מאמר שיטה

זיהוי מהיר וספציפי של זיהומי אצינטובקטר באומני באמצעות הגברת פולימראז רקומבינאז/מערכת מבוססת Cas12a

DOI:

10.3791/67542

⸱

25 באפריל 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Practice, The First Hospital of Jilin University, 2Department of Respiratory Medicine, Center for Pathogen Biology and Infectious Diseases, The First Hospital of Jilin University, 3Bioinformatics Laboratory, The First Hospital of Jilin University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להקל על הזיהוי המהיר והמדויק של Acinetobacter baumannii, אנו מציגים פרוטוקול המשתמש בהגברה רקומבינאז פולימראז (RPA) בשילוב עם אנדונוקלאז LbaCas12a לזיהוי זיהומי A. baumannii .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Acinetobacter baumannii, חיידק גרם שלילי, ידוע לשמצה בגרימת זיהומים חמורים עם שיעורי תמותה גבוהים. זיהוי מהיר ומדויק של A. baumannii הוא חיוני לטיפול מהיר, בקרת זיהום יעילה וריסון עמידות לאנטיביוטיקה. עם זאת, אין שיטה מתאימה לזיהוי מהיר וקל באתר של A. baumannii. מערכת ה-DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR) מציעה גישה מהירה, מדויקת ורגישה לזיהוי A. baumannii על ידי שילוב יכולות הזיהוי הספציפיות למטרה של Cas12a עם יעילות ההגברה האיזותרמית של הגברת פולימראז רקומבינאז (RPA). פרוטוקול זה מפרט את הזיהוי של A. baumannii באמצעות RPA בשילוב עם אנדונוקלאז LbaCas12a. השלבים הבאים מתוארים במאמר זה: מיצוי DNA, בחירת רצף DNA ספציפי, תכנון פריימר ו-CRISPR RNA (crRNA), בניית פלסמיד רקומביננטי חיובי, הגדרת בדיקת Cas12a-RPA, אופטימיזציה של מערכת ההגברה RPA, הדמיה של בדיקת RPA-CRISPR/Cas12a באמצעות כלי זיהוי פלואורסצנטי כגון מכשיר PCR בזמן אמת, והערכת רגישות והערכת ספציפיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במיקרוביולוגיה קלינית, איתור זיהומי Acinetobacter baumannii מהווה אתגר משמעותי. חיידק גרם שלילי זה יכול לגרום לזיהומים עם תסמינים קליניים חמורים, אפילו עם שיעורי תמותה גבוהים, במיוחד בקרב חולים מדוכאי חיסון1. שיטות זיהוי מסורתיות מבוססות תרבית לזיהומים פתוגנים גוזלות זמן ועשויות להיות חסרות רגישות, מה שעלול לעכב את הטיפול האנטיביוטי ולפגוע בתוצאות המטופלים. זיהוי מהיר ומדויק של A. baumannii הוא חיוני לטיפול יעיל ולבקרת התפרצויות. טכניקות מולקולריות המשתמשות בהגברה של חומצות גרעין נחקרו כדי לענות על צורך זה. עם זאת, גישות אלו זקוקות לרוב לציוד רכיבה תרמי מתוחכם ועשויות להיות מוגבלות על ידי טכנאים מאומנים היטב ומעבדות מבוססות היטב. כדי להתגבר על אתגרים אלה, המחקר מתמקד יותר ויותר בפיתוח שיטות הגברה איזותרמיות 2,3,4.

הגברת פולימראז רקומבינאז (RPA) היא שיטה שהוקמה על ידי Piepenburg et al 5 ומשמשת להגברת DNA, בדומה לתגובת שרשרת פולימראז (PCR) אך ללא צורך במחזור טמפרטורה. שיטה זו כוללת 50 מ"מ טריס (pH 7.5), 100 מ"מ אשלגן אצטט, 14 מ"מ מגנזיום אצטט, 2 מ"מ DTT, 5% PEG20000 (פוליאתילן גליקול במשקל מולקולרי גבוה), 200 מיקרומטר dNTPs, 3 מ"מ ATP, 50 מ"מ פוספוקריאטין, 100 מיקרוגרם/מ"ל קריאטין קינאז, 120 מיקרוגרם/מ"ל UvsX, 30 מיקרוגרם/מ"ל UvsY, 900 מיקרוגרם/מ"ל Gp32, 30 מיקרוגרם/מ"ל Bsu LF, 450 ננומטר פריימרים ותבניות DNA. תהליך ההגברה מתחיל עם החלבון הרקומבינאז UvsX שנקשר לפריימרים בנוכחות 3 מ"מ ATP ו-5% PEG20000 יצירת קומפלקס רקומבינאז-פריימר. קומפלקס זה מקל על השילוב של פריימרים עם הרצפים ההומולוגיים על ה-DNA הדו-גדילי.

בעזרת UvsY, ה-UvsX הרקומבינאז מקל על ההחלפה בין הפריימר לגדיל התבנית, וכתוצאה מכך תזוזה של גדיל אחד של ה-DNA המטרה. Gp32 מסייע בשמירה על מבנה ה-DNA החד-גדילי. לבסוף, הרקומבינאז מתנתק, ו-DNA פולימראז (Bsu LF) המסוגל לעקור גדילי DNA נקשר לקצה ה-3' של הפריימר, ומאריך אותו בנוכחות דאוקסיריבונוקלאוזידים טריפוספטים (dNTPs). תהליך זה חוזר על עצמו באופן מחזורי, ומשיג הגברה אקספוננציאלית. ניתן להשלים את כל תהליכי ההגברה תוך 20-40 דקות ובטמפרטורות קבועות יחסית בין 37 מעלות צלזיוס ל-42 מעלות צלזיוס. טווח טמפרטורות זה זהה בערך לטמפרטורות פיזיולוגיות, מה שמאפשר לבצע RPA בסביבה מינימליסטית, מה שהופך את RPA לכלי רב-תכליתי ויעיל לזיהוי וניתוח DNA.

מערכת החזרות הפלינדרומיות הקצרות (CRISPR) ומערכת החלבון הקשור ל-CRISPR (CRISPR-Cas) מתפקדת כמנגנון חיסוני אדפטיבי בחיידקים וארכאונים, הכוללים מערכות Class I ו-Class II. Class II כולל חלבונים כגון Cas12 (a, b, f), Cas13 (a, b) ו-Cas14, המזהים ומבקעים DNA או RNA מטרה מונחה על ידי CRISPR RNA (crRNA)6,7,8. LbaCas12a (או Cpf1) הוא אנדונוקלאז DNA מונחה crRNA. ה-crRNA משמש כ-RNA מנחה בתוך מערכת CRISPR-Cas, שם הוא מתחבר עם חלבוני Cas. הוא ממנף את אזור המרווח שלו כדי לזווג עם ה-DNA של המטרה, ולמעשה מנווט את קומפלקס החלבון לרצפי המטרה. הרצף 5'-UAAUUUCUACUAAGUGAUGAU-3' משמש כחזרת crRNA משומרת, אלמנט קבוע בכל ה-crRNAs של LbaCas12a. לאחר חזרה זו מופיע קטע ספציפי למטרה השונה בהתאם ליעד ה-DNA המיועד. רצף מטרה זה נע בין 18 ל-24 נוקלאוטידים.

רצף ה-PAM (Protospacer-Adjacent Motif) (TTTV, כאשר V יכול להיות A, C או G) ממוקם בקצה 5' של הגדיל הלא משלים של יעד ה-DNA. ה-Cas12a חותך את ה-DNA הדו-גדילי ברצף ה-PAM. לאחר מכן, חלבוני ה-Cas המופעלים מבצעים טרנס-פיצול לא ספציפי של DNA חד-גדילי (ssDNA)9,10,11,12. לפיכך, ssDNA המסומן עם פלואורופור ומרווה עובר מחשוף, וכתוצאה מכך פליטה של אות פלואורסצנטי לאחר מחשוף צדדי 8,13. ניתן לכמת את עוצמת הקרינה באמצעות קורא פלואורסצנטי לזיהוי מדויק של חומצות גרעין14. יש לציין כי Cas12a נמצא בשימוש נרחב לניתוח DNA, כאשר הקישור והפיצול של רצפי המטרה שלו מותנים בזיהוי המוטיב הסמוך לפרוטו-ספייסר (PAM), בעוד ש-Cas13a פועל ללא תלות בדרישה כזו.

מערכות CRISPR-Cas 15,16,17 מקלות על מחשוף בתוך תגובה אחת 18,19,20,21. שילוב של שני הנ"ל יכול ליצור כלי חזק המכונה A. baumannii-DETECTR (LbaCas12a-Enabled Detection of Targeted A. baumannii) לזיהוי חומצות גרעין 22,23,24. פרוטוקול זה מדגים את השימוש ב-RPA בשילוב עם פעילות ה-DNase של Cas12a כדי למקד ולבקע באופן ספציפי רצף מונחה crRNA בתוך גן ה-rDNA 16s של A. baumannii, ובכך לאפשר זיהוי רגיש ומדויק של הפתוגן.

שיטת A. baumannii-DETECTR מציגה מספר יתרונות על פני שיטות זיהוי קונבנציונליות25,26. ראשית, המאפיין האיזותרמי של RPA מייעל את ההליכים התפעוליים ומפחית עלויות באמצעות מנגנון ההגברה הבלתי תלוי במחזור התרמי שלו5. שנית, האנדונוקלאז Cas12a מגדיל את הספציפיות של הבדיקה באמצעות מיקוד בתיווך crRNA וזיווג בסיס ווטסון-קריק7. לבסוף, שימוש בשיטת הצינור האחד של A. baumannii-DETECTR לא רק חוסך זמן אלא גם מפחית משמעותית את הסיכון לזיהום אמפליקון19.

הפרוטוקול מתאר שלבים למיצוי מיצוי DNA, בחירת רצפי DNA מטרה, תכנון פריימרים ו-crRNAs, בניית פלסמידים רקומביננטיים חיוביים, הקמת מבחן Cas12a-RPA, אופטימיזציה של אופטימיזציה של הגברת RPA והדמיה של תוצאות באמצעות כלים לזיהוי פלואורסצנטי כגון מכונת PCR בזמן אמת, עם הערכות רגישות וספציפיות.

שיטת A. baumannii-DETECTR מבטיחה בשיפור תוצאות המטופלים על ידי הקלה על טיפול בזמן ויעיל, בקרת זיהום חזקה ובלימת התפשטות עמידות לאנטיביוטיקה. פרוטוקול זה יכול לשמש כהנחיה מקיפה ליישום טכנולוגיית Cas12a-RPA, ולשפר את התועלת שלה במסגרות בריאות שונות. עם זאת, חשוב לציין שכל שלב צריך להיות אופטימלי על סמך תנאי מעבדה ספציפיים ומגוון הדגימות כדי להבטיח תוצאות עקביות ואמינות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בניית ה-A. baumannii -DETECTR

הערה: הבנייה של A. baumannii-DETECTR היא תהליך בן ארבעה שלבים הכולל תכנון של פריימר ו-crRNA, בניית בניית פלסמיד רקומביננטי חיובי, הכנת פתרונות תגובה, הגברת DNA איזותרמית על ידי RPA והדמיה של בדיקת RPA-CRISPR/Cas12a. הסכימה של מבחן ה-DETECTR מודגמת באיור 1.

  1. תכנון פריימר ו-crRNA (ראה קובץ משלים 1)
    1. תכנון 12 זוגות פריימרים באמצעות כלי עיצוב על בסיס עקרונות עיצוב פריימר. השג ארבעה פריימרים קדימה (F0-F3) ושלושה פריימרים הפוכים (R1-R3) כדי להרכיב שנים עשר זוגות פריימרים (F0R1, F0R2, F0R3, F1R1, F1R2, F1R3, F2R1, F2R2, F2R3, F3R1, F3R2, F3R3).
      1. ודא שקצה ה-5' של הפריימר מכיל בסיסי C או T בתוך 3-5 הנוקלאוטידים הראשונים במקום מתיחת G רציפה. בנוסף, ודא ששלושת הנוקלאוטידים האחרונים בקצה 3' הם באופן אידיאלי בסיסי G ו-C כדי לשפר את ההגברה.
      2. תכנן פריימרים ללא רצפים משלימים את עצמם כדי למנוע היווצרות סיכות ראש ועם לא יותר מארבעה בסיסים משלימים או הומולוגיים ביניהם. התרחק מהשלמת קצה 3' כדי למנוע דימריזציה של פריימר.
    2. העריכו את הספציפיות של כל זוג פריימרים באמצעות כלי Primer-BLAST של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI) כדי להעריך את היעילות והספציפיות של הפריימרים.
      הערה: Primer-BLAST יכול להשתמש במסד הנתונים של NCBI כדי למצוא רצפים התואמים את הפריימרים המתוכננים, ולעזור למשתמשים להעריך את היעילות והספציפיות של הפריימרים.
    3. לאחר הקרנת הפריימר, תכנן את ה-CRISPR RNA (crRNA) או ה-RNA המנחה (gRNA) באמצעות רצף פיגומי LbaCas12a crRNA (5'-UAAUUUCUAAGUGUAGAU-3') כרצף הקבוע. שלב קטע ספציפי למטרה (5'-GUUAAUACCUAGAGAUAGUG-3'), וודא שמוטיב ה-PAM ממוקם בקצה 5' של הגדיל הלא משלים.
      הערה: הרצפים של כל האוליגונוקלאוטידים וה-crRNA מוצגים בטבלה 1.
  2. בניית פלסמיד רקומביננטית חיובית
    1. הגבירו את מקטע ה-rDNA של 16 שניות באמצעות ערכת הפריימר A. baumannii 16s rDNA-F (פריימר קדימה) ו-A. baumannii 16s rDNA-R (פריימר הפוך).
      1. הוסף 1 μL של 10 μM F ו-10 μM R, 10 μL של מאגר pFu מהירפי 5, 1 μL של pFu פולימראז מהיר, 4 μL של 2.5 mM dNTPs, 1 μL של 10 ng/μL A. baumannii DNA גנומי ו-32 μL של מים נטולי נוקלאז למערכת 50 μL PCR.
      2. הגדר את תנאי הרכיבה של PCR כדלקמן: דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריה 33 מחזורי דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך דקה ו-20 שניות. לבסוף, בצע 10 דקות ב-72 מעלות צלזיוס להארכה הסופית.
    2. כדי לטהר את מוצר ה-PCR החיובי, השתמש בערכת טיהור DNA בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, שכפל את ה-DNA המטוהר לווקטור pUC57, שעוכל עם אנזימי BamHI ו-SalI.
      הערה: תהליך זה יביא ליצירת פלסמיד רקומביננטי חיובי המכיל אזור שמור.
    3. לדלל את הפלסמיד הרקומביננטי החיובי באופן סדרתי במרווחים של פי עשרה עם ddH2O מעוקר כדי להשיג ריכוז של עותק אחד/מיקרוליטר ל-107 עותקים/מיקרוליטר. אחסן את הפלסמיד המדולל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לניסויים הבאים.
  3. הכנת פתרון
    1. הכן את פתרון A באופן הבא: עבור כל תגובה, הוסף 29.5 מיקרוליטר של מאגר התייבשות ללא פריימר, 2.4 מיקרוליטר של 10 מיקרומטר A. baumannii-F ו-10 מיקרומטר A. baumannii-R, ו-12.2מיקרוליטר של ddH2O כדי להשיג נפח סופי של 46.5 מיקרוליטר מערבולת וסובב לזמן קצר. לאחר מכן, הוסף את תערובת התגובה לצינורות תגובת האנזים מערכת RPA. פיפטה לערבב.
      הערה: הפריימרים של A. baumannii-F ו-R משמשים בבדיקה המכוונת לגן A. baumannii . אנא עיין בטבלה 1 לרצף.
    2. הכן את פתרון B באופן הבא: עבור כל תגובה, הוסף 0.24 μL של 10 μM ssDNA reporter, 2 μL של 10x Cas12a Reaction Buffer, 1 μL של 1 μM crRNA, 1 μL של 1 μM Cas12a ו-10.76μL של ddH2O כדי להשיג נפח סופי של 15 μL.
      הערה: הבדיקות (מדווח ssDNA) נרכשו והורכבו ממדווח DNA חד-גדילי שתויג עם פלואורופור 5-Carboxyfluorescein (FAM) בקצה 5' ומרווה חור שחור 1 (BHQ1) בקצה 3'. במקרה של דגימות רבות הזקוקות לזיהוי, הכינו כמות משמעותית של תמיסה B, ולאחר מכן חלקו את הדגימות למנות מאוחר יותר.
  4. הגברת DNA איזותרמית (RPA)
    1. הוסף 1 מיקרוליטר של הפלסמיד הרקומביננטי החיובי של 107 עותקים/מיקרוליטר לתמיסה A עם זוגות פריימר שונים; מערבבים היטב. לאחר מכן, הוסיפו לתמיסה 2.5 מיקרוליטר של 280 מ"מ מגנזיום אצטט (MgOAc) וערבבו היטב.
      הערה: תגובות RPA מתחילות ברגע שמוסיפים MgOAc.
    2. יש לדגור בטמפרטורה של 39 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר 20 דקות, טהר את המוצרים המוגברים עם פריימרים שונים באמצעות RPA עם ערכת טיהור, ולאחר מכן הפעל את המגפליקונים הנקיים על ג'ל אגרוז 1% ב-120 וולט למשך 10 דקות כדי לבחור את הרצועה הבהירה והרחבה ביותר כזוג הפריימר הטוב ביותר.
      הערה: למספר עותק תבנית נמוך, לאחר 4 דקות, הסר את צינור ה-EP, המערבולת וסובב לזמן קצר; לאחר מכן החלף אותו במכשיר החימום למשך 16 דקות נוספות. לאחר ההגברה, יש לפתוח את הצינורות בזהירות רבה כדי למנוע זיהום משטחי עבודה במגברים. אמצעי זהירות זה יפחית את הסיכון לגרימת תוצאות חיוביות כוזבות בהליכים ניסיוניים הבאים.
  5. אופטימיזציה של מערכת הגברה RPA
    הערה: זוג הפריימר האופטימלי F3R3 שנבחר בשלב הקודם הוגדר לריכוזים סופיים שונים עבור תגובת הגברה של RPA כדי לסנן את ריכוז הפריימר והזמן האופטימליים. NC הוא בקרה ריקה עבור ריכוז הפריימר המתאים.
    1. שמור על ריכוזי הרכיבים האחרים קבועים ועל הנפח הכולל של 46.5 מיקרוליטר בתמיסה A. התאם את נפח ה-ddH2O נטול RNase בהתאם כדי להשיג את ריכוזי הפריימר הסופיים של 10 μM F3 ו-10 μM R3 ב-0.40 μM (2.0 μL), 0.44 μM (2.2 μL), 0.48 μM (2.4 μL) ו-0.52 μM (2.6 μL), בהתאמה.
    2. דגירה בטמפרטורה של 39 מעלות צלזיוס לזמנים שונים: 10 דקות, 20 דקות, 30 דקות.
    3. נקו את מוצרי ה-RPA באמצעות ערכת טיהור DNA ובצעו אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 1% ב-120 וולט למשך 10 דקות כדי לזהות את ריכוז הפריימר וזמני הדגירה האופטימליים על ידי ניתוח מאפייני הרצועות.
  6. הדמיה של בדיקת RPA-CRISPR/Cas12a
    1. מוסיפים 5 מיקרוליטר ממוצר ה- RPA לתמיסה B ומערבבים היטב עד לקבלת תערובת אחידה.
    2. הנח את הדגימות במכשיר ה-PCR הכמותי הקרינה, הגדר את ערוץ ה-FAM וקרא את הערכים כל דקה במשך 60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, פי 60 בסך הכל 60 דקות.
      הערה: אות פלואורסצנטי ירוק יכול להימשך מספר ימים. כדי לוודא שהמערכת פועלת ביעילות, עדיף לבצע בדיקת DNA ו-RNase ללא DNASE.

2. הערכת ספציפיות של פלטפורמת הזיהוי מבוססת RPA-CRISPR/Cas12a

הערה: כדי לבדוק את הספציפיות של A. baumannii-DETECTR, חומצות הגרעין של A. baumannii, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Rickettsia mooseri, Enterobacter, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Chlamydia psittaci, Legionella, Cockerella burnetii, Serratia ודגימות אנושיות הועברו לבדיקת DETECTR.

  1. השתמשו בתבניות דנ"א שהתקבלו ממינים שונים על ידי שימוש בערכת הדנ"א המוזכרת או בידודן על ידי הרתחת החיידקים במים. ודא שלכל התבניות יש ריכוזים שווים. השתמש במים כבקרה שלילית.
  2. הוסף 10 ננוגרם או 1 מיקרוליטר של תבניות DNA לפתרון A המכיל פריימרים F3R3. מוסיפים 2.5 מיקרוליטר MgOAc, מערבבים היטב ודוגרים את התערובת בחום של 39 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  3. לאחר 20 דקות מוסיפים 5 מיקרוליטר מהמוצר מהשלב הקודם לתמיסה B ומערבבים.
  4. הנח במכשיר ה-PCR הכמותי הקרינה, הגדר את הערוץ ל-FAM וקרא את הערך אחת לדקה ב-37 מעלות צלזיוס, בסך הכל 60 x למשך 60 דקות.

3. הערכת רגישות של פלטפורמת הזיהוי מבוססת RPA-CRISPR/Cas12a

  1. השתמש בפלסמיד רקומביננטי חיובי, שהוכן לריכוז של 1-107 עותקים/מיקרוליטר, כתבנית לתגובה. השתמש במים לשליטה שלילית.
  2. בצע את השיטה על ידי ביצוע שלבים 2.2-2.4.
    הערה: ערכת הפריימר RPA-F3 ו-RPA-R3 נועדה להגביר שבר קצר יותר של 174 זוגות בסיסים מהפלסמיד הרקומביננטי החיובי.

4. הכנות בזמן שהדגימה נמצאת תחת אור UV וזיהוי LFS

  1. הוצא את המספר הנדרש של רצועות בדיקה ותייג אותן כראוי.
  2. העבירו 10 מיקרוליטר מהמוצרים המוגברים משלבים 2 ו-3 לצינורות PCR נפרדים, בהתאמה. לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר של ddH2O לכל צינור.
    הערה: אם משתמשים במערכת תגובה בהכנה עצמית, מומלץ לבחון את יחס הדילול האופטימלי.
  3. בצע את הבדיקה.
    1. הכניסו את צינור ה-PCR המכיל את המוצרים המוגברים לטרנס-מאיר כדי להעריך את נוכחות הקרינה.
    2. הכנס את רצועות הבדיקה לתוך צינורות ה-PCR כשקצה כרית הדגימה פונה כלפי מטה.
    3. תן לו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות כדי לקרוא את התוצאה. לאחר זמן זה, ודא שמפלס הנוזל אינו חורג מהקו המקסימלי לפני שתמשיך הלאה.
    4. פרש את התוצאות כשליליות אם קו T אינו מציג צבע. פרש את התוצאות כחיוביות אם קו ה-T נראה לעין בלתי, מה שמצביע על כך שבדיקת חומצת הגרעין נבקעה על ידי האנזים Cas, והאנזים Cas הופעל. קחו בחשבון את התוצאה כלא חוקית אם לא בקו C ולא בקו T מופיע צבע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, אנו מציגים פלטפורמת אבחון חדשה וניידת בשם A. baumannii-DETECTR, המשלבת את יעילות ההגברה האיזותרמית של מערכת RPA ו-CRISPR-Cas12a לזיהוי שדה מהיר ואמין של A. baumannii. הסכימה של מבחן ה-DETECTR מודגמת באיור 1.

שנים עשר זוגות פריימרים תוכננו באמצעות כלי עיצוב על בסיס עקרונות עיצוב פריימר. התקבלו ארבעה פריימרים קדמיים (F0-F3) ושלושה פריימרים הפוכים (R1-R3), וכתוצאה מכך נוצרו ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לשיטות אבחון מסורתיות לזיהומי A. baumannii יש מגבלות שונות שהופכות אותן לפחות נגישות ואפשריות לבדיקות נקודתיות27. לדוגמה, ל-PCR יש רגישות וספציפיות טובות אך מחייב ציוד מיוחד לרכיבה תרמית ותהליכי עבודה מורכבים שחייבים להיות מופעלים על ידי אנשי מקצוע. השיטה החדשנית המוצגת כאן, המשלבת עריכת גנום RPA ו-CRISPR-LbaCas12a עם רקומבינריה, הידועה בשם מבחן A. baumannii-DETECTR, מאפשרת מניפולציה גנטית יעילה. הוא מספק שיטת זיהוי מהירה, רגישה וספציפית לזיהומי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט תוכנית פיתוח המדע והטכנולוגיה של מחוז ג'ילין, סין (20240305027YY) ומחלקת הכספים של מחוז ג'ילין (JLSWSRCZX2023-55, JLSWSRCZX2021-041).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
 -20 ° מקפיא C HaierHYCD-290סין
Agarose BasicBioFroxx1110GR100סין
כל האוליגונוקלאוטידים וה-crRNA סונתזו על ידי החברהwww.comatebio.com
מצע חיתוך Cas12a - ssDNA - סוג פלואורסצנטיEZassay Biotech. בע"מDNA-FAM-BHQמצע
חיתוך סין Cas12a - ssDNA - סוג נייר בדיקהEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BIOסין
מכשיר אלקטרופורזהBIO-RADPOWERארה"ב
מכשיר PCR כמותי פלואורסצנטיBIO-RADCFXCONNECT ארה"ב
הדמיית ג'לBIO-RADGel Doc 2000ארה"ב
https://ezassay.com/rna
https://www.ezassay.com/primer  
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast רצועת נייר זרימה רוחבית (ביוטין / FAM)EZassay Biotech. Co. Ltd.HD-FMBOסין
LbaCas12a (Cpf1) חלבון משופרEZassay Biotech. בע"מCAS-12E-001סין
משדר LEDLABGICBL-20סין
מגנזיום אצטט, MgOAcTwistDxTABAS03KITבריטניה
מיקרוצנטריפוגהallshengMini-6kסין
צינורות רצועתPCR צינורות רצועת PCRPST-0208-FT-Cסין
TGrade חממת אמבטיה יבשהTiangen טכנולוגיה ביוכימית OSE-DB-01
ערכת DNA של חיידקי Tianampטכנולוגיה ביוכימית Tiangen DP302-02
ערכת DNA של חיידקי TIANamp בסין טיאנג'ן ביוטק  (בייג'ינג) ושות'; בע"מ.DP302  סין 
טרנססטארט  FastPfu  DNA פולימראז טרנסג'ן ביוטק בע"מAP221  סין 
ערכה בסיסית TwistAmpTwistDXTABAS03KITבריטניה
ערכת טיהור DNA אוניברסליתטכנולוגיה ביוכימית Tiangen DP214-03סין
PAC1000 מערכת בסין ,

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lenie, D., Alexandr, N., Harald, S. An increasing threat in hospitals: Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nat Rev Microbiol. 5 (12), 939-951 (2007).
  2. Li, P., et al. Rapid detection of Acinetobacter baumannii and molecular epidemiology of carbapenem-resistant A. baumannii in two comprehensive hospitals of Beijing, China. Front Microbiol. 6, 997(2015).
  3. Wu, X., et al. A diagnostic test that uses isothermal amplification and lateral flow detection sdaA can detect tuberculosis in 60 min. J Appl Microbiol. 130 (6), 2102-2110 (2020).
  4. Huang, B., et al. A cas12a-based fluorescent microfluidic system for rapid on-site human papillomavirus diagnostics. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (20), 6287-6297 (2023).
  5. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).
  6. Abudayyeh, O. O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), aaf5573(2016).
  7. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), eaar6245(2018).
  8. Xiong, D., et al. Rapid detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas12a. PLoS Biol. 18 (12), e3000978(2020).
  9. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with crispr-Cas13a/C2C2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  10. Harrington, L. B., et al. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science. 362 (6416), 839-842 (2018).
  11. Li, S. Y., et al. CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA. Cell Res. 28 (4), 491-493 (2018).
  12. Wang, B., et al. Cas12aVDet: A CRISPR/Cas12a-based platform for rapid and visual nucleic acid detection. Anal Chem. 91 (19), 12156-12161 (2019).
  13. Huang, Z., et al. Ultra-sensitive and high-throughput crispr-p owered COVID-19 diagnosis. Biosens Bioelectron. 164, 112316(2020).
  14. Zhang, W. S., et al. Reverse transcription recombinase polymerase amplification coupled with CRISPR-Cas12a for facile and highly sensitive colorimetric SARS-CoV-2 detection. Anal Chem. 93 (8), 4126-4133 (2021).
  15. Marraffini Luciano, A. CRISPR-Cas immunity in prokaryotes. Nature. 526 (7571), 55-61 (2015).
  16. Mohanraju, P., et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 353 (6299), aad5147(2016).
  17. Makarova, K. S., et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol. 13 (11), 722-736 (2015).
  18. Li, S. Y., et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection. Cell Discovery. 4 (1), 20(2018).
  19. Li, L., Li, S., Wu, N., Wu, J., Wang, J. Holmesv2: A CRISPR-Cas12b-assisted platform for nucleic acid detection and DNA methylation quantitation. ACS Synth Biol. 8 (10), 2228-2237 (2019).
  20. Liang, M., Li, Z., Wang, W., Liu, J., Zhang, L. X. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nat Communications. 10 (1), 3672(2019).
  21. Aquino-Jarquin, G. CRISPR-Cas14 is now part of the artillery for gene editing and molecular diagnostic. Nanomedicine. 18, 428-431 (2019).
  22. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  23. Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
  24. Swarts, D. C., John, V. D. O., Jinek, M. Structural basis for guide RNA processing and seed-dependent DNA targeting by CRISPR-Cas12a. Mol Cell. 66 (2), 221-233 (2017).
  25. Jiang, Y., et al. CRISPR-Cpf1 assisted genome editing of Corynebacterium glutamicum. Nat Commun. 8, 15179(2017).
  26. Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-assisted recombineering in bacteria. Appl Environ Microbiol. 83 (17), e00947-e01017 (2017).
  27. Ashraf, A., et al. A novel multiplex pcr assay for simultaneous detection of nine clinically significant bacterial pathogens associated with bovine mastitis. Mol Cell Probes. 33, 57-64 (2017).
  28. Zhu, L., et al. A rapid on-site visualization platform based on RPA coupled with CRISPR-Cas12a for the detection of genetically modified papaya 'huanong no.1'. Talanta. 277, 126437(2024).
  29. Zheng, C., et al. Rapid developments in lateral flow immunoassay for nucleic acid detection. Analyst. 146 (5), 1514-1528 (2021).
  30. Wang, Y., et al. Establishment and clinical application of a RPA-LFS assay for detection of capsulated and non-capsulated Haemophilus influenzae. Front Cell Infect Microbiol. 12, 878813(2022).
  31. Wang, F., et al. Rapid and sensitive recombinase polymerase amplification combined with lateral flow strips for detecting Candida albicans. Anal Biochem. 633, 114428(2021).
  32. Ma, B., et al. A simple and efficient method for potential point-of-care diagnosis of human papillomavirus genotypes: Combination of isothermal recombinase polymerase amplification with lateral flow dipstick and reverse dot blot. Anal Bioanal Chem. 411 (28), 7451-7460 (2019).
  33. Sun, Y., Yu, L., Liu, C., Ye, S., Huang, W. One-tube SARS-CoV-2 detection platform based on RT-RPA and CRISPR/Cas12a. J Transl Med. 19 (1), 74(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Acinetobacter Baumannii DetectionCRISPR Cas12aRapid Pathogen DetectionDNA ExtractionPrimer DesignFluorescence PCRLateral Flow AssaySpecificity EvaluationSensitivity Evaluation

מאמרים קשורים