים תלת מימדיים של דלקת עצבית. הגישות הנוכחיות כוללות שילוב של מיקרוגליה מובחנת לחלוטין באורגנואידים במוח בוגרים או אינדוקציה של התמיינות מיקרוגליה מהשלב המוקדם של גופים עובריים שמקורם ב-iPSC (EBs). הגישה הראשונה מפספסת את השלב שבו התמיינות מיקרוגליה מקיימת אינטראקציה עם הסביבה העצבית הסמוכה, והגישה המאוחרת מאתגרת מבחינה טכנית, וכתוצאה מכך חוסר עקביות בין האורגנואידים הסופיים מבחינת כמות ואיכות המיקרוגליה. כדי למדל אורגנואידים במוח עם מיקרוגליה כדי לחקור את האינטראקציות המוקדמות בין התפתחות מיקרוגליה והתפתחות עצבית, תאי אב המטופויאטיים טהורים מאוד (HPC) המובחנים מ-iPSCs אנושיים שולבו ב-EBs שמקורם ב-iPSC כדי ליצור אורגנואידים במוח. באמצעות צביעה חיסונית וניתוח ריצוף RNA חד-תאי (sc-RNA-seq), אישרנו ש-HPCs שולבו באורגנואידים התלת-ממדיים, שבסופו של דבר התפתחו לאורגנואידים במוח עם מיקרוגליה ונוירונים. בהשוואה לאורגנואידים במוח ללא HPC, גישה זו מייצרת שילוב משמעותי של תאי מיקרוגליאה באורגנואידים במוח. מודל אורגנואיד תלת מימדי חדשני זה, המורכב מתכונות התפתחות מיקרוגליאליות ועצביות כאחד, יכול לשמש לחקר האינטראקציות המוקדמות בין התפתחות מערכת החיסון המולדת והתפתחות מערכת העצבים ופוטנציאלית כמודל לדלקת עצבית והפרעות נוירו-זיהומיות.

מבוא

מיקרוגליה הם תאי חיסון במוח, הממלאים תפקידים קריטיים הן בהתפתחות המוח והן בהומאוסטזיס 1,2. הפעלת מיקרוגליה מביאה לייצור גורמים פרו-דלקתיים, פגוציטוזיס מוגבר ומתח חמצוני תגובתי, המסיר את הפתוגנים הפולשים והתאים שנפגעו. עם זאת, הפעלת יתר או הפעלה ממושכת של מיקרוגליה עלולה, לעומת זאת, לגרום לניוון עצבי כמנגנון של פתוגנזה בהפרעות נוירולוגיות רבות, כולל מחלת פרקינסון 3,4. חשוב שמיקרוגליה תיכלל במודלים הרלוונטיים לחקר הפרעות נוירולוגיות אנושיות. בשנים האחרונות נעשה שימוש בתאי גזע אנושיים לפיתוח אורגנואידים תלת מימדיים כמו מודלים במבחנה כחלופה למודלים של בעלי חיים ולמחקרים בבני אדם5. באופן אידיאלי, אורגנואידים אנושיים מהווים מספר סוגי תאים ומבני רקמות הדומים לאיברים אנושיים מקבילים, ומייצגים טוב יותר את הפיזיולוגיה והפתוגנזה האנושית מאשר מודלים של בעלי חיים, אך ללא החששות האתיים הכרוכים במחקרים על אנשים אנושיים ישירות. הם עשויים לייצג את העתיד של מודלים של מחלות אנושיות לחקר פתוגנזה ופיתוח תרופות ולהנחיית טיפולים פרטניים6. כדוגמה, אורגנואידים תלת מימדיים של מוח אנושי שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSCs) שלטו בתחום המחקר במדעי המוח, תוך מודלים של מחלות זיהומיות עצביות כולל ZIKA, SARS-CoV-27, ומחלות ניווניות כולל טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) ומחלת אלצהיימר 8,9. עם זאת, אורגנואידים עצביים תלת-ממדיים קונבנציונליים המשתמשים בעיכוב SMAD כפול כדי לגרום להתמיינות עצבית10 מייצרים אורגנואידים במוח חסרי מיקרוגליה, מכיוון שהם נגזרים מאבות שגויסו מהדם במקום משושלת הנוירו-אקטודרם שהנוירונים הםמ-11,12. ללא נוכחות מיקרוגליה, האורגנואידים אינם מספיקים למודל זיהומים במערכת העצבים המרכזית, דלקת וניוון עצבי נלווה.

כדי לטפל בבעיה קריטית זו, נעשו ניסיונות לשלב מיקרוגליה מובחנת באורגנואידים במוח13 או לגרום להתמיינות מיקרוגליאלית בתוך אורגנואידים מההתחלה באמצעות גישות חלופיות במקום עיכוב SMAD כפול13. עם זאת, על ידי שילוב מיקרוגליה מובחנת באורגנואידים במוח, האינטראקציות המוקדמות בין התפתחות עצבית ומיקרוגליה מתפספסות. זה יכול להיות חשוב בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית או בפתוגנזה של הפרעות נוירו-זיהומיות המכוונות להתפתחות המוח של תינוקות, כמו בזיהום בנגיף ZIKA14. מצד שני, הבחנה בין מיקרוגליה מולדת בתוך אורגנואידים במוח שמקורם ב-iPSC ללא שלבים לסירוגין כרוכה בתהליך ממושך ובעלת שונות גבוהה יותר בתוך התוצרים הסופיים15. בפרוטוקול מדווח זה, שילבנו את תאי האב ההמטופויאטיים (HPCs) שמקורם ב-iPSC לתוך ה-iPSCs כדי ליצור גופים עובריים (EBs), אשר התמיינו עוד יותר לאורגנואידים תלת-ממדיים הכוללים גם נוירונים וגם מיקרוגליה.

הפרוטוקול שלנו מספק גישה קלה שניתן לאמץ כדי לחקור את מערכת העצבים המרכזית האנושית הכוללת אינטראקציות עצביות-מיקרוגליאליות מוקדמות ופתוגנזה של הפרעות זיהומיות עצביות ודלקת עצבית הכוללת הפעלת מיקרוגליה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דגימות הדם המקוריות מתורמים בוגרים בריאים נאספו בבנק הדם לרפואת עירוי של ה-NIH, וטפסי הסכמה מדעת חתומים הושגו בהתאם לוועדת הביקורת המוסדית של ה-NIH.

1. ייצור תאי אב המטופויאטיים (HPCs) מ-iPSCs אנושיים

הערה: תאי iPSC אנושיים 510 ו-507 שימשו להפקת התוצאות המייצגות. ניתן למצוא את שיטות הייצור והתחזוקה של iPSCs בפרסום קודם16.

  1. יום 0: מצפים צלחת תאים של 12 בארות על ידי הוספת 500 מיקרוליטר לבאר של תמיסת מטריג'ל קרה כקרח (מטריצת קרום הבסיס [BMM]) המדוללת במדיום DMEM/F12 ודוגרים אותה לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  2. הסר את הציפוי לחלוטין והחלף אותו ב-1 מ"ל של מדיום E8 Flex לכל באר.
  3. בדוק את תרבית ה-iPSC בצלחת של 6 בארות מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שה-iPSCs הם באיכות גבוהה וללא סימני התמיינות. בחר מושבה בגודל בינוני על ידי סימון בעט טוש מתחת לתחתית הצלחת.
  4. הסר את המדיום מתרבית ה-iPSC והוסף לבאר 500 מיקרוליטר של מאגר דיסוציאציה iPSC של חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) (0.5 מ"מ EDTA, 0.45 גרם/ליטר NaCl ב-DPBS).
  5. התבוננו במיקרוסקופ בסימנים של דיסוציאציה של תאים כאשר שלוש עד ארבע שורות של תאים מקצוות המושבה מתחילות להתכווץ, כאשר חלל ריק מופיע בין התאים. זה בדרך כלל לוקח 1-3 דקות.
  6. השלך את תמיסת ה-EDTA לחלוטין. עקור את מושבת ה-iPSC המסומנת על ידי פיפטינג של 1 מ"ל של מדיום E8 Flex בכוח וישירות עליו. ודא שהמושבה מתנתקת לחלוטין למדבקות תאים המכילות 20-50 תאים כל אחד לאחר 1-3 פעמים של פיפטינג.
  7. אספו את הסופרנטנט המכיל טלאי תאים והוסיפו אותו לבאר הראשונה של הבארות המצופות בצלחת של 12 בארות.
  8. מערבבים את הבאר על ידי פיפטה פעם או פעמיים ומעבירים 1 מ"ל מהתאים לבאר השנייה המכילה 1 מ"ל מדיום.
  9. חזור על שלב 1.8 פעמיים כדי ליצור תרביות iPSC מדוללות סדרתיות בארבע בארות בסך הכל.
  10. דגרו את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  11. לאחר 24 שעות, ביום הראשון, בדקו את המושבות תחת המיקרוסקופ וספרו את מספר המושבות על ידי מעבר על כל השדות בבאר ברציפות. בחר באר אחת המכילה 10-20 מושבות iPSC.
  12. החלף את המדיום ב -1 מ"ל של מדיום A מהערכה ההמטופואטית. החזירו את הצלחת לחממה למשך 48 שעות.
  13. ביום השלישי, הסר 500 מיקרוליטר של מדיום משומש והוסף 500 מיקרוליטר של מדיום טרי A.
  14. ביום הרביעי, התבוננו תחת המיקרוסקופ והבחינו בצמיחה משמעותית של תאים והתמיינות ממושבות ה-iPSC. החלף את המדיום ב -1 מ"ל של בינוני B.
  15. עקוב אחר התמיינות התאים תחת המיקרוסקופ ובצע שינוי חצי בינוני עם 500 מיקרוליטר של מדיום B כל יומיים. התאים דמויי HPC מופיעים בימים 6-7.
  16. ביום העשירי, התבוננו תחת המיקרוסקופ בתאים עגולים בודדים בהירים עם מורפולוגיה של HPCs רגילים צפים בתווך או מחוברים באופן רופף לשכבה התחתונה היחידה של תאים שטוחים, עם כמה אגרגטים של תאים רופפים.
    הערה: ה-HPCs המובחנים מוכנים לאיסוף לאפיון או לניסוי נוסף.
  17. אסוף את כל ה-HPCs המובחנים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש פעמים באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל כדי לשבור את אגרגטים של התאים ולנתק את ה-HPCs משטח הצלחת.
  18. הוסף את התאים לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה את התאים ב -300 x גרם למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדורית התא ל-1 מ"ל של מדיום B.
  19. ספור את התאים והתאם את הריכוז למיליון תאים/מ"ל. בשלב זה נוצרים יותר ממיליון HPCs. כאשר בודקים עם ציטומטריית זרימה, ודא שהטוהר הוא יותר מ-85% מהתאים עם CD34+/CD43+. ודא שלא מבחינים בתאים מתים משמעותיים (יותר מ-5%).

2. פיתוח גופים עובריים מ-iPSCs ו-HPCs מעורבים

  1. באותו יום של איסוף ה-HPC, ודא שתרבית iPSC מגיעה גם למפגש של 80% בבאר אחת בצלחת של 6 בארות (או שתי בארות בצלחת של 12 בארות).
  2. טפל בבאר אחת של צלחת תרבית המיקרווול להיווצרות EB עם 500 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה נגד הידבקות על ידי הוספתה כדי למזער בועות.
  3. סובב את הצלחת ב-2000 x גרם למשך 5 דקות ברוטור דלי מתנדנד המצויד במחזיקי צלחות להסרת בועות אפשריות.
  4. הסר את תמיסת השטיפה לחלוטין על ידי פיפטינג ושטוף את הבארות פעמיים עם 1 מ"ל DPBS ולאחר מכן 1 מ"ל DMEM/F12 מבלי ליצור בועות.
  5. נתק את ה-iPSCs מהצלחת על ידי טיפול בתאים עם 1 מ"ל של תמיסת Accutase.
  6. התבוננו במיקרוסקופ עד שהתאים מראים סימני היפרדות אך עדיין מחוברים לתחתית. זה קורה בדרך כלל תוך 1-3 דקות מהטיפול ב-Accutase. אין לעכל יתר על המידה את תאי ה-iPSCs.
  7. הסר את תמיסת Accutase לחלוטין מבלי להפריע לתאים והוסף 1 מ"ל של מדיום DMEM/F12 לבארות. יתר על כן, נתק את התאים לתאים בודדים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כמה פעמים באמצעות קצה של 1 מ"ל.
  8. אוספים את התאים לצינור של 15 מ"ל וממלאים אותו ל-5 מ"ל במדיום DMEM/F12. סובב את התאים ב -300 x גרם למשך 5 דקות.
  9. הסר את הסופרנטנט על ידי פיפטינג והשעיה מחדש של התאים ב-1 מ"ל של מדיום E8 Flex. ספור את התאים והתאם את ריכוז התאים למיליון תאים למ"ל במדיום E8 Flex.
  10. ערבבו iPSCs עם HPCs ביחס של 2:1 על ידי הוספת מיליון iPSCs (1 מ"ל) וחצי מיליון HPCs (500 מיקרוליטר) יחד. הוסף את כל התאים המעורבים לבאר שטופלה בעבר בצלחת תרבית המיקרווול.
  11. הוסף 1 מיקרוליטר של מעכב סלע Y27632 תמיסת מלאי (1 מ"ל) לכל מדיום של 1 מ"ל לתוך הסופרנטנט. נענע את הצלחת מצד לצד כמה פעמים כדי לפזר את התאים באופן שווה.
  12. סובב את צלחת תרבית המיקרווול ב -300 x גרם למשך 5 דקות ברוטור דלי מתנדנד המצויד במחזיקי צלחות. התבוננו מתחת למיקרוסקופ כדי לראות אם התאים התיישבו במיקרו-בארות. (איור משלים 1A).
  13. מבלי להפריע לתאים, הכניסו את הצלחת לחממת תאים של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 .
  14. ביום השני, 48 שעות לאחר מכן, התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ להיווצרות EBs. כאשר ה-EBs נוצרים בבירור, המשיכו לשלב הבא (איור משלים 1B).
  15. טפל בצלחת תרבית תאים של 24 בארות עם מאגר שטיפה נגד הידבקות (500 מיקרוליטר) למשך 15 דקות כדי ליצור צלחת חיבור נמוכה.
  16. הסר את מאגר השטיפה לחלוטין ושטוף את הבארות פעמיים עם 1 מ"ל DPBS, ולאחר מכן הוסף 1 מ"ל של מדיום E8 Flex לבארות.
  17. השעו מחדש את ה- EBs בצלחת תרבית המיקרווול על ידי פיפטינג אותם עם קצה פיפטה פתח ברוחב 1 מ"ל למספר פעמים.
  18. עבור כל באר של 24 צלחות באר שטופלו בהיצמדות נמוכה, אספו והוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום המכיל EBs. זה יביא ל-10-20 EBs לבאר. הוסף מדיום E8 Flex לבאר הישנה המכילה את שאריות ה- EB כגיבויים.
  19. דגרו את הצלחת בחממת תאים של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 48 שעות.

3. 3D אינדוקציה, התפשטות והתבגרות של אורגנואידים עצביים

  1. ביום השני לאחר היווצרות ה-EB, יש להפשיר כמויות של BMM על קרח למשך 30 דקות לפחות.
  2. השתמש בקצה מקורר מראש של 20 מיקרוליטר, והוסף בחוכמה טיפת BMM קרה כקרח של 15 מיקרוליטר על גבי המדיום כדי לצפות את ה-EBs. זה יוצר סרט של BMM ש-EBs יתחברו אליו ויגדלו עליו.
  3. הכניסו את הצלחת לחממת תאים של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 .
  4. ביום 4, לאחר היווצרות ה-EB, הסר 500 מיקרוליטר של מדיום בזהירות מבלי להשליך EBs וחזור על ציפוי BMM על ידי ביצוע שלב 3.2.
  5. התחל מיד אינדוקציה עצבית על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מדיום אינדוקציה עצבית PSC על גבי התאים.
  6. בימים 6 ו-8, בצע שינוי חצי בינוני על ידי הסרה זהירה של 500 מיקרוליטר של מדיום מבלי לגעת בתאים והוספת 500 מיקרוליטר של מדיום אינדוקציה עצבית.
  7. בימים 10, 12 ו-14, בצע שינוי חצי בינוני עם מדיום תאי גזע עצביים (NSC): נוקאאוט DMEM/F12 + 1x תוסף גלוטמקס + 1x תוסף עצבי + bFGF + EGF.
  8. ביום ה-15, העבירו את כל באר הכדורים עם בינוני לצלחת חדשה של 12 בארות שטופלה בתמיסת שטיפה נגד הידבקות כפי שתואר קודם לכן. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום התבגרות עצבי (DMEM/F12 + 1x תוסף N2 + 1x תוסף B27 + 1x אנטיביוטיקה-אנטי-פטרייתי) על גבי התרבית.
  9. בצע שינוי חצי בינוני עם מדיום התבגרות עצבית אחת ליומיים.
  10. בשלב ההתבגרות, אם ישנם סימנים לדלדול התזונה, כגון שינוי צבע של המדיום, העבירו את האורגנואיד ל -6 צלחות באר, המחזיקות עד 3 מ"ל מדיום לבאר.
  11. לחלופין, 17 יום לאחר היווצרות ה-EB, השלם את מדיום ההתבגרות בציטוקינים (IL-34, M-CSF, TGF-β1, CD200, CX3CL1) למשך 6 ימים כדי להקל על התבגרות המיקרוגליה.
  12. ביום ה-23, אסוף את האורגנואידים העצביים המתקבלים לאפיון או לניסויים נוספים.

4. פינוי וצביעה חיסונית של אורגנואידים עצביים תלת מימדיים

  1. תקן עד 10 אורגנואידים על ידי טבילה ב-1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  2. העבירו את האורגנואידים לבאר לצלחת תחתונה שקופה של 96 בארות, ושטפו עם 200 מיקרוליטר DPBS פעמיים למשך שעה בכל פעם בניעור עדין.
  3. לחדור אורגנואידים על ידי שטיפתם פעם אחת ב-50% מתנול ב-DPBS, 80% מתנול במים מזוקקים כפולים (dd) ו-100% מתנול יבש למשך 10 דקות כל אחד, ב-4 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין.
  4. שטפו את האורגנואידים באופן סדרתי ב-20% DMSO/מתנול, 80% מתנול במי dd, 50% מתנול ב-DPBS, ב-100% DPBS, ולאחר מכן ב-DPBS עם 0.2% טריטון X-100, למשך 10 דקות כל אחד ב-4 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין. השתדלו להסיר את המאגר הנותר לחלוטין לאחר כל כביסה.
  5. דגירה במאגר חדיר (DPBS עם 0.2% טריטון X100, 0.3 M גליצין ו-20% DMSO) עם ניעור עדין למשך 40 דקות ב-RT.
  6. חסום את המאגר החוסם (DPBS עם 0.2% Triton X100, 6% סרום עיזים ו-10% DMSO) למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין על שייקר ב-80 סל"ד.
  7. דגירה עם נוגדנים במאגר דילול נוגדנים (IBA1 1:100, TREM2 1:100, βIII-tubulin, 1:1000, 100 מיקרוליטר /באר ב-DPBS עם 0.2% Tween 20, 100 מיקרוגרם/מ"ל הפרין, 3% סרום עיזים ו-5% DMSO) ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים או בחדר קירור עם ניעור עדין ב-80 סל"ד למשך 3 ימים.
  8. שטפו עם DPBS עם 0.2% Tween 20, 100 מיקרוגרם/מ"ל הפרין 5 פעמים, 10 דקות כל אחד ב-RT עם ניעור עדין על שייקר ב-80 סל"ד.
  9. דגירה עם נוגדן משני (1:200 עז נגד עכבר Alexa488) ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה ואחריה RT למשך הלילה עם ניעור עדין על שייקר ב-80 סל"ד.
  10. עבור צביעת ניגודיות גרעינית, בצע צביעת DAPI יחד עם דגירה של נוגדנים או במאגר כביסה.
  11. שטפו את האורגנואידים 10 פעמים במאגר כביסה, 10 דקות בכל פעם בחום של 37 מעלות צלזיוס, בניעור עדין.
  12. התבוננו במיקרוסקופ. אם הרקע עדיין גבוה, המשך לשטוף אותו 5 פעמים.
  13. השליכו את הסופרנטנט ככל האפשר. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת פינוי אורגנואידים ודגר אותה למשך 5 דקות לפני התצפית וצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול שלנו עוקב אחר סכימה להבדיל בין HPCs ל-iPSCs ואז לערבב את ה-HPCs עם iPSCs כדי ליצור EBs, ואחריהם אינדוקציה עצבית, התמיינות והתבגרות (איור 1). איכות גבוהה של התמיינות HPC היא קריטית להצלחת היווצרות EB ובהמשך התמיינות אורגנואידים. טכניקת תרבית דילול סדרתי משמשת לייצור המספרים והגודל המתאימים של מושבות iPSC כדי להתחיל את התמיינות ה-HPC (איור 2A). בדרך כלל, מושבות iPSC יעברו שינויים מורפולוגיים משמעותיים בסוף התרבית במדיום A...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, מוצג פרוטוקול מפורט ליצירת אורגנואידים עצביים תלת מימדיים המכילים מיקרוגליה מולדת מ-EBs שמקורם ב-iPSCs מעורבים ו-HPCs מובחנים ב-iPSC. זוהי גישה קצרה וקלה יחסית הכוללת רק טכניקות וציוד תרבית תאים הזמינים בדרך כלל ברוב המעבדות.

הגורם הקריטי ביותר להצלחת פרוטוקול זה הוא איכות הבידול של HPC. אימצנו את השיטהשפורסמה 17 תוך שימוש בערכה מסחרית כדי להבדיל בין HPCs ל-iPSCs עם כמה שינויים. בהשוואה לפרוטוקול המקורי, אנו מתחילים עם גודל קטן יות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי קרנות מחקר פנימיות של NINDS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
12 צלחות תרבית תאים בארקורנינג #3512
צלחת תרבית תאים 24 בארSARSTEDT#83.3922
AccutaseThermoA1110501
Aggrewell 400 צלחתטכנולוגיות תאי גזע#34411מכונה צלחת תרבית מיקרווול 
Alexa Fluor 488 נוגדן נגד עכבר עיזיםLife techniologiesA110011:400 דילול
Alexa Fluor 594 נוגדן נגד ארנב עזיםLife techniologiesA110121:400 דילול
Allegra X-30R צנטריפוגה עם רוטור S6069בקמן קולר
נגד הדבקות  תמיסת שטיפהטכנולוגיות תאי גזע#07010
נוגדן CD34טכנולוגיות תאי גזע#600131:100 דילול
אנטי-אנושי CD43 נוגדןתאי גזע#600851:100 דילול
אנטי-IBA1 נוגדן רבביטפוג'יפילם019-197412.5 ומיקרו; g/mL
anti-TREM2  חולדות pAbRD Systemsmab172912.5 µ גרם/מ"ל
אנטיביוטיקה-אנטי-פטרייתGibco15240-0621x
תוסף B27טכנולוגיות חיים17504-0441x
bFGFPeprotech100-18B20 ננוגרם/מ"ל
CD200נובופרוטאיןC311  בקבוקוני CryoTube 100 ננוגרם/מ"ל
Thermo#368632
CX3CL1Peprotech300-31  100 ננוגרם/מ"ל
DAPISigmaD95421 ומיקרו; g/mL
DMEM/F12Life technologies12400-0241x
DMSOSigmaD2650
DPBSGibco#41901361x
E8 Flex ערכה בינוניתתרמוA2858501
EDTAMediatech46-034-Cl 0.5 מ"מ
EGFPeprotechAF-100-1520 ng/mL
EVOS FL מיקרוסקופ אוטומטי מיקרוסקופתרמופלואורסצנטי 
FastStart אוניברסלי SYBR ירוק PCR מאסטר מיקסRoche#4913850001
GlutamaxGibco#35050079
סרום עיזיםSigmaG90234%
IL-34Peprotech200-34  100 ננוגרם/מ"ל
מולקולרייםמיקרו קונפוקליים
נוקאאוט DMEM/F12Gibco#10829018
M-CSFPeprotech300-25  25 ננוגרם/מ"ל
MatrigelCorning#354277מטריצת ממברנת הבסיס (BMM)
עכבר אנטי ובטא; נוגדן III-tubulinPromegaG712A1:1000 דילול
מר מיכל פרוסטיתרמו5100-0001
N2 תוסףטכנולוגיות חיים17502-0481x
ParaformadehydeSigmaP61484%
PSC אינדוקציה עצבית בינוניתGibcoA1647801
מעכב סלע Y27632תא גזע technologies#723041 מ"מ מלאי
RT LTS 1000 ul קצות פיפטהRAININ#30389218  להעברת אורגנואידים
STEMdiff ערכת אורגנואידים מוחיתטכנולוגיות תאי גזע #08570
STEMdiff Hematopoietic KitStemCell Technologies#5310המכונה ערכה המטופויאטית
תוסף עצבי StemProGibcoA1050801המכונה תוסף עצבי
TGF-β 1Peprotech100-2150 ng/mL
Total RNA Purification Plus KitNorgen#48400
TritonX-100SigmaT92840.10%
Visikol Histo-Starter KitVisikolHSK-1מכיל תמיסת ניקוי אורגנואידים HISTO-M, מאגר כביסה
Zeiss LSM 510-META מיקרוסקופ קונפוקליZeiss
טכנולוגיות ImageXpress מכשירים

מקורות

  1. Sabate-Soler, S., et al. Microglia integration into human midbrain organoids leads to increased neuronal maturation and functionality. Glia. 70 (7), 1267-1288 (2022).
  2. Lazarov, T., Juarez-Carreño, S., Cox, N., Geissmann, F. Physiology and diseases of tissue-resident macrophages. Nature. 618 (7966), 698-707 (2023).
  3. Wang, T., Liu, B., Zhang, W., Wilson, B., Hong, J. S. Andrographolide reduces inflammation-mediated dopaminergic neurodegeneration in mesencephalic neuron-glia cultures by inhibiting microglial activation. J Pharmacol Exp Ther. 308 (3), 975-983 (2004).
  4. Qian, L., Flood, P. M., Hong, J. S. Neuroinflammation is a key player in Parkinson's disease and a prime target for therapy. J Neural Transm (Vienna). 117 (8), 971-979 (2010).
  5. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  6. Fakıoğlu, D. M., Altun, B. New therapeutic approaches in cystic fibrosis. Turk J Pharm Sci. 17 (6), 686-697 (2020).
  7. Mcmillan, R. E., Wang, E., Carlin, A. F., Coufal, N. G. Human microglial models to study host-virus interactions. Exp Neurol. 363, 114375(2023).
  8. Scopa, C., et al. Jun upregulation drives aberrant transposable element mobilization, associated innate immune response, and impaired neurogenesis in Alzheimer's disease. Nat Commun. 14 (1), 8021(2023).
  9. Tamaki, Y., et al. Spinal cord extracts of amyotrophic lateral sclerosis spread TDP-43 pathology in cerebral organoids. PLoS Genet. 19 (2), e1010606(2023).
  10. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and IPS cells by dual inhibition of smad signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  11. Kim, S. H., Chang, M. Y. Application of human brain organoids-opportunities and challenges in modeling human brain development and neurodevelopmental diseases. Int J Mol Sci. 24 (15), 12528(2023).
  12. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  13. Ormel, P. R., et al. Microglia innately develop within cerebral organoids. Nat Commun. 9 (1), 4167(2018).
  14. Abdelmalek, C. M., et al. Building a growing genomic data repository for maternal and fetal health through the ping consortium. medRxiv. , (2024).
  15. Wei, Z., et al. Human IPSC-derived brain organoids: A 3D mini-brain model for studying HIV infection. Exp Neurol. 364, 114386(2023).
  16. Wang, T., et al. Regulation of stem cell function and neuronal differentiation by HERV-K via mTOR pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (30), 17842-17853 (2020).
  17. Mcquade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Mol Neurodegener. 13 (1), 67(2018).
  18. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  19. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 12 (1), 7302(2021).
  20. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  21. Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
  22. Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 186 (10), 2111-2126.e20 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNA
גזירה של אורגנואיד מוח אנושי עם התפתחות מיקרוגליה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.