מאמר שיטה

זיהוי מבוסס פלואורסצנטי של פעילות נוקלאז FEN1 וסינון של מעכבי מולקולות קטנות

DOI:

10.3791/67968

⸱

27 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר בדיקה ביוכימית של שינוי ג'ל למדידת פעילות FEN1 (Flap Endonuclease 1) והתפתחות מעכבים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FEN1 (Flap Endonuclease 1) הוא נוקלאז DNA מרכזי המעורב בשכפול DNA ותיקון נזקים, וממלא תפקיד מכריע בשמירה על יציבות גנומית. רמות גבוהות של פעילות FEN1 קשורות קשר הדוק להתפתחות סוגי סרטן שונים, מה שהופך את FEN1 לסמן ביולוגי מוכר ויעד תרופתי לסרטן הריאות, השד והערמונית. שיטות תיוג רדיואיזוטופיות קונבנציונליות לזיהוי פעילות נוקלאז FEN1 מציבות אתגרים מבחינת נוחות ובטיחות. במחקר זה, סונתז מצע שבר DNA עם מבנה דש במבחנה. מצע זה מסומן בפלואורופור בקצה 5' של הדש, המאפשר לנוקלאז FEN1 לזהות ולבקע באופן ספציפי את האתר המיועד. פעילות FEN1 נקבעה לאחר מכן על ידי זיהוי אות הפלואורופור לאחר אלקטרופורזה של ג'ל. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה ויעילה של פעילות נוקלאז FEN1 וסינון מעכביו. הוא מספק גישה רגישה וספציפית לניתוח פעילות FEN1 ולהערכת יעילותם של מעכבי מולקולות קטנות. יתר על כן, הוא תורם באופן משמעותי למחקר על תיקון נזקי DNA והתפתחות סרטן, ומציע אסטרטגיה חדשה למחקר קליני על מנגנוני מחלה וזיהוי חומרים גנוטוקסיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שכפול ה-DNA אינו תמיד ללא רבב ויכול להיות מופרע על ידי גורמים פנימיים וחיצוניים כאחד. כתוצאה מכך, מנגנוני שכפול ה-DNA ותיקון הנזק חיוניים להישרדות התאים וליציבות הגנום. בתהליך זה, האנדונוקלאז הספציפי למבנה המסתעף האנושי FEN1 (Flap Endonuclease 1), נוקלאז DNA ליבה, ממלא תפקיד מכריע 1,2,3.

FEN1 מעורב בעיקר בשכפול DNA והוא הכרחי להבשלה של שברי אוקזאקי על הגדיל המפגר 4,5. זה מבטיח התקדמות יעילה של שכפול DNA ותיקון מדויק של DNA פגום. עם זאת, עליות חריגות ברמות FEN1 נקשרו קשר הדוק להתפתחות סוגי סרטן שונים 6,7, כגון סרטן ריאות ושד7. לפיכך, FEN1 לא רק חיוני לשכפול ותיקון DNA אלא גם זכה לתשומת לב משמעותית כסמן ביולוגי לאבחון סרטן ויעד טיפולי פוטנציאלי 8,9. גילוי פעילות FEN1 חיוני לאבחון מוקדם של סרטן ולקידום המחקר על טיפולים ממוקדי מטרה.

לאור חשיבותו של FEN1, והצורך לחקור את פעילותו לאבחון מוקדם של סרטן ופיתוח טיפול ממוקד, המטרה העיקרית של השיטה שפותחה בניסוי זה הייתה למדוד בצורה מדויקת ויעילה את פעילות הנוקלאז של FEN1. שיטה זו נועדה לספק פלטפורמה אמינה לסינון מעכבי מולקולות קטנות המכוונים ל-FEN1. על ידי השגת מטרות אלה, המחקר מבקש לתרום להבנה טובה יותר של תפקידו של FEN1 בסרטן ולהקל על גילוי אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

קיימות טכניקות רבות לזיהוי פעילות נוקלאז FEN1, כל אחת עם מאפיינים, עקרונות, יתרונות, מגבלות ותרחישים ישימים מובחנים. לדוגמה, אלקטרופורזה של ג'ל ושיטות הפרדת מצע מבוססות HPLC מספקות תוצאות אינטואיטיביות אך כרוכות בהליכים מסורבלים ותפוקה נמוכה10,11. מבחני קיטוב פלואורסצנטי (FP) מתמודדים עם אתגרים בהערכת פעילות FEN1 עקב הפרעות מאוטו-פלואורסצנטיות מורכבות או פיזור אור, המשפיעים על אותות FP. למרות שאסטרטגיות סינון נגדי יכולות לשלול באופן חלקי תוצאות חיוביות כוזבות, כ-15% מהתרכובות הפעילות העיקריות עדיין מזוהות באופן שגוי עקב הפרעות טכניות12. השימוש המשולב בזוגות תורמים/מרווה פלואורסצנטיים (למשל, TAMRA/BHQ-2) וכימילומינסנציה של AlphaScreen מציג חסרונות, כגון עלות הסינתזה הגבוהה של מצעים פלואורסצנטיים מורכבים בעלי דש משולש, במיוחד מגביל את התועלת שלהם בהקרנה בקנה מידה גדול. יתר על כן, מבנה הדש הכפול של המצעים עלול לעכב את הקישור האופטימלי עם FEN1, להפחית את יעילות המחשוף האנזימטי ולפגוע ברגישות הזיהוי. בנוסף, גישה זו מסתמכת במידה רבה על מכשירים מיוחדים (למשל, ViewLux, EnVision), ומגבילה את אימוצה במעבדות מוגבלות במשאבים 13,14,15. שיטות זיהוי פלואורסצנטיות המבוססות על ננו-בדיקות DNA בצורת משקולת כפולה המתפקדות עם ננו-אשכולות כסף (DNA-AgNCs) סובלות משונות מאצווה לאצווה בשל תלותן בחישול מדויק ובשלבי גרעין באתר, מה שמעכב את יכולת השחזור והמדרגיות. עלויות גבוהות והליכים ארוכים מגבילים עוד יותר את יישומם המעשי16.

במאמר זה, פותחה בדיקה מבוססת תיוג פלואורסצנטי כדי לתת מענה למגבלות הטכניות הנוכחיות ולענות על הביקוש הגובר לשיטות בטוחות ונגישות יותר לחקר פעילות FEN1. טכניקה זו מנצלת את הספציפיות והרגישות הגבוהה של גילוי פלואורסצנטי, כמו גם את היכולת להנדס מצעי DNA עם מבנים מוגדרים הניתנים לזיהוי ולבקע על ידי FEN1 (איור 1). שיטה זו מייעלת את הליכי הניסוי תוך שמירה על דיוק גבוה בהערכת פעילות נוקלאז FEN1. בהשוואה לאלקטרופורזה מסורתית של ג'ל וטכניקות מבוססות HPLC, הוא מציע פעולה פשוטה ותפנית מהירה יותר. בניגוד למבחני קיטוב פלואורסצנטיים, גישה זו מאפשרת סינון איכותי מהיר של תרכובות, ומבססת אסטרטגיה יעילה להערכה אנזימטית ראשונית.

שיטה זו מתאימה לחקר פעילות נוקלאז FEN1 בסביבות מעבדה בהן הגישה לחומרים רדיואקטיביים מוגבלת. הוא גם מתאים היטב לסינון מספר רב של מעכבי מולקולות קטנות בזמן קצר יחסית, במיוחד כאשר נדרשת רגישות וסגוליות גבוהות. עם זאת, הוא אינו אידיאלי למחקרים הדורשים כימות מוחלט ברמת דיוק גבוהה מאוד או למעבדות חסרות ציוד בסיסי לגילוי פלואורסצנטי ומומחיות בניתוח אותות פלואורסצנטיים. עבור מחקרים המתמקדים ביישומי in vivo - שבהם התנהגות FEN1 עשויה להיות מושפעת מגורמים ביולוגיים מורכבים שאינם משוכפלים בעיצובי בדיקה נוכחית במבחנה - ייתכן שיהיה צורך בחידוד נוסף או בשיטות חלופיות.

בדיקת פלואורסצנטיות זו רגישה וספציפית ביותר, ומספקת כלי בטוח, נוח ויעיל לחקר פעילות FEN1 ולפיתוח מעכביו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. טיהור ביטוי חלבון FEN1

  1. טיהור חלבונים
    1. הסר את מלאי החיידקים המכיל את פלסמיד המטרה (ראה טבלת חומרים) מ-80 מעלות צלזיוס. להפשיר בטמפרטורת החדר ולחסן 200 מיקרוליטר מצינורות המיקרו-צנטריפוגה הקפואים של 1.5 מ"ל למדיום LB של 20 מ"ל המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין באמצעות קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר.
      הערה: הזן הוא E. coli BL21(DE3)-FEN1.
    2. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-160 סל"ד למשך 12 שעות.
    3. העבירו את תרחיף החיידקים לבקבוק ארלנמאייר בנפח 200 מ"ל המכיל מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין. המשיכו בדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-160 סל"ד למשך 2-3 שעות.
    4. כאשר ה- OD600 של התרבית מגיע לכ- 0.6, הוסף 2 מ"ל IPTG (ריכוז סופי: 1 מ"מ). המשך הדגירה ב-25 מעלות צלזיוס, 160 סל"ד למשך 10 שעות.
    5. העבירו את התרבית המושרה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל שנשקל מראש. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו -2500 × גרם למשך 15 דקות. השליכו את הסופרנטנט. שקלו את הצינור המכיל גלולה והפחיתו את משקל הצינור הריק כדי לחשב את מסת הגלולה.
    6. הוסף 7 מ"ל של מאגר ליזה לגרם של כדור תאים רטוב. השתמש בפיפטה כדי להשעות את הגלולה ביסודיות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
      הערה: מאגר ליזה (סה"כ 10 מ"ל) מכיל 20 מ"מ של Tris-HCl, 250 מ"מ של NaCl, 2% Triton X-100 ו-ddH2O. בצע שלב זה במכסה אדים כדי להבטיח טיפול בטוח בריאגנטים כימיים.
    7. מעבירים את תרחיף החיידקים במאגר ליזה למקפיא של -80 מעלות צלזיוס ומקפיאים למשך הלילה. למחרת, הפשירו את המתלה על שייקר של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לשפר את יעילות הליזה.
    8. תאי ליז באמצעות אולטרסאונד בעוצמה של 75% למשך 45 דקות. צנטריפוגה את הליזאט ב-12,000 × גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להפריד את הסופרנטנט מהגלולה.
      הערה: אם הליזאט נשאר עכור, הגדל את נפח מאגר הליזיס או חזור על מחזורי הקפאה-הפשרה. ניתן להוסיף גם מעכב נוקלאז כדי לשמור על שלמות החלבון ולמנוע פירוק.
    9. מרחו את הסופרנטנט המובהר לאורך דופן צינור המכיל שרף טיהור חלבון מוכן. שטפו עם 10 מ"ל של מאגר פליטה כדי להסיר חלבונים שאינם קשורים במיוחד.
      הערה: מאגר אלוטיון מכיל 20 מ"מ של Tris-HCl (pH 7.5), 250 מ"מ של NaCl, 2% Triton X-100, 200 מ"מ של אימידזול ומים מזוקקים.
    10. לחסל את חלבון FEN1 על ידי הוספת 5 מ"ל של מאגר פליטה לאורך הדופן הפנימית של הצינור.
  2. זיהוי חלבוני מטרה על ידי צביעה כחולה מבריקה מהירה של קומאסי
    1. הכן ג'ל SDS-PAGE באמצעות 12% ג'ל הפרדה ו-5% ג'ל ערימה בהתאם לגודל הצפוי של FEN1.
    2. מערבבים את דגימת חלבון המטרה ותקן BSA עם מאגר דגימה של 5× ביחס של 1:4. חממו את התערובת בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לנטרל את החלבונים במלואם.
    3. טען 20 מיקרוליטר כל אחת מדגימות החלבון הסטנדרטיות והדנטורציה של BSA לבארות נפרדות של ג'ל SDS-PAGE.
    4. חבר את מנגנון האלקטרופורזה. הגדר את המתח ל 90 וולט והפעל למשך שעה ו -40 דקות.
    5. לאחר האלקטרופורזה, העבירו את הג'ל למיכל מכתים. שוטפים במים נטולי יונים, ואז מוסיפים 30 מ"ל תמיסת מכתים חלבון ומכתימים למשך 25 דקות. שחזרו את תמיסת הצביעה, שטפו את הג'ל ב-20 מ"ל מים נטולי יונים והסירו צבע למשך הלילה על שייקר אופקי.
    6. לאחר הסרת הצבע, הניחו את הג'ל על צלחת פלסטיק שקופה והתבוננו ברצועות החלבון באור לבן.
      הערה: אם הרצועות חלשות או ריכוז החלבון נמוך, רכז את הדגימה באמצעות צינורות אולטרה-סינון. שלב זה מסיר עודפי ממס ומולקולות קטנות, משפר את ריכוז החלבון ומבטיח ניתוח מדויק בניסויים הבאים.

2. הכנת מצע DNA עם תווית FEN1 TAMRA

  1. הכנת מצע DNA עם תווית TAMRA
    1. תכנן גדילי אוליגונוקלאוטידים של DNA על סמך פעילות המחשוף הספציפית של FEN1, תוך התייחסות לשיטות שפורסמו17 (ראה טבלה 1). הקצה של 5′ של רצף D1 שונה עם תווית TAMRA פלואורסצנטית.
    2. הוסף אוליגונוקלאוטידים מעורבים של DNA חד-גדילי ל-10 מיקרוליטר של מאגר חישול בנפחים הבאים: 5 מיקרוליטר של D1 (10 pmol/μL), 10 μL של T1 (10 pmol/μL) ו-7.5 μL של U2 (10 pmol/μL). הוסף מים נטולי יונים כדי להביא את הנפח הכולל ל-50 מיקרוליטר.
      הערה: מאגר החישול מכיל 100 מ"מ של Tris-HCl (pH 7.5) ו-10 מ"מ של MgCl2.
    3. מחממים את תערובת התגובה באמבט מתכת בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ואז מעבירים אותה מיד ל-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות18.
      הערה: מצע ה- DNA הסופי הוא באורך 80 נוקלאוטידים. הטמפרטורה ההתחלתית הגבוהה (100 מעלות צלזיוס) מבטיחה דנטורציה, בעוד שטמפרטורת החישול (72 מעלות צלזיוס) מקדמת זיווג מדויק של גדילים.
    4. כבה את מקור החום ואפשר לתמיסה להתקרר בהדרגה לטמפרטורת החדר, וליצור את מצע ה- DNA הדו-גדילי השלם.
  2. בדיקת מצע DNA עם תווית TAMRA
    1. הכן ג'ל פוליאקרילאמיד 12% דנטור על ידי ערבוב של 4.8 מ"ל של 30% אקרילאמיד (29:1), 4.32 מ"ל של 6 מ"ל אוריאה, 2.4 מ"ל של 5× TBE, 50 מיקרוליטר של 10% APS, 5 מיקרוליטר של TEMED ו-0.48 מ"ל של מים נטולי יונים. מערבבים היטב להכנת הג'ל.
    2. מכניסים את הג'ל לתנור בחום של 37 מעלות למשך 30 דקות להתמצקות.
    3. לזיהוי, פיפטה 2 מיקרוליטר ממצע ה-DNA המסונתז ל-18 מיקרוליטר של מים מזוקקים והוסף מאגר עצירה של 7.7 מיקרוליטר.
    4. לעיון, פיפטה 2 מיקרוליטר של D1 המסומן על ידי TAMRA לתוך 18 מיקרוליטר מים מזוקקים והוסף 7.7 מיקרוליטר של מאגר עצירה.
    5. טען 20 מיקרוליטר מכל דגימה מוכנה על הג'ל ובצע אלקטרופורזה SDS-PAGE כדי לנתח את היווצרות מצע ה-DNA.

3. בדיקת פעילות נוקלאז FEN1

  1. בדיקת פעילות אנזים FEN1
    1. הכן 20 מיקרוליטר של תערובת תגובה על ידי שילוב של 2 מיקרוליטר של מצע DNA עם נוקלאז FEN1 במאגר התגובה.
      הערה: מאגר התגובה מורכב מ-100 מ"מ של Tris-HCl (pH 7.5), 200 מ"מ של MgCl2, 2 מ"מ של DTT, 0.2 מ"ג/מ"ל BSA ומים נטולי יונים.
    2. דגרו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מתכת למשך 15 דקות.
    3. סיים את התגובה על ידי הוספת 20 μL של 2× מאגר סיום.
    4. טען 20 מיקרוליטר מהדגימה המגיבה על ג'ל פוליאקרילאמיד 12% דנטורציה שהוכן מראש ובצע אלקטרופורזה ב-100 וולט למשך 60 דקות.
    5. לאחר אלקטרופורזה, דמיין את התוצאות באמצעות מערכת הדמיה פלואורסצנטית (מסלול 600).

4. סינון מעכבי מולקולות קטנות של נוקלאז FEN1

  1. סינון מעכבי מולקולות קטנות
    1. השתמש בפיפטה כדי להעביר 2 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
    2. הוסף לצינור 2 מיקרוליטר של נוקלאז FEN1 ו-10 מיקרוליטר של מאגר תגובה של 2×.
    3. מערבבים היטב ומדגרים את התערובת על קרח למשך 10 דקות.
    4. הוסף 2 מיקרוליטר של מצע DNA ו-4 מיקרוליטר של מים נטולי יונים, ערבב היטב כדי להביא את נפח התגובה הכולל ל-20 מיקרוליטר.
    5. הכן דילול עבודה של מעכב נוקלאז FEN1, FEN1-IN-4, על ידי ביצוע דילול סדרתי כפול של תמיסת מלאי של 1 M ב-DMSO.
    6. פיפטה 2 מיקרוליטר של נוקלאז FEN1 (0.03 מיקרוגרם/מיקרוליטר) ו-2 מיקרוליטר של מעכב FEN1-IN-4 המדולל לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל. הוסף 10 מיקרוליטר של 2× מאגר תגובה ו-4 מיקרוליטר של מים נטולי יונים. יש לערבב בעדינות ולדגור על קרח למשך 10 דקות כדי להבטיח אינטראקציה מספקת בין המעכב לאנזים.
    7. הוסף 2 מיקרוליטר של מצע DNA לצינור ליצירת תערובת תגובה סופית של 20 מיקרוליטר.
    8. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מתכת למשך 15 דקות.
    9. סיים את התגובה על ידי הוספת 20 μL של 2× מאגר סיום.

5. הערכת עוצמת העיכוב של מעכב מולקולות קטנות FEN1--IN-4

  1. השתמש במיקרופיפטה כדי לקחת 10 מיקרוליטר של מאגר תגובה של 2× ולהוסיף אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  2. הוסף 2 מיקרוליטר של נוקלאז FEN1 בריכוז של 0.03 מיקרוגרם/מיקרוליטר, כמו גם 2 מיקרוליטר של מעכב FEN1 FEN1-IN-4 בריכוז שונה.
    הערה: יש לקבוע שיפועי ריכוז מרובים בהתאם לדרישות הניסוי.
  3. מוסיפים 4 מיקרוליטר מים נטולי יונים ומערבבים היטב את התמיסה. הניחו את צינור המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל על קרח ודגרו למשך 10 דקות.
  4. הוסף 2 מיקרוליטר של מצע DNA דו-גדילי לצינור ליצירת מערכת תגובה של 20 מיקרוליטר.
  5. הנח את צינור ה-EP באמבט מתכת של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  6. לאחר השלמת התגובה, הוסף 20 מיקרוליטר של 2× מאגר עצירה לתערובת התגובה כדי לסיים את התגובה.
  7. התבונן בתוצאות באמצעות מכשיר הדמיה פלואורסצנטי ושרטט את עקומת IC50 19.
    הערה: כימות עוצמת הקרינה בוצע באמצעות Fiji/ImageJ20, ואחריו ניתוח סטטיסטי והדמיה עם תוכנת גרפים וניתוח21.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שמוצג באיור 2A, מגיב הצביעה נקשר לחלבון, מה שגורם לחלבון להופיע כפס כחול על הג'ל. הנתיב הראשון מכיל את החלבון המסומן המשמש כהתייחסות למשקל מולקולרי, שבו רצועת החלבון הסטנדרטית של BSA תואמת למשקל מולקולרי של 70 kDa, ורצועת החלבון של חומצת הגרעין FEN1 מתאימה למשקל מולקולרי של 45 kDa. תוצאות הניסוי הראו כי נוקלאז FEN1 הופיע כרצועה שקופה בכ-45 kDa, מה שמעיד על טיהור מוצלח של ביטוי החלבון המושרה.

כפי שמוצג באיור 2B, D1 בנתיב 2 מייצג מצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת פעילות נוקלאז FEN1 ובדיקת מעכבי מולקולות קטנות הם מרכזיים במחקר על תיקון נזקי DNA והתפתחות סרטן. בהשוואה לטכניקות תיוג רדיו מסורתיות, השיטה הנוכחית מציעה אלטרנטיבה חסכונית, יעילה, קלה לתפעול ובטוחה יותר. בנוסף, בניגוד למבחני FEN1 מבוססי פרץ פלואורסצנטי, גישה זו מספקת הדמיה אינטואיטיבית יותר של מחשוף הסובסטרט, ובכך מאפשרת הערכה מדויקת יותר של פעילות האנזים ומציעה פלטפורמה אמינה יותר למחקרים קשורים14.

מספר שלבים מרכזיים הם קריטיים ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי צוות המחקר החדשני של המוסד להשכלה גבוהה של ג'יאנגסו למדע וטכנולוגיה (2021), התוכנית של מרכז המחקר הטכנולוגי ההנדסי של המכללה המקצועית של ג'יאנגסו (2023), תוכנית הטכנולוגיה המרכזית של פרויקטים טכנולוגיים לפרנסה של תושבי סוג'ואו (SYWD2024099), פרויקט של מעבדת המפתח הממלכתית לרפואת קרינה והגנה, אוניברסיטת סוצ'ו (GZK12023013), תוכניות של המכללה לבריאות מקצועית של סוג'ואו (SZWZYTD202201, SZWZYTD202205), ופרויקט צ'ינג-לאן של מחוז ג'יאנגסו בסין (2021, 2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 מ' Tris-HCLביוטייםST774
30% Acr-Bis (29:1)ביוטייםST003-500 מ"ל
5 מ' NaclביוטייםST347
ביובלו פלוסביוטייםP0003S
BL21(DE3)-FEN1ואזיםC504-F1
BSAביוטייםP0007
שייקר הסרת צבעקיילין-בלTS-100
DL-דיתיותרייטולביוטייםסט041
חממת אמבטיה יבשהרויצ'נג200 ד"ח
מכשיר אלקטרופורזהביי ג'ינג ליו-יי ביוטכנולוגיהDDY-6D
FEN1 ב-4טרגטMOLT8545
IPTGטקאבה9030
Kanamycin SlufateביושארפBS152
צנטריפוגה במעבדהתרמוSL 16R
מרק LBסולארביוL8291
Ni-NTA שרף הכריכה שלו7SE ביוטקPANF001-001C
אודיסיאהאודיסיאהלי-קור
דף SDSביוטייםP0015L
Trition-x-100שיואנייהS15022

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xu, S., et al. Novel cell-virus-virophage tripartite infection systems discovered in the freshwater lake Dishui Lake in Shanghai, China. J Virol. 94 (11), e00149(2020).
  2. Mougari, S., Sahmi-Bounsiar, D., Levasseur, A., Colson, P., La Scola, B. Virophages of giant viruses: An update at eleven. Viruses. 11 (8), 733(2019).
  3. Paez-Espino, D., et al. Diversity, evolution, and classification of virophages uncovered through global metagenomics. Microbiome. 7 (1), 157(2019).
  4. Zheng, L., et al. Functional regulation of FEN1 nuclease and its link to cancer. Nucleic Acids Res. 39 (3), 781-794 (2011).
  5. Yang, F., Hu, Z., Guo, Z. Small-molecule inhibitors targeting FEN1 for cancer therapy. Biomolecules. 12 (7), 946(2022).
  6. Wang, Z., et al. Inhibition of FEN1 promotes DNA damage and enhances chemotherapeutic response in prostate cancer cells. Med Oncol. 40 (8), 242(2023).
  7. Abdel-Fatah, T. M., et al. Genomic and protein expression analysis reveals flap endonuclease 1 (FEN1) as a key biomarker in breast and ovarian cancer. Mol Oncol. 8 (7), 1326-1338 (2014).
  8. Guo, E., et al. FEN1 endonuclease as a therapeutic target for human cancers with defects in homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19415-19424 (2020).
  9. Zhao, E., Zhou, C., Chen, S. Flap endonuclease 1 (FEN1) as a novel diagnostic and prognostic biomarker for gastric cancer. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 45 (1), 101455(2021).
  10. Finger, L. D., et al. The 3'-flap pocket of human flap endonuclease 1 is critical for substrate binding and catalysis. J Biol Chem. 284 (33), 22184-22194 (2009).
  11. Liu, R., Qiu, J., Finger, L. D., Zheng, L., Shen, B. The DNA-protein interaction modes of FEN-1 with gap substrates and their implication in preventing duplication mutations. Nucleic Acids Res. 34 (6), 1772-1784 (2006).
  12. McWhirter, C., et al. Development of a high-throughput fluorescence polarization DNA cleavage assay for the identification of FEN1 inhibitors. J Biomol Screen. 18 (5), 567-575 (2013).
  13. Dorjsuren, D., Kim, D., Maloney, D. J., Wilson, D. M. 3rd, Simeonov, A. Complementary non-radioactive assays for investigation of human flap endonuclease 1 activity. Nucleic Acids Res. 39 (2), e11(2011).
  14. Van Pel, D. M., et al. An evolutionarily conserved synthetic lethal interaction network identifies FEN1 as a broad-spectrum target for anticancer therapeutic development. PLoS Genet. 9 (1), e1003254(2013).
  15. Tumey, L. N., et al. The identification and optimization of a N-hydroxy urea series of flap endonuclease 1 inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 15 (2), 277-281 (2005).
  16. Tang, Y., Wei, W., Liu, Y., Liu, S. Fluorescent assay of FEN1 activity with nicking enzyme-assisted signal amplification based on ZIF-8 for imaging in living cells. Anal Chem. 93 (11), 4960-4966 (2021).
  17. Liu, S., et al. fragment maturation involves α-segment error editing by the mammalian FEN1/MutSα functional complex. EMBO J. 34 (13), 1829-1843 (2015).
  18. Zheng, L., Dai, H., Qiu, J., Huang, Q., Shen, B. Disruption of the FEN-1/PCNA interaction results in DNA replication defects, pulmonary hypoplasia, pancytopenia, and newborn lethality in mice. Mol Cell Biol. 27 (8), 3176-3186 (2007).
  19. Hilda, S., et al. Alginate-based 3D cell culture technique to evaluate the half-maximal inhibitory concentration: An in vitro model of anticancer drug study for anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid Res. 14 (1), 10(2021).
  20. Nadine, S. Microstructure analysis of polymer amended fluid fine tailings using Fiji-ImageJ image analysis software. , Carleton University Theses and Dissertations. (2022).
  21. Pablo, T. Quantifications figures 2-6 & supplemental fig. 1 (GraphPad Prism 8.1 files). Figshare. , (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNADNAthroughputDNA

מאמרים קשורים