מאמר שיטה

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67616

⸱

24 בינואר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Faculty of Medicine and Life Sciences, Xiamen University, 2Technology Center, Shanxi Xinghuacun Fenjiu Distillery Co., Ltd., 3Research Unit of Cellular Stress of CAMS, Cancer Research Center of Xiamen University, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 4Laboratory Animal Center, Xiamen University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימון חלבונים עם תג חלבון פלואורסצנטי בזחלי דג הזברה, מערכת in vivo שפותחה לאחרונה ושונתה שימושית במיוחד להדמיית חלבונים בשפע נמוך בדג הזברה.

תקציר

טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מאפשרת תיוג קל יותר של חלבון פלואורסצנטי בדגי זברה (Danio rerio), אורגניזם מודל מועדף להדמיה in vivo בשל שקיפותו בשלב ההתפתחותי המוקדם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע KI של גן פלואורסצנטי ביעילות גבוהה, סינון מהיר למייסדי KI ומעקב אחר חלבונים בשפע נמוך בזחלי דג הזברה, אשר יניח בסיס קריטי למחקרים פיזיו-פתולוגיים הבאים בדג הזברה. הפרוטוקול הנוכחי כולל שלבים מלאים לתכנון sgRNA עבור הגן המעניין, שעתוק sgRNA במבחנה , שעתוק Cas9 mRNA במבחנה , מסך sgRNA in vivo לזה בעל היעילות הגבוהה ביותר, תכנון ובנייה של פלסמיד תורם, מיקרו-הזרקה בזחלי דג הזברה, מסך מייסד KI והדמיה חיה של דג הזברה. שלבים קריטיים, טיפים לפתרון בעיות, שיטות בקרת איכות ויתרונות ויישומים של פרוטוקול זה כלולים ונדונים. פרוטוקול זה מבטיח תוצאות מהירות ומדויקות בעלות נמוכה ואומת על ידי ניסויים מרובים.

מבוא

כאורגניזם מודל מקובל, דג הזברה (Danio rerio) נמצא בשימוש נרחב במחקר מדעי על פיתוח, התחדשות, גידול, זיהום וחסינות וכו '1,2,3,4,5. דגי הזברה מתאימים במיוחד להדמיה חיה in vivo כאשר הם מטופלים ב-PTU (1-phenyl 2-thiourea), תרכובת כימית רעילה המעכבת מלנוגנזה והופכת את זחלי דג הזברה לשקופים לפרק זמן ארוך יחסית6. זני דג זברה שקופים מהונדסים גנטית, כגון קספר7 וקריסטל8, זמינים גם הם, המאפשרים הדמיה חיה ומעקב אחר שושלת עד לבגרות. מלבד המאמצים האלה להתגבר על פיגמנטציה להדמיה חיה טובה יותר בדגים בוגרים, המחקר שלנו מתמקד גם בפיתוח אסטרטגיות עריכת גנים חזקות כדי להפוך את תיוג החלבון הפלואורסצנטי ליעיל יותר ופחות מלאכותי.

טכנולוגיית KI מבוססת חיבור קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה (MMEJ) בתיווך CRISPR/Cas9 מיושמת כיום באופן נרחב בשינויים גנטיים באורגניזמים מרובים, כולל דג זברה, בשל יעילות ה-KI הגבוהה יחסית שלה 9,10,11,12. כדי להשיג הדמיה מוצלחת in vivo, יש לטפל בשני אתגרים. האחד הוא האינדלים או הצלקות שנוצרו על ידי תהליך הרקומבינציה; השנייה היא שחלק מגני המטרה מתבטאים באופן אנדוגני ברמה נמוכה, מה שמוביל לאותות חלשים של תג הקרינה המתבטא במשותף ולכישלון של זיהוי in vivo. במטרה לתיוג חלבונים יעיל ומדויק ולמזער את ההפרעה של רמות ביטוי גנים אנדוגניות, עבודה שנערכה לאחרונה דיווחה על אסטרטגיה אופטימלית המשלבת שיטת תיוג "VH" להגברת אותות פלואורסצנטיים וזרימת עבודה מעודנת של מסך קו נבט13, המתאימה יותר לתיוג פלואורסצנטי של גנים בעלי ביטוי נמוך ויעילה יותר משיטות קודמות על ידי אופטימיזציה של עמוד השדרה של התורם ושילוב של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ואימות פלואורסצנטי כדי ליישם את מסך קו הנבט בעלות הנמוכה ביותר של זמן ומאמץ. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב לשיטה המדווחת, כולל שלבים של הכנת עוברים וגידול דגי זברה, עיצוב sgRNA, שעתוק במבחנה של sgRNAs, שעתוק חוץ גופי של Cas9 mRNA, מיקרו-הזרקת עובר של דג זברה, מסך in vivo עבור sgRNAs עם היעילות הגבוהה ביותר, תכנון ובנייה של פלסמיד תורם, גנוטיפ של דג זברה KI, מסך קו נבט KI והדמיה ופנוטיפ של דג זברה KI. פרוטוקול הכל-באחד זה, המספק שיטת תיוג פלואורסצנטית מתקדמת, ללא ספק יקדם מחקרים המשתמשים בדגי זברה בתחומים מדעיים שונים ויועיל לקוראים מרקעים אקדמיים שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל גידול דגי הזברה והניסויים נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה והניהול של חיות המעבדה של אוניברסיטת שיאמן והיו בהתאם לפרקטיקה טובה של בעלי חיים כפי שהוגדרה על ידי מרכז חיות המעבדה של אוניברסיטת שיאמן. המחקר עמד בכל התקנות האתיות הרלוונטיות לשימוש בבעלי חיים.

הערה: כל דגי הזברה הבוגרים והזחלים נשמרו בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך של 13/11 שעות במערכת האקווריום של דג הזברה של אוניברסיטת שיאמן. העוברים הוחזקו במאגר העוברים (טבלה 1) באינקובטור מבוקר (טמפרטורה, 28 ± 0.5 מעלות צלזיוס; אור, 13 שעות אור / 11 שעות חושך). האכלה וניטור כללי של כל דגי הזברה בוצעו פעמיים ביום (9 בבוקר ו-4 אחר הצהריים). הזן הפראי (WT) ששימש במחקר זה היה טובינגן (Tü).

1. בחירת גנים מעניינים ועיצוב ה-RNA המנחה

  1. דע את המידע של הגן המעניין. חפש במסד הנתונים (https://zfin.org/) וודא שמספר וריאנטים של הגנים ידוע. החליטו איזה וריאנט לתפעל והורידו מידע על גן היעד מ-Ensembl (https://www.ensembl.org/), כולל רצף גנום, רצף cDNA ורצף קידוד (CDS). סמן אקסונים, אינטרונים, UTRs, קודוני התחלה וקודוני עצירה ברצפים.
  2. בחר לא יותר מ-200 bp של CDS במעלה הזרם של קודון העצירה (TAA, TAG או TGA) של גן המטרה כאזור היעד sgRNA.
    הערה: עדיף לוודא שבאזור זה אין פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs) על ידי ריצוף DNA.
  3. השתמש באתר CRISPRscan (https://www.crisprscan.org/) כדי לתכנן sgRNAs מועמדים באזור היעד הנבחר ולחזות יעילות sgRNA.
    1. הזן את רצף ה-DNA למסגרת העיצוב.
    2. בחר את המידע המתאים, כולל מינים, אי-התאמה מקסימלית ב-off-targets, אנדונוקלאז ומקדם. במקרה זה, בחר דג זברה- Danio rerio, ללא אי התאמה, Cas9-NGG ומקדם T7 במבחנה.
    3. לחץ על קבל sgRNAs כדי להשיג כמה sgRNAs. בחר 5-7 sgRNAs עם ציון סריקת CRISPR גבוה וציון נמוך מחוץ למטרה עבור מסך in vivo .
  4. תכנן פריימרים PCR המאגפים את אתרי היעד sgRNA שהתוצר שלהם הוא כ-500 bp להגברת PCR לאחר מכן, בדיקת עיכול אנזימטית וריצוף כדי לאמת את יעילות הנוקאאוט לאחר הזרקת מיקרו-sgRNA/Cas9. בחר רצף של כ-20 bp באזורים במעלה הזרם ובמורד הזרם וודא שתכולת ה-GC שלו היא כ-50% וערך ה-Tm נע בין 50-55 מעלות צלזיוס.
    הערה: תכנן שני פריימרים במעלה הזרם ושני פריימרים במורד הזרם אם יש צורך לבצע שילובים.

2. הכנת sgRNAs

הערה: רצף פיגומי ה-sgRNA הנפוץ (איור 1) שובט לפלסמיד (טבלת חומרים).

  1. PCR מגביר את הרצף המצומד של מקדם-sgRNA T7 באמצעות פריימרים ותערובת PCR המוצגים בטבלה 2 ובטבלה 3, בהתאמה. הפעל את תוכנית ה-PCR בטבלה 4. אלקטרופורזה של ג'ל Run (ג'ל אגרוז, 1.2% אגרוז במאגר TAE; מאגר TAE [טבלה 1]; 200 וולט; כ-5 דקות) עם 2 מיקרוליטר מתוצרי ה-PCR כדי לוודא שהמוצרים נכונים (ה-MW הוא כ-150 bp).
  2. טהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת טיהור (טבלת חומרים) או ערכות אחרות הזמינות מסחרית בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: מעתה ואילך, יש להשתמש בריאגנטים וחומרים נטולי RNase, ויש לבצע הליכים בזהירות מיוחדת כדי למנוע זיהום RNase (ראה דיון).
    1. הוסף את מאגר הקישור למוצרי ה-PCR ביחס נפח של 5:1 וערבב. מרחו את התערובת על העמוד המונח בצינור איסוף של 2 מ"ל. צנטריפוגה ב-17,900 × גרם למשך דקה אחת ב-25 מעלות צלזיוס. השלך את הזרימה והנח את העמודה בחזרה לאותו צינור איסוף.
    2. הוסף 750 מיקרוליטר ממאגר הכביסה לעמוד ולצנטריפוגה ב-17,900 × גרם למשך דקה אחת ב-25 מעלות צלזיוס. השלך את הזרימה והנח את העמודה בחזרה לאותו צינור איסוף. צנטריפוגה בטמפרטורה של 17,900 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. הנח את העמוד בצינור נקי של 1.5 מ"ל.
    3. הוסף 20 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז לעמודה, צנטריפוגה ב-17,900 × גרם למשך 2 דקות ב-25 מעלות צלזיוס, כדי לפלוט את ה-DNA ולמדוד את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר.
  3. השתמש במערכת ייצור ה-RNA T7 בטבלת החומרים או בערכות שוות ערך כדי לתמלל במבחנה 250 ננוגרם מה-DNA המטוהר. נדרשים פעולות ותנאים ללא RNase.
    1. הכן את התגובה בצינורות PCR (ללא RNase) לפי טבלה 3, וערבב בעדינות. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מתכת למשך שעתיים.
    2. מוסיפים 0.5 מיקרוליטר DNase I (ללא RNase), ומערבבים בעדינות. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מתכת למשך 15-20 דקות.
    3. משקעי אתנול
      1. הוסף מים ללא RNase לכל תגובה כדי שהנפח הסופי יגיע ל-20 מיקרוליטר, והעביר את הדגימות לצינורות של 1.5 מ"ל.
      2. מוסיפים 50 מיקרוליטר של 100% אתנול (2.5V, ללא RNase), מערבבים היטב, מניחים את התערובת על קרח למשך 10 דקות, וצנטריפוגה בחום של 21,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      3. השליכו את הסופרנטנט, שטפו את הגלולה עם 500 מיקרוליטר של 75% אתנול (ללא RNase), וצנטריפוגה ב-21,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      4. השליכו את הסופרנטנט, יבשו את הגלולה ב-45 מעלות צלזיוס באמבט מתכת, והמיסו עם 40 מיקרוליטר מים ללא RNase.
        הערה: עבור KI, sgRNAs צריכים להיות משקעים LiCl (ראה להלן), אך עבור KO, זה לא הכרחי.
    4. ג'ל אגרוז (ג'ל אגרוז: 1.2% אגרוז במאגר TAE; מאגר TAE [טבלה 1]; 200 וולט; כ-5 דקות) עם 1-2 מיקרוליטר של ה-RNA כדי להעריך את האיכות ולאחר מכן למדוד את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר.
      הערה: ניתן לאחסן sgRNAs בטמפרטורה של -20 °Cor -80 °C לשימוש נוסף.

3. הכנת Cas9 mRNA

  1. בצע עיכול אנזימטי של הפלסמיד Cas9 (טבלת החומרים) במשך יותר מ-1.5 שעות באמצעות XbaI בהתאם להוראות היצרן (לתערובת התגובה, ראה טבלה 3). בדיקה על ידי אלקטרופורזה בג'ל (ג'ל אגרוז: 1.2% אגרוז במאגר TAE; מאגר TAE [טבלה 1]; 200 וולט; כ -10 דקות) עם 1 מיקרוליטר כדי לבדוק שהעיכול יסודי.
  2. טהר את המוצרים באותו אופן כמו מוצרי sgRNA PCR (שלבים 2.2.1-2.2.3). מכאן ואילך, נדרשים חומרים ופעולות ללא RNase.
  3. השתמש בערכת התמלול T3 (טבלת חומרים) או בערכות שוות ערך לשעתוק במבחנה של Cas9 mRNA.
    1. הכן את התגובה בצינורות PCR ללא RNase לפי טבלה 3 וערבב בעדינות. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יותר מ-2.5 שעות.
    2. יש להוסיף 1 מיקרוליטר של Turbo DNase נטול RNase ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות.
    3. משקעי LiCl
      1. מעבירים את הדגימות לצינורות של 1.5 מ"ל, מוסיפים 30 מיקרוליטר LiCl (1.5 וולט) ומערבבים בעדינות.
      2. שמים את התערובת ב-20 מעלות צלזיוס למשך כ-30 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ב-21,000 × גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      3. השליכו את הסופרנטנט, שטפו את הכדורים עם 500 מיקרוליטר של 75% אתנול (ללא RNase), וצנטריפוגה ב-21,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      4. השליכו את הסופרנטנט, יבשו את הגלולה ב-45 מעלות צלזיוס והמיסו אותה ב-40 מיקרוליטר מים נטולי RNase.
  4. מדוד את ריכוז ה-mRNA Cas9 באמצעות ספקטרופוטומטר. ג'ל אגרוז (ג'ל אגרוז: 1.2% אגרוז במאגר TAE; מאגר TAE [טבלה 1]; 200 וולט; כ -10 דקות) עם 1-2 מיקרוליטר של ה- RNA כדי לבדוק את הריכוז והאיכות.
    הערה: OD 260/280 צריך להיות מעל 2.0, והריכוז צריך להיות סביב או גבוה מ-1000 ננוגרם/מיקרוליטר. ניתן לאחסן Cas9 mRNA ב-20 °Cor -80 °C לשימוש נוסף.

4. הכנה למיקרו-הזרקה

  1. הכן את דג הזברה: בלילה שלפני הזרקת מיקרו, הניחו נקבת דג זברה בריאה ושני דגי זברה זכרים בריאים במיכל הזדווגות, בעזרת מפריד כדי להפריד בין הזכרים והנקבות כדי להכין אותם להזדווגות.
  2. הכן 4% אגרוז, מאגר ליזה ומאגר עובר (pH 8.0) (טבלה 1).
  3. הכן מחטי זכוכית נימיות להזרקת המיקרו (טבלת חומרים).
  4. הכן צלחות מיקרו-הזרקה: יוצקים 35 מ"ל מהאגרוז המומס 4% לתוך צלחת פטרי בגודל 10 ס"מ ומניחים בעדינות תבנית פלסטיק ליצירת שקתות בצורת טריז. הימנע מבועות אוויר על ידי הקשה עדינה על התבנית. לאחר שהוא מתמצק, מוסיפים אליו מעט מים מזוקקים כפולים (ddw) ומניחים את הצלחת על 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.

5. בדיקת יעילות sgRNA באמצעות מיקרו-הזרקה

  1. ביום המיקרו-הזרקה, הכינו את תערובת המיקרו-הזרקה כמפורט בטבלה 5 על קרח בסביבה נטולת RNase.
  2. טען את תמיסת המיקרו-הזרקה לתוך המחט באמצעות קצה פיפטה נטול RNase (טבלת חומרים). היזהר לא להביא בועות.
  3. הנח את המחט הטעונה במיקרומניפולטור המחובר למיקרו-מזרק. חותכים את קצה מחט ההזרקה מתחת למיקרוסקופ בעזרת הפינצטה המחודדת, צובטים בעדינות את קצה המחט כדי לשבור אותה. לאחר מכן, כוונן את לחץ ההזרקה עד שהמחט פולטת באופן עקבי טיפה של 1 nL, אשר מכומתת באמצעות מיקרומטר שלב ונימי.
  4. הסר את המחיצה ואפשר לדג להתרבות כ -6 דקות. אסוף והעביר את העוברים בשלב התא האחד לצלחת פטרי המכילה חיץ עוברים.
    1. בדוק את בריאות העוברים במיקרוסקופ האור והסר ביציות או פסולת לא מופרות. הניחו בצד 20 עוברים בריאים כבקרות לא מוזרקות בצלחת פטרי ותווית נפרדת.
  5. העבירו וסדרו בעדינות עוברים בריאים בשלב תא אחד על החריצים של צלחת המיקרו-הזרקה המחוממת לטמפרטורת החדר (RT) באמצעות מברשת קטנה. הסר את המאגר העודף.
  6. בצע את כל הפעולות הבאות תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמש בקצה המחט כדי להתאים בעדינות את מיקום העובר כך שמוט החיה יפנה למחט. הזרקו 1 nL מהתמיסה המעורבת לתוך מוט החיה.
  7. הזרקה של כ -100 עוברים מספיקה ל- sgRNA אחד. לאחר ההזרקה יש לשטוף בעדינות את העוברים לצלחת של שש בארות עם מאגר עוברים. הכניסו את המנה לחממה בטמפרטורה קבועה של 28.5 מעלות צלזיוס. בסביבות 10 שעות לאחר ההפריה (hpf), בדוק את ההתפתחות העוברית תחת מיקרוסקופ סטריאו והסר עוברים מתים.
  8. ב-24 hpf, אסוף עוברים בצינורות של 1.5 מ"ל לגנוטיפ (3 צינורות לכל sgRNA ו-5 עוברים לכל צינור). השליכו מים מיותרים בזהירות בעזרת פיפטה, הוסיפו 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה המכיל פרוטאינאז K (בריכוז סופי של 0.5 מ"ג/מ"ל) לכל צינור, ודגרו ב-56 מעלות צלזיוס למשך שעה ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  9. מוסיפים 200 מיקרוליטר אתנול (2V), מערבבים היטב וצנטריפוגה בחום של 19,000 × גרם למשך 10 דקות ב-RT.
  10. השליכו את הסופרנטנט, שטפו את הגלולה עם 500 מיקרוליטר של 70% אתנול, וצנטריפוגה ב-19,000 × גרם למשך 3 דקות ב-RT.
  11. השליכו את הסופרנטנט, יבשו את הכדור ב-RT והמיסו אותו עם 50 מיקרוליטר של ddw. לאחר מכן, השתמש ב-1 מיקרוליטר מהתמציות כדי להכין את תערובת התגובה ל-PCR (טבלה 3) (עבור פריימרים של PCR, ראה שלב 1.4).
  12. ג'ל אגרוז (ג'ל אגרוז: 1.2% אגרוז במאגר TAE; מאגר TAE [טבלה 1]; 200 וולט; כ-10 דקות) עם 2 מיקרוליטר מתוצרי ה-PCR כדי לאשר שה-PCR מוצלח, ולאחר מכן לבצע עיכול אנזימטי (טבלה 3) כדי לקבוע את היעילות של ה-sgRNAs. מערבבים בעדינות את תערובת העיכול האנזימטית. דגירה בטמפרטורה למשך פרק הזמן המוצע על ידי היצרן.
  13. הפעל ג'ל אגרוז למוצרים המעוכלים (ג'ל אגרוז: 1.2% אגרוז במאגר TAE; מאגר TAE [טבלה 1]; 200 וולט; כ-10 דקות) עם מוצרי ה-PCR הלא מעוכלים כבקרות כדי לאשר אם העיכול מתרחש.
    הערה: אתר המחשוף Cas9 הוא כ-3 bp במעלה הזרם של ה-PAM, כך שאתר זיהוי אנזימי ההגבלה הוא הטוב ביותר לכיסוי 6 bp במעלה הזרם של PAM. אם יעילות ה-sgRNA גבוהה, חיתוך ותיקון שגוי יובילו לאינדלים, כך שקיימת אפשרות גבוהה שאנזים ההגבלה כבר לא יוכל לזהות את אתר החיתוך. אם ה-sgRNA אינו יעיל ואתר זיהוי אנזימי ההגבלה שלם, העיכול האנזימטי יכול להתרחש כרגיל. באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, ניתן להבחין אם התרחש עיכול אנזימטי.
  14. אם אין אתר זיהוי אנזימי הגבלה מתאים, רצף את תוצרי ה-PCR ונתח את יעילות ה-sgRNA על ידי TIDE (https://tide.nki.nl/). זכור לעשות PCR וגם לרצף DNA גנומי WT כבקרה.
    1. פתח את האתר ולחץ על התחל TIDE. הזן את הרצף המנחה של sgRNA במסגרת תחת רצף מדריך.
    2. לחץ על עיון תחת פקד כרומטוגרמה לדוגמה ( .ab1 או .scf) כדי להזין את תוצאת הרצף עבור פקד WT ולחץ על עיון תחת בדיקת כרומטוגרמה לדוגמה ( .ab1 או .scf) כדי להזין את תוצאת הרצף עבור הדגימה הערוכה.
    3. לחץ על עדכן תצוגה. האתר ייתן אחוז מההפרש בין שני הרצפים. אחוז גדול יותר מצביע על יעילות sgRNA גבוהה יותר. sgRNA עם יעילות נוקאאוט מעל 80% מתאים להליכי KI הבאים.

6. בניית פלסמיד תורם לתיוג חלבון פלואורסצנטי

  1. תכנן רצפים שישובטו תחילה לתוך הפלסמיד ולאחר מכן יוכנסו עוד לגנום הדג כמו איור 2: רצף של 25 bp במעלה הזרם של אתר המחשוף החזוי Cas9 מתוכנן כזרוע ההומולוגיה השמאלית, ורצף של 25 bp במורד הזרם של אתר המחשוף החזוי Cas9 הוא זרוע ההומולוגיה הימנית. הכנס CDS בין אתר היעד sgRNA לקודון העצירה לתורם כדי לשמור על שלמות הגן האנדוגני.
    הערה: ה-5' של ה-CDS המשלים (אלמנט 4 באיור 2) צריך לעבור מוטציה נרדפת כדי למנוע פיצול משני של הגנום הרקומביננטי על ידי קומפלקס sgRNA/Cas9.
  2. השתמש בשיבוט בלתי תלוי בקשירה (LIC)14 באמצעות אקסונוקלאז III (טבלת חומרים) לבניית הפלסמיד התורם. שיטות אחרות, כמו הרכבת גיבסון, אפשריות גם הן. פריימרים לשיבוט מומחשים באיור 2. אלמנטים "1", "2", "3" ו- "4" נישאים על ידי הפריימרים:
    1. עיצוב פריימר F1, המורכב מרצף חופף עם הווקטור, אלמנט "1" וחלק מהאלמנט "2".
    2. עיצוב פריימר R2, המורכב מחלק מרכיב "1", אלמנט "2" ואלמנט "3".
    3. עיצוב פריימר F2, המורכב מאלמנטים "3", "4", ורצף 5' של ה-CDS העוקב אחר אתר היעד sgRNA.
    4. עיצוב פריימר R1, המורכב מרצף 3' של ה-CDS של הגן ורצף חופף עם הווקטור.
    5. השתמש ב-cDNA של דג הזברה כתבנית ובצע PCR באמצעות הפריימרים.
      הערה: החפיפה המומלצת בין פריימרים או בין הפריימר לווקטור היא 15-20 bp. פריימרים אלה הם ספציפיים לגן המטרה, ודוגמה לפריימרים עבור cx39.9 ו-cx44.1 ניתנת בטבלה 2. עיצוב זה יושם בהצלחה כפי שתואר קודם לכן13. מפות פלסמיד מפורטות מסופקות בקובץ משלים 1 ובקובץ משלים 2. רצפי ה-DNA והחלבון המעוצבים של cx39.9 ו-cx44.1 מסופקים בקובץ משלים 3.
    6. טהר את מוצרי ה-PCR באותו אופן כמו מוצרי sgRNA PCR (שלבים 2.2.1-2.2.3).
  3. לעכל את וקטור התורם (איור 3 וטבלה 6) על ידי אנזימי הגבלה מתאימים. בדוגמה זו, האנזימים הם PciI ו-Acc65I (טבלת חומרים). בצע את הפעולה בהתאם להוראות היצרן (טבלה 3). טהר את וקטור התורם המעוכל באותו אופן כמו מוצרי sgRNA PCR (שלבים 2.2.1-2.2.3).
  4. לכמת את שברי ה-PCR המטוהרים ואת וקטור התורם המעוכל על ידי אלקטרופורזה של ג'ל DNA (ג'ל DNA: 1.2% אגרוז במאגר TAE; מאגר TAE [טבלה 1]; 200 וולט; כ-10 דקות). הכן את תערובת התגובה עבור LIC לפי טבלה 3.
    הערה: יש להניח את כל הצינורות ומרכיבי התגובה על קרח, ואת התגובה וכל המניפולציות יש לבצע על קרח. הוסף 1 מיקרוליטר של Exo III (20 יחידות) לתגובה כמרכיב האחרון ולאחר מכן מיד פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב את כל הרכיבים. זכור לכלול תערובת תגובה אחת ללא שברי PCR כבקרה כדי להראות את הפוטנציאל של חישול עצמי של הווקטור המעוכל.
  5. מניחים מיד את תערובת התגובה על קרח ודוגרים למשך 60 דקות.
  6. הוסף 1 מיקרוליטר של 0.5 מ' EDTA (pH 8.0) כדי לעצור את התגובה, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב, ולאחר מכן דגירה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן על קרח למשך 5 דקות.
  7. טרנספורמציה של תאים מוכשרים, כגון DH5α, באמצעות תוצרי LIC וגידול החיידקים על לוחות LB (טבלת חומרים וטבלה 1) עם אנטיביוטיקה מתאימה (אמפיצילין במקרה זה) למשך 16 שעות.
  8. ודא שיש הבדלים בסדרי גודל בין מספר המושבות על הלוחות המכילים שברי PCR לזה שעל לוחית הבקרה. בחר מושבות בודדות מלוחות ה-LIC לניתוח עיכול אנזימטי וריצוף DNA.
  9. חלץ וטהר פלסמידים תורמים נכונים עם ערכת טיהור באותו אופן כמו מוצרי sgRNA PCR (שלבים 2.2.1-2.2.3). ודא שהריכוז הסופי הוא מעל 300 ננוגרם/מיקרוליטר.

7. מיקרו-הזרקה של עוברי דג זברה לגן KI

  1. בצע את כל מניפולציות המיקרו-הזרקה שתוארו לעיל, למעט הכנת תמיסת המיקרו-הזרקה לפי טבלה 7.

8. סינון וזיהוי של צאצאים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי

  1. התבונן בפלואורסצנטיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו 12-48 שעות לאחר הזרקת מיקרו.
  2. החל שיטת מסך חדשהשהוקמה 13. אם נצפתה פלואורסצנטיות ברורה, בחר את הזחלים הפלואורסצנטיים וגדל אותם. אם נצפה רק שמץ של פלואורסצנטיות או אפילו לא נצפה פלואורסצנטי, יש להחזיר את כל הזחלים המוזרקים.
  3. בגיל חודש, הרדמו דג זברה בהזרקת מיקרו עם 0.02% טריקאין (טבלה 1). עבור כל דג זברה, אספו חתיכה קטנה מסנפיר הזנב לתוך צינור PCR מסומן ושמרו את דג הזברה המורדם המתאים בבאר אחת של צלחת בת שש בארות המכילה מים מסוננים מעוקרים UV (pH 7.2) עם אותה תווית.
  4. השתמש בשיטת הליזיס האלקליין (מאגר ליזה בטבלה 1)15 למיצוי DNA גנומי, ואחריו ה-PCR בצומת 5'. תכנן את הפריימר הקדמי במעלה הזרם של זרוע ההומולוגיה השמאלית ואת הפריימר ההפוך על התוסף (איור 4). גודל מוצר ה-PCR הוא בסביבות 500 bp. לדוגמאות של הפריימרים, ראה טבלה 2.
    הערה: עבור דג הזברה הפלואורסצנטי, PCR זה משמש לאימות הדיוק של ה-KI, כך שמוצר ה-PCR נתון לריצוף. עבור דג זברה ללא פלואורסצנטיות, PCR זה משמש כדי לוודא אם מתרחש KI. בחר את הדגים החיוביים ל-PCR וגדל אותם לבגרות כ-F0.
  5. לבחון עוברים F1 שהתקבלו מהזדווגות של F0 המוקרן עם WT לדפוסי ביטוי GFP וגנוטיפ על ידי PCR צומת.
    הערה: אם החדרת היעד מתרחשת ב-F1 (בין אם מושלמת ובין אם לא), ה-F0 המתאים מוגדר כ-F0 הניתן לתורשה, שתוצר ה-PCR שלו מרוצף לאחר מכן. אם ההכנסה מדויקת, ה-F0 המתאים מוגדר כ-F0 הרצוי.
  6. כאשר מתקבל ה-F0 הרצוי, השתמש בצאצאים להדמיה כדי לצפות ולעקוב אחר חלבון המטרה.

9. הדמיה ועיבוד נתונים

  1. קבע את השלב ההתפתחותי שיש לצלם. מכינים את הדג מראש. הוסף 1-פניל 2-תיאוריאה מדולל (PTU; 0.003%, טבלת חומרים) לדג כדי להסיר את הפיגמנטים במידת הצורך.
    הערה: PTU יהיה פחות יעיל אם יוחל לאחר 24 hpf. בדוגמה זו, PTU נוסף למאגר העובר לפני 24 hpf ונשמר במאגר עד 48 hpf כאשר זחלי דג הזברה עובדו להדמיה.
  2. מוסיפים 2 מ"ל אגרוז מומס של 4% (טבלה 1) לכלי בגודל 35 מ"מ ומשאירים אותו בצד להתמצקות. העבירו את הדג למאגר העובר המכיל 0.02% טריקאין (טבלה 1).
  3. לדלל 200 מיקרוליטר של 4% אגרוז מומס ב-1 מ"ל של ddw. העבירו את הדג המורדם לתוך האגרוז המדולל באמצעות פיפטה של 1 מ"ל כאשר האגרוז מתקרר. מערבבים בעדינות ומעבירים את האגרוז המורכב מהדג לכלי המכיל ג'ל אגרוז 4% מוצק שהוכן בשלב 9.2.
  4. מקם את הדג כך שהחלק המעניין יהיה בחלק העליון.
  5. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי זקוף להדמיה ועיבוד נתונים בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

צמתים מרווחים המורכבים מחלבונים פולימריים הנקראים קונקסינים חיוניים להחלפת מטבוליטים ויונים בעלי משקל מולקולרי נמוך בין תאים במגע. שיטת תיוג החלבון הפלואורסצנטי שתוארה לעיל שימשה לסימון קונקסין 39.9 (איור 5A) וקונקסין 44.1 (איור 5B), בהתאמה. KI נכון אומת על ידי PCR בצומת (איור 6). בהסכמה עם נתוניםשפורסמו 16, נצפתה פלואורסצנטיות ספציפית תורשתית בשרירים של כל צאצאי F1 , מה שמצביע על...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כדי לבצע ניסוי זה בצורה חלקה ומוצלחת, יש לשים לב יותר לכמה היבטים חשובים. השלב ההתפתחותי האופטימלי של דג הזברה להזרקה צריך להיות שלב התא האחד. השלמת ההזרקה בשלב זה יכולה להבטיח שכל התאים המיוצרים באמצעות חלוקה עוקבת יכילו את הרכיבים הדרושים ל-KI, ובכך להגדיל את ההסתברות להתרחשות KI בו זמנית בכל התאים ולשפר את שיעור ההצלחה הכולל של KI. הורדת טמפרטורת הסביבה תאט את ההתפתחות העוברית של דג הזברה18. עם זאת, חשיפה ממושכת של עוברים לטמפרטורות נמוכות מעלה את שיעורי התמותה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים במאמר זה.

תודות

אנו מודים ללו ג'ואו (אוניברסיטת שיאמן) על ההגהה והעריכה של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק 82388201 ל-J.H.; מענק 31801158 ל-Y.Z.), תוכנית המו"פ המרכזית הלאומית של סין (2020YFA0803500 ל-J.H.), קרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (CIFMS) (2019-I2M-5-062 ל-J.H.), התוכנית המיוחדת לפיתוח מדע וטכנולוגיה של מחוז פוג'יאן המרכזי לפיתוח מדע וטכנולוגיה מקומי (2022L3079 ל-J.H.), ותוכנית שיתוף הפעולה המחוזית FuXia-Quan Zi-Chuang (3502ZCQXT2022003 ל-J.H.). למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטות פרסום או הכנת כתבי יד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1000 ומיקרו; L  טיפיםכל מותגN/Aלכל המניפולציות
צינורות 1.5 מ"לכל מותגN/Aלאחסון וצנטריפוגה של פתרונות שונים
צינורות 1.5 מ"ל (ללא RNase)כל מותגN/Aלאחסון וצנטריפוגה של פתרונות ללא RNase
10 ומיקרו; טיפים לכלמותגN/Aלכל המניפולציות
10 ומיקרו; טיפים L (ללא RNase)כל מותגN/Aלמניפולציות ללא RNase
1000 ומיקרו; L  טיפים (ללא RNase)כל מותגN/Aלמניפולציות ללא RNase
1-phenyl 2-thiourea (PTU)SigmaP7629לעיכוב מלנוגנזה ושמירה על שקיפת הזחלים
200 ומיקרו; טיפיםלכל מותגN/Aלכל המניפולציות
200 ומיקרו; טיפים L (ללא RNase)כל מותגN/Aלמניפולציות ללא RNase
2x Taq Plus Master Mix II (צבע פלוס)VazymeP213-03PCR לבדיקות יעילות sgRNA
צלחות 35 מ"מקורנינג430165להדמיית
צלחות 6 בארותכל מותגN/Aלגידול דג זברה בנפרד ובאופן זמני
Acc65INEBR0599Sעבור עיכול אנזימטי
חומצה אצטיתSigma695092להכנת מאגר TAE
AgarBiofroxx8211GR500עבור צלחות LB
Ampicillin, מלחנתרן SangonA610028עבור צלחות LB
CaCl2SigmaC5080להכנת מאגר עוברי
צינורות נימייםמכשירהרווארד30-0016ליצירת מחטים להזרקת
צינורות נימייםכל מזהה מותג(קוטר פנימי) = 0.1 מ"מלכימות טיפה של 1-nL
CRISPRscanCRISPRscan  http://www.crisprscan.org/לעיצוב sgRNA
DH5 ואלפא;TIANGENCB101לטרנספורמציה
EDTASigmaE6758להכנת מאגר ליזה והכנת מאגר TAE
אנסמבלאנסמבל  https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Indexכדי למצוא מידע על גנים
אתנולHUSHI64-17-5לטיהור ומיצוי DNA
Exonuclease IIITakara2170ALIC
מיקרו-מזרק המופעל על ידי גזWarner InstrumentsPLI-100Aלמיקרו-הזרקה
מערכת אלקטרופורזה ג'לWIXWIX-EP3000לג'ל כפפות אלקטרופורזה
כל מותגN / Aלכל המניפולציות
גלוקוזsgdbio10010518לצלחות LB
גליצרולסנגוןA501745לצלחות LB
gRNA-pMD19-Tמרכז משאבי דג הזברה בסין (CZRC)CZP3sgRNA פלסמיד המכיל פיגום sgRNA
KClSigmaP5405לעובר הכנת חיץ
תמיסת משקעים ליתיום כלורידThermofisherAM9480משקעים של sgRNAs, ללא RNase
נקודת התכה נמוכה agaroseSangonA600015להכנת 4% ג'ל אגרוז
מגנזיום סולפטsgdbio20025118עבור צלחות LB
אמבט מתכתכל מותגN / Aלדגירה בטמפרטורה קבועה
מתילן כחולסיגמאM9140להכנת חיץ עוברי
עובש מיקרואינקציהתוצרת ביתN/Aליצירת חריצים להחזקת עוברים במהלך מיקרו-הזרקה
Microloader, קצה למילוי Femtotips ומיקרו-נימי זכוכית אחרים, סטרילי, 0.5 – 20 ומיקרו; L, 100 מ"מ, אפור בהיר, 192 יח'. (2 ארונות תקשורת וזמנים; 96 יח')Eppendorf5242956003כדי לטעון את תמיסת המיקרו-הזרקה לתוך מחט ההזרקה,
חולץ מיקרופיפטהמכשיר סאטרP-97לייצור מחטים להזרקה
מיקרופיפטותEppendorfN/Aלכל המניפולציות
מיקרוגלכל מותגN/Aליציקת צלחת הזרקה וג'ל אגרוז
MinElute PCR ערכת טיהור (50)QIAGEN28004לטיהור מוצרי PCR ומוצרי עיכול, ערכת תמלול mMESSAGE mMACHINE T3 ללא RNase
InvitrogenAM1348שעתוק במבחנה של Cas9 mRNA, ללא RNase
N2כל מותגN/Aלמיקרו-הזרקה
NaClSigmaS5886להכנת מאגר עוברים והכנת מאגר ליזה
NaHCO3SigmaS5761להכנת חיץ עוברי
NaOHSangonA100173להכנת מאגר TAE
מים ללא נוקלאזThermofisherR0581מניפולציות הקשורות ל-RNA,
PciINEBR0655Sלעיכול אנזימטי
מכונת PCRכל מותגN / Aצינורות רצועת PCR הגברה
PCR כל מותגN / Aעבור צינורות PCR
PCRFEITONGKANGblp-200פטרי
PCR כל מותגN / Aלגידול זחלי דג זברה וכו '.
פנול אדוםסיגמאP0290למיקרו-הזרקה,
מחזיק פיפטותוורנר אינסטרומנטסPLI-PH1למיקרו-הזרקה
PrimeStar (Premix)TakaraDR040Aלשיבוט מולקולרי
פרוטאינאז KMerck539480למיצוי DNA גנומי
pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin)מרכז משאבי דג הזברה בסין (CZRC)תבנית פלסמיד CZP11Cas9
צנטריפוגה מקוררתכל מותגN / Aעבור צנטריפוגה הקשורה ל- RNA
סולםSartoriusBCE124-1CCNליציקת צלחת הזרקה וג'ל אגרוז
מספרייםכל מותגN / Aלגזירה זנבות דגים בוגרים
SDSSangonA600485להכנת מאגר
ליזהמברשות קטנותכל מותגN/Aלעוברים הנעים בעדינות על לוחות מיקרו-הזרקה
ספקטרופוטומטרThermofisherNanoDrop 2000למדידות ריכוז DNA/RNA
מיקרומטר שלבכל מותגDIV (חלוקה) = 0.01 מ"מלכימות טיפה 1-nL
מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוOlympusSZX16לתצפית על ביטוי גנים
מיקרוסקופ סטריאומוטיקSMZ-168לתצפית והזרקת מיקרו
T7 RiboMAX Express מערכת ייצור RNA בקנה מידה גדולPromegaP1320שעתוק חוץ גופי של sgRNAs,
חממה מבוקרת טמפרטורהכל מותגN/Aלדגירת
עובריםTIDE TIDEhttps://tide.nki.nl/לניתוח יעילות sgRNA 
Tricaine methanesulfonateSigmaA5040להכנת תמיסת טריקאין
TrisSangonA600194לתמיסת טריקאין, מאגר ליזה והכנת מאגר TAE
טריפטוןOXOIDLP0042לצלחות LB
פינצטהכל מותגN / Aלחיתוך מחטי הזרקה
XbaINEBR0145Sלאנזימטי עיכול
תמצית שמריםOXOIDLP0021לצלחות LB
מערכת אקווריום דג זברהESENESEN-AW-S1לגידול דגים בוגרים
מיכלי הזדווגות דג זברה (עם מחיצה)כל מותגN/Aלהזדווגות הדגים
Zeiss LSM 900 + Airyscan2ZEISSZeiss LSM900להדמיה קונפוקלית של הדגים המסומנים בפלואורסצנטיות וניתוח נתונים
אתרZFIN ZFINhttp://zfin.org/לאיתור מידע על גנים
ללא RNase ללא RNase עבור צלחת ללא RNase ללא RNase

מקורות

  1. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).
  2. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  3. Haraoka, Y., Miyake, M., Ishitani, T. Zebrafish imaging reveals hidden oncogenic-normal cell communication during primary tumorigenesis. Cell Struct Funct. 48 (1), 113-121 (2023).
  4. Gomes, M. C., Mostowy, S. The case for modeling human infection in zebrafish. Trends Microbiol. 28 (1), 10-18 (2020).
  5. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
  6. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Mar Biotechnol (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  7. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  8. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Sci Rep. 6, 29490(2016).
  9. He, M. D., et al. Efficient ligase 3-dependent microhomology-mediated end joining repair of DNA double-strand breaks in zebrafish embryos. Mutat Res. 780, 86-96 (2015).
  10. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Sci Rep. 5, 8841(2015).
  11. Luo, J. J., et al. CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy. FASEB J. 32 (9), 5132-5142 (2018).
  12. Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. Elife. 9, e53968(2020).
  13. Liu, J., et al. Optimal tagging strategies for illuminating expression profiles of genes with different abundance in zebrafish. Commun Biol. 6 (1), 1300(2023).
  14. Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Res. 25 (20), 4165-4166 (1997).
  15. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282(2014).
  16. Hirata, H., et al. Connexin 39.9 protein is necessary for coordinated activation of slow-twitch muscle and normal behavior in zebrafish. J Biol Chem. 287 (2), 1080-1089 (2012).
  17. Cason, N., White, T. W., Cheng, S., Goodenough, D. A., Valdimarsson, G. Molecular cloning, expression analysis, and functional characterization of connexin44.1: a zebrafish lens gap junction protein. Dev Dyn. 221 (2), 238-247 (2001).
  18. Urushibata, H., et al. Control of developmental speed in zebrafish embryos using different incubation temperatures. Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).
  19. Yu, D., et al. Cyclic digestion and ligation-mediated PCR used for flanking sequence walking. Sci Rep. 10 (1), 3434(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRISPRsgRNA

מאמרים קשורים