מאמר שיטה

מערכת מיקרופיזיולוגית לבבית לחקר התפשטות Ca2+ באמצעות גירוי אופטי לא גנטי

DOI:

10.3791/67823

⸱

21 במרץ 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology and Biosciences, University of Milano-Bicocca, 2Center for Nano Science and Technology, Istituto Italiano di Tecnologia, 3Disease Biophysics Group, John A. Paulson School of Engineering and Applied Science, Harvard University, 4Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering “Giulio Natta”, Politecnico di Milano, 5Department of Physics, Politecnico di Milano, 6Department of Physics and Astronomy, University of Bologna

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש באור לשליטה בתאי הלב והרקמות מאפשר גירוי ללא מגע, ובכך שומר על המצב והתפקוד הטבעיים של התאים, מה שהופך אותו לגישה בעלת ערך הן למחקר בסיסי והן ליישומים טיפוליים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים מיקרופיזיולוגיים של הלב במבחנה אמינים ביותר למחקר מדעי, פיתוח תרופות ויישומים רפואיים. למרות שמערכות אלה מקובלות על ידי הקהילה המדעית, הן עדיין מוגבלות באורך החיים בשל היעדר טכניקות גירוי לא פולשניות. מתמרי פוטו מספקים שיטת גירוי יעילה, המציעה גישה אלחוטית עם רזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה תוך מזעור פולשניות בתהליכי גירוי. בכתב יד זה, אנו מציגים שיטה אופטית מלאה לגירוי וזיהוי הפעילות של מודל מיקרופיזיולוגי לבבי במבחנה. באופן ספציפי, ייצרנו רקמות אנזוטרופיות למינריות מהונדסות על ידי זריעת קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים (hiPSC-CMs) המושרים על ידי בני אדם שנוצרו בתרבית תרחיף ביו-ריאקטור תלת מימדית. השתמשנו במתמר פוטו, נגזרת אזובנזן אמפיפילית, בשם Ziapin2, לגירוי וצבע Ca2+ (X-Rhod 1) לניטור תגובת המערכת. התוצאות מדגימות כי Ziapin2 יכול לבצע פוטומודולציה של תגובות Ca2+ במערכת המופעלת מבלי לפגוע בשלמות הרקמה, בכדאיות או בהתנהגות. יתר על כן, הראינו שגישת הגירוי מבוסס האור מציעה רזולוציה דומה בהשוואה לגירוי חשמלי, תקן הזהב הנוכחי. בסך הכל, פרוטוקול זה פותח נקודות מבט מבטיחות ליישום Ziapin2 וגירוי פוטו-סטימולציה מבוסס חומרים במחקר הלב.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש באור לגירוי תאים ורקמות חיים מסתמן כמשנה משחק משמעותי במחקר הביו-רפואי, ומציע יכולות גירוי ללא מגע ברזולוציה זמנית ומרחבית מדויקת 1,2,3,4,5,6. אחת הטכניקות המובילות המשמשות להפיכת תאים לרגישים לאור היא אופטוגנטיקה, הכוללת שינוי גנטי של תאים כדי לבטא תעלות יונים או משאבות רגישות לאור 7,8. גישה זו הוכיחה יעילות מרשימה בוויסות תאים בתוך רקמה חיה; עם זאת, הסתמכותו על העברת גנים ויראלית עיכבה את אימוצו הנרחב במחקר וביישומים קליניים.

כדי להתגבר על מגבלה זו, חומרים אורגניים ואנאורגניים שימשו כמתמרים רגישים לאור לפיתוח טכניקות גירוי לא גנטיות מבוססות חומר 9,10. מתמרי פוטו ננו-מובנים אורגניים 11,12,13,14,15 הוכיחו לאחרונה הצלחה יוצאת דופן בהפעלת תגובות תאיות ביישומים מגוונים, כולל נוירונים, קרדיומיוציטים ותאי שריר שלד.

כאן, אנו מציעים Ziapin2 16,17,18, נגזרת של אזובנזן, לחקירת התפשטות Ca2+ ברקמות לב למינריות מהונדסות. המבנה האמפיפילי של המולקולה מאפשר מיקוד מדויק של קרום הפלזמה של התא, בעוד שליבת האזובנזן מאפשרת איזומריזציה המושרה על ידי אור, מה שמוביל לשינוי הקונפורמציה שלה 16,17,18. בתאי לב, איזומריזציה זו של טרנס-ציס משנה את עובי קרום הפלזמה, וגורמת למפל של השפעות המייצר פוטנציאל פעולה, אשר בתורו מפעיל את תהליך העירור-התכווצות 19,20,21.

בנוסף, אנו מתארים את תהליך הייצור של פלטפורמה מהונדסת לגידול אנזוטרופי של רקמת לב22 ומפרטים את מערך הניסוי המשמש להפעלה אופטית ולניטור פעילותה, עם דגש מיוחד על רכישת דינמיקת Ca2+ בתוך הרקמה23,24. לבסוף, אנו משווים את האותות הנרכשים לאלה המתקבלים באמצעות גירוי חשמלי, הנחשב לתקן הייחוס. בסך הכל, פרוטוקול זה מדגיש את היישום של מתמר חדש המגיב לאור בקידום ההבנה שלנו לגבי התנהגות תאית לבבית, במיוחד בהקשר של רקמות מהונדסות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרבית תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים (hiPSC) המשמשת היא קו iPSC זכרי אנושי מסוג פרא המכיל מערכת CRISPR/Cas9 המושרה על ידי דוקסיציקלין (Dox), שנוצרה על ידי החדרת CAGrtTA::TetO-Cas9 ללוקוס AAVS1 (Addgene: #73500). המחקר נערך בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של בית החולים לילדים בבוסטון. הסכמה מדעת התקבלה מהמטופלים לפני השתתפותם במחקר. יצירת קרדיומיוציטים שמקורם ב-hiPSC (hiPSC-CMs) הושרה כמתואר קודם לכן25,26. הפרוטוקול יסוכם בקצרה בסעיף הבא:

1. יצירה והכנה של קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע אנושיים

  1. שטפו את ה-hiPSCs שגודלו בצלוחיות T75 פעם אחת עם PBS. נתק את התאים על ידי דגירה עם חומר הכלאט Versene למשך 10-15 דקות וזרע לתוך כלי ביו-ריאקטור שטופלו מראש בתמיסה של 1% של חומר פעילי שטח לא יוני בצפיפות של 50 מיליון IPSCs לכלי ב-100 מ"ל של מדיום E8 בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרומטר Y-27632.
  2. הגדר את הפרמטרים הבאים של ביו-ריאקטור: תסיסה 60 סל"ד, טמפרטורה 37 מעלות צלזיוס, pH 7 וכיסוי גזים (O2 ו-CO2) ב-3 ליטר לשעה סטנדרטיים.
  3. לאחר יום אחד בתרבית, יש לוודא שקוטר הגוף העוברי (EB) הגיע ל-100-300 מיקרומטר ולטפל בתאים במדיום RPMI בסיסי (מדיום RPMI 1640 בתוספת B27 מינוס אינסולין), המכיל 7 מיקרומטר CHIR99021 למשך 24 שעות, ולאחר מכן שינוי המדיה ל-RPMI למשך 24 שעות נוספות. הוסף מדיום RPMI בסיסי המכיל 5 מיקרומטר IWR-1-endo למשך 48 שעות נוספות כדי להתחיל את תהליך ההתמיינות לכיוון שושלת הלב. לאחר 48 שעות, שנה את המדיום בחזרה ל-RPMI בסיסי.
  4. ביום השביעי של ההתמיינות, תרבית תאים במדיום RPMI בסיסי הוסיפה אינסולין אנושי ביחס של 1:1,000 (v/v). רענן את המדיה כל יומיים או כל יום עם שינוי בינוני של 50% אם צריכת החמצן מגיעה ליותר מ-30%.
  5. ביום ה-15, יש לפרק אנזימטית את תאי הביוריאקטור למשך 3 שעות באמצעות תמיסת קולגנאז II המכילה HBSS, קולגנאז II (200 יחידות/מ"ל), HEPES (10 מ"מ), מעכב ROCK Y-27632 (10 מיקרומטר) ו-N-benzyl-p-toluenesulfonamide (BTS, 30 מיקרומטר). לשם כך, יש לשטוף תחילה את ה-hiPSC-CM EBs המובחן פי 2 עם HBSS מחומם מראש ולדגור אותם בתמיסת קולגנאז II (נפח 200 מיקרוליטר של EBs / 12 מ"ל תמיסת קולגנאז II) ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 עד שתאים בודדים מופיעים מדיסוציאציה מלאה של EB.
  6. עצור את תגובת הדיסוציאציה על ידי הוספת נפח שווה של מאגר חוסם (RPMI-1640 ללא B27 ו-DNase II, עם 6 מיקרוליטר של DNase II לכל מ"ל של RPMI-1640) למתלה התא היחיד. ספרו את ה-hiPSC-CMs המובחנים, הצנטריפוגה (200 × גרם, 5 דקות), והתכוננו ליישומים במורד הזרם על ידי הקפאת התאים ב-80 מעלות צלזיוס באיזופרופנול למשך 24 שעות והעברתם למיכלי חנקן נוזלי עד לביצוע הזריעה.

2. ייצור רקמות למינריות מהונדסות

  1. הדביקו שתי שכבות של סרט מעבדה, אחת לבנה ואחת כחולה, ליריעת אקריליק שקופה בעובי 1 מ"מ, עמידה בפני שריטות ו-UV. בעזרת חרט לייזר CO2, חותכים את יריעת האקריליק בעיגולים (קוטר 20 מ"מ כדי להתאים ל-12 מגה-וואט) ואת תבנית השבב (ריבועים של 3 x 7.5 מ"מ, שלושה לכל שבב) על הסרט כפי שתוכנן בתוכנת גרפיקה וקטורית (למשל, CorelDraw); פרמטרי חיתוך אקריליים: 100 הספק, 20 מהירות ו-1,000 PPI; פרמטרים לחיתוך קלטת: 8 הספק, 6 מהירויות ו-1,000 PPI. הסר את שתי שכבות הסרט בתוך הקו הפנימי ביותר בעזרת פינצטה, השרו את הצ'יפס באקונומיקה טהורה למשך 30 דקות עד שעה כדי להסיר קווים עבים וכתמים כהים מהחיתוך, והשאיר קו חד, ושטוף את הצ'יפס בכוס במים זורמים נטולי יונים (DI) למשך הלילה או למשך 3 שעות לפחות.
    הערה: אין להלבין יותר משעתיים, מכיוון שהדבר יחרוט את הדבקים על הדפנות, וימנע מהג'לטין להידבק כראוי.
  2. סוניק את השבבים למשך 10 דקות ואת חותמות הפולידימתילסילוקסן (PDMS, Sylgard 184) עם תכונות חריץ קו (רוחב רכס של 25 מיקרומטר, רוחב חריץ של 4 מיקרומטר ועומק חריץ של 5 מיקרומטר) למשך 30 דקות באתנול נקי של 70%. העבירו את השבבים והחותמות לאזור נקי מתחת למכסה המנוע והניחו להם להתייבש תחת זרימת אוויר למשך ~1-2 שעות.
  3. שקלו 1 גרם ג'לטין מעור חזיר (חוזק ג'ל ~175 גרם בלום, סוג A) לתוך שפופרת של 50 מ"ל. הוסיפו 5 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) וערבבו היטב כדי להבטיח פירוק מיידי של הג'לטין. הנח את הצינור באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להשלים את תהליך הפירוק. באופן דומה, שקלו 1 גרם של טרנסגלוטמינאז מיקרוביאלי (MTG) לתוך צינור נפרד של 50 מ"ל. הוסיפו 12.5 מ"ל PBS, ערבבו היטב והניחו את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להבטיח פירוק מלא של ה-MTG.
  4. יש לסרוק את שפופרת הג'לטין למשך 15 דקות, ולאחר מכן להחזיר אותה לאמבט המים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס לפני השימוש. הנח את צינור ה-MTG בחומר ייבוש כשהמכסה משוחרר מעט והפעל את הוואקום לאט. שימו לב לבועות המוסרות מתמיסת ה-MTG בוואקום. לאחר הסרת הגז, החזר את צינור ה-MTG לאמבט המים של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: עקוב אחר התהליך והתאם את הוואקום כדי למנוע רתיחה נמרצת.
  5. מכסים דף רשת בפרפילם נקי, מניחים את הצ'יפס על הרשת ושומרים את החותמת בקרבת מקום, מוכנה לשימוש. הוסף 5 מ"ל של MTG ל -5 מ"ל של תמיסת ג'לטין, פיפטינג בזהירות כדי למנוע בועות; לאחר מכן, פיפטה במהירות את הג'לטין על השבב, תוך שימוש מספיק כדי לכסות את שטח השבב (כ- 0.5 מ"ל כל אחד). לאחר מכן, הנח את חותמת PDMS22 (רוחב קו 25 מיקרומטר, גובה 5 מיקרומטר, מרווח 4 מיקרומטר) מעל והחל משקל של 200 גרם כדי להבטיח שהג'לטין מעוצב במקביל לציר האורך של הרקמה. לאחר שכל השבבים יצוקים, כסו אותם בצנצנת זכוכית כדי למנוע הפרעה סביבתית ותנו להם להצטלב.
    הערה: השתמש בתמיסה המעורבת ג'לטין-MTG תוך 5 דקות; אחרת, דפוס היעד ישתנה עקב מצב צולב גבוה יותר של הג'לטין.
  6. העבירו את כריך החותמת של השבב וה-PDMS לכלי P150 חדש מלא ב-PBS והרטיב את הג'לטין למשך 30 דקות עד שעה כדי להקל על הפרדת חותמת ה-PDMS מהשבב. הסר את כל עודפי הג'לטין הלא יצוק סביב השבב והעביר את השבב הנקי לכלי P150 חדש מלא ב-PBS. אחסן את חותמות ה-PDMS ב-70% אתנול.
  7. עקרו את הצ'יפס על ידי השרייתם באתנול למשך 10 דקות מתחת למכסה המנוע.
    הערה: אין לחרוג מ-10 דקות באתנול, מכיוון שחשיפה ארוכה יותר עלולה לעוות את הג'לטין.
  8. מעבירים את הצ'יפס ל-PBS, משרים 10 דקות ושוטפים פי 3. הכן תמיסות ציפוי על ידי ערבוב של 20 מיקרוגרם/מ"ל פיברונקטין עם מטריצת ממברנת בסיס מדוללת של 1:100 במצעי גידול (כ-0.5 מ"ל לבאר). מצפים את הצ'יפס למשך שעתיים בחממה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 או ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  9. הפשרה ותאי זרעים (8 × 105 hiPSC-CMs לס"מ2) במדיום RPMI עם Y-27632 (10 מיקרומטר), ואז החלף אותו ב-RPMI ללא Y-27632 לאחר 24 שעות.
  10. שלושה ימים לאחר זריעת התאים, הסר את הסרט הלבן בעזרת פינצטה.

3. סינתזה ויישום של מתמר הפוטו

הערה: Ziapin2 סונתז על פי נוהל שפורסם בעבר 16,18 וניתן ל-hiPSC-CMs ישירות במדיום התרבית.

  1. הוסף 25 מיקרומטר של Ziapin2 לתרבית התאים ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 7 דקות.
  2. יש לשטוף בעדינות מולקולות עודפות ולשטוף עם מדיום תרבית טרי.

4. בדיקת כדאיות

הערה: Alamar Blue היא בדיקה מבוססת רזזורין שיכולה לחלחל לתאים ולשמש כאינדיקטור חמצון חיזור לניטור כדאיות התאים. רזזורין מתמוסס במאגרים פיזיולוגיים, וכתוצאה מכך תמיסה כחולה עמוקה שמתווספת ישירות לתאים בתרבית. תאים ברי קיימא עם חילוף חומרים פעיל מפחיתים את רזזורין לרזופורין, שהוא ורוד ופלואורסצנטי.

  1. תאי צלחת בצלחת של 96 בארות שצופו בעבר בפיברונקטין של 20 מיקרוגרם/מ"ל ומטריצת קרום בסיס מדוללת של 1:100 במצע תרבית. מערבבים על ידי ניעור ולאחר מכן מוסיפים באופן אספטי אלמר כחול לכל באר בכמות השווה ל-10% מנפח הבאר.
  2. דגרו על תרביות עם Alamar Blue למשך 4 שעות.
  3. טפל בתאים עם מתמר הפוטו והרכב (DMSO) כפי שתואר קודם לכן. הפעל גירוי אור (1 הרץ פועם אור למשך דקה אחת) דרך סיב אופטי (ציאן, 470 ננומטר) כדי להעריך את ההשפעה של הפנמת Ziapin2 וחשיפה לאור על כדאיות hiPSC-CM.
  4. קרא פלואורסצנטיות עם קורא צלחות בעירור 560 ננומטר ופליטה 590 ננומטר.

5. הערכת אניזוטרופיה של רקמת לב למינרית מהונדסת

הערה: פרוטוקול זה מתאר גישה שיטתית להערכת האניזוטרופיה של רקמת לב למינרית מהונדסת באמצעות צביעה חיסונית, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח גרעינים27.

  1. שטפו את המצע עם PBS מספר פעמים לפני הקיבוע עם 4% (v/v) פרפורמלדהיד המכיל 0.05% (v/v) Triton X-100 ב-PBS למשך 10 דקות.
  2. חסום קשירה לא ספציפית על ידי דגירה של דגימות עם 5% (w/v) אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS למשך 30 דקות.
  3. דגירה של דגימות עם Hoechst (1:500) בטמפרטורת החדר למשך שעה.
  4. שטפו עם PBS לפני ההרכבה על שקופיות מיקרוסקופ עם חומר נגד דהייה. הניחו לשקופיות להתייבש למשך הלילה ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד להדמיה.
  5. דגימות תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב בהגדלה של פי 20. קבע את כיוון התאים באמצעות OrientationJ Measure28, תוסף FiJi.

6. הקלטות מיפוי אופטי

הערה: מיפוי אופטי בוצע לאחר 5 ימים בתרבית על hiPSC-CMs שנזרעו על שבבי רקמה יצוקים בג'לטין.

  1. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, ודא שמנגנון המיפוי האופטי מורכב ממיקרוסקופ עדשה טנדם שונה המצויד במצלמה מהירה ובמקור אור העירור, מנורת כספית של 200 mW. הנח מראה דיכרואית מול מצלמת ההדמיה הייעודית Ca2+ כדי להבטיח שהתכשיר חשוף לאור עירור ולאסוף את הקרינה הנפלטת המגיעה מהדגימה.
  2. דגרו את הדגימה עם 2 מיקרומטר X-Rhod 1 שנוספו למדיום התרבות למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
    הערה: חשוף את הדגימה לאור רק במהלך רכישת התמונה כדי למנוע הלבנה של הצבע.
  3. דגור את הפוטו-טראסטור כמתואר קודם לכן בסעיף 3.
  4. שוטפים עם מדיום תרבית טרי ומעבירים את הצ'יפס למדיום RPMI 1640 נטול פנול אדום בתוספת B27 מינוס אינסולין.
  5. הנח את שבבי הרקמה בצלחת מבוקרת טמפרטורה והתחל להקליט בטמפרטורה פיזיולוגית (37 מעלות צלזיוס), תוך קבלת תמונות בקצב פריימים של 2.5 פריימים לשנייה.
  6. עבור קוצב אופטי, הפעל את גירוי הנקודה האופטית בקצה אחד של הרקמה באמצעות מקור אור LED (465/25 ננומטר) המאפשר גירוי Ziapin2. קצב את הרקמות בתדר של 0.5 או 1 הרץ באמצעות סיב אופטי מווסת זמנית הממוקם במרחק של 1 מ"מ מהרקמה. עבור קוצב חשמלי, הפעל גירוי נקודתי באמצעות אלקטרודת פלטינה דו קוטבית הממוקמת במרכז הקצה הדיסטלי ביותר של הרקמה המלבנית. מיקום זה מבטיח שהתפשטות גל Ca2+ מקורה בנקודת האמצע של רוחב הרקמה, התואמת את הצד הקצר יותר של המלבן. יש להפעיל את הגירוי בתדר של 0.5 הרץ, עם משרעת של 10 וולט ומשך דופק של 100 אלפיות השנייה.
  7. לאחר ההקלטות, החל מסנן מרחבי בגודל 3 x 3 פיקסלים כדי לשפר את יחס האות לרעש.
  8. קבע את מהירות הולכת הגל Ca2+ בכל פיקסל עבור כל פולס, וחשב את קצב השינוי לאורך שני כיווני ה-x וה-y. לשם כך, מדוד את השיפוע המרחבי של עוצמת האות Ca2+ בכיוונים אלה וקשר אותו לעיכוב הזמן של התפשטות האות. על ידי שילוב שיעורי שינוי כיווניים אלה, כמת כמה מהר הגל עובר על פני השדה הסלולרי בשני הממדים.

7. ייצוא וטיפול בנתונים

  1. חלץ ונתח את הנתונים באמצעות התוכנה המוזכרת.
  2. החל מסנן מרחבי של 3 x 3 פיקסלים כדי לשפר את יחס האות לרעש.
  3. חלץ את עקבות הטרנזיינטים של Ca2+ (CaT) כממוצע של אזור עניין ספציפי שנבחר ידנית (ROI).
  4. מדוד את פרמטרי ה-CaT באזור עניין מרכזי (ROI) של 50 x 50 פיקסלים (≈ 25 מ"מ2).
  5. עבור כל CaT, נתח את משרעת ה-CaT, זמן העלייה (שיא t), זמן שיפוע הדעיכה המקסימלי (שיפוע הדעיכה המקסימלי) והזמן עד 90% דעיכה חולפת (זמן דעיכה90).

8. ניתוח סטטיסטי

  1. הערך את נורמליות ההתפלגות באמצעות מבחן סטטיסטי מתאים, כגון מבחן נורמליות, כדי לקבוע אם יש ליישם שיטות פרמטריות או לא פרמטריות.
  2. להעריך מובהקות סטטיסטית בין שני מצבים באמצעות מבחן t של הסטודנט או מבחן Mann-Whitney U עבור נתונים רציפים או קטגוריים, בהתאמה. כאשר משווים יותר משתי קבוצות, השתמש ב-ANOVA חד-כיווני או במבחן Kruskal-Wallis בהתאם להנחות הנתונים, ולאחר מכן בדיקות פוסט-הוק מתאימות כדי לזהות הבדלים זוגיים משמעותיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פותח ויושם תהליך רב-שלבי לייצור רקמת לב למינרית מהונדסת באמצעות שילוב של דפוס לייזר, יציקת ג'לטין וטכניקות זריעת תאים. טכניקה זו, שהוקמה במקור על ידי McCain et al.22 ו-Lee et al.24, יושמה מחדש, בעקבות הפרוטוקולים שלהם לבניית המיקרו-רקמות הלמינריות המהונדסות. התהליך משלב דפוס מדויק מבוסס לייזר להנחיה מבנית, ג'לטין כחומר פיגום וזריעת תאים מבוקרת ליצירת סביבת רקמה ביומימטית. (איור 1).

שיקוע מצעי הנייר כלל הדבקה של שתי ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גישה זו מספקת פלטפורמה חזקה לקידום מחקר הלב, ומספקת תובנות לגבי הדינמיקה המורכבת של רקמת הלב ופותחת אפשרויות חדשות למחקרים מכניסטיים ארוכי טווח במבחנה שעשויים להוביל לאסטרטגיות טיפוליות חדשות. כדי להבטיח את הצלחת המתודולוגיה הזו, חיוני לשחזר סביבה מיקרופיזיולוגית המחקה מקרוב את תנאי ה-in vivo של לב האדם. לכן, יש להקדיש תשומת לב קפדנית לתכנון ויישור הרקמה כדי לשכפל את האניזוטרופיה הטבעית של ארכיטקטורת הלב, החיונית להולכה חשמלית תקינה ולתפקוד התכווצות. גורמים קריטיים כולל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CB, GL ו-FL הם ממציאי "תרכובות פוטוכרומיות" פטנט מס. EP 3802491 (02/07/2020).

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים בהכרת תודה למייקל רוסנאך על האיורים באיור 1 ובאיור 3, ולפרופ' וויליאם ט. פו על אספקת hiPSC. עבודה זו נתמכה על ידי קונסורציום שבבי הרקמות של NCATS (UH3 TR003279) ל-KKP, משרד האוניברסיטאות והמחקר האיטלקי באמצעות פרויקט PRIN 2022 (ID 2022-NAZ-0595) ל-FL, פרויקט PRIN 2020 (ID 2020XBFEMS) ל-CB ו-GL, ופרויקט Fondo Italiano per la Scienza (ID FIS00001244) ל-GL.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
alamarBlue Cell כדאיות ריאגנטתרמו פישר מדעיDAL1025כדאיות תאים
B-27 תוסף, מינוס אינסוליןתרמו פישר A1895601 מדעיתלתרבית תאים
סרום בקר אלבומיןסיגמא-אולדריץ'A9056-50Gלצביעה תאים
תוכנת מנתח BrainVision מוצרי מוחhttps://www.brainproducts.com/downloads/analyzer/ייצוא וטיפול בנתונים
BTSSigma203895-5MG
CHIR99021Stem Cell Technologies72054
יריעת אקריליק שקופה עמידה בפני שריטות ו-UV, 12 אינץ' x 12 אינץ' x 0.01 אינץ'McMaster Carr4076N11ייצור שבבי רקמות
קולגנאז סוג II וורת'ינגטוןCLS-2 / LS004176
DNase IIVWR89346-540
חיוני 8 בינוני Thermo Fisher ScientificA1517001לתרבית תאים
פיברונקטיןVWR47743-654ציפוי
ג'לטין מחוזק ג'ל עור חזיר 175 סוג ASigma-AldrichG2625-100Gייצור שבבי רקמות
Geltrex LDEV-Free, מוסמך hESC, גורם צמיחה מופחת מטריצת קרום מרתףThermo Fisher ScientificA1413302ציפוי
HBSS תרמו פישר14175-095
HEPES (1 מ')תרמו פישר סיינטיפיק15630080
הוכסט 33342 Life TechnologiesH1399עבור צביעת תאים
תמיסת אינסולין אנושיתSigma AldrichI9278-5ML
IWR-1-endoטכנולוגיות תאי גזע72564
Paraformadehyde 16% תמיסה מימית (PFA)VWR100503-917לצביעת תאים
PBS, סטרילי, 500 מ"לThermo Fisher Scientific10010049ייצור שבבי רקמות
פוספט חוצץמלח Thermo Fisher Scientific10010049
Pluronic F-127 (תמיסה של 20% ב-DMSO)Thermo Fisher ScientificP3000MPROCK פעילי שטח לא יוני
Y-27632Stem Cell Technologies72304
RPMI 1640 בינוני, תוסף GlutaMAXThermo Fisher Scientific61870127לתרבית
תאיםRPMI 1640 בינוני, ללא פנול אדוםThermo Fisher Scientific 11835030מיפוי אופטי
Versene Solution ThermoFisher Scientific15040066סוכן כלאטינג
VWR קלטת תיוג מעבדה לשימוש כלליVWR89098-058ייצור שבבי רקמות
X-Rhod-1 AMThermo Fisher ScientificX14210מיפוי אופטי
בדיקת מעכב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Maria, F., Lodola, F., Zucchetti, E., Benfenati, F., Lanzani, G. The evolution of artificial light actuators in living systems: from planar to nanostructured interfaces. Chem Soc Rev. 47 (13), 4757-4780 (2018).
  2. Manfredi, G., et al. The physics of plasma membrane photostimulation. APL Mater. 9 (3), 030901(2021).
  3. Bareket-Keren, L., Hanein, Y. Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges. Int J Nanomed. 9 Suppl 1 (Suppl 1), 65-83 (2014).
  4. Ford, S. M., Watanabe, M., Jenkins, M. W. A review of optical pacing with infrared light. J. Neural Eng. 15 (1), 011001(2018).
  5. Antognazza, M. R., et al. Shedding light on living cells. Adv Mater. 27 (46), 7662-7669 (2015).
  6. Zhang, J., Wang, J., Tian, H. Taking orders from light: progress in photochromic bio-materials. Mater Horiz. 1 (2), 169-184 (2014).
  7. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  8. Ambrosi, C. M., Entcheva, E. Optogenetics' promise: pacing and cardioversion by light. Future Cardiol. 10 (1), 1-4 (2014).
  9. Hopkins, J., et al. Photoactive organic substrates for cell stimulation: Progress and perspectives. Adv Mater Technol. 4 (5), 1800744(2019).
  10. Vurro, V., Venturino, I., Lanzani, G. A perspective on the use of light as a driving element for bio-hybrid actuation. Appl Phys Lett. 120 (8), 080502(2022).
  11. Bruno, G., et al. All-optical and label-free stimulation of action potentials in neurons and cardiomyocytes by plasmonic porous metamaterials. Adv Sci. 8 (21), 2100627(2021).
  12. Ronchi, C., et al. Nongenetic optical modulation of pluripotent stem cells derived cardiomyocytes function in the red spectral range. Adv Sci. 11 (3), 2304303(2023).
  13. Li, P., et al. Monolithic silicon for high spatiotemporal translational photostimulation. Nature. 626 (8001), 990-998 (2024).
  14. Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nat Protoc. 14 (5), 1339-1376 (2019).
  15. Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proc Natl Acad Sci USA. 116 (45), 22531-22539 (2019).
  16. DiFrancesco, M. L., et al. Neuronal firing modulation by a membrane-targeted photoswitch. Nat Nanotechnol. 15 (4), 296-306 (2020).
  17. Paternò, G. M., et al. Membrane environment enables ultrafast isomerization of amphiphilic azobenzene. Adv Sci. 7 (8), 1903241(2020).
  18. Vurro, V., et al. Molecular design of amphiphilic plasma membrane-targeted azobenzenes for nongenetic optical stimulation. Front Mater. 7, 631567(2021).
  19. Vurro, V., et al. Optical modulation of excitation-contraction coupling in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. iScience. 26 (3), 106121(2023).
  20. Vurro, V., et al. Light-triggered cardiac microphysiological model. APL Bioeng. 7 (2), 026108(2023).
  21. Florindi, C., et al. Role of stretch-activated channels in light-generated action potentials mediated by an intramembrane molecular photoswitch. J. Transl. Med. 22 (1), 1068(2024).
  22. McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35 (21), 5462-5471 (2014).
  23. Park, S. -J., et al. Insights into the pathogenesis of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia from engineered human heart tissue. Circulation. 140 (5), 390-404 (2019).
  24. Lee, K. Y., et al. An autonomously swimming biohybrid fish designed with human cardiac biophysics. Science. 375 (6581), 639-647 (2022).
  25. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2013).
  26. Prondzynski, M., et al. Efficient and reproducible generation of human iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac organoids in stirred suspension systems. Nat Commun. 15 (1), 5929(2024).
  27. Pasqualini, F. S., Sheehy, S. P., Agarwal, A., Aratyn-Schaus, Y., Parker, K. K. Structural phenotyping of stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Rep. 4 (3), 340-347 (2015).
  28. Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40 (7), 2552-2556 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Ziapin2

מאמרים קשורים