Method Article

הקמה והשוואה של שיטות זיהוי פעילות T6SS מבוססות פלואורסצנטיות ב - Acinetobacter baumannii

DOI:

10.3791/67772

⸱

June 20th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, Center for Infectious Diseases and Pathogen Biology, The First Hospital of Jilin University, 2Department of Respiratory Medicine, Center for Infectious Diseases and Pathogen Biology, The First Hospital of Jilin University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציעים שיטת זיהוי כמותית המבוססת על תיוג פלואורסצנטי (במיוחד לוציפראז) כדי להעריך ביעילות ובדייקנות את הפעילות של חיידקי T6SS, המתאים לניתוח תפוקה גבוהה של זנים קליניים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת ההפרשה מסוג VI (T6SS) היא מנגנון מכריע המתווך אינטראקציות בין-תאיות בחיידקים גראם-שליליים, במיוחד במינים פתוגניים כגון Acinetobacter baumannii. מחקרים קודמים הראו כי הפלסמיד הגדול pAB3 בזן A. baumannii ATCC 17978 מקודד חלבון דמוי TetR המעכב את ביטוי הגנים הליבה T6SS. לעומת זאת, זן WTR -, שחסר pAB3, יכול לבטא ולהפריש ביציבות את חלבון האפקטור T6SS Hcp ומפגין את היכולת להרוג E. coli. הגן tssM , אחד מגני הליבה של T6SS, חיוני לפעילותו; מחיקתו מובילה ישירות להשבתת T6SS. עם זאת, שיטות מסורתיות לזיהוי פעילות T6SS, כגון מבחני הריגה, סובלות מתפוקה נמוכה ורגישות לא מספקת. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, פיתחנו שיטות זיהוי כמותיות המבוססות על תיוג פלואורסצנטי.

כדי לשפר את זיהוי פעילות T6SS, פיתחנו שלוש שיטות תיוג פלואורסצנטיות: (1) שיטת זיהוי כמותית המבוססת על תיוג לוציפראז, המאופיינת בספציפיות, רגישות ושחזור גבוהים, מה שהופך אותה למתאימה לניתוח תפוקה גבוהה; (2) שיטת זיהוי המבוססת על תיוג חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), שלמרות היותו רגיש להפרעות סביבתיות, מציע את היתרון של תפוקה גבוהה; (3) זיהוי ציטומטריית זרימה, שיכול להעריך כמותית את כדאיות החיידקים אך הוא מורכב ויקר מבחינה תפעולית. לאחר השוואה מקיפה, שיטת התיוג המבוססת על לוציפראז הוכיחה את עצמה כמדויקת, רגישה וידידותית למשתמש. כאשר יושמה על 20 מבודדים קליניים של A. baumannii, שיטה זו אושרה להעריך במהירות ובדייקנות את פעילות T6SS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת ההפרשה מסוג VI (T6SS) היא מערכת הפרשת חלבון חשובה בחיידקים גראם-שליליים, המעורבת באופן נרחב בתחרות חיידקים, אנטגוניזם נגד פונדקאים אוקריוטיים וויסות התגובות החיסוניות של המארח 1,2. על ידי הזרקת חלבוני אפקטור רעילים לחיידקים שכנים או לתאים אוקריוטיים, T6SS מסייע לחיידקים לשמור על יתרון תחרותי בסביבות מורכבות. בשנים האחרונות, התפקיד המשמעותי של T6SS בהסתגלות חיידקים, פתוגניות ואינטראקציות מיקרוביאליות הפך אותו למוקד מחקר, במיוחד בפתוגנים עמידים לתרופות מרובות, שם תפקידיו מספקים מטרות פוטנציאליות לפיתוח אסטרטגיות אנטיבקטריאליות חדשות 3,4,5.

Acinetobacter baumannii (Ab) הוא פתוגן אופורטוניסטי גרם שלילי המופץ באופן נרחב בבתי חולים. בשל עמידותו הגבוהה לתרופות ויכולת ההסתגלות החזקה שלו, הוא הפך לפתוגן נוסוקומיאלי חשוב ברחבי העולם 6,7,8. הישרדותו של A. baumannii בסביבות מיקרוביאליות מורכבות מסתמכת על מערכות הפרשה מרובות, ביניהן T6SS ממלא תפקיד מפתח בתחרות שלו עם חיידקים אחרים ובאינטראקציות עם המארח. עם אשכול הגנים T6SS השמור היטב והפונקציות המוגדרות היטב, A. baumannii הפך למודל אידיאלי לחקר מנגנוני T6SS. יתר על כן, המבנה הייחודי של ה-T6SS ב-A. baumannii מספק נקודת מבט ייחודית לחשיפה נוספת של המגוון והפונקציות של T6SS.

אשכול הגנים T6SS של A. baumannii מכיל 12 גנים של חלבוני ליבה (כגון tssA-tssM, חסר tssJ) ומספר גנים עם תפקודים לא ידועים (כגון tagX, tagN, tagF וכו').2,9,10. ביניהם, חלבון המוליזין (Hcp) הוא מרכיב חשוב ב- T6SS, והפרשתו נחשבת לסימן היכר של T6SS פונקציונלי. מחקרים הראו כי הפלסמיד הגדול pAB3 ב-A. baumannii מעכב את ביטוי T6SS על ידי קידוד חלבון רגולטורי דמוי TetR. לעומת זאת, זנים שאיבדו pAB3 (כגון WTR-) יכולים לבטא ולהפריש Hcp ביציבות, ולהפגין פעילות T6SS משמעותית11. הגן tssM הוא אחד מגני הליבה של T6SS, ומחיקתו מובילה ישירות להשבתת T6SS.

עם זאת, לשיטות מסורתיות לזיהוי פעילות T6SS (כגון מבחני הריגה) יש מגבלות כגון תפוקה נמוכה, שחזור לקוי ורגישות לא מספקת, המגבילות מאוד את המחקר המעמיק והיישום הנרחב של T6SS5. לכן, פיתוח שיטות יעילות ומדויקות לזיהוי פעילות T6SS הפך לצורך דחוף במחקר הנוכחי. מחקר זה נועד לבסס ולהשוות שיטות זיהוי פעילות T6SS המבוססות על תיוג פלואורסצנטי כדי להתגבר על החסרונות של שיטות מסורתיות. באמצעות טכנולוגיית תיוג פלואורסצנטי, השגנו ניטור כמותי בזמן אמת של פעילות T6SS, ומספקים כלי מדויק ואמין יותר לחקר אינטראקציות חיידקיות. מחקר זה אימת את יעילותן של שיטות תיוג פלואורסצנטיות, ועל ידי השוואת היתרונות והחסרונות של אסטרטגיות שונות לתיוג פלואורסצנטי, סיפק נקודות מבט חדשות ותמיכה מתודולוגית למחקר עתידי. הוא לא רק מציע אמצעים טכניים חדשים למחקר T6SS אלא גם מניח בסיס מדעי להבנת המנגנונים המורכבים של אינטראקציות חיידקיות ולפיתוח אסטרטגיות טיפוליות אנטיבקטריאליות חדשות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מקורות של זנים ופלסמידים

  1. השתמש בזן הסטנדרטי A. baumannii ATCC 17978, E. coli (pZY01), והזן הקליני של A. baumannii שבודד מהמחלקה לרפואת מעבדה בבית החולים הראשון של אוניברסיטת ג'ילין.
  2. השתמש בפלסמיד pZY01-GFP (הנושא גן עמידות לקנאמיצין, המסוגל לביטוי יציב ב- A. baumannii), ששונה ונשמר במעבדה, ובפלסמיד pGEN-luxCDABE שנרכש מסחרית (הנושא גן עמידות לאמפיצילין).
  3. תרבית A. baumannii ו- E. coli במדיום Luria-Bertani (LB) או מדיום מינימלי המכיל: 50 מ"מ חוצץ אשלגן פוספט (pH 7.4), 15 מ"מ (NH4)2SO4, 2 מ"מ MgSO4, 0.2% (w/v) נתרן סוקסינט כמקור הפחמן היחיד, ו-0.01% (w/v) תמצית שמרים12. הוסף אנטיביוטיקה בריכוזים הבאים בעת הצורך: E. coli: אמפיצילין (100 מיקרוגרם/מ"ל) וקנאמיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל); A. baumannii: סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל).
    הערה: E. coli (pZY01) ו - E. coli (pZY01-GFP) מבטאים עמידות לקנאמיצין. ל-E. coli (pZY01) אין סמן פלואורסצנטי ולכן ניתן להתייחס אליו כ-E. coli בטקסט הבא.

2. הכנת זני חיידקים לפני הניסוי

  1. אחזר את זני החיידקים מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס יומיים לפני הניסוי. חסנו את זני החיידקים על צלחות אגר LB המכילות את האנטיביוטיקה המתאימה. דוגרים את הצלחות למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: ודא שכל התאים שומרים על הפלסמידים בתחילת הניסוי.
  2. בחר שתי מושבות בודדות עצמאיות של כל זן חיידקים יום אחד לפני הניסוי. יש לחסן כל מושבה בנפרד לשתי שפופרות נפרדות המכילות 5 מ"ל של מדיום נוזלי LB. דגרו על התרביות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד. השתמש בתרביות אלה לניסויים הבאים.
    הערה: בצע אופטימיזציה של זמן הדגירה על סמך קצב גידול החיידקים כדי להבטיח קבלת כמות מספקת של ביומסה חיידקית.

3. הכנת זני E. coli (GFP) / E. coli (Luciferase)

  1. שינוי
    1. הוסף 50 ננוגרם של DNA פלסמיד (pZY01-GFP או pGEN-luxCDABE, מכומת באמצעות NanoDrop ב-A260/A280) ל-100 מיקרוליטר של תאים מוכשרים E. coli DH5α, בהתאמה, וערבב בעדינות.
    2. דגירה על קרח למשך 30 דקות, הלם חום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, והנח מיד על קרח למשך 30 שניות.
    3. מוסיפים 700 מיקרוליטר מרק LB ללא אנטיביוטיקה ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-180 סל"ד למשך שעתיים.
  2. ציפוי ותרבות
    1. צנטריפוגה במינון של 420 × גרם למשך 2 דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-100 מיקרוליטר של מרק LB ללא אנטיביוטיקה.
    2. מורחים את מוצר הטרנספורמציה pZY01 (GFP) על לוחות אגר LB המכילים 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין.
    3. מורחים את מוצר הטרנספורמציה pGEN-luxCDABE על לוחות אגר LB המכילים 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. אימות שיבוטים חיוביים
    1. בחר מושבות בודדות וחלץ DNA כתבניות תגובת שרשרת פולימראז (PCR) למחרת. בצע הגברת PCR ואמת על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
    2. אשרו זנים חיוביים וסמנו אותם כ-E. coli (GFP) ו-E. coli (לוציפראז).
      הערה: ודא שאיכות התאים המוסמכים גבוהה לטרנספורמציה יעילה. הימנע מנוזל חיידקים מוגזם במהלך הציפוי כדי למנוע הפרעה לבידוד מושבה בודדת.

4. כתמים מערביים

  1. הכנת מדגם
    1. אסוף תרביות חיידקים וצנטריפוגות (1500 × גרם, 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס) כדי להפריד בין כדור התא לסופרנטנט.
    2. הוסף כמות מתאימה של מאגר העמסה הן לכדור התא והן לסופרנטנט. מרתיחים בחום של 100 מעלות צלזיוס באמבט מתכת למשך 10 דקות. צנטריפוגה (1500 גרם, 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס) ואוספים את הסופרנטנטים כדגימות חלבון.
    3. מדוד את ריכוז החלבון בשיטת חומצה ביסינצ'ונינית (BCA) או ברדפורד והתאם לאותו ריכוז.
  2. אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE)
    1. הכן ג'ל SDS-PAGE בריכוזים מתאימים (למשל, 12% ג'ל מפריד, 5% ג'ל ערימה)13.
    2. טען 20 מיקרוגרם דגימות חלבון לבארות הג'ל יחד עם סמן חלבון צבוע מראש של 1-2 מיקרוליטר. בצע אלקטרופורזה ב-100-120 וולט עד שהמחוון הכחול של הברומופנול יגיע לתחתית הג'ל.
      הערה: מאגר ריצה: Tris 25 מ"מ, גליצין 192 מ"מ, SDS 0.1% (w/v), מים מזוקקים עד 1 ליטר.
  3. העברה (Western Blotting)
    1. הסר את הג'ל מצלחות הזכוכית והשרו אותו במאגר העברה. הכן קרום פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) או ניטרו תאית (NC), הפעל את קרום ה-PVDF עם מתנול ולאחר מכן השרו אותו במאגר העברה.
      הערה: מאגר העברה: 25 מ"מ טריס, 192 מ"מ גליצין, 20% מתנול
    2. הרכיבו את מנגנון ההעברה במבנה "כריך" (נייר פילטר-ג'ל-קרום-פילטר). העברה ב -100 וולט למשך 60-90 דקות (התאם את הזמן על סמך משקל מולקולרי של חלבון; לחלבוני תא מארח (HCP) יש משקל מולקולרי של כ-17 kDa).
      הערה: הנח את מיכל ההעברה במי קרח והוסף חבילות קרח כדי לשמור על טמפרטורה נמוכה. אם זמן ההעברה ארוך, החלף את שקיות הקרח באמצע הדרך.
  4. חסימת
    1. לאחר ההעברה, הניחו את הממברנה בתמיסה חוסמת חלב דל שומן של 5%. יש לחסום בטמפרטורת החדר (RT) על שייקר למשך שעה אחת או למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  5. דגירה ראשונית של נוגדנים
    1. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם תמיסת מלח Tris-buffered (TBS) המכילה 0.1% מאגר Tween 20 (TBST), 5 דקות בכל פעם. לדגור את הממברנה עם נוגדנים ראשוניים מדוללים (נוגדן נגד HCP של עכבר, דילול של 1:1000; נוגדן נגד איזוציטראט דהידרוגנאז (ICDH) של עכבר, דילול של 1:1000) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או RT למשך שעתיים.
  6. דגירה משנית של נוגדנים
    1. שוטפים את הממברנה עם מאגר TBST 3 פעמים, 5 דקות כל אחת. לדגור את הממברנה עם נוגדן משני מדולל (IgG מצומד נגד עכבר חזרת פרוקסידאז [HRP], דילול 1:3000) ב-RT למשך שעתיים.
  7. זיהוי
    1. שוטפים את הממברנה עם מאגר TBST 3 פעמים, 5 דקות כל אחת. הכן מצע כימילומינסנט ECL והחל אותו באופן שווה על הממברנה.
    2. זיהוי אותות באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנציה וצילום תמונות (לחלבון HCP יש משקל מולקולרי של כ-17 kDa, ICDH הוא אנזים מטבולי ציטופלזמי עם משקל מולקולרי צפוי של כ-45 kDa ב-A. baumannii).
      הערה: ICDH הוא סמן בקרת איכות חשוב שניתן לזהות רק בשבר כדור התא (המכיל חיידקים שלמים) ולא בשבר הסופרנטנט (המכיל חלבונים מופרשים), ובכך מדגים כי לא התרחשה ליזה של תאים במהלך הכנת הדגימה. הפרשת Hcp (17 kDa) אמורה להיות גלויה רק בסופרנטנטים מזנים פעילים T6SS.

5. הכנת צלחות 96 באר עם מדיום אגר LB

  1. הוסף במהירות מדיום אגר LB ללא אנטיביוטיקה חיטוי, מחומם מראש, לצלחת סטרילית של 96 בארות, 50 מיקרוליטר לבאר. הניחו לצלחת לשבת ב-RT למשך שעה אחת לפחות כדי להבטיח התמצקות מלאה של המדיום.
  2. השתמש בצלחות בעלות קירות שחורים עם תחתית שקופה לזיהוי פלואורסצנטיות GFP.
  3. השתמש בלוחות 96 בארות חסיני אור לזיהוי פלואורסצנטי לוציפראז כדי למנוע הפרעות פלואורסצנטיות צולבות.
    הערה: הימנע מיצירת בועות בעת הוספת המדיום כדי להבטיח עובי ג'ל אחיד, המקדם מגע וצמיחה אופטימליים של חיידקים.

6. מבחן הריגה של A. baumannii

  1. בדיקת הריגה סטנדרטית
    1. תרבית WTR- ו-Δ tssM זנים מוטנטיים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול במדיום LB בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, מגדלים E. coli בנפרד במדיום LB המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין בתנאים זהים.
    2. שטפו את תרביות החיידקים פעמיים עם PBS סטרילי והשעו אותן במדיום LB טרי ללא אנטיביוטיקה. התאם את OD600 ל-1.0 לסטנדרטיזציה.
    3. מערבבים זנים מוטנטיים WTR- ו-Δ tssM עם E. coli ביחס של 1:1.
    4. הבחין ב-10 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים המעורב על צלחות אגר LB נטולות אנטיביוטיקה ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות.
    5. מגרדים את כתמי החיידקים ומשעים אותם מחדש ב -1 מ"ל של PBS. בצע חמישה דילולים טוריים פי 10.
    6. הבחין ב-10 מיקרוליטר של תרחיפי החיידקים המדוללים על לוחות LB המכילים קנמיצין ודגר למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
    7. לנתח את הפעילות האנטיבקטריאלית התלויה ב-T6SS של זנים מוטנטיים WTR- ו-Δ tssM על ידי ספירת מושבות.
      הערה: הקפידו על ערבוב יסודי של תרחיפי חיידקים כדי למנוע שגיאות ניסוי. בצע לפחות שלושה שכפולים עצמאיים עבור כל דגימה כדי להבטיח מהימנות נתונים.
  2. זיהוי כמותי של פעילות T6SS באמצעות תיוג לוציפראז
    1. תקנן את ה-OD600 של מוטציות E. coli (Luciferase), WTR-, ΔtssM וזנים אחרים (למשל, ATCC 17978, E. coli, Ab#40, Ab#170, Ab#180) ל-1.0. הוסף 5 מיקרוליטר של תרחיף חיידקים לצלחת של 96 בארות המכילה אגר LB ללא אנטיביוטיקה. לאחר ייבוש באוויר בחושך, מדוד ביולומינסנציה מבוססת לוציפראז כדי לאמת את ספציפיות הזוהר של E. coli (לוציפראז).
    2. בצע דילול סדרתי פי 5 של E. coli (לוציפראז). הבחין ב-10 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים המדולל על צלחת של 96 בארות עם אגר LB וצלחת ריקה של 96 בארות (שתיהן חסינות לאור). מדוד ביולומינסנציה מבוססת לוציפראז כדי להעריך את הרגישות של שיטת הזיהוי המבוססת על לוציפראז ולאשר אם אגר LB מפריע לאות הזוהר.
    3. ערבבו E. coli (לוציפראז) עם מוטציות WTR-, ΔtssM ו-20 זנים קליניים (OD600 מתוקנן ל-1.0) ביחס של 1:1. לדלל פי 10, להוסיף 5 מיקרוליטר לצלחת של 96 בארות ולהגדיר שלושה שכפולים טכניים.
    4. לאחר ייבוש אוויר בחושך, מדוד ביולומינסנציה. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 4-6 שעות, ואז מדוד שוב ביולומינסנציה (אורך גל פליטה: 562 ננומטר).
    5. להעריך כמותית את הפעילות האנטיבקטריאלית התלויה ב-T6SS על ידי השוואת ערכי ביולומינסנציה לפני ואחרי תרבית משותפת.
      הערה: הקפידו על ערבוב יסודי של תרחיפי חיידקים כדי למנוע שגיאות ניסוי. בצע לפחות שלושה שכפולים עצמאיים עבור כל דגימה כדי להבטיח מהימנות נתונים. השתמש במבחן t של סטודנט לניתוח סטטיסטי.
  3. זיהוי פעילות T6SS באמצעות תיוג GFP
    1. בצע את אותו הליך כמו ניסוי תיוג לוציפראז (אורך גל עירור: 480 ננומטר, אורך גל פליטה: 509 ננומטר).
    2. מערבבים E. coli (GFP) עם מוטציות WTR- ו-Δ tssM (OD600 מתוקנן ל-1.0) ביחס של 1:1. יש להניח 10 מיקרוליטר על צלחות אגר LB ללא אנטיביוטיקה. לאחר ייבוש אוויר ב-RT, צלם תמונות באמצעות ערוץ הקרינה GFP (תוכנית Alex488, עירור: 488 ננומטר, פליטה: 509 ננומטר) של מערכת הדמיה רב תכליתית.
    3. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 4-6 שעות, ולאחר מכן צלם שוב תמונות. להעריך את פעילות T6SS על סמך שינויים בעוצמת הקרינה של כתמי חיידקים.
      הערה: בצע את כל השלבים בחושך כדי למנוע הפרעה לאותות הקרינה. הקפידו על ערבוב יסודי של תרחיפי חיידקים כדי למנוע טעויות ניסיוניות. בצע לפחות שלושה שכפולים עצמאיים עבור כל דגימה כדי להבטיח מהימנות נתונים.
  4. זיהוי ציטומטריית זרימה
    1. מערבבים WTR- עם מוטציות E. coli (GFP) ו-ΔtssM עם E. coli (GFP) ביחס של 1:1. קח כמות מתאימה של תרחיף החיידקים המעורב ודלל אותו לריכוז מתאים (בדרך כלל OD600 של 0.1-0.5) באמצעות PBS סטרילי או 1× מאגר.
      הערה: 1× מאגר מתייחס למאגר צביעת ציטומטריה זרימה (1×), המרכיבים כוללים: 1× PBS (137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na2HPO4, 1.8 מ"מ KH2PO4, pH 7.4), בתוספת: 2-5% (v/v) FBS מומת חום (או 1% BSA כחלופה), 2 מ"מ EDTA.
    2. צנטריפוגה את תרחיף החיידקים המעורב המדולל ב-300 x גרם למשך 2 דקות והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל PBS סטרילי או 1× מאגר וערבבו בעדינות. סנן את התמיסה המרחפת דרך מסננת תאים של 35 מיקרומטר כדי להסיר אגרגטים ולהבטיח השעיה של תא יחיד.
    3. הפעל את ציטומטר הזרימה, חמם את הלייזר וכייל את המכשיר.
      1. הגדר את פרמטרי הזיהוי: השתמש בלייזר 488 ננומטר כדי לרגש GFP. ערוץ זיהוי: FL1 (בדרך כלל מסנן 530/30 ננומטר לזיהוי פלואורסצנטי GFP). הגדר פרמטרים של פיזור קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC) כדי להבחין בין תאי חיידקים.
      2. השתמש ב- E. coli ללא תווית כבקרה שלילית, התאם את המתח וההגבר, וודא שהאוכלוסייה השלילית של GFP נמצאת בקו הבסיס של אות הקרינה.
    4. מערבבים בעדינות את הדגימה המסוננת ומעבירים 100 מיקרוליטר לצינור ציטומטריית זרימה.
      1. נתח את הדגימות באמצעות הגדרות המכשיר הבאות: הגדר את סף FSC-H ל-19,000 כדי לא לכלול פסולת, עם ערכי רווח של 100 (FSC), 110 (SSC) ו-80 (FITC).
      2. עבור שער, בתחילה אל תכלול פסולת ואותות שאינם מטרה בעלילת הפיזור FSC-A לעומת SSC-A, ולאחר מכן ניתוח אוכלוסייה בערוץ FITC. רכוש מינימום של 10,000 אירועים מאוכלוסיית היעד (המוגדרים על ידי מאפייני FSC/SSC) עבור כל מדגם.
    5. לנתח את הנתונים באמצעות תוכנת זרימה ציטומטרית (למשל, FlowJo, BD FACSDiva).
      1. תרשים תרשים פיזור FSC לעומת SSC כדי לשער את אוכלוסיית חיידקי היעד. שרטט היסטוגרמות פלואורסצנטיות FL1 כדי להבחין בין אוכלוסיות חיוביות ל-GFP ושליליות ל-GFP.
      2. חשב את אחוז התאים החיוביים ל-GFP ואת עוצמת הקרינה הממוצעת (MFI).
    6. צנטריפוגה את תרחיף החיידקים המעורב שנותר ב -300 גרם למשך 2 דקות והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיקרוליטר של מים סטריליים ואתרו אותה על צלחות אגר LB ללא אנטיביוטיקה.
    7. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 5 שעות, ואז גרדו את כתמי החיידקים והשעו אותם מחדש ב-500 מיקרוליטר של 1× PBS. קח 100 מיקרוליטר מהתמיסה המושעית, דלל כראוי ובצע זיהוי ציטומטריית זרימה, חזור על שלבים 6.4.4-6.4.5.
    8. השווה את אחוז התאים החיוביים ל-GFP ועוצמת הקרינה לפני ואחרי תרבית משותפת. העריכו את השפעת ההרג של מוטציות WTR- ו-Δ tssM על E. coli (GFP).
      הערה: ודא מתלה של תא יחיד כדי למנוע צבירת תאים המשפיעה על תוצאות הזיהוי. כייל את המכשיר לפני הזיהוי כדי להבטיח את הדיוק והשחזור של אותות הקרינה. הימנע מחשיפת דגימות לאור חזק במהלך הניסוי כדי למנוע כיבוי פלואורסצנטי של GFP. בצע לפחות שלושה שכפולים עבור כל דגימה כדי להבטיח מהימנות נתונים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות מסורתיות לזיהוי פעילות T6SS כוללות בדרך כלל תרבית משותפת של זני טורף ומטרה על לוחות אגר LB ללא אנטיביוטיקה למשך 5 שעות, ולאחר מכן גירוד כתמי החיידקים, השעייתם מחדש וביצוע דילולים סדרתיים. לאחר מכן מבחינים בתרחיף החיידקים המדולל על צלחות אגר סלקטיביות. על ידי ספירת המושבות של זן המטרה על הלוחות למחרת, ניתן להעריך באופן איכותי את פעילות T6SS. עם זאת, לשיטה זו יש מגבלות, כולל נהלים מסורבלים, הסתמכות על ספירת מושבות ידנית וקושי בניתוח כמותני. כדי לטפל בחסרונות אלה, מחקר זה מציג באופן חדשני שיטת זיהוי כמותית מבוססת פלוא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת ההפרשה מסוג VI (T6SS) היא מנגנון רב-חלבוני מורכב שתפקידיו מתממשים בעיקר באמצעות הפרשת חלבוני אפקטור. חלבונים אפקטורים אלה מתווכים תחרות בין-בקטריאלית על ידי הריגה או עיכוב של מיני חיידקים אחרים, ובכך מספקים לחיידק המארח יתרון תחרותי בקהילות מיקרוביאליות15. מעבר לתפקידו בתחרות, מחקרים הראו כי T6SS מעורב בתהליכים תאיים שונים, כולל התיישבות חיידקים, הסתגלות סביבתית, היווצרות ביופילם, שינוי הידבקות והתחמקות חיסונית. יש לציין כי הוויסות של...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לכל המחברים כמו גם למעבדה כולה על עזרתם בתמיכה טכנית ובסקירת כתבי היד. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט Bethune של אוניברסיטת ג'ילין 2024B20 ופרויקט פיתוח המדע והטכנולוגיה של העיר צ'אנגצ'ון 23YQ10 ומחלות כרוניות לא מדבקות - פרויקט לאומי למדע וטכנולוגיה 2024ZD0529700.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ערכת הכנת ג'ל 10%, 15% SDS-PAGEEpizymePG112-20
& deg; מקפיא CHaier HYCD-290
37 ° C IncubatorBluepard181254254
4 ° מקרר CHaier HYC390-80
° מקפיא CHaierDW-86L726G (726L)
צלחת 96 בארותJETTCP010096
AgarBiofrox8211KG001
אמוניום פרסולפט (APS)Thermo7727-54-0
ארון בטיחות ביולוגיESCOAC2-4S1 
איזון אלקטרוניSartorius AGBSA124S-CW
מכשיר אלקטרופורזהBIO-RADPOWER
מכונת קרח פתיתיםGRANTXB70
ציטומטר זרימהBECKMAN COULTERAW38143
זרימה ציטומטריה מכתים מאגרחלבוןPF00018
מערכת הדמיית ג'לBIO-RADג'ל Doc 2000
גליציןZikeZK-L2577
צנטריפוגה במהירות גבוההEppendorf5405IN106358
HRP מצומד ארנב/עכבר נוגדן משניפרוטאינטקSA00001-2
LB מרקSolarbioL8291
צנטריפוגה במהירות גבוהה בטמפרטורה נמוכהתרמו17R
מתנולתרמוR40121
מיקרו UV-Vis ספקטרופוטומטרתרמוננוטיפ אחד
מיקרוצנטריפוגהallshengמיני-6k
קורא מיקרופלייטביו-טקH1M
NuPAGE LDS מאגר מדגםתרמוNP0007
תמיסת מאגר פוספט (PBS)ZikeZK-L1649
דיוק פלוס חלבון כפול צבע תקניBio-Rad1610374
SDS מאגר טעינת מדגםBeyotimepoo15L
אבקת חלב רזהתרמוLP0033B
נתרן דודציל סולפט (SDS)Zikezk6885
אמבט מים תרמוסטטיJingHongDK-420S
מכשיר העברהBio-RadPowerPac HC
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)ZikeZK-L2557
מנגנון אלקטרופורזה אנכיתBio-RadMii-PROTEAN Tetra
PAC1000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapitein, N., Mogk, A. Type VI secretion system helps find a niche. Cell Host Microbe. 16 (1), 5-6 (2014).
  2. Carruthers, M. D., Nicholson, P. A., Tracy, E. N., Munson, R. S. Jr Acinetobacter baumannii utilizes a type VI secretion system for bacterial competition. PLoS One. 8 (3), e59388(2013).
  3. Kandolo, O., et al. Acinetobacter type VI secretion system comprises a non-canonical membrane complex. PLoS Pathog. 19 (9), e1011687(2023).
  4. Boyer, F., Fichant, G., Berthod, J., Vandenbrouck, Y., Attree, I. Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome-wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources. BMC Genomics. 10, 104(2009).
  5. Russell, A. B., Peterson, S. B., Mougous, J. D. Type VI secretion system effectors: poisons with a purpose. Nat Rev Microbiol. 12 (2), 137-148 (2014).
  6. Pogue, J. M., Kaye, K. S., Cohen, D. A., Marchaim, D. Appropriate antimicrobial therapy in the era of multidrug-resistant human pathogens. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 302-312 (2015).
  7. McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiol Rev. 37 (2), 130-155 (2013).
  8. Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clin Microbiol Rev. 30 (1), 409-447 (2017).
  9. de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol Syst Biol. 4, 174(2008).
  10. Weber, B. S., et al. Genetic dissection of the type VI secretion system in Acinetobacter and identification of a novel peptidoglycan hydrolase, TagX, required for its biogenesis. mBio. 7 (5), e01253-e01316 (2016).
  11. Scherzinger, E., et al. Replication of the broad host range plasmid RSF1010: requirement for three plasmid-encoded proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (3), 654-658 (1984).
  12. Weber, B. S., Ly, P. M., Irwin, J. N., Pukatzki, S., Feldman, M. F. A multidrug resistance plasmid contains the molecular switch for type VI secretion in Acinetobacter baumannii. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9442-9447 (2015).
  13. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 10 (unit 10.2A), (2012).
  14. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  15. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends Microbiol. 24 (1), 51-62 (2016).
  16. Hood, R. D., et al. A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
  17. Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and regulation of the type VI secretion system. Annu Rev Microbiol. 66, 453-472 (2012).
  18. Smith, M. G., et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes Dev. 21 (5), 601-614 (2007).
  19. Repizo, G. D., et al. Differential role of the T6SS in Acinetobacter baumannii virulence. PLoS One. 10 (9), e0138265(2015).
  20. Lin, J., et al. A Pseudomonas T6SS effector recruits PQS-containing outer membrane vesicles for iron acquisition. Nat Commun. 8, 14888(2017).
  21. Bernard, C. S., Brunet, Y. R., Gueguen, E., Cascales, E. Nooks and crannies in type VI secretion regulation. J Bacteriol. 192 (15), 3850-3860 (2010).
  22. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
  23. Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
  24. Meighen, E. A. Bacterial bioluminescence: organization, regulation, and application of the lux genes. Faseb J. 7 (11), 1016-1022 (1993).
  25. Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS One. 5 (8), e12441(2010).
  26. Pletzer, D., et al. The Pseudomonas aeruginosa PA14 ABC transporter NppA1A2BCD is required for uptake of peptidyl nucleoside antibiotics. J Bacteriol. 197 (13), 2217-2228 (2015).
  27. Szittner, R., Meighen, E. Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium. J Biol Chem. 265 (27), 16581-16587 (1990).
  28. Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Sci Rep. 6, 37246(2016).
  29. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Type VI SecretionT6SS ActivityAcinetobacter BaumanniiFluorescence DetectionLuciferase LabelingGFP LabelingFlow CytometryBacterial Killing AssayHcp SecretionTssM Gene
Video Coming Soon

Related Articles