זרימת עבודה של הדמיה וניתוח בתפוקה גבוהה להערכת פנוטיפים של תאי עור ומצבי התפשטות בדגימות רקמה

Summary

השילוב של איטרטיבי-הלבנה-הרחבה-ריבוי (IBEX) ובדיקת תיוג נוקלאוטידים מסחרית (Click-iT EdU) מאפשר זיהוי וסיווג של סוגי תאים מתחלקים בתהליכים דינמיים ביותר בקטעי רקמת עכברים קפואים קבועים. יתר על כן, צינור עיבוד תמונה חדש בקוד פתוח מספק רכישה וניתוח של תמונות בתפוקה גבוהה.

Abstract

פציעות עור יוזמות מפל התחדשות מורכב המשלב סוגי תאים שונים. בין אלה, תאי גליה היקפיים ממלאים תפקיד קריטי בהבטחת הצלחת תהליך התיקון. עם זאת, הבנתנו את התהליכים הללו נותרה חלקית עקב מגבלות בטכנולוגיות הנוכחיות. לכן, נעשה שימוש בשיטת IBEX כדי לאפיין שינויים בהרכב התאי של העור באמצעות נוגדנים המכוונים כנגד חלבונים המתבטאים על ידי סוגי תאים ומבנים מרכזיים המעורבים בהתחדשות רקמות. חשוב לציין, נוגדנים המכוונים נגד סמני התפשטות תאים לעתים קרובות ממעיטים בהערכת מספר התאים המתחלקים בעור. כדי להתגבר על מגבלה זו, הכימיה של Click-iT EdU שולבה עם שיטת IBEX, מה שמאפשר אפיון מפורט של סוגי תאים מתרבים. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי אוטומטי לחלוטין של דיסק מסתובב, פותח זרימת עבודה בתפוקה גבוהה להדמיה איטרטיבית של דגימות שנחתכו ללוחות של 24 בארות. מעבר להרחבת שיטת IBEX להערכת מצבי תא באתרם עם Click-iT EdU, הוצג גם צינור עיבוד תמונה חדש בקוד פתוח לביצוע תיקון תמונה, תפירה ורישום, ויכול לשמש חוקרים ללא ניסיון רב בתכנות. יתר על כן, מסופק גם תיעוד מפורט על עיבוד והדמיה של נתוני הדמיה מרובים מאוד (באמצעות תוכנות ניתוח תמונה קונבנציונליות, כולל פיג'י ו-QuPath). לסיכום, פרוטוקול זה מדגיש את הרבגוניות של פרוטוקול IBEX ומדגים את התאמתו לפלטפורמת הדמיה קונבנציונלית מבוססת. יש לציין כי שילוב IBEX עם תיוג Click-iT EdU מאפשר זיהוי וסיווג של סוגי תאים המתחלקים באופן פעיל ברקמות שלמות ובמהלך תהליכים דינמיים ביותר ברזולוציה מרחבית.

Introduction

העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף האדם והמחסום הקדמון להגנה על הגוף מפני הסביבה החיצונית¹. כתוצאה מכך, הוא חשוף לשפע של אתגרים חיצוניים הפוגעים בתפקוד המחסום שלו. לכן, העור פיתח מנגנונים מורכבים לשיקום שלמות הרקמה ותפקודה לאחר נזק. ריפוי פצעי עור מתרחש בשלושה שלבים חופפים: דלקת, התפשטות והתבגרות/עיצוב מחדש. שלושת השלבים הללו כוללים מספר סוגי תאים שונים, כגון פיברובלסטים עוריים ותאי חיסון, הפועלים יחד כדי לשחזר את התכונות הביולוגיות הראשוניות של רקמת העור הפגועה ^1,2,3.

העור הוא איבר עצבני צפוף, וידוע כי עצבוב עצבי חיוני לתהליך תיקון מוצלח ^4,5,6. מלבד איתות אקסונלי ^4,7,8, הגליה ההיקפית, העוטפת בדרך כלל את האקסונים, משתתפת בהתחדשות רקמות מוצלחת ^9,10,11. עם זאת, תפקידם של סוגי תאים שאינם מיוצגים, כגון תאי גליה היקפיים, נותר לא מובן היטב בתהליכים דינמיים כמו התחדשות רקמת העור. כדי לקבוע טוב יותר את תפקודם של תאים אלה, קריטי לנתח את המיקרו-סביבה התאית ואת סוגי התאים השכנים איתם הם עשויים לקיים אינטראקציה במהלך תהליך ההתחדשות. יתרה מכך, מכיוון שריבוי תאים הוא שלב מפתח להתחדשות רקמות, חשוב לזהות ולסווג במדויק את סוגי התאים המתרבים לאורך תהליך התיקון.

שיטות הדמיה אופטיות מרובות ועתירות-תכולה, כגון IBEX¹², פותחו כדי לאפיין את ההרכב התאי, לדמיין ולכמת אינטראקציות תא-תא ולנתח דפוסים מיקרו-סביבתיים בתוך רקמות מורכבות ברזולוציה מרחבית. בעוד ששיטות ריבוב אחרות דורשות מכשירים מיוחדים וריאגנטים קנייניים, יתרון מיוחד של IBEX הוא שניתן להקים אותו בעלויות נמוכות יחסית באמצעות נוגדנים, ריאגנטים ומיקרוסקופים זמינים מסחרית הנגישים בסביבת מחקר סטנדרטית. בעוד שנוגדנים נגד Ki-67, המשמשים לעתים קרובות בפאנלים של IBEX, מסמנים באופן אמין סוגי תאים מתרבים ברקמות רבות^13,14, נמצא כי מספר התאים החיוביים ל-Ki-67 (Ki-67+) מוערך בחסר בהשוואה למתודולוגיות אחרות בקטעי רקמה קפואים קבועים של פצעי עור חריפים של עכברים. לכן, שילבנו את הכימיה של Click-iT EdU עם IBEX ומצאנו שמספר תאי EdU⁺ מייצג בצורה מדויקת יותר את המספר הכולל של תאים מתרבים המתקבלים במתודולוגיות אחרות.

יתר על כן, על ידי שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי אוטומטי לחלוטין של דיסק מסתובב, נוצר זרימת עבודה בתפוקה גבוהה להדמיה איטרטיבית של קטעי רקמה המונחים בצלחת של 24 בארות. התמונות המתקבלות מעובדות לאחר מכן על ידי שילוב של מספר כלי Python בקוד פתוח לצינור עיבוד תמונה חדשני שמתקן את התמונות לתאורה לא אחידה, מבצע את התפירה של האריחים הבודדים, ובסופו של דבר, רישום תמונה. בפירוט, ספריית BaSiCPy¹⁵ שימשה לתיקון תאורה, ספריית m2stitch לתפירת התמונות ומתאם פאזה-צולב לרישום מחזור. התמונות הרשומות נשמרות כ-OME-TIFF ולאחר מכן ניתן לטעון אותן לתוכנת ניתוח תמונות קונבנציונלית, כגון Fiji¹⁷ ו-QuPath¹⁸, שם התמונות מעובדות עוד יותר, וניתן לבצע סיווג סוג תא ומדידות אחרות, כמו חישובי עוצמה ומרחק. יחד, הפרוטוקול הנוכחי איפשר לנו לבצע אפיון מפורט ויעיל ביותר של סוגי התאים העיקריים של העור המתחדש, עם דגש מיוחד על המיקרו-סביבה התאית המקיפה את אוכלוסיית תאי הגליה ההיקפיים.

Protocol

כל גידול בעלי החיים, הדיור והניסויים נערכו על פי הנחיות המשרד הווטרינרי של קנטון ציריך, שוויץ.

1. פצעי עור בעובי מלא (יום 0)

1. יש להשרות עכברים בני 8-10 שבועות עם 5% איזופלורן ב-70% O₂ ולשמור עליו באמצעות 2.5% איזופלורן.
2. לגלח את עור הגב ולנקות אותו ביסודיות.
3. יש לחטא לפני הניתוח באמצעות סבון אנטיבקטריאלי ותמיסת EtOH 70%.
4. יש למרוח משככי כאבים לפני הניתוח באמצעות זריקה תת עורית של בופרנורפין (30 מיקרוגרם-מ"^ג-ק"ג-1).
5. צור ארבעה פצעי כריתה עגולים בעובי מלא בקוטר 5 מ"מ על עור הגב התחתון של כל בעל חיים, שניים מכל צד, 1 ס"מ מקו האמצע של החיה, ובמרחק של כ-2 ס"מ זה מזה¹⁹.
6. לבצע שיכוך כאבים לאחר הניתוח עם טיפול של 3 ימים בבופרנורפין באמצעות מי שתייה (9 מיקרוגרם/מ"ל עם 2% סוכרוז).
7. תנו לפצעים להחלים בלי להתלבש.
8. אסוף את הפצעים בנקודות זמן מוגדרות לבדיקה היסטולוגית וניתוח ציטומטריית זרימה.
9. עבור פרוטוקול IBEX, יש לנתח ולתקן את רקמות העור עם תמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. השתמש בכמוסה ביופסיה זמינה מסחרית כדי למנוע סלסול של הדגימות במהלך הקיבוע. הגן בהקפאה על 4% רקמות קבועות PFA ב-30% סוכרוז ב-PBS למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. העבירו את הרקמות לתערובת של 1:1 של 30% סוכרוז עם תרכובת O.C.T למשך שעתיים ב-RT ולבסוף הטמיעו ב-O.C.T לפני הקפאה באיזופנטן.

2. הכנת דגימה (יום 1)

1. מצפים את צלחת 24 הבארות ב-200 מיקרוליטר של ג'לטין אלום כרום למשך 15 דקות על שייקר נדנדה. לאחר מכן, מסירים לחלוטין את הג'לטין ומייבשים את הבארות המצופות למשך 60 דקות בתנור של 40 מעלות צלזיוס. מעיל כפול מהבארות הדרושות כגיבוי. הוסף 2 מ"ל PBS לבאר.
   הערה: ודא שהציפוי יבש לחלוטין לפני הנחת הטישו. ניתן גם לצפות בארות יום לפני ולייבש למשך הלילה ב-RT. לאחר הציפוי, אין לאחסן את הבארות המצופות במקרר או במקפיא, ולקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש בצלחת המצופה של 24 בארות תוך 1-2 ימים.
2. חותכים את הרקמה המוטמעת ב-O.C.T לעובי של 15-30 מיקרומטר בקריוסטט ומעבירים אותה במהירות לבאר מצופה המכילה 2 מ"ל PBS.
   הערה: ניתן להעביר את הרקמה באמצעות מרית מתכת או מלקחיים.
3. הסר בזהירות את ה-PBS באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, במטרה לשמור על קטע הרקמה במרכז הבאר. כדי לעשות זאת ביעילות, שאפו לאט את ה-PBS משולי הבאר, והתאימו את מיקום הפיפטה לפי הצורך כדי למנוע את תזוזה של הרקמה.
   הערה: מיקום מדויק של הרקמה חיוני להצלחת הפרוטוקול. ברגע שהרקמה נדבקת למשטח המצופה, לא ניתן למקם אותה מחדש.
4. יבש את חלקי הטישו למשך שעה בתנור 37 מעלות צלזיוס.

3. חסימת רקמות, תגובת EdU Click-iT ותיוג חיסוני של נוגדנים, IBEX מחזור 1 (יום 1)

1. יש להחזיר לחות עם 1 מ"ל PBS למשך 5 דקות.
2. לחדור את הרקמה עם 500 מיקרוליטר של 0.5% טריטון ב-PBS למשך 30 דקות ב-RT.
3. שטפו את הטישו לזמן קצר פי 2 עם PBS.
4. בצע תגובת Click-iT, בהתאם להוראות היצרן, למשך 30 דקות ב-RT.
   הערה: שמור על הדגימות מוגנות מפני אור.
5. שטפו את הטישו לזמן קצר פי 2 עם PBS.
6. חסום את הרקמה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT) באמצעות מאגר חוסם.
   הערה: כאן, 10% סרום חמורים ב-PBS שימש לניסוי זה, אך ניתן להתאים זאת לפי הצורך; כל מאגר חוסם התואם לפרוטוקולי תיוג חיסוני סטנדרטיים מתאים.
7. יש למרוח נוגדנים ראשוניים (מדוללים במאגר חוסם; ראו טבלת החומרים) למחזור הראשון למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: ניתן לבצע חסימה ותיוג חיסוני גם למשך ~ שעה באמצעות מיקרוגל שאינו מחמם, כמתואר ב- Radtke et ^al.12. עם זאת, עבור פצעי עור, יחס האות לרעש הטוב ביותר מתקבל כאשר נוגדנים ראשוניים מודגרים במהלך הלילה. ניתן לאחסן קטעי רקמה עם תווית חיסונית ב-PBS במשך מספר ימים לפני ההדמיה. הדמיה מומלצת למחרת לקבלת איכות אות מיטבית.

4. תיוג חיסוני של נוגדנים משניים וכתם נגד גרעיני (יום 2)

1. שוטפים את הבארות עם 3 x 1 מ"ל PBS.
2. דגרו את קטע הרקמה עם צביעת הנוגדנים המשניים נגד ארנב (1:300) בתמיסת חסימה, יחד עם כתם נגד גרעיני Hoechst 1:1,000, למשך שעה אחת ב-RT בחושך.
3. שטפו 3 x 5 דקות עם 1 מ"ל PBS ב-RT.
4. השאירו ~500 מיקרוליטר PBS בכל באר והביאו את הצלחת למיקרוסקופ.
   הערה: זו יכולה להיות נקודת הפסקה: הדגימות יציבות במשך מספר ימים ב-4 מעלות צלזיוס, אך יחס האות לרעש הוא הטוב ביותר כאשר הן מצולמות תוך 24 שעות של תיוג חיסוני.

5. הגדרת מיקרוסקופ והדמיה של מחזור IBEX הראשון (יום 2)

1. היכנס למיקרוסקופ וטען את התוכנה, והיכנס לפרופיל המשתמש.
2. היכנסו למערך הרכישה (פתח דרך סינון | Acquisition Setup) עבור תצורת פרוטוקול ורכישת תמונות.
3. השתמש בלחצן הוצא כדי לטעון את הצלחת למיקרוסקופ.
4. נקו את החלק התחתון של צלחת 24 הבארות עם 70% אתנול רגע לפני הכנסת הצלחת למיקרוסקופ. לחץ על לוחית הטעינה כפתור כדי לטעון את הצלחת למיקרוסקופ.
5. בחר את מצב ההגדלה והרכישה הרצוי תחת מטרה ומצלמה. כמצב הרכישה , בחר במצב חריץ קונפוקלי של 51 מיקרומטר .
   הערה: כאן, שימש לניסוי יעד טבילה במים פי 20 עם צמצם מספרי של 0.95, ודיסק מסתובב עם חורים של 50 מיקרומטר, במרווח של 250 מיקרומטר.
6. תחת הכרטיסייה לוחית , בחר את דגם הלוחית המשומשת.
7. עבור אל הכרטיסייה צלחת/אתרים לביקור. תחת אפשרויות אתר, לחץ על מספר קבוע של אתרים. בחר את מספר העמודות והשורות כך שבערך כל הבאר מכוסה. לחץ על אתרים חופפים ב- 10%.
   הערה: יש להפעיל כפתור זה כדי להבטיח תפירה של האריחים הבודדים.
8. בחר רק את הבאר הראשונה שהתמלאה לרכישה על ידי לחיצה ימנית על הבאר המתאימה במפת הבאר. בארות נבחרות הן ירוקות ובארות שלא נבחרו הן אפורות.
9. העבר את השלב למצב שבו הרקמה צריכה להיות על ידי לחיצה שמאלית על הבאר הראשונה שמולאה במפת הצלחת ועל אתר ליד המרכז במפת האתר. חפש צבע כהה יותר של הבאר והאתר המציין את המיקום הנוכחי.
10. עבור אל הכרטיסייה רכישה . בחר באפשרויות אפשר מיקוד מבוסס לייזר ו-Acquire Z Series.
11. עבור אל הכרטיסייה רכישה/פוקוס אוטומטי . עבור פוקוס אוטומטי טוב לטובה, בחר באפשרות פוקוס בצלחת ובתחתית באר , ועבור פוקוס אוטומטי של אתר, בחר באפשרות כל האתרים .
12. עבור אל אורכי גל הכרטיסייה ובחר את מספר הצבעים שיש לצלם במחזור הנוכחי. חפש את המספר המתאים של כרטיסיות חדשות שנפתחות מתחת לכרטיסיה אורכי גל .
13. עבור לכרטיסיית אורך הגל הראשונה. תחת תאורה, בחר את הגדרות המסנן המתאימות ביותר לפלואורופור המעניין (למשל, בחר DAPI אם נעשה שימוש ב-Hoechst).
14. בחר לייזר עם היסט z עבור מיקום z ולחץ על הלחצן חשב היסט כדי להגדיר את גובה ההדמיה הנכון. סדרה של תמונות תירכש במיקומי z שונים. בחר את זה שבו המדגם הוא הכי ממוקד.
    הערה: ודא שמיקום הבמה מוגדר למיקום עם רקמה. אם לא נראית רקמה בתנוחה זו, בחר אתר אחר ונסה שוב (ראה שלב 4.9).
15. לחץ על כפתור המיקוד והמתן להצגת תמונה ממוקדת של הרקמה.
16. עבור עוצמת תאורה, בחר 50%. הזן 2000 עבור יעד עוצמה מקסימלית ולחץ על חשיפה אוטומטית כדי לכוונן את זמן החשיפה באופן אוטומטי.
    הערה: כדי להאיץ את הרכישה, ניתן להגדיל את עוצמת הלייזר, מה שאמור להפחית את זמן החשיפה. עם זאת, זה עשוי להוביל ליותר הלבנת תמונות, מה שיוביל לחפצי תמונה שבהם האריחים הבודדים חופפים.
17. באפשרות Z Series, בחרו Z-Series ו-2D Projection Image, ובחרו באפשרות Shading Correction , בחרו FL Shading בלבד.
18. חזור על שלבים 5.13-5.17 עבור אורכי הגל האחרים, אך במקום לייזר עם קיזוז z, בחר Z-offset מ-W1 ובחר 0.
19. עבור אל הכרטיסייה סדרת Z . הזן את גודל הצעד הרצוי (עבור המטרה 20x, השתמש בגודל צעד של 0.5 מיקרומטר).
    הערה: ניתן להגדיל את מהירות הרכישה באמצעות גודל צעד שהוא פי 2-3 מהערך המומלץ.
20. לחץ על לחצן פוקוס והמתן להופעת חץ עם התווית מיקום נוכחי .
21. לחץ על התחל בשידור חי והמתן להופעת חלון חדש עם תמונות חיות. גרור את חץ המיקום הנוכחי עד שמגיעים לתחתית הטישו ולחץ על כפתור הגדר B . גררו את חץ המיקום הנוכחי עד שתגיעו לחלק העליון של הממחטה ולחצו על הלחצן Set T . לחץ על F2: עצור.
    הערה: ניתן לבחור את אורך הגל המשמש להדמיה חיה תחת אורך גל פעיל.
22. בחר את האתרים לרכישה; ראשית, ודא שהשלב נמצא בבאר הראשונה על ידי לחיצה ימנית עליו ולחץ שוב על התחל בשידור חי . עבור למיקומים שונים בתוך הבאר על ידי לחיצה ימנית על אתרים שונים במפת האתר. מצא את גבול הרקמה וסמן את כל האתרים המכילים רקמה לרכישה על ידי לחיצה ימנית. אתרים נבחרים יהיו ירוקים ואתרים שלא נבחרו יהיו אפורים.
    הערה: לעת עתה, עשו זאת רק עבור הבאר הראשונה וודאו שרק הבאר הראשונה נבחרה לרכישה.
23. עבור אל הכרטיסיה הפעלה . עבור שם הלוחית, תן לו את השם "Cycle{i}_Well{w}_{description}"; החלף את {i}, {w} ו-{description} בערכים/תיאור המתאימים.
24. לחץ על שמור פרוטוקול ושמור אותו, שוב כולל "Cycle{i}_Well{w}" בשם.
25. הגדר את אזורי הרכישה עבור כל הבארות האחרות. לשם כך, חזור על שלבים 5.22-5.24.
    הערה: כדי שכל באר תרכוש, יש לשמור קובץ פרוטוקול בודד. ודא שהבאר הנכונה מופעלת לפני משיכת ההחזר החדש על ההשקעה. התוצאה צריכה להיות פרוטוקול שמור אחד לכל באר כדי לרכוש. זה הכרחי מכיוון שלרקמות יש צורות שונות מבאר לבאר. במקרה שה-ROI ו-z-stack זהים בין הבארות, ניתן לדלג על שלבים חוזרים 5.22-5.24, וניתן לדלג גם על שלבים 5.26-5.29. במקרה כזה, פשוט בחר את כל הבארות להדמיה (ראה שלב 5.22), עבור ללשונית הפעלה ולחץ על רכוש לוחית.
26. לחץ על פקד | כתב עת | התחל להקליט ואז מיד שלוט | כתב עת | הפסק את ההקלטה. שמור את היומן שנוצר ופתח אותו שוב באמצעות בקרה | כתב עת | עריכת יומן.
27. בחלונית השמאלית, מצא ולחץ פעמיים על רכישת לוחית - טען פרוטוקול מקובץ ועל רכישת לוחית כדי להוסיף את השלבים הללו ליומן; חפש אותם בחלונית הימנית. לחץ פעמיים על רכישת הצלחת שנוספה - טען פרוטוקול מקובץ ובחר את הפרוטוקול שנשמר עבור הבאר הראשונה (ראה שלב 5.24).
28. חזור על שלב 5.27 עבור כל באר שתרכוש, ותמיד טוען את הפרוטוקול המתאים.
29. לחץ על שמור ולבסוף על הפעל יומן כדי להתחיל את הרכישה (דורש כ-3 שעות כדי לרכוש 180 אריחים עם מחסנית z של 15 מיקרומטר).

6. הלבנת פלואורופור (יום 2)

1. כ-30 דקות לפני סיום היומן, הכינו את מגיב ההלבנה. ממיסים 10 מ"ג ליתיום בורוהידריד ב-10 מ"ל של ddH₂O ועוברים דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. השאירו למשך 10 דקות, ממתינים להיווצרות בועות. כדי להבטיח הלבנה יעילה, השתמש במגיב ההלבנה תוך 4 שעות לאחר ההכנה.
   זהירות: עבוד מתחת למכסה מנוע כימי בעת הטיפול בליתיום בורוהידריד, מכיוון שהוא יכול להגיב עם אוויר ועלול לייצר גז מימן דליק.
2. הלבינו את הפלואורופורים עם 1 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל ליתיום בורוהידריד למשך 15 דקות תוך חשיפה לתאורת סביבה סטנדרטית. חפש בועות קטנות על הרקמה במהלך הליך ההלבנה.
   הערה: בעת עבודה מתחת למכסה מנוע כימי, ודא שהתאורה אינה כבויה אוטומטית במהלך הליך ההלבנה.
3. חזור על ההלבנה עם עוד 1 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל ליתיום בורוהידריד (מוכן מאותה תמיסה) למשך 15 דקות.
4. שוטפים את הבאר למשך 3 x 5 דקות עם 1 מ"ל PBS.
   הערה: אין לקצר את זמני הכביסה, מכיוון שהסרה לא מלאה של מגיב ההלבנה עלולה לפגוע בפאנל הנוגדנים הבא.

7. מחזורי IBEX (יום 2)

1. יש למרוח נוגדנים ראשוניים למחזור התיוג החיסוני הבא (שלב 3.7) ולדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. חזור על שלבים 4.4-5.4.
   הערה: שלבים 4.2-4.3 אינם חוזרים על עצמם מכיוון שנוגדנים לארנב לא מצומדים משמשים רק במחזור ה-IBEX הראשון. עם זאת, נוגדנים לא מצומדים הגדלים במינים פחות נפוצים כמו עוף או שרקן יכולים לשמש גם במחזורים מאוחרים יותר, מכיוון שהנוגדן המשני שלהם לא יגיב עם הנוגדנים הראשוניים המחוברים אליו. פרטים מדויקים של הנוגדנים המשמשים בכל מחזור ניתן למצוא בטבלת החומרים.
2. במיקרוסקופ, טען את הגדרות הפרוטוקול ממחזור IBEX הקודם עבור הבאר המתאימה על ידי לחיצה על פרוטוקול טעינה, שנשמר במחשב המקומי כ-Cycle{i}_Well{w} (שלב 5.24). הגדרות הפרוטוקול יכללו את החזר ה-ROI (אריחים נבחרים לרכישה), הגדלה, הגדרות פוקוס אוטומטי וכל הגדרות רכישה נוספות שנשמרו ממחזור ה-IBEX הקודם (שלבים 5.5-5.25).
3. בחר את כרטיסיות אורך הגל והתאם את עוצמת החשיפה והתאורה עבור פאנל הנוגדנים החדש (שלבים 5.12-5.18). הקפד לדמיין סמן אחד (בדרך כלל DAPI או Hoechst) לאורך כל המחזורים כדי ליישר את המחזורים לאחר מכן.
   הערה: כפי שדווח ב-Radtke et ^al.18, חלבונים פלואורסצנטיים נפוצים, כגון GFP ו-tdTomato, אינם רגישים להלבנת ליתיום בורוהידריד. כאשר עובדים עם רקמה המכילה חלבונים פלואורסצנטיים אנדוגניים כגון tdTomato, ניתן להשמיט את אורך הגל המתאים מהרכישה לאחר מחזור 1, אם אין צורך בו לרישום תמונה - זה יאיץ את ההדמיה. ניתן להסיר אורכי גל בכרטיסייה אורך גל כולל על ידי הפחתת מספר ערוצי הרכישה. יתר על כן, לא נצפתה עלייה עקבית באוטו-פלואורסצנטיות של רקמות במהלך מחזורי ההדמיה; עם זאת, סביר להניח שזה ישתנה בהתאם לסוג הרקמה¹⁸.
4. בדוק אם הגדרות z-Stack עדיין סבירות והתאם בהתאם (שלבים 5.19-5.21).
   הערה: ודא שגודל הצעד של מחסנית ה-z זהה עבור כל המחזורים.
5. עדכן את שם הלוחית בכרטיסייה הפעלה ושמור מחדש את הפרוטוקול.
6. חזור על שלבים 7.2-7.5 כדי לרכוש את כל הבארות.
   הערה: מומלץ לרשום את הגדרת החשיפה עבור כל אורכי הגל המשמשים בבאר הראשונה ולהשתמש באותה הגדרה בכל הבארות הבאות.
7. ערוך את היומן, בחר את קבצי הפרוטוקול החדשים ושמור את היומן למחזור זה.
8. הפעל את היומן.
9. חזור על שלבים 6.1-6.4 כדי להלבין את הפלואורופורים.
10. חזור על שלבים 7.1-7.9 עד להשגת הכמות הרצויה של תיוג חיסוני.

8. עיבוד תמונה (יום 2)

1. לאחר השלמת רכישת התמונה של מחזורי IBEX, ייצא נתוני תמונה:
   1. בחר הקרנה | כלי עזר לנתוני לוחיות | ייצוא תמונות.
   2. לחץ על בחר לוחות(ים) ובחר את כל הלוחות שנרכשו עבור כל מחזור ובכן.
   3. בחר All Z Planes, בחר ספריית פלט ולחץ על OK כדי לייצא את הנתונים.
      הערה: הנתונים ייוצאו כקובצי tiff נפרדים עבור כל אריח ומישור. כדי לשלב את כל האריחים והמחזורים, בוצעו שלבי העיבוד הבאים.
2. סדר את הנתונים המיוצאים בתיקיות לפי הסכימה הבאה: ודא שכל מחזור הוא תיקיה אחת, שכל אחת מכילה שוב תיקיה אחת לכל באר. שם באופן הבא: "\cycle{i}\{well}\*_Plate_*", כאשר {i} ו-{well} הם המחזור המתאים ו-well, ו-* הוא כל תו. לדוגמה: "\cycle1\A01\some_name_Plate_8654"
   הערה: נדרש מבנה נכון של מתן שמות ותיקיות לשלבי העיבוד הבאים.
3. התקן חבילות python נחוצות: השתמש ב-Miniforge לניהול סביבת Python. ראה https://github.com/conda-forge/miniforge הוראות התקנה.
   הערה: הקוד לשלבי העיבוד מסופק בצורה של מחברות Jupyter. ניתן למצוא אותם בכתובת https://github.com/ZMB-UZH/zmb-ibex-jove או כקבצים משלימים (תיק משלים 1, תיק משלים 2, תיק משלים 3, תיק משלים 4 ותיק משלים 5).
4. בעת הורדת הקוד מ-Github, הורד את כל הקבצים על ידי לחיצה על קוד | הורד את ZIP ופעל לפי הוראות ההתקנה בקובץ README.md.
5. התחל את Jupyter-Lab (קובץ משלים 2):
   1. הפעל את סביבת ה-conda המותקנת על ידי הזנת conda activate zmb-ibex-jove במסוף.
   2. בטרמינל, שנה לספרייה שהורדת על ידי הזנה, למשל, cd C:\path\to\zmb-ibex-jove.
   3. הפעל את Jupyter-Lab על ידי הזנת Jupyter-Lab בטרמינל. ייפתח חלון דפדפן עם jupyter-lab.
6. חשב תיקון תאורה:
   1. בכרטיסייה השמאלית, נווט אל המחברת " דוגמאות/01_get_flatfield_BaSiC.ipynb" ופתח אותה על ידי לחיצה כפולה עליה. מחברת זו תחשב את תמונות תיקון התאורה, באמצעות ספריית BaSiCPy (קובץ משלים 3).
   2. שנה את "base_dir" ו- "save_dir" לנתיבים הנכונים, היכן נמצאים הנתונים והיכן יש לשמור את תמונות תיקון התאורה.
   3. כדי להפעיל את הקוד בתוך המחברת, בחר כל תא והקש Shift+Enter כדי לבצע אותו. הפעל את המחברת מלמעלה למטה.
7. בצע תפירה עבור כל מחזור בודד (קובץ משלים 4):
   1. בכרטיסייה השמאלית, נווט למחברת הבאה ופתח אותה: "02_stitching_MD.ipynb". במחברת זו, עבור כל מחזור, האריחים הבודדים נטענים, התאורה מתוקנת ותפורים יחד, וכתוצאה מכך קובץ תמונה אחד לכל באר ומחזור. השתמש בספריית m2stitch (https://github.com/yfukai/m2stitch) לתפירה.
   2. שנה את הקלט בתא הראשון לנתיבי הקבצים הנכונים. הפעל שוב את המחשב הנייד מלמעלה למטה.
8. בצע רישום תמונה בין מחזורים (קובץ משלים 5):
   1. בכרטיסייה השמאלית, נווט למחברת הבאה ופתח אותה: "03_registration_pcc.ipynb". במחברת זו, המחזורים הבודדים מיושרים זה עם זה באמצעות טרנספורמציות תרגומיות בלבד, המחושבות באמצעות אלגוריתם מתאם פאזה-צולב מספריית תמונות scikit-image בגישה פתוחה (https://scikit-image.org/).
   2. שנה את הקלט בתא הראשון לנתיבי הקבצים הנכונים. בחר מחזור ייחוס וערוץ התייחסות לשימוש (בדרך כלל DAPI). הפעל שוב את המחשב הנייד מלמעלה למטה.
      הערה: יש לבצע רק אחד מהפרקים "אפשרות 1: טען ושמור את כל הערוצים יחד" ו"אפשרות 2: טען ושמור ערוצים כקבצים בודדים". הפרק הראשון ייצור קובץ אחד גדול, המכיל את כל הערוצים של כל המחזורים. הפרק השני ייצור קובץ נפרד לכל ערוץ. האפשרות השנייה תדרוש פחות זיכרון לעיבוד.

9. ניתוח תמונות (יום 2)

1. הורד ופתח את פיג'י (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
   הערה: התמונות המתקבלות יהיו תמונות מרובות מישורים ורב-ערוציות, שניתן לנתח כתמונות תלת-ממדיות. כאן, זרימת עבודה לדוגמה של ניתוח מוצגת עבור נתונים דו-ממדיים בלבד, שעבורם מחושבת תחילה הקרנה של עוצמה מרבית.
2. פתח את הקובץ בפיג'י על ידי גרירת הקובץ לחלון פיג'י.
3. חשב את ההקרנה בעוצמה המרבית על-ידי בחירה באפשרות Image | ערימות | Z Project..., בחר עוצמה מקסימלית ולחץ על אישור. שמירה מחדש של התמונה באמצעות קובץ | שמירה בשם | אומה-טיף".
4. כדי לנתח את התאים, השתמש בתוכנת הקוד הפתוח QuPath; הורד והתקן אותו מ-https://qupath.github.io/.
5. פתח את QuPath וצור פרוייקט חדש על-ידי גרירת תיקיה ריקה לחלון.
6. ייבא את כל הקבצים לפרויקט על ידי גרירתם לחלון QuPath ולחיצה על ייבוא עם ההגדרות הסטנדרטיות.
7. לחץ פעמיים על תמונה בחלונית השמאלית כדי לפתוח אותה. ציין אותו כפלואורסצנטי כאשר תתבקש לעשות זאת.
8. פתח את חלון הבהירות/חדות על-ידי הקשה על Shift+C.
   הערה: כאן, אפשר לבחור אילו ערוצים יוצגו, ולהתאים את הבהירות והניגודיות. אפשר גם לשנות את שמות הערוצים והצבעים על ידי לחיצה כפולה על השמות.
9. בחר את הכלים | כלי מצולע וביאור אזור הרקמה. חפש ביאור חדש תחת הכרטיסייה ביאורים . הגדר אותו למחלקה ספציפית על ידי בחירת הביאור, בחירת מחלקה (למשל, אחר) ולחיצה על הגדר מחלקה.
10. זיהוי תאים: עבור אל ניתוח | זיהוי תאים | זיהוי תאים.
    1. בחר ערוץ גרעיני.
    2. השאר את רוב ההגדרות כפי שהן, אך התאם את הסף על ידי ריחוף מעל גרעין עם העכבר וציון העוצמה המוצגת בפינה השמאלית התחתונה. רחף מעל אזור רקע ושים לב שוב לעוצמה. בחר ערך באמצע הדרך בין הרקע לחזית כסף.
    3. לחץ על הפעל.
11. בדיקת תאים ומדידות:
12. על ידי לחיצה כפולה על תא או על ידי בחירתו בכרטיסייה היררכיה , בדוק את המידות שלו בחלונית השמאלית התחתונה. יש להוסיף מדידות צורה ועוצמה שונות עבור התא, הגרעין והציטופלזמה.
13. סיווג תאים:
    1. כדי לסווג את התאים שזוהו לפי העוצמה בערוץ, עבור אל סיווג | סיווג אובייקטים | צור מסווג מדידה יחיד.
    2. בחר את הערוץ הרצוי תחת מסנן ערוץ ומדידה מתאימה תחת מדידה (למשל, תא: ממוצע ערוץ).
    3. כוונן את הסף על-ידי ריחוף שוב מעל תא חיובי ומעל תא שלילי ובחירת ערך בין השניים.
    4. בחר, לדוגמה, חיובי עבור מעל הסף ושלילי עבור מתחת לסף. בדוק את התוצאה על-ידי בדיקת תצוגה מקדימה חיה.
    5. לחץ על החל כדי לסווג את התאים.
14. מדוד מרחק לאובייקטים מבוארים (למשל, צרורות עצבים):
    1. בחר את הכלים | הכלי מברשת .
    2. צייר מעל אזורי עניין (למשל, צרורות עצבים).
    3. עבור אל הכרטיסיה ביאורים . בחר את כל הביאורים החדשים, בחר מחלקה מתאימה ולחץ על הגדר מחלקה.
       הערה: ניתן ליצור מחלקה חדשה על ידי לחיצה ימנית בחלון הכיתה ובחירה באפשרות הוספה/הסרה | הוסף כיתה.
    4. עבור לניתוח ניתוח מרחבי | מרחק חתום לביאורים דו-ממדיים ולחץ על כן כאשר תתבקש לעשות זאת.
    5. הוסף מדידה חדשה לכל תא, המציינת את המרחק לביאור הקרוב ביותר של מחלקה נתונה.
15. מדידות ייצוא:
    1. עבור אל מדידה | הצג מדידות זיהוי והמתן להופעת רשימה של כל המדידות של כל הזיהויים.
    2. ייצא את הטבלה כ-.txt באמצעות לחצן שמור .
    3. ייבא את הנתונים לתוכנת עיבוד נתונים לבחירתך לניתוח נוסף.

Results

שיטה זו מאפשרת זיהוי הולם של סוגי תאים מתרבים על ידי שילוב כימיה של EdU Click-iT עם IBEX בחלקי עור עכברים קפואים קבועים. זיהוי סוגי תאים מתרבים הושווה באמצעות מתודולוגיות שונות, בפרט, תיוג של סוגי תאים מתרבים עם נוגדן Ki-67 וזיהוי התפשטות תאים באמצעות גישת הכימיה EdU Click-iT (איור 1). ראינו כי תיוג נוגדני Ki-67 מעריך בחסר את מספר התאים המתרבים בחלקי עור עכברים קפואים קבועים (איור 1B,D), בעוד ששילוב EdU משקף כראו...

Discussion

התפשטות תאים היא אחד מארבעת השלבים העיקריים של תיקון העור, והמעבר בין השלב הדלקתי לשלב ההתפשטות הוא קריטי לתהליך תיקון מוצלח²⁰. תגובה חיסונית מווסתת היטב היא חיונית, שכן דלקת ממושכת עלולה להוביל לפצעים כרוניים, בעיה בריאותית עולמית משמעותית ^1,21. התפשטות היא תהליך ביולוגי מרכזי, חשוב לא רק לתיקון רקמות אלא גם להתפתחות אורגניזמים והערכת מחלות, כולל סרטן. קיימות מתודולוגיות שונות למדידת התפשטות תאים, בין אם ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
נוגדנים ותגובות	מקור	המזהה	הערות
<חזקים>נוגדנים
CD31 אלקסה פלואר 647 (מחזור 2)	ביולג'נד	חתול#102516	1:100
AB_2161029
CD45 אלקסה פלור 488 (מחזור 2)	ביולג'נד	חתול#103122	1:100
AB_493531
Ki-67 FITC (מחזור 1)	ביולג'נד	חתול#151212	1:50
AB_2814055
עוף Ki-67 (ck)	LSBio	Cat#LS-C772946	1:800
עכברוש Ki-67 (rt)	ביולג'נד	Cat#652402	1:100
AB_11204254
נוירופילמנט H& מ' (NF-H/NF-M) אלקסה פלואר 647 (מחזור 3)	BioLegend	קטגוריה#837710	1:300
AB_2734613
p75NTR (מחזור 1)	טכנולוגיית איתות סלולרי	Cat#8238                                            AB_10839265	1:1500
וימנטין אלקסה פלואר 488 (מחזור 3)	ביולג'נד	Cat#699305	1:100
AB_2888889
אלקסה פלואר 647 נגד ארנב לחמור	Jackson ImmunoResearch	Cat#711-605-152
<חזקים>ריאגנטים
צלביס 24 באר תחתית זכוכית	סלביס	P24-1.5H-N
ג'לטין אלום כרום	Newcomer Supply	קטגור#1033A
ערכת Click-iT EdU	תרמו פישר סיינטיפיק	C10637
Hoechst 33342	סיגמא-אלדריץ'	קטגוריה #14533; CAS# 23491-52-3
LiBH4, ליתיום בורוהידריד, 95%	תרמו פישר סיינטיפיק	חתול#10438443
Tissue-Tek O.C.T קומפאונד סאקורה	ביוסיסטמס שווייץ	קטגוריה#7109-4583
PBS	תרמו פישר סיינטיפיק	קטגור#10010-015
שקופיות מיקרוסקופ סופרפרוסט פלוס היצמדות	אפרדיה	Cat#J1800AMNZ
טריטון X-100	סיגמא-אלדריץ'	Cat#T8787
<חזק>ציוד
מברשת שיער	פאוסט AG	Cat#9172051 ו-9172050
להבי מיקרוטום	ביוסיסטמס שווייץ	Cat#207500011
מיקרוסקופ	מכשירים מולקולריים, ImageXpress Confocal HT.ai
תנור	תרמו פישר סיינטיפיק	Cat#HBMCR4220
שייקר רוקר	אדמונד בü hler GmbH	Cat#32310015