הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תיוג איזוטופ יציב in vivo לזיהוי ספקטרומטריית מסה של מטבוליטים אבהיים המועברים מזרע לביצית במהלך ההפריה

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67765

⸱

17 ביוני 2025

 ,  ,  ,  , 
1Biogem Scarl, Institute of Molecular Biology and Genetics Research, 2Department of Experimental Medicine, University della Campania Luigi Vanvitelli, 3Department of Biology, University of Naples "Federico II ", 4Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Salerno, 5Department of Pharmacy, University of Naples "Federico II "

במאמר זה

סיכום

הליך זה נועד לזהות מטבוליטים המועברים מזרע לביציות במהלך ההפריה על ידי שימוש בתיוג איזוטופים יציב עם גלוקוז 2H2O או U13C ואחריו ניתוח מטבולומי. אבות עם תווית דאוטריום מחוברים לסכרים לא מסומנים. עוברים שנאספו לפני ההשתלה מנותחים על ידי ספקטרומטריית מסה כדי למיין מטבוליטים אבהיים (דאוטרטים) ואימהיים (לא דאוטרטים).

תקציר

תרומת האב לגנטיקה של העובר הוגבלה עד כה לרצפים אלליים במשך עשרות שנים. עשור של תוצאות מצביעים, במקום זאת, על כך שגורמים אפיגנטיים - מתילציה של DNA, שינויים בהיסטון, ארגון כרומוזומלי ו-RNA רגולטורי - ממלאים תפקידים מכריעים בתורשה האבהית ומשפיעים על התפתחות עוברית וביטוי גנים זיגוטים. יחד עם חומצות גרעין, מטבולום הזרע (שומנים, פחמימות, חומצות אמינו חופשיות) עשוי לשמש כאות אפיגנטי. פרוטוקול זה נועד לזהות מטבוליטים המועברים מזרע לביצית על ידי ספקטרומטריית מסה. ההליך כולל תיוג איזוטופים יציבים של תאי זרע עם גלוקוז של 2H2O או U13C כדי לעקוב, על ידי מטבולומיקה, מטבוליטים אבהיים המועברים לביצית במהלך ההפריה. המטרה הכוללת של הפרוטוקול היא לחשוף את תפקידו של מטבולום הזרע של האב ברגישות של צאצאים לחוסר חילוף חומרים, וניתן להתאים אותו כדי לספק תובנות לגבי האופן שבו תנאים סביבתיים, כגון תזונה וחשיפה למזהמים, משנים את המסרים המטבוליים של האב, מה שעלול להשפיע על בריאות הצאצאים ועל נטייתם לסוכרת, השמנת יתר ומחלות לב וכלי דם.

מבוא

אפיגנום אבהי משפיע על רגישות הצאצאים לחוסר חילוף חומרים
בשונה משפע התפקידים לפני ואחרי ההתעברות שנוצלו על ידי אמהות במהלך התפתחות העובר, תרומתם של תאי זרע נחשבת במשך עשרות שנים לגנטית בלבד. על פי תיאוריית התורשה הגנטית, יש לייחס את תרומת האב לשונות הפנוטיפית של פרט (כולל רגישותו למחלות) אך ורק לרצף הגנטי של וריאנטים אלליים שעברו בירושה מאב ולאינטראקציות שלהם עם אלה שעברו בירושה מהאם1. כיום, ברור כי אללים אינם המסרים הגנטיים היחידים המועברים על ידי האב לצאצאיו במהלך ההפריה, וכי במקום זאת, מספר רב של אותות אפיגנטיים תורמים לתורשה אבהית 2,3,4. האותות האפיגנטיים שזוהו עד כה כוללים: (1) קבוצות מתיל שנוספו קוולנטית לציטוזינים של הגנום ההורי 5,6,7, (2) שינויים לאחר התרגום (אצטילציה, מתילציה) של היסטונים הקשורים לכרומוזומי זרע ומועברים לביציות8, (3) הארגון התלת-ממדי של כרומוזומי האב המוביל לאינטראקציה תוך-כרומוזומלית (הידועה גם בשם תחומי אסוציאציה טופולוגית, TAD) המתמשכת בזיגוטה9,10 ו-(4) מולקולות RNA רגולטוריות (miRNAs, מקטעים שמקורם ב-tRNA ו-RNA המקיימים אינטראקציה עם piwi)11,12 כמו גם rRNAs13 ו-tRNAs14 המשתחררים מזרע לביצית במהלך ההפריה.

האפיגנום האבהי הוא כלי מידע חשוב עבור הצאצאים. מידע אבהי ישפיע על הזיגוטה, על העובר במהלך התפתחותו, ולאחר הלידה, על נטייתם של הצאצאים להפרעות חילוף חומרים ומחלות. תורשה לא-מנדלית זו (המכונה בין-דורית או בין-דורית, תלוי אם היא משפיעה על דור אחד או מספר דורות עוקבים), נחשבת על ידי מחברים רבים לאחד הגורמים התורמים הסמויים האחראים לעלייה הדרסטית במחלות דיסמטבוליות המתרחשות במדינות המערב המפותחות15. ואכן, על פי תיאוריות PoHaD (מוצא אבהי של בריאות וחולי) ו-DoHaD (מקור התפתחותי של בריאות וחולי), התרומה האפיגנטית ההורית היא אחד הגורמים המועדים לצאצאים לפתח סוכרת, השמנת יתר ומחלות לב וכלי דםבבגרותם. מעניין לציין כי האפיגנום ההורי רגיש במיוחד לגירויים סביבתיים ויכול להיות מושפע ממצבים מטבוליים (כגון שימוש בסמים, הרגלי תזונה וכושר מטבולי)18 כמו גם מפרמטרים סביבתיים גרידא (כגון חשיפה למזהמים, יחסים חברתיים ומתח נפשי ויחסי)5,11. כל אחד מהגירויים שהוזכרו לעיל יכול אפוא לשנות את האפיגנומים של תאי הנבט (זרע וביציות) ולהשפיע על הדורות הבאים.

צריכת תזונה עתירת שומן (HFD) מייצגת את אחד הגירויים הסביבתיים הנחקרים ביותר המסוגלים לשנות את האפיגנום האבהי ולהוביל למסרים מזיקים המועברים לצאצאים19. גירוי זה משפיע על פנוטיפ צאצאים (עד הדור השלישי), שלעתים קרובות מציגים נטייה גדולה יותר לפתח חוסר חילוף חומרים, ללא קשר לצריכת הקלוריות שלהם. צאצאים מאב שצרך HFD מפגינים עיכוב גדילה, אי סבילות לגלוקוז ותנגודת לאינסולין הן בעכברים והן בחולדות20,21. בבני אדם, תורשה אפיגנטית נחקרה בעיקר בדורות שנולדו במהלך ומיד לאחר תקופות של רעב או האכלת יתר22. בקבוצת Överkalix, זמינות המזון של סבים וסבתות מצד האב במהלך תקופת הגדילה האיטית שלהם הייתה בקורלציה עם הסיכון הכללי לתמותה, מחלות לב וכלי דם, BMI, היקף המותניים ומסת השומן של נכדיהם23. לאחרונה, עדויות להעברה בין-דורית אבהית אושרו בקבוצות אחרות24.

מטבוליטים אבהיים המעורבים בתורשה בין-דורית
למרות הראיות הקליניות והאפידמיולוגיות, הפרטים המולקולריים של תורשה בין-דורית אבהית נותרו לא ברורים. בהתחלה, הזיהוי של כל המתמרים המולקולריים של מידע אפיגנטי עדיין לא הושלם. ראיות מדעיות מצביעות על כך שהמרכיב הגרעיני של הזרעונים, כשלעצמו, אינו יכול להסביר את המורכבות של התורשה הבין-דורית. וריאציות במתילציה של DNA אכן נמדדו בזרעונים של עכברים וחולדות שניזונו מ-HFD, אך באחוז כה נמוך מאוכלוסיית הזרע שהדבר אינו יכול להסביר את החדירה הגבוהה של הפנוטיפ הדיסמטבולי שנצפה בצאצאים25. מצד שני, למאגר ה-RNA המאותת המועבר מזרע לביציות יש זמן מחצית חיים קצר מאוד, ולמרות שהוא מסוגל להשפיע על ביטוי גנים זיגוטיים, נראה כי לא סביר שיישמר בריכוזים יעילים לאחר ההפריה, בזיגוטה בעוברים ביום השני, השלישי, במורולות ובבלסטוציסטים. לפיכך, נראה ברור שגורמים מולקולריים חדשים חייבים להיות מעורבים במנגנון התורשה הבין-דורי.

יחד עם חומצות גרעין, הזרע תורם גם רכיבים מטבולומיים לזיגוטה, כגון שומנים, פחמימות וחומצות אמינו 26,27,28,29. מטבוליטים אלה, במיוחד אלה שניחנו בפעילויות מודולטוריות, יכולים להשפיע על ביטוי גנים זיגוטיים והתפתחות עוברית ובכך עשויים לשמש כאותות אפיגנטיים30. יתר על כן, בדומה לחומצות גרעין, הריכוז והשפע היחסי של מטבוליטים אלה בזרע יכולים להיות מושפעים מהתנאים הסביבתיים שחווה האב ובכך מייצגים כלי מידע עבור הצאצאים 28,30,31,32,33,34. ואכן, הוכח כי מטבולום הזרע של זרעונים בוגרים תלוי במצבו הבריאותי של האב ומושפע מגורמים סביבתיים כגון תזונה, פעילות גופנית, חומרים רעילים ומשבשים אנדוקריניים.

הבנת תפקידם של מטבוליטים של זרע בהתפתחות עוברית מסובכת על ידי מספר מגבלות טכניות: (1) הפרש הגודל בין הזרע לביצית, מה שמביא לתרומה מטבולית מינימלית של הזרע לזיגוטה, ו-(2) הווריאציות המטבולומיות השונות שהזרע עובר בשלבי הייצור שלו (זרע), התבגרות אפידידימלית, שפיכה ואיחוי עם הביצית.

תנודות במטבולום הזרע במהלך הבשלת הזרע
ביונקים, זרעונים מיוצרים באשך באמצעות ספרמטוגנזה, תהליך תלוי תאי גזע זרעונים שבאמצעותו זרעונים מחויבים מתפתחים לזרעונים ראשוניים שנכנסים למיוזה ומייצרים זרעונים הפלואידים עגולים. מורפוגנזה של תאים אלה לזרעונים מתרחשת באמצעות spermiogenesis, שיפוץ מורפו-תפקודי מסיבי של זרעונים, מתאים עגולים לתאים מוארכים/מעובים/מיוחדים מאוד, המתאימים לשלב האחרון של הזרע. עם זאת, הזרעונים המתקבלים הם חסרי תנועה ועדיין אינם מסוגלים להפרות35. לאחר הזרע, כאשר הזרעונים משתחררים מהאשך הרטה לתוך האפידידימיס, תאי הזרע מקיימים אינטראקציה עם תאי אפידידימליים אפיתליים ומתקשרים עם חלבונים ושלפוחיות אקסוזומליות המופרשות על ידי תאים אלה (אפידידימוזומים, עשירים בספינגומיאלין וחומצה ארכידונית). המעבר דרך האפידידימיס מאפשר לזרע להגיע לבגרות מלאה, וגם אם הוא נשמר במצב קיבולי מראש, הוא רוכש יכולת לתנועתיות36. במהלך מעבר אפידידימלי, קרום הזרע הופך טעון שלילי יותר ומועשר בספינגומיאלין. קרום הזרע הופך גם הוא לנוזלי יותר עקב ירידה מתקדמת בכולסטרול ובמקביל עלייה בחומצות שומן רב בלתי רוויות (בעיקר חומצות ארכידוניות, דוקוסאפנטאנואיות ודוקוסהקסאנואיות). לאחר שפיכה, בדרכי המין הנשיות, חלבוני נוזל הזרע ואלבומין מקדמים קיבולת זרע על ידי קידום היפרפולריזציה וזרימת סידן להפעלת תנועתיות הזרע. קרום הפלזמה של זרע קיבולי מציג נזילות מוגברת נוספת, יחס כולסטרול לפוספוליפידים נמוך ותכולת חומצה סיאלית, גנגליוזיד GM1 וטריגליצרידים31,37.

לפני המפגש עם הביצית, הזרע עובר את תגובת האקרוזום, איחוי של האקרוזום (אברון קרומי שמקורו בגולגי המכסה את החלק הקדמי של גרעין הזרע ונוצר במהלך הזרע) עם קרום פלזמת הזרע, המאפשר ארגון מחדש של קרום פלזמת הזרע ויכולת לחדור ל-zona pellucida (ZP), מטריצה של גליקופרוטאינים המקיפים את הביצית35, 38. כשלב האחרון, המיפוזיה בין הזרע לקרום הביצית, המקודמת על ידי חלבוני הזרע IZUMO1, SPACA6 ו-TMEM9539, מביאה לשילוב שומני זרע בקרומי הביצית ולהעברת תוכן הגרעין והמטבולי לביצית.

רציונל ההליך
מטרת הליך זה היא לזהות מטבוליטים המועברים על ידי הזרע ומועברים לביצית בעת ההפריה (איור 1). כדי להבחין בין מטבוליטים שמקורם בזרע ובביצית בזיגוטה, הזרעונים מסומנים בדאוטריום (2H, איזוטופ מימן) או 13C (איזוטופ פחמן) באמצעות תיוג מטבולי in vivo עם תחמוצת דאוטריום, 2H2O40, או מסומן באופן אחיד U13C גלוקוז41. עכברים זכרים עם תווית איזוטופית מזווגים לאחר מכן עם נקבות לא מסומנות כדי לאסוף בסופו של דבר זיגוטים, מורולים ובלסטוציסטים. עוברים בשלב מוקדם מעובדים כדי לחלץ (1) מטבוליטים קוטביים, (2) לא קוטביים ו-(3) סטרולים. לאחר מכן מנתחים מטבולומים באמצעות טכניקות ספקטרומטריית מסה. מטבוליטים בעלי תווית איזוטופית (אבהית) יזוהו ויבדלו מאלה שאינם מסומנים (אימהיים), מה שמדגים באופן חד משמעי את מקורם האבהי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת נאפולי פדריקו השני, איטליה. הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. בחירה וקיבוץ של זכרי C57BL/6J

  1. בחר זכרים C57BL/6J של כ-12 שבועות.
  2. חלקו את הזכרים לשתי קבוצות וקראו להם LABELED (עוברים תיוג איזוטופים יציב) או UNLABELED (משמש כבקרה ולמדידת היעילות של תיוג איזוטופים בתאי זרע ומורולות).
  3. על מנת לרוקן את האפידידימיס מתאי זרע ללא תווית, אפשר לזכרים להזדווג עם נקבות מזווגות.

2. תיוג איזוטופי יציב של זכרים C57BL / 6J

  1. אם משתמשים ב-2H2O לתיוג in-vivo , הכינו מים מועשרים ב-10% v/v 2H2O שישמשו כמי שתייה על ידי ערבוב של 100 מ"ל של 2H2O עם 900 מ"ל מי ברז. אם משתמשים ב-U13C-Glucose לתיוג in-vivo , הכינו 5%-15% U13C-Glucose מי שישמשו כמי שתייה על ידי המסת 50-150 גרם U13C-Glucose ב-1 ליטר מי ברז;
    זהירות: צריכה ממושכת של 2שעות2O רעילה לעכברים. הגדר עבור כל זן עכבר ספציפי, את הכמות המקסימלית של 2שעות2O להוסיף מי שתייה כדי להשיג יעילות תיוג מקסימלית ותופעות לוואי מינימליות. צריכה ממושכת של גלוקוז גורמת להיפרגליקמיה וסוכרת בעכברים. הגדר את הכמות המקסימלית של U13C-Glucose להוספה למי השתייה כדי להשיג יעילות תיוג מקסימלית ומינימום תופעות לוואי.
  2. החליפו את בקבוקי המים בבקבוקים המכילים מי שתייה עם תווית איזוטופית ואפשרו לעכברים לשתות אותם במשך 2.5-5 שבועות (המכסים לפחות מחצית מהזרע), וחידשו את הנוזל פעמיים בשבוע.
  3. בתום תקופת הטיפול, אפשר לזכרים המסומנים להזדווג עם נקבות מבייצות.

3. ביוץ-על של נקבות C57BL/6J

  1. נקבות נבחרות בנות כ-4 שבועות במשקל שבין 12.5-14 גרם, בגיל טרום גיל ההתבגרות.
  2. לגרום להבשלת הזקיק על ידי הזרקה תוך-צפקית של 5 IU/50 מיקרוליטר לעכבר של PMSG (סרום סוסה בהריון).
  3. לאחר 47 שעות, יש להזריק תוך צפקית של הורמון הלוטניזציה HCG (גונדוטרופין כוריוני אנושי, 5 IU/50 מיקרוליטר לעכבר) כדי לקדם את השלמת התבגרות הזקיק ולגרום לביוץ ולהיווצרות הגופיף הצהוב.
  4. לאחר הזרקת ה-HCG, אפשרו לנקבות להזדווג עם עכברים מסומנים וללא תווית, לפי שלב 1 באיור 1.
  5. לאחר ההזדווגות, בצע את בקרת פקק הנרתיק42. הפרידו את הנקבות החיוביות וכלאו אותן.

4. איסוף עוברים לפני השרשה על ידי שטיפה

  1. להקריב נקבות חיוביות לנרתיק בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד (2.5 יום לאחר קיום יחסי מין כדי לאסוף מורולות).
  2. הניחו את החיות בשכיבה גבית על השולחן; הרטיבו את הבטן עם 70% אתנול, ובצעו לפרוטומיה רחבה.
  3. הסר את הרחם בצד אחד על ידי צביטה של צוואר הרחם וחיתוך בקצה הזנב של צוואר הרחם; בצד השני, על ידי חיתוך בקצה קרן הרחם (החלק האינפונדיבולרי).
  4. מניחים את הרחם בצלחת פטרי עם PBS כדי לשטוף אותם ולאחר מכן מעבירים אותם לצלחת פטרי נקייה אחרת כדי למנוע נוכחות של שאריות.
  5. על מנת לשטוף את הרחם, טען מזרק של 2.5 מ"ל עם מדיום התרבית והצמד אותו למחט המילטון עם קצה קהה של 33 גרם.
  6. הכנס את המחט לתוך האינפונדיבולום של צינור הביצית שהוכן כמתואר לעיל ושטוף את כל הרחם.
  7. אוספים את המורולה בטיפת מדיום תרבית כדי לשטוף אותם מכל שאריות רירית ודם.
  8. העבירו דגימות שנאספו בצינורות איסוף חדשים, וקבצו אותן ב-LABELED MORULAE ו-MORULAE ללא תווית, תלוי אם הן נובעות מאירועי הזדווגות הכוללים אבות מסומנים או לא מסומנים. הקפיאו את הדגימות בחנקן נוזלי.
  9. להקריב קבוצה של נקבות ביוציות לא מזווגות (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד) על מנת לאסוף ביציות לא מופרות. העבירו את הדגימות שנאספו לצינורות איסוף חדשים, ותייגו אותן כביציות ללא תווית. הקפיאו את הדגימות בחנקן נוזלי.

5. איסוף זרע מזנב אפידידימלי

  1. להקריב אבות מסומנים או לא מסומנים.
  2. הניחו את בעלי החיים בשכיבה גבית על השולחן, הרטיבו את הבטן באתנול 70% ובצעו לפרוטומיה רחבה.
  3. הסר את האפידידימיס וטבל אותם מיד ב -3 מ"ל של PBS (pH 7.6) וחתוך אותם באופן רופף כדי לנקז זרע מהצינורות.
  4. סנן את דגימות הזרע דרך בד הגבינה.
  5. צנטריפוגה של תאי הזרע ב-800 x גרם למשך 10 דקות (בטמפרטורת החדר).
  6. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מים קרים נטולי יונים. רק תאי זרע יתנגדו לתמיסה ההיפוטונית, בעוד שתאים שאינם זרע יתפוצצו.
  7. תאי זרע צנטריפוגה ב-800 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. סמן את הצינורות, וקבץ אותם כזרע מסומן וזרע ללא תווית, תלוי אם הם נאספו מאבות מסומנים או ללא תווית.
  9. הצמד להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי ולאחסן דגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

6. מיצוי שומנים ומטבוליטים קוטביים

  1. אזנו את הדגימה משלבים 1-5 ב-4 מעלות צלזיוס על קרח.
  2. הוסף 225 מיקרוליטר של מתנול קר כקרח (MeOH) לדגימות ודגר בטמפרטורה של -30 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ולאחר מכן הכניס אותן לאמבטיה קולית למשך 10 דקות.
    1. אופציונלי: בעת קביעת תנאי הניסוי, הוסף 0.1-2 חל"מ של C16-Ceramide-13 C3-15 N ו-L-Lysine-ε-15N הידרוכלוריד כתקנים פנימיים למדידת יעילות המיצוי עבור מטבוליטים לא קוטביים וקוטביים, בהתאמה.
  3. הוסף 750 מיקרוליטר של מתיל טרט-בוטיל אתר קר כקרח (MTBE) בתרמו-מיקסר למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס (550 סל"ד).
  4. הוסף 188 מיקרוליטר של H2O לדגימות לאחר צנטריפוגה. הפרד את השלבים העליונים (שומנים) מהשלב התחתון (מטבוליטים קוטביים) וייבש אותם.
    זהירות: MeOH גורם לעיוורון ולנזק לכבד, לכליות וללב בבליעה. לחשיפת יתר יש השפעה מצטברת על מערכת העצבים המרכזית. MTBE עלול לגרום לגירוי בעור, בעיניים ובנשימה. עבדו מתחת למכסה אדים.
  5. יבש את הדגימה באמצעות רכז ואקום. אחסן דגימות מיובשות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח מסה/ספקטרומטריה.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות מיובשות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים, להמתין לניתוח מסה/ספקטרומטריה. לזיהוי מטבוליטים המיוצגים פחות בעוברים לפני ההשתלה, זה עשוי לדרוש איגום דגימות שהתקבלו מאותו זוג הזדווגות ואירוע הזדווגות.

7. מיצוי סטרולים

הערה: הימנע משימוש בצינורות פלסטיק וטיפים [הם יומסו על ידי הממס האורגני הלא קוטבי]; במקום זאת, השתמש בצינורות זכוכית ופיפטות פסטר מזכוכית כדי להוציא נוזלים.

  1. אזנו את הדגימה משלבים 1-5 ב-4 מעלות צלזיוס על קרח. השעו מחדש את הדגימות שנאספו ב-500 מיקרוליטר של תמיסה של מתנול/H20 70% v/v והעבירו את התרחיף לצינור זכוכית.
    1. הומוגניזציה על ידי מערבולת במשך 30 שניות. השאירו את ההומוגנאט למשך 16 שעות בחום של 4 מעלות צלזיוס.
    2. אופציונלי: בעת קביעת תנאי הניסוי, הוסף 0.1-2 ppm של הסטרול הצמחי Sitostanol-5,6,22,23-d4 כתקנים פנימיים למדידת יעילות המיצוי של סטרולים.
      זהירות: MeOH גורם לעיוורון ולנזק לכבד, לכליות וללב בבליעה. לחשיפת יתר יש השפעה מצטברת על מערכת העצבים המרכזית.
  2. צנטריפוגה את הדגימה ב-3.220 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את הסופרנטנט לצינור זכוכית נקי והשלימו אותו עם 500 מיקרוליטר PBS.
  3. הוסף 7 מ"ל של אתר דיאתיל קר כקרח ומערבולת למשך דקה אחת. תן לדגימה לעמוד 1-2 דקות והמתן להפרדת שלבים. הקפיאו על ידי טבילת הצינור באמבט קרח יבש/אצטון. העבר את שלב האתר דיאתיל הלא קפוא לצינור זכוכית שסומן לאחרונה.
    זהירות: אתר דיאתיל הוא נוזל ואדים דליקים במיוחד ומתפרק לפרוקסידים נפיצים באוויר ובאור. אין לעבוד במגע הדוק עם להבות. אתר דיאתיל מסוכן אם נבלע ומזיק לעור.
  4. הפשירו את שלב המים ב-37 מעלות צלזיוס וחזרו על שלב 4.3. שלב שלבי אתר דיאתיל שנאספו בשלבים 4.3-4.4 בצינור זכוכית יחיד.
  5. יבש את הדגימה באמצעות רכז ואקום. אחסן דגימות מיובשות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח מסה/ספקטרומטריה.

8. נגזרת מדגם

הערה: דגימות יפיקו תועלת מגזירת TMS לניתוח מטבוליטים ספציפיים (כולסטרול, חומצות שומן, חומצות אמינו).

  1. איזון הדגימות בטמפרטורת החדר
    זהירות: שיווי משקל לא שלם עלול לגרום לעיבוי של מים אטמוספריים על דפנות הצינור והדגימות. מים מתחרים קשות על נגזרת TMS.
  2. ממיס את הדגימות ב-50 מיקרוליטר של פירידין ונגזר אותן על ידי הוספת 25 מיקרוליטר של N,O-Bis (trimethylsilyl(TMS)trifluoroacetamide (BSTFA). דגרו את הדגימות למשך 90 דקות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. סובב את הדגימות והמשך מיד בניתוח GC-MS.
    אזהרה: פירידין הוא דליק, מגרה ורעיל. BSTFA הוא דליק, קורוזיבי ומגרה. עבדו מתחת למכסה אדים והשתמשו בכפפות מגן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

על מנת לעקוב אחר העברת מטבוליט מזרע לביצית, מורולה שבודדה מנקבות C57 BL/6J שהזדווגו עם אבות מקבוצות LABELED ו-UNLABELED נאספות ומנותחות על ידי מטבולומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה. מטבוליטים חולצו כמתואר בשלבים 6-7 ונגזרו באמצעות TMS כמתואר בשלב 8. בוצע פרופיל מטבולומי וליפידומי של תאי זרע מסומנים, מורולים ללא תווית, ביציות ללא תווית, תאי זרע מסומנים ותאי זרע ללא תווית. הפרופילים שהתקבלו נותחו סטטיסטית, יושרו והושוו על מנת לזהות מינים כימיים, הקיימים באופן ספציפי הן בתאי זרע מסומנים והן בתאי זרע מסומנים ונעדרים במורולות לל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר מאפשר זיהוי מטבוליטים המועברים מזרע לביציות במהלך ההפריה על ידי שימוש בתיוג איזוטופים יציב של עכברים זכרים עם גלוקוז 2H2O או U13C ואחריו ניתוח מטבולומי. מטבוליטים בעלי תווית איזוטופית המצויים במורולות הם ממקור אבהי.

למרות שמימן ודאוטריום הם איזוטופים, הם אינם זהים לחלוטין מבחינת התנהגות כימית. נקודות ההיתוך והרתיחה של 2H2O גבוהות מאלו של H2O. בנוסף, הצמיגות והמסיסות של מלחים הנמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2H2O מסונן, 99.8 atom % 2Hסיגמא אולדריץ'756822
אצטוןסיגמא אולדריץ'179124
אג'ילנט  סיל-8אג'ילנט (סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב)
C16-סרמיד-13C3-15Nתקן LGCTRC-C342770-25 מ"ג
דיכלורומתאןסיגמא אולדריץ'34856
אתר דיאתיל סיגמא אולדריץ'673811
אתנולסיגמא אולדריץ'1,11,727
HCG (גונדוטרופין כוריוני אנושי,סיגמא אולדריץ'CG5-1VL
ל-ליזין-&אפסילון;-15N הידרוכלורידסיגמא אולדריץ'608971
גברים ונקבות  עכברי C57BL/6JOlaHsdאינוטיב C57BL/6JOlaHsd
מתיל טרט-בוטיל אתר (MTBE)סיגמא אולדריץ'306975
מטאוסיגמא אולדריץ'1,06,035
N,O-Bis (טרימתילסיליל(TMS)
טריפלואורואצטמיד (BSTFA)		סופלקו15238
PBSאפליקציהA0965-9010
PMSG (סוסה בהריון) s serum)לי ביו-סולושנס493-10
פירידיןסיגמא אולדריץ'360570
Shimadzu GCMS 2010plus שימדזו
סיטוסטנול-5,6,22,23-ד4סיגמא אולדריץ'680028
נתרן טריפלואוראצטטסיגמא אולדריץ'1615138
SolariX XR 7T ברוקר דלטוניקס
טימסטוף פרו Q-TOF ברוקר דלטוניקס
גלוקוז U13C סיגמא אולדריץ'389374
RS3000 UHPLC אולטימטיבי תרמו פישר סיינטיפיק
עמודה מקדימה של VanGuard CSHTM (5.0 & פעמים; 2.1 מ"מ; 1.7 μ מ', 130 וארינג;)ווטרס

מקורות

  1. Wang, Y., Liu, H., Sun, Z. Lamarck rises from his grave: Parental environment-induced epigenetic inheritance in model organisms and humans. Biol Rev. 92 (4), 2084-2111 (2017).
  2. Champroux, A., Cocquet, J., Henry-Berger, J., Drevet, J. R., Kocer, A. A decade of exploring the mammalian sperm epigenome: Paternal epigenetic and transgenerational inheritance. Front Cell Dev Biol. 6, 50(2018).
  3. Horsthemke, B. A critical view on transgenerational epigenetic inheritance in humans. Nat Commun. 9 (1), 2973(2018).
  4. Schagdarsurengin, U., Steger, K. Epigenetics in male reproduction: Effect of paternal diet on sperm quality and offspring health. Nat Rev Urol. 13 (10), 584-595 (2016).
  5. Skinner, R. C., Gigliotti, J. C., Ku, K. -M., Tou, J. C. A comprehensive analysis of the composition, health benefits, and safety of apple pomace. Nutr Rev. 76 (12), 896-909 (2018).
  6. King, S. E., Skinner, M. K. Epigenetic transgenerational inheritance of obesity susceptibility. Trends Endocrinol Metab. 31 (7), 478-494 (2020).
  7. Martínez Duncker Rebolledo, E., et al. Sperm DNA methylation defects in a new mouse model of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase 677C>T variant and correction with moderate dose folic acid supplementation. Mol Hum Reprod. 30 (4), gaae008(2024).
  8. Lismer, A., et al. Histone H3 lysine 4 trimethylation in sperm is transmitted to the embryo and associated with diet-induced phenotypes in the offspring. Dev Cell. 56 (5), 671-686.e6 (2021).
  9. Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodeling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
  10. Diaz-Castillo, C., Chamorro-Garcia, R., Shioda, T., Blumberg, B. Transgenerational self-reconstruction of disrupted chromatin organization after exposure to an environmental stressor in mice. Sci Rep. 9 (1), 13057(2019).
  11. Gapp, K., et al. Implication of sperm RNAs in transgenerational inheritance of the effects of early trauma in mice. Nat Neurosci. 17 (5), 667-669 (2014).
  12. Chen, Q., et al. Sperm tsRNAs contribute to intergenerational inheritance of an acquired metabolic disorder. Science. 351 (6271), 397-400 (2016).
  13. Liberman, N., et al. 18S rRNA methyltransferases DIMT1 and BUD23 drive intergenerational hormesis. Mol Cell. 83 (18), 3268-3282.e7 (2023).
  14. Tomar, A., et al. Epigenetic inheritance of diet-induced and sperm-borne mitochondrial RNAs. Nature. 630 (8017), 720-727 (2024).
  15. Pinhas-Hamiel, O., Zeitler, P. The global spread of type 2 diabetes mellitus in children and adolescents. J Pediatr. 146 (5), 693-700 (2005).
  16. Galan, C., Krykbaeva, M., Rando, O. J. Early life lessons: The lasting effects of germline epigenetic information on organismal development. Mol Metab. 38, 100924(2020).
  17. Rando, O. J., Simmons, R. A. I'm eating for two: Parental dietary effects on offspring metabolism. Cell. 161 (1), 93-105 (2015).
  18. Perez, M. F., Lehner, B. Intergenerational and transgenerational epigenetic inheritance in animals. Nat Cell Biol. 21 (2), 143-151 (2019).
  19. Carone, B. R., et al. Paternally induced transgenerational environmental reprogramming of metabolic gene expression in mammals. Cell. 143 (7), 1084-1096 (2010).
  20. Pastore, A., et al. Pre-conceptional paternal diet impacts on offspring testosterone homoeostasis via epigenetic modulation of cyp19a1/aromatase activity. NPJ Metab Health Dis. 2 (1), 8(2024).
  21. Fullston, T., et al. Paternal obesity initiates metabolic disturbances in two generations of mice with incomplete penetrance to the F2 generation and alters the transcriptional profile of testis and sperm microRNA content. FASEB J. 27 (10), 4226-4243 (2013).
  22. Lumey, L., et al. Cohort profile: The Dutch Hunger Winter Families Study. Int J Epidemiol. 36 (6), 1196-1204 (2007).
  23. Pembrey, M. E., et al. Sex-specific, male-line transgenerational responses in humans. Eur J Hum Genet. 14 (2), 159-166 (2006).
  24. Comas-Armangue, G., Makharadze, L., Gomez-Velazquez, M., Teperino, R. The legacy of parental obesity: Mechanisms of non-genetic transmission and reversibility. Biomedicines. 10 (10), 2461(2022).
  25. Shea, J. M., et al. Genetic and epigenetic variation, but not diet, shape the sperm methylome. Dev Cell. 35 (6), 750-758 (2015).
  26. Dupont, J., Bertoldo, M. J., Rak, A. Energy sensors in female and male reproduction and fertility. Int J Endocrinol. 2018, 8285793(2018).
  27. Guiton, R., Henry-Berger, J., Drevet, J. R. The immunobiology of the mammalian epididymis: The black box is now open. Basic Clin Androl. 23 (1), 8(2013).
  28. Jarvis, S., et al. High fat diet causes distinct aberrations in the testicular proteome. Int J Obes. 44 (9), 1958-1969 (2020).
  29. Liu, L. -L., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma signaling in human sperm physiology. Asian J Androl. 17 (6), 942(2015).
  30. Masaki, H., et al. Long-chain fatty acid triglyceride metabolism disorder impairs male fertility: A study using adipose triglyceride lipase deficient mice. Mol Hum Reprod. 23 (7), 452-460 (2017).
  31. Cheng, X., et al. Lipidomics profiles of human spermatozoa: Insights into capacitation and acrosome reaction using UPLC-MS-based approach. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1273878(2023).
  32. Collodel, G., Castellini, C., Lee, J. C. -Y., Signorini, C. Relevance of fatty acids to sperm maturation and quality. Oxid Med Cell Longev. 2020, 7038124(2020).
  33. Watkins, A. J., et al. Paternal diet programs offspring health through sperm- and seminal plasma-specific pathways in mice. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (40), 10064-10069 (2018).
  34. Darbandi, M., et al. Oxidative stress-induced alterations in seminal plasma antioxidants: Is there any association with keap1 gene methylation in human spermatozoa. Andrologia. 51 (1), e13159(2019).
  35. Deneke, V. E., Pauli, A. The fertilization enigma: How sperm and egg fuse. Annu Rev Cell Dev Biol. 37 (1), 391-414 (2021).
  36. Cobellis, G., et al. A gradient of 2-arachidonoylglycerol regulates mouse epididymal sperm cell start-up. Biol Reprod. 82 (2), 451-458 (2010).
  37. Kawano, N., Yoshida, K., Miyado, K., Yoshida, M. Lipid rafts: Keys to sperm maturation, fertilization, and early embryogenesis. J Lipids. 2011, 264706(2011).
  38. Rubinstein, E., Ziyyat, A., Wolf, J., Lenaour, F., Boucheix, C. The molecular players of sperm-egg fusion in mammals. Semin Cell Dev Biol. 17 (2), 254-263 (2006).
  39. Satouh, Y., Inoue, N., Ikawa, M., Okabe, M. Visualization of the moment of mouse sperm-egg fusion and dynamic localization of IZUMO1. J Cell Sci. 125 (pt 3), 498-506 (2012).
  40. Kim, J., Seo, S., Kim, T. -Y. Metabolic deuterium oxide (D2O) labeling in quantitative omics studies: A tutorial review. Anal Chim Acta. 1242, 340722(2023).
  41. Li, X., et al. Sustained high glucose intake accelerates type 1 diabetes in NOD mice. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1037822(2022).
  42. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538(2012).
  43. Katz, J. J. Chemical and biological studies with deuterium. , Sigma Xi, The Scientific Research Honor Society. (2024).
  44. Oakberg, E. F., Hughes, A. M. Deuterium oxide effect on spermatogenesis in the mouse. Exp Cell Res. 50 (2), 306-314 (1968).
  45. Sumiyoshi, M., Sakanaka, M., Kimura, Y. Chronic intake of high-fat and high-sucrose diets differentially affects glucose intolerance in mice. J Nutr. 136 (3), 582-587 (2006).
  46. Aragno, M., Mastrocola, R. Dietary sugars and endogenous formation of advanced glycation endproducts: Emerging mechanisms of disease. Nutrients. 9 (4), 385(2017).
  47. Wilkinson, D. J., Brook, M. S., Smith, K. Principles of stable isotope research-with special reference to protein metabolism. Clin Nutr Open Sci. 36, 111-125 (2021).
  48. Wilkinson, D. J., et al. A validation of the application of D2O stable isotope tracer techniques for monitoring day-to-day changes in muscle protein subfraction synthesis in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 306 (5), E571-E579 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תיוג איזוטופ יציב in vivo לזיהוי ספקטרומטריית מסה של מטבוליטים אבהיים המועברים מזרע לביצית במהלך ההפריה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.