מאמר שיטה

חקר אינטראקציות בין תאים מיאלואידים ותאי CAR T במבחנה וב-In Vivo

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68013

⸱

25 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 4Division of Hematology, Mayo Clinic, 5Department of Immunology, Mayo Clinic

במאמר זה

סיכום

בהתחשב במודלים המוגבלים של קסנוגרפט הזמינים לחקר אינטראקציות בין CART אנושי לתאים מיאלואידים, הקמנו מודלים במבחנה וב-vivo כדי להבין את ההשפעות של מקרופאגים אנושיים על תאי CART. ניתן להכליל את הממצאים כדי להעריך את תפקידי המקרופאגים במיקרו-סביבת הגידול ולבדוק אימונותרפיות ממוקדות מקרופאגים.

תקציר

טיפול בתאי T של קולטן אנטיגן כימרי (CART) הוביל להצלחות קליניות יוצאות דופן בטיפול בגידולים המטולוגיים. עם זאת, רוב החולים חוזרים תוך 1-2 שנים. זוהו מספר מנגנונים המובילים לעמידות ל-CART, כולל עיכוב תאי T על ידי תאים מיאלואידים מדכאי חיסון. עדויות הולכות וגדלות הראו כי מונוציטים ומקרופאגים במיקרו-סביבת הגידול (TME) תורמים לביצועי CART גרועים ולתוצאות קליניות. מודלים פרה-קליניים לחקר אינטראקציות בין מקרופאגים אנושיים לתאי CART מוגבלים. כאן, אנו דנים בגישות להבנת ההשפעות של מקרופאגים אנושיים על תאי CART הן במבחנה והן במבחנה. אנו מתארים מודלים של קוקולטורה במבחנה כדי להראות כי מקרופאגים מדכאי חיסון מעכבים תפקודי CART. בנוסף, אנו מדווחים על מודל קסנוגרפט שבו מקרופאגים אנושיים ותאי גידול מושתלים תת עורית בעכברי NSG כדי לחקור אינטראקציות מקרופאגים דמויי M2 עם תאי CART ותאי גידול. ניתן להשתמש במודלים אלה כדי להעריך את תפקידי המקרופאגים ב-TME ולבדוק אימונותרפיות ממוקדות מקרופאגים לסרטן.

מבוא

טיפול בתאי T של קולטן אנטיגן כימרי אוטולוגי (CART) השיג הצלחות קליניות בטיפול בגידולים המטולוגיים חוזרים או עמידים, מה שהוביל לאישור ה-FDA האמריקאי לשישה מוצרי CART המכוונים לאנטיגן התבגרות תאי CD19 או B (BCMA)1. למרות הפעילות הראשונית המרשימה של הטיפול בתאי CART, רוב החולים חוזרים במהלך 1-2 השנים הראשונות לאחר הטיפול2. זוהו מספר מנגנונים של עמידות ל-CART, כולל כושר לא אופטימלי של תאי T, בריחת אנטיגן והתמדה לקויה של CART, כמו גם עיכוב המתווך על ידי מיקרו-סביבת הגידול המדכאת את המערכת החיסונית (TME)2,3. תאים מיאלואידים, כגון מונוציטים ומקרופאגים, מהווים לעתים קרובות חלק משמעותי מה-TME והוכחו כמעכבים עיקריים של תאים חיסוניים אחרים, כולל תאי T 4,5. ההשפעות המזיקות של תאים מיאלואידיים בהקשר של יעילות טיפולית של תאי CART דווחו במודלים פרה-קליניים ובניסויים קליניים של גידולים המטולוגיים ומוצקיםכאחד 3,6. עיכוב בתיווך מיאלואיד יכול להתרחש מתחילת תהליך הייצור של CART - הוכח כי מונוציטים בתוצר האפרזיס ההתחלתי מעכבים התרחבות CART ex vivo 7,8. בהתחשב בעדויות המצטברות לעיכוב CART בתיווך מיאלואיד, מחקרים רבים נועדו להנדס תאי CART כדי למקד ולחסל מקרופאגים מדכאי חיסון ב-TME לתגובות חיסוניות טובות יותר5. עם זאת, המנגנונים מאחורי האינטראקציות בין תאי CART למקרופאגים מדכאי חיסון עדיין לא הובהרו במלואם. בנוסף, ישנם מודלים מוגבלים הזמינים לציבור של אינטראקציות אלה. לכן, יש צורך דחוף במודלים החוקרים אינטראקציות בין מקרופאגים אנושיים לתאי CART הן במבחנה והן במודלים של עכברים.

כאן, אנו מתארים שיטה שבה תאי CART אנושיים ממוקדי CD19 (CART19) עוברים תרבית משותפת עם תאי גידול CD19+ ומקרופאגים דמויי M2 מקוטבים ex vivo . בנוסף, אנו מדווחים על מודל עכברי קסנוגרפט שבו עכברים חסרי חיסון מושתלים תת עורית הן בתאי מטרה והן במקרופאגים אנושיים, מה שמאפשר הערכה של אימונותרפיות מעניינות בסביבה עם מקרופאגים מדכאי חיסון. באופן ספציפי, ניתחנו התפשטות ספציפית לאנטיגן CART בנוכחות או היעדר מקרופאגים מדכאי חיסון במבחנה, והראו עיכוב משמעותי בהתרחבות תאי T הן בלוחות טרנסוול והן בתרבית משותפת ישירה. במודל הקסנוגרפט שלנו, עכברי NSG הושתלו תת עורית עם תאי גידול ומקרופאגים אנושיים שהושעו במטריג'ל לבדיקת טיפול. מודל בעלי חיים זה הראה בהצלחה כי מקרופאגים אנושיים מדכאי חיסון מובחנים ex vivo הצליחו לקדם את התקדמות הגידול בעכברי NSG. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, ניתן לבדוק את יעילותם של טיפולים ממוקדי מקרופאגים מדכאי חיסון, כולל תרופות במולקולות קטנות, ביולוגיות וטיפולים אחרים מבוססי תאים. עם זאת, בשל מגבלות השימוש בעכברים חסרי חיסון לחקר ה-TME האנושי, המודלים המוצעים מתאימים ביותר למחקרי הוכחת רעיון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול שלהלן עוקב אחר ההנחיות של מועצת הביקורת המוסדית של מאיו קליניק (IRB), ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית (IBC) והמחלקה לרפואה השוואתית תחת פרוטוקול הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים A00001767.

1. הכנת מונוציטים קלאסיים אנושיים ללימוד חוץ גופי

  1. לבודד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) מתורמי דם בריאים כפי שתואר קודם לכן9. בקצרה, יש לדלל דם מלא עם 2% FBS ב-PBS ביחס נפח של 1:1, ואחריו בידוד PBMC במדיום שיפוע צפיפות.
  2. בודד מונוציטים קלאסיים אנושיים (CD14+CD16-) מ-PBMCs שנקטפו על ידי בחירת חרוזים מגנטיים שליליים בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים). בקצרה, שטפו את המספר המתאים של PBMCs עם מאגר בידוד והשעו מחדש תאים בנפח המצוין בהתאם להוראות היצרן. סמן תאים מלבד מונוציטים קלאסיים עם קוקטייל נוגדנים ומיקרו-חרוזים מגנטיים. אסוף מונוציטים קלאסיים מהזרימה, תוך שמירה על לא-מונוציטים בעמודות.
    הערה: נניח ש-5% מכל ה-PBMCs הם מונוציטים קלאסיים והתאם את מספר התאים ההתחלתי של PBMCs בהתאם. שמור את ה-PBMCs הנותרים לאישור טוהר של אוכלוסיית המונוציטים בשלב 1.7. תמיד יש לבודד מונוציטים קלאסיים מ-PBMCs טריים ללא שימור מוקדם בהקפאה.
  3. ספור את מספר המונוציטים המבודדים באמצעות מונה תאים (טבלת חומרים) וסובב תאים ב-300 x g ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השעו מחדש תאים במאגר בידוד התאים כדי להגיע ל-1 x 106 תאים/מ"ל כריכוז הסופי. קח 100 מיקרוליטר של מתלה תאים והעביר לצלחת שטוחה של 96 בארות.
  4. העבר 1 x 105 PBMCs לאותה צלחת כמו בקרת שער שלילית כדי לאשר את טוהר אוכלוסיית המונוציטים הקלאסית על ידי ציטומטריית זרימה. סובב תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. שמור מונוציטים מבודדים על קרח במהלך שלבים 1.5-1.12.
  5. שטפו על ידי השעיה מחדש של תאים עם 200 מיקרוליטר של מאגר FACS וסובבו תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. שפכו בזהירות סופרנטים.
  6. עבור כל דגימה, הכינו 50 מיקרוליטר של מאגר FACS המכיל 0.3 מיקרוליטר של מגיב חי/מת (עירור ב-405 ננומטר), 0.5 מיקרוליטר של CD1410 מצומד APC אנטי-אנושי (1 ננוגרם/מיקרוליטר), ו-0.5 מיקרוליטר של CD16 11 מצומדPE אנטי-אנושי (1 ננוגרם/מיקרוליטר; טבלת חומרים).
    הערה: כדי לשמור על עקביות הצביעה, הכינו תערובת מאסטר למספר דגימות בהתאם למספר המדגם הכולל. מעבירים 50 מיקרוליטר של תמיסת מכתים לכל באר.
  7. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת מכתים לכל באר וערבב בעדינות תאים כדי למנוע בועות. דגרו תאים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  8. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר FACS לכל באר וסובב תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. שפכו בזהירות סופרנטים.
  9. שטפו על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר FACS לכל באר וסובבו תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. הוציא בזהירות סופרנטנטים והשהה מחדש תאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS. הפעל דגימות על ציטומטר זרימה (טבלאות חומרים).
  10. שער CD14+CD16- אוכלוסייה. ודא שאוכלוסיית CD14+CD16- היא מעל 90% מהתאים החיים לטוהר אידיאלי. שער CD14+CD16 - אוכלוסיית רווקים חיים.
    הערה: ההנחה היא שהמשתמשים מכירים את ניתוח ציטומטריית הזרימה.

2. התמיינות מקרופאגים M0 ממונוציטים קלאסיים אנושיים

הערה: התמיינות מקרופאגים דמויי M2 ממונוציטים קלאסיים אנושיים מותאמת מפרסום קודם12.

  1. סובבו מונוציטים מבודדים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ושאבו סופרנטנטים. השעו מחדש תאים במצע תרבית תאים כדי להגיע לריכוז סופי של 1 x 106 תאים/מ"ל.
  2. הוסיפו GM-CSF רקומביננטי אנושי כדי להגיע לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל (טבלת חומרים) וערבבו היטב. העבירו 100 מיקרוליטר של תאים לצלחת 48 בארות שטופלה בתרבית רקמות והוסיפו 50 מיקרוליטר נוספים של מצע תרבית תאים. ודא שלכל תנאי יש 3 שכפולים עבור הקריאה הסופית ביום 11.
    הערה: משתמשים יכולים להוסיף קבוצות ניסוי נוספות בהתאם. פרוטוקול זה כולל רק תרבויות ניסיוניות של תאי גידול ותאי T עם או בלי מקרופאגים דמויי M2 (טבלה 1).
  3. העבירו 100 מיקרוליטר של תאים לצלחת נוספת של 48 בארות והוסיפו 50 מיקרוליטר נוספים של מצע תרבית תאים לפנוטיפ מקרופאגים. הקפד לכלול באר אחת לפנוטיפ של מקרופאגים M0 ואחת לפנוטיפ של מקרופאגים דמויי M2.
  4. הוסף 200 מיקרוליטר PBS בבארות שמסביב כדי למנוע אידוי תרבית תאים. דגירה על מונוציטים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים כדי להבדיל תאים למקרופאגים M0.
  5. כדי לחקור אינטראקציות בין מקרופאגים מובחנים ותאי CART19 המותאמים לתורם, בודדו 1 x 107 תאי T מה-PBMCs של אותו תורם וצרו תאי CART19 לאחר הליך ייצור CART של 8 ימים כפי שתואר קודם לכן 9,13,14.
    הערה: תאי CART בעלות של תחום איתות CD28 נוצרים מ-5 x 106 תאי T כפי שתואר קודם לכן 9,13,14. במקביל, תאי T לא מתמרים (UTD) נוצרים בעקבות אותו תהליך 9,13,14. תאי T של UTD ישמשו כבקרה שלילית בהתפשטות תאי T כדי לשלוט בשגשוג אלוגני.

3. התמיינות מקרופאגים דמויי M2 ממקרופאגים M0 באמצעות קוקולטורציה עם תאי מטרה

  1. ביום השביעי, קחו את צלחת 48 הבארות עם מקרופאגים M0 ודגרו על קרח למשך 30 דקות לפחות. תאי פיפטה נמרצים כל הזמן תוך שמירה על הצלחת על קרח.
    הערה: אורך הדגירה של הקרח תלוי במידת המקרופאגים הדביקים, שיכולים להיות שונים עקב שונות התורם. הערבוב הראשון הוא איסוף מקרופאגים דבוקים באופן רופף, ולכן פיפטינג של 5 דקות אמור להספיק.
  2. העבירו את התאים המנותקים לצינור חרוטי טרי של 15 מ"ל (טבלת חומרים) מקורר מראש על קרח. הוסף 200 מיקרוליטר של PBS קר כקרח לבארות של צלחת 48 הבארות ופיפטה במרץ את התאים הנותרים כל 10 דקות עד שרוב המקרופאגים מנותקים מהקרקעית. לאחר כל פיפטינג, בדוק תאים במיקרוסקופ והתאם את זמן הדגירה של הקרח לפי הצורך, עם זמני דגירה ארוכים יותר לתאים דבקים יותר.
  3. העבירו את שאר המקרופאגים M0 המנותקים לתוך הצינור החרוטי של 15 מ"ל על קרח. מערבבים תאים בזהירות וסופרים תאים על מונה תאים.
  4. סובבו תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ושאבו סופרנטנטים. השעו מחדש ב-PBS קר כקרח כדי להגיע לריכוז סופי של 1 x 106 תאים/מ"ל.
  5. העבירו 200 מיקרוליטר תאים לצלחת שטוחה של 96 בארות (טבלאות חומרים). סובב תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. שפכו בזהירות סופרנטים. כבקרת שער שלילית, הוסף באר נוספת מוכתמת בסמנים של אוכלוסיית ההורים בלבד.
  6. הוסף 100 מיקרוליטר של חוצץ FACS בתוספת 1 μL של תמיסת חסימת קולטן Fc לכל דגימה. דגרו תאים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. סובב תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. שפכו בזהירות סופרנטים.
    הערה: חשוב לדגור מראש מקרופאגים עם מאגר חוסם קולטן Fc לפני צביעת סמן בפועל כדי למנוע תוצאות חיוביות כוזבות.
  7. עבור באר הדגימה, הכינו 50 מיקרוליטר של מאגר FACS המכיל 0.3 מיקרוליטר של מגיב חי/מת (עירור ב-405 ננומטר), 0.5 מיקרוליטר של CD1410 מצומד APC אנטי-אנושי (1 ננוגרם/מיקרוליטר), 0.5 מיקרוליטר של CD20615 מצומד APC/Cy7 אנטי-אנושי (2 ננוגרם/מיקרוליטר), ו-0.5 מיקרוליטר של CD16316 מצומד PerCP (2 ננוגרם/מיקרוליטר; טבלת חומרים). לבקרת השער השלילי, הכן 50 מיקרוליטר של מאגר FACS המכיל 0.3 מיקרוליטר של מגיב חי/מת ו-0.5 מיקרוליטר של CD14 מצומד APC.
  8. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת מכתים לכל באר וערבב בעדינות תאים כדי למנוע בועות. דגרו תאים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  9. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר FACS לכל באר. סובב תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. שפכו בזהירות סופרנטים.
  10. שטפו על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר FACS. סובב תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. הוציא בזהירות סופרנטנטים והשהה מחדש תאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS.
  11. הפעל דגימות על ציטומטר זרימה ושער את אוכלוסיית התאים CD14+CD206+CD163+ . השתמש בביטוי של CD163 ו-CD206 על מקרופאגים M0 כקו בסיס לפנוטיפים דמויי M2. הגירת אוכלוסייה מ-CD163נמוך, CD206נמוך ל-CD163גבוה או CD206גבוה צפויה במקרופאגים דמויי M2. גודל השינוי באוכלוסייה יכול להיות תלוי בתורם.
  12. הכן את קו תאי הגידול המעניין וסמוך על מונה תאים.
    הערה: פרוטוקול זה משתמש בקו תאי הלימפומה של תאי המעטפת CD19+ שאינו דבק, JeKo-1, כמטרה. ניתן לבדוק קווי תאי גידול אחרים ויכולתם להבדיל בין מקרופאגים דמויי M0 ל-M2 לפי הצורך.
    1. שמור על תאי JeKo-1 עם אמצעי התרבית המוצע על ידי הספק (טבלת חומרים) ב-1 x 106 תאים/מ"ל בבקבוק תרבית רקמה. מערבבים את תאי הגידול בבקבוק וסופרים אותם עם מונה תאים.
  13. סובב תאי מטרה ב-300 x g ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ושאב סופרנטנטים. השעו מחדש תאי מטרה עם אמצעי תרבית תאים כדי להגיע לריכוז סופי של 2 x 106 תאים/מ"ל.
    הערה: הכן את המספר המתאים של תאי גידול על סמך מספר קבוצות הניסוי. ודא שיש 2 x 105 תאי מטרה עבור כל קבוצת קוקולטורה של מקרופאגים דמויי M2, כולל לוחית הפנוטיפ M2.
  14. העבירו 100 מיקרוליטר של תאי גידול לקבוצות קוקולטורציה של מקרופאגים דמויי M2 בצלחת של 48 בארות שהוכנה ביום 0 ופיפטה בעדינות לערבוב. דגרו תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות נוספות.
    הערה: יחס של 2:1 של מקרופאגים JeKo-1: M0 נבדק עבור התמיינות פנוטיפ דמוית M2. ניתן לבדוק יחסים אחרים לפי הצורך.
  15. ביום 8, הניחו צלחת פנוטיפ דמוית M2 על קרח, נתקו תאים במרץ והתכוננו לפנוטיפ כמתואר בשלבים 3.4-3.11.
    הערה: מקרופאגים דמויי M2 נצמדים הרבה יותר ממקרופאגים M0, ולכן צפוי צורך בדגירת קרח ארוכה יותר. פרוטוקול זה משתמש רק בקרח וב-PBS קר כקרח כדי לנתק מקרופאגים כדי למזער את הלחץ על התאים.
  16. שלב את קבצי ציטומטריית הזרימה של פנוטיפ M0 מהיום השביעי עם פנוטיפ דמוי M2. שער CD206 ו-CD163 של אוכלוסיית תאי האב CD14+ של דגימת המקרופאגים M0 והחילו את אותה אסטרטגיית שער על דגימת המקרופאגים דמויי M2 כדי לדמיין את שינוי האוכלוסייה.
  17. כדי להכניס תאי T לקו-תרבויות, קצרו תאי CART19 ו-UTD T ביום 8 שנוצרו בשלב 2.5 והעבירו את התאים לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל. מערבבים היטב עם פיפטה וסופרים עם דלפק תאים.
  18. סובב תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ושאף בזהירות את הסופרנטנטים. השעו מחדש תאי CART או UTD T במדיה של תרבית תאים כדי להגיע לריכוז סופי של 2 x 106 תאים/מ"ל.
  19. הכן את קו תאי הגידול וסמוך על מונה התאים. סובבו את התאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ושאבו את הסופרנטנטים.
  20. השעו מחדש תאי גידול עם מצע תרבית תאים כדי להגיע לריכוז סופי של 2 x 106 תאים/מ"ל. העברת 100 מיקרוליטר של תאי גידול לבארות קוקולטורה ללא מקרופאגים דמויי M2 (טבלה 1).
  21. העבר 100 מיקרוליטר של תאי CART או UTD T לבארות הקוקולטורה המתאימות (טבלה 1). הקוקולטורה הסופית עם מקרופאגים דמויי M2 צריכה לכלול תאי גידול, תאי T ומקרופאגים ביחס של 2:2:1. השתמש בקוקולטורות ללא מקרופאגים כבקרות.
  22. כדי לשמור על הנפח הסופי עקבי בין קבוצות, הוסף עוד 100 מיקרוליטר של מצע תרבית תאים לבארות ללא מקרופאגים. דגירה על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.
    הערה: אם נעשה שימוש בתאי CART אלוגניים, על המשתמשים לכלול תאי UTD T מותאמים לתורם בקוקולציות כבקרה מתאימה כדי לזהות כל התרחבות של תאי T הנגרמת על ידי אלוגניות. במקרה זה, יש להפשיר ולשחזר כראוי תאי CART ו-UTD T שנוצרו בהקפאה, ולאחר מכן לפחות 3-4 שעות של מנוחה לפני הוספה לקו-תרבויות.

4. ניתוח התפשטות ספציפית לאנטיגן של תרבויות משותפות

  1. ביום ה-11, הניחו את צלחת הקוקולטורה על קרח ותאי פיפטה נמרצים. מערבבים היטב תאים ומעבירים תאים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
    הערה: הקריאה העיקרית של הקו-תרבויות היא לכמת את התפשטות תאי T, כך שניתוק מקרופאגים אינו הכרחי אלא אם כן המשתמשים מתכננים לנתח סמנים אחרים על מקרופאגים באותו פאנל גם כן.
  2. הוסף 200 מיקרוליטר PBS קר כקרח לבארות הדגימה ופיפטה במרץ. העבירו את התמיסה שנותרה לאותם צינורות מיקרו-צנטריפוגה.
  3. בדוק בארות מתחת למיקרוסקופ (פי 10) כדי לוודא שתאי ההשעיה נקצרים לחלוטין. סובבו תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ושאבו סופרנטנטים.
  4. השעו מחדש תאים מכל התנאים עם 200 מיקרוליטר של מאגר FACS והעבירו לצלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות. סובב תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. שפכו בזהירות סופרנטים.
  5. הכן 50 מיקרוליטר של מאגר FACS המכיל 0.3 מיקרוליטר של מגיב חי/מת (עירור ב-405 ננומטר) ו-0.5 מיקרוליטר של CD317 מצומד APC אנטי-אנושי (1 ננוגרם/מיקרוליטר; טבלת חומרים) לכל מדגם היטב. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת מכתים לכל באר וערבב בזהירות את התאים עם פיפטה כדי למנוע בועות.
    הערה: בשלב זה, יהיו כדורי תאים גדולים. כדי לוודא שכל תאי ה-T מוכתמים, בדוק את תחתית הצלחת כדי לוודא שלא נותרו כדורי תאים לאחר ערבוב יסודי.
  6. דגרו תאים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר FACS לכל באר. סובב תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. שפכו בזהירות סופרנטים.
  7. שטפו על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר FACS. סובב תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. הוציא בזהירות סופרנטנטים והשהה מחדש תאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS.
  8. הפעל דגימות על ציטומטר זרימה. שער תאי CD3+ וכימת את המספר המוחלט של תאי CD3+ חיים כמפורט להלן:
    figure-protocol-1
  9. גרף את המספר המוחלט של תאי CD3+ בכל תנאי באמצעות GraphPad Prism.
    הערה: תרבויות עם מקרופאגים דמויי M2 צפויות להיות בעלות מספר אבסולוטי נמוך בהרבה של תאי CD3 T מאשר בתנאים בהיעדר מקרופאגים דמויי M2.

5. השפעת מקרופאגים דמויי M2 על תאי CART במערכת טרנסוול

הערה: לוחות Transwell מפרידים פיזית בין מקרופאגים דמויי M2 לתאי CART מגורים ומאפשרים רק למולקולות מסיסות לנוע בין סוגי התאים, מה שמאפשר למשתמשים לחקור דינמיקה של אינטראקציות בלתי תלויות במגע בין מקרופאגים לתאי CART (איור 1).

  1. בודד 1 x 106 מונוציטים קלאסיים אנושיים ואשר את טוהר האוכלוסייה על ידי ציטומטריית זרימה כמתואר בשלבים 1.1-1.10. סובב 1 x 106 מונוציטים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ושאף סופרנטנטים.
    הערה: ייתכן שמשתמשים ירצו ליצור CART אוטולוגי ותאי UTD מותאמים לתורם כמתואר בשלב 2.5.
  2. השעו מחדש תאים במצע תרבית תאים כדי להגיע לריכוז סופי של 1 x 106 תאים/מ"ל. הוסיפו GM-CSF רקומביננטי אנושי כדי להגיע לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל וערבבו היטב.
  3. העבר 200 מיקרוליטר של תאים תלויים לבאר התחתונה של צלחת טרנסוול של 24 בארות (0.4 מיקרומטר) עם 3 שכפולים טכניים. הוסף 100 מיקרוליטר נוספים של אמצעי תרבית תאים לכל באר וודא שתחתית הבאר מכוסה במלואה. הוסף 300 מיקרוליטר של מצע תרבית תאים ל-3 בארות נוספות לתנאים ללא מקרופאגים (בקרה חיובית).
  4. הוסף 200 מיקרוליטר PBS בבארות שמסביב כדי למנוע אידוי תרבית תאים. דגירה של תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.
  5. ביום השביעי, הכינו 1.4 x 106 תאי גידול JeKo-1 והעבירו אותם לצינור חרוטי של 15 מ"ל. סובבו את התאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ושאבו את הסופרנטנטים.
  6. השעו מחדש תאי גידול עם מצע תרבית תאים כדי להגיע לריכוז סופי של 2 x 106 תאים/מ"ל. הוסף 200 מיקרוליטר של תאי גידול לבארות התחתונות של כל תנאי הדגימה וערבב היטב. דגרו תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות נוספות. השתמש בבארות תחתונות עם JeKo-1 בלבד כבקרה חיובית.
  7. ביום 8, יום הקציר 8 תאי CART ו-UTD T נוצרו בשלב 5.1. ולהשעות תאי T במצע תרבית תאים כדי להגיע לריכוז סופי של 1 x 106 תאים/מ"ל.
    הערה: אם נעשה שימוש בתאי CART אלוגניים, על המשתמשים לכלול תאי UTD T מותאמים לתורם בקוקולרביות כמתואר בשלב 3.22.
  8. ספרו והכינו 1.4 x 106 תאי JeKo-1. העבירו תאי גידול לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וסובבו תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  9. שאפו סופרנטנטים והשעו מחדש תאים במצע תרבית תאים כדי להגיע לריכוז סופי של 1 x 106 תאים/מ"ל. העבר 100 מיקרוליטר של תאי T מוכנים ו-100 מיקרוליטר של תאי גידול לכל באר עליונה לכל תנאי הדגימה.
  10. מערבבים היטב תאים בבאר העליונה ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.
  11. ביום ה-11, מערבבים תאים בתא העליון ומעבירים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. שטפו בארות עליונות עם 200 מיקרוליטר PBS והעבירו את התאים הנותרים לצינורות המיקרו-צנטריפוגה.
  12. סובבו תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ושאבו סופרנטנטים. בצע בדיקת התפשטות תאי T כמתואר בשלבים 4.4-4.9.
    הערה: מקרופאגים דמויי M2 מקוטבים של JeKo-1 יכולים לדכא התפשטות תאי T ספציפיים לאנטיגן באופן שאינו תלוי במגע. ניתן לבדוק מודלים אחרים של גידולים לפי הצורך.

6. הקמת מודל קסנוגרפט עם מקרופאגים אנושיים וגידול בעכברי NSG

  1. בודד 1 x 107 מונוציטים קלאסיים אנושיים ואשר טוהר על ידי ציטומטריית זרימה כמתואר בשלבים 1.1-1.10. השתמש בעכברי NSG שהושתלו ב-JeKo-1 בלבד כבקרה כדי לאשר השפעות פרו-גידוליות של מקרופאגים דמויי M2, כפי שמוצג באיור 2.
    הערה: פרוטוקול זה משתיל עכברי NSG עם 5 x 105 מקרופאגים אנושיים תת עורית. התאוששות המקרופאגים לאחר ניתוק ביום 7 היא כ-50%. משתמשים יכולים להתאים את מספרי התאים בהתאם ולהקפיד להכין תאים נוספים.
  2. סובבו מונוציטים מבודדים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ושאבו סופרנטנטים. השעו מחדש תאים במצע תרבית תאים כדי להגיע לריכוז סופי של 1 x 106 תאים/מ"ל.
  3. הוסיפו GM-CSF רקומביננטי אנושי כדי להגיע לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל וערבבו היטב. העבירו מונוציטים לבקבוק תרבית רקמה T25 ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.
  4. ביום השביעי, יש להניח במרץ תאי פיפטה על קרח כל 10 דקות ולבדוק תאים תחת מיקרוסקופ עד שרוב המקרופאגים מנותקים. העבירו תאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל על קרח, שטפו את הבקבוק עם PBS קר כקרח כדי לשחרר את התאים הנותרים, ושלבו את התאים בצינור החרוטי.
  5. ספור תאים במונה התאים. סובבו תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ושאבו סופרנטנטים.
  6. שטפו והשעו תאים עם 5 מ"ל PBS קר כקרח. סובבו תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ושאבו סופרנטנטים.
  7. השעו מחדש תאים ב-PBS קר כקרח כדי להגיע לריכוז סופי של 2 x 107 תאים/מ"ל. העבירו את תמיסת התא לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ושמרו אותה על קרח.
  8. הכן 1.5 x 107 תאי לוציפראז + JeKo-1 והעביר תאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    הערה: בשל המספר הנמוך של תאים מוזרקים, הדמיית ביולומינסנציה (BLI) נחוצה לניטור עומס הגידול. ניתן להגדיל את מספר המקרופאגים ותאי הגידול לזריקות תת עוריות לפי הצורך. אם הגידולים נראים ונגישים באמצעות קליפר לאחר ההזרקה, ניתן להשתמש בתאי גידול מסוג פרא במקום.
  9. סובבו תאים בטמפרטורה של 300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ושאבו סופרנטנטים. השעו מחדש תאים ב-PBS קר כקרח כדי להגיע לריכוז סופי של 4 x 107/mL.
  10. העבירו את אותו נפח של מקרופאגים ותאי גידול לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה טרי אחר של 1.5 מ"ל וערבבו היטב. הוסף את אותו נפח של מטריצת קרום הבסיס המסיס לתמיסת התאים המעורבים וערבב היטב על קרח.
    הערה: יש להפשיר את מטריצת קרום המרתף על קרח למשך הלילה כדי למנוע התמצקות. בשלב זה, לכל 100 מיקרוליטר של תמיסת תאים יש 5 x 105 מקרופאגים ו-1 x 106 JeKo-1 תלויים במטריצת ממברנת הבסיס, המשתמשת באותו יחס מספר תאים המשמש בפרוטוקול התמיינות מקרופאגים דמוי M2 במבחנה .
  11. כבקרה, העבירו את תאי JeKo-1 המוכנים הנותרים עם אותו נפח של PBS קר כקרח לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה טרי של 1.5 מ"ל, הוסיפו את אותו נפח של מטריצת קרום הבסיס לתמיסת התא וערבבו היטב על קרח.
  12. הכן 10 עכברים נקבות וזכרים בני 6-8 שבועות NOD-SCID-γ-/- (NSG) (~20 גרם) להרדמה באינהלציה עם 2.5% איזופלורן. הציגו הרדמה איזופלורן באמצעות מכשיר הרדמה משאף למכרסמים. האיזופלורן המאודה מועבר לתא ולבמה מחוממת עם קונוסים באף.
  13. הכניסו עכברים לתא ההרדמה למשך 1-2 דקות. העבירו עכברים לקונוסים של האף על הבמה המחוממת לאחר אובדן היציבה והרפלקסים הימניים18. שמור עכברים על שלב החימום לאורך כל ההליך. מרחו משחת עיניים על שתי עיני העכברים כדי למנוע נזק לקרנית עקב אובדן רפלקס המצמוץ במהלך ההרדמה.
  14. גלח בזהירות את הצד הימני של כל עכבר כדי לחשוף את העור לאחר הרדמת העכברים. טען מזרק של 0.5 מ"ל עם 100 מיקרוליטר של תערובת תאי מקרופאג JeKo-1 והסר בזהירות בועות בתמיסה.
  15. הרם בזהירות את העור החשוף ביד והכנס את המחט לאזור המורם. המשך להרים את העור עם המחט ולחץ על אצבע אחת במקום ההזרקה. נסה לא להזיז את המחט לאחר החדרתה כדי למנוע דקירות מקריות ודליפת תאים.
  16. שחרר לאט את התאים לשכבה התת עורית והסר בזהירות את המחט. חזור על הזריקות התת עוריות עבור כל 10 עכברי NSG, כאשר 5 עכברים קיבלו גם JeKo-1 וגם מקרופאגים ו-5 עכברים קיבלו JeKo-1 בלבד.
  17. להכין D-לוציפרין (טבלת חומרים) בריכוז של 15 מ"ג/מ"ל. טען מזרק של 0.5 מ"ל עם 200 מיקרוליטר של D-luciferin והזריק לכל עכבר תוך צפק.
  18. הניחו עכברים מורדמים על הבמה ל-BLI 10 דקות לאחר הזרקת D-לוציפרין. בצע BLI עבור כל עכבר ורשום כעומס גידול בסיסי (יום 0). החזירו את העכברים לכלובים שלהם.
    הערה: על המשתמשים לוודא שהעכברים המורדמים לא יישארו ללא השגחה עד שיחזרו להכרה כדי לשמור על שכיבה חזה לאחר הליך ההדמיה.
  19. עקוב אחר עומס הגידול על ידי BLI פעמיים בשבוע עד להגעה לנקודות קצה ניסיוניות או אנושיות. נקודת הסיום הכוללת של ההישרדות מושגת ברגע שנפח הגידול הוא 2000מ"מ 3 ומעלה, מחושב לפי הנוסחה שלהלן:
    figure-protocol-2
    הערה: ניתן להתאים את משך ניטור הגידול על סמך מטרת הניסויים והקריאות הרצויות. בשל גודל גידול קטן במיוחד ב-2-3 השבועות הראשונים, BLI מומלץ להתוויית עומס גידול. ברגע שהגידולים נראים ונגישים באמצעות קליפר, מומלץ לבצע מדידות BLI וקליפר לניתוח מדויק של הגידול.
  20. לחקור אינטראקציות בין מקרופאגים אנושיים מושתלים ותאי CART19 אוטולוגיים בעכברי NSG, ליצור ולהשתיל מקרופאגים אנושיים מובחנים ex vivo כמתואר בשלבים 6.1-6.16. יש לבודד תאי T אוטולוגיים מאותו תורם דם בשלב 6.1 לאחר פרוטוקול ייצור CART בן 8 ימים כפי שתואר קודם לכן 9,13,14.
    הערה: כל עכבר NSG מטופל ב-2 x 106 תאי CART19. על המשתמשים לייצר לפחות 2 x 107 תאי CART כדי לטפל ב-10 עכברים. תאי CART נשמרים בהקפאה ביום 8 ומאוחסנים עד להשתלת JeKo-1/מקרופאגים בעכברים, 5 ימים לאחר הזרקות תת עוריות.
  21. לאחר 5 ימים של זריקות גידול/מקרופאגים, יש לחלק עכברים באופן אקראי על סמך BLI כמתואר בשלבים 6.17-6.18. הפשירו והכינו תאי CART כמתואר בשלב 3.22. שטפו תאי CART עם PBS וסובבו תאים ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  22. השעו מחדש תאי CART ב-PBS כדי להגיע לריכוז סופי של 2 x 107 תאים/מ"ל. טען מזרק של 0.5 מ"ל עם 100 מיקרוליטר של תאי CART מוכנים והזריק לכל עכבר מושתל בגידול תוך ורידי דרך וריד הזנב.
  23. עקוב אחר עומס הגידול על ידי BLI פעם בשבוע למשך 4 שבועות.
    הערה: בשל התפקודים המדכאים את מערכת החיסון של מקרופאגים אנושיים מושתלים, צפויות פגיעה בפעילות האנטי-גידולית של CART ועומס גידול גבוה יותר בעכברים שהוזרקו עם JeKo-1/מקרופאגים.

7. אישור פנוטיפ דמוי M2 במקרופאגים אנושיים מושתלים על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית

  1. כדי לאשר פנוטיפ דמוי M2 המושרה על ידי JeKo-1 במקרופאגים אנושיים מושתלים המתוארים בשלב 6 על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית, בצע את שלבים 6.1-6.19 והגדל את מספר המקרופאגים המוזרקים ולוציפראז + JeKo-1 ל-5 x 106 תאים ו-1 x 107 תאים לכל עכבר NSG, בהתאמה.
    הערה: על המשתמשים לוודא שנפח ההזרקה הסופי עבור כל עכבר הוא 100 מיקרוליטר.
  2. ביום 7, המתת חסד של עכברי NSG על ידי CO2, בצע פריקת צוואר הרחם ואשר אובדן רפלקסים בקרנית כפי שתואר קודם לכן19. הניחו עכברים על שולחן העבודה כשהגידולים פונים כלפי מעלה. רססו 70% אתנול על אתרי הגידול וקצרו בזהירות גידולים מושתלים בעזרת מספריים ומלקחיים.
  3. להעביר רקמות גידול לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל מלאים ב-20-30 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד לקיבוע כפי שתואר קודם לכן20. שימור בהקפאה והקפאה של רקמות גידול לצביעה אימונופלואורסצנטית על פי פרוטוקול20 שפורסם בעבר.
  4. רקמת גידול כתמים עם נוגדן CD206 אנטי-אנושי לעכבר מצומד עם AF546 (1:50) ונוגדני iNOS אנטי-אנושיים לארנב מצומדים עם AF647 (1:100) מדולל במאגר צביעה אימונופלואורסצנטי, ואחריו צביעת גרעין ושימור כפי שתואר קודם לכן21.
    הערה: לקבלת תוצאות צביעה מיטביות, על המשתמשים לבצע טיטרציה של נוגדנים בהתאם, במיוחד כאשר נעשה שימוש בקווי תאי גידול שונים.
  5. רכוש תמונות אימונופלואורסצנטיות עם מיקרוסקופיה קונפוקלית ב-40x. כדי לאשר שמקרופאגים אנושיים מושתלים מפתחים פנוטיפ דמוי M2, צפו לראות ביטוי של CD206 אנושי וביטוי מינימלי של iNOS אנושי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מטרת פרוטוקול זה היא לבסס מודלים במבחנה וב-vivo לחקר אינטראקציות בין מקרופאגים מדכאי חיסון אנושיים ותאי CART בשל האופי והדינמיקה המורכבים של האינטראקציות והמודלים המוגבלים הקיימים של קסנוגרפטים. בעקבות הפרוטוקול, מונוציטים קלאסיים אנושיים מבודדים מובחנים כדי לרכוש פנוטיפים דמויי M2 ולהפוך למדכאי חיסון תפקודית.

כדי לאשר את הטוהר של מונוציטים קלאסיים אנושיים מבודדים, הפעל דגימות מוכתמות על ציטומטר זרימה ונתח על ידי שער על אוכלוסיית CD14+CD16- אנושית (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טיפול בתאי CART הראה הצלחות קליניות רבות בטיפול בתת-קבוצות של חולים עם ממאירויות המטולוגיות, אך רוב החולים חוזרים תוך 1-2 שנים לאחר עירוי CART 1,2. זוהו מנגנוני עמידות פוטנציאליים שונים ל-CART, ותאים מיאלואידים מדכאי חיסון נמצאו כממלאים תפקיד חשוב בדיכוי חיסוני TME ובכישלון CART שלאחר מכן 3,4,5,6,7,8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

SSK היא ממציאה של פטנטים בתחום האימונותרפיה CAR המורשים לנוברטיס (באמצעות הסכם בין Mayo Clinic, אוניברסיטת פנסילבניה ונוברטיס), MustangBio (באמצעות Mayo Clinic) ו-Sendero (באמצעות Mayo Clinic). RLS ו-SSK הם ממציאים על פטנטים בתחום האימונותרפיה CAR המורשים ל-Humanigen (באמצעות Mayo Clinic). KY, RLS, TH, BK, ES ו-SSK הם ממציאים על פטנטים בתחום אימונותרפיה CAR המורשים ל-Immix. SSK מקבלת מימון מחקר מ-Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc., Incyte ו-Lentigen. SSK השתתפה בפגישות ייעוץ עם Kite/Gilead, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio ו-Novartis. SSK כיהנה במועצת בטיחות וניטור הנתונים עם Humanigen ו-Carisma. SSK שימשה כיועצת ל-Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, Carisma ו-Humanigen.

תודות

מחקר זה מומן בחלקו באמצעות מרכז הסרטן המקיף של מאיו קליניק (SSK), מרכז מאיו קליניק לרפואה אינדיבידואלית (SSK), מרכז מאיו קליניק לטיפולים ביולוגיים רגנרטיביים (SSK), מענק המכונים הלאומיים לבריאות R37CA266344-01 (SSK) ומענק משרד ההגנה CA201127 (SSK).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק 0.5 מ"לפישר סיינטיפיק329461
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לאפנדורף1415-2508 
צינור חרוטי 15 מ"לקורנינג מדעי החיים352097
צלחת טרנסוול 24 בארות (0.4 μ m)קורנינג מדעי החיים3397
צינור חרוטי 50 מ"לקורנינג מדעי החיים352098
CD206 מצומד APC/Cy7 אנטי-אנושיביולג'נד321119נוגדן זרימה
CD14 אנטי-אנושי מצומד APCביולג'נד325607נוגדן זרימה
CD3 אנטי-אנושי מצומד APCביולג'נד344811נוגדן זרימה
פתרון שטיפה autoMACSמילטני ביוטק130-091-222מאגר בידוד מונוציטים קלאסיים 
מטריצת קרום מרתףקורנינג מדעי החייםCLS356237מטריצת קרום מרתף מסיס
מדיה לתרבית תאים10% סרום AB אנושי 1% פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין במדיום תאים המטופויאטיים ללא סרום X-VIVO 15
ערכת בידוד מונוציטים קלאסית, אנושיתמילטני ביוטק130-117-337
מערכת CytoFLEX  B5-R3-V5בקמן קולטרC04652ציטומטר זרימה
די-לוציפריןגולד ביוטכנולוגיהמזל -1G
D-PBS (תמיסת מלח עם חוצץ פוספט של Dulbecco)ג'יבקו14190250 
משחת עינייםתרמו-פישר19-090-832
מאגר FACS2% FBS 1% נתרן אזיד ב-PBS
סרום בקר עובריקורנינג מדעי החיים35-011-CV
צלחת שטוחה עם 96 בארותקורנינג מדעי החייםCLS3997
סרום AB אנושי מנוטרל בחום מחקר חדשני4931
TruStain FcX אנושי (תמיסה לחסימת קולטן Fc)ביולג'נד422301
נוזל איזופלורן   פיראמל פארמה בע"מ66794-017-10
מערכת הדמיה IVIS Spectrum In Vivoפרקין אלמר124262
מדיית תרבית קו תאים JeKo-110% FBS 1% פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין במדיום RPMI-1640
ערכת כתמי תאים מתים חיים/מתים, לעירור של 405 ננומטרInvitrogenL34966
עמודת LSמילטני ביוטק130-042-401בחירת חרוזים שליליים
לימפופרפטכנולוגיות תאי גזע07811מדיום שיפוע צפיפות
פתרון מלאי MACS BSAמילטני ביוטק130-091-376מאגר בידוד מונוציטים קלאסיים 
נוגדן CD206 אנטי-אנושי לעכבר מצומד עם AF546 סנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-376232
הנהון. Cg-Prkdcscid  עכברי Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)מעבדת ג'קסון 5557
CD16 מצומד PE אנטי-אנושיביולג'נד302007נוגדן זרימה
פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (פי 100), נוזלג'יבקו10378-016
CD163 אנטי-אנושי מצומד PerCPביולג'נד333625נוגדן זרימה
נוגדן iNOS אנטי-אנושי לארנב מצומד ל-AF647 פרוטאינטקCL647-18985
GM-CSF אנושי רקומביננטיטכנולוגיות תאי גזע78015
RPMI-1640 בינוניג'יבקו11875093
SepMate-50 IVDטכנולוגיות תאי גזע85450בידוד PBMC על ידי צנטריפיגציה של שיפוע צפיפות 
נתרן אזיד, 5% (w/v)ריקה כימיקל7144.8-16
צלחת 48 בארות שטופלה בתרבית רקמותקורנינג מדעי החיים3548
מנתח כדאיות תא XR של Vi-cellבקמן קולטרמונה תאים
X-VIVO 15 מדיום תאים המטופויאטיים ללא סרוםלונזה04-418 ש

מקורות

  1. Yun, K., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Who wins the combat, CAR or TCR. Leukemia. 37 (10), 1953-1962 (2023).
  2. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. New England J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  3. Shah, N. N., Fry, T. J. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 16 (6), 372-385 (2019).
  4. Kiss, M., Caro, A. A., Raes, G., Laoui, D. Systemic Reprogramming of Monocytes in Cancer. Fronti Oncol. 10, (2020).
  5. Rodriguez-Garcia, A., et al. cell-mediated depletion of immunosuppressive tumor-associated macrophages promotes endogenous antitumor immunity and augments adoptive immunotherapy. Nat Commun. 12 (1), (2021).
  6. Kankeu Fonkoua, L. A., Sirpilla, O., Sakemura, R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. CAR T cell therapy and the tumor microenvironment: Current challenges and opportunities. Mol Ther Oncolyt. 25, 69-77 (2022).
  7. Stroncek, D. F., et al. Elutriated lymphocytes for manufacturing chimeric antigen receptor T cells. J Trans Med. 15 (1), (2017).
  8. Stroncek, D. F., et al. Myeloid cells in peripheral blood mononuclear cell concentrates inhibit the expansion of chimeric antigen receptor T cells. Cytotherapy. 18 (7), 893-901 (2016).
  9. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells. J Vis Exp. (149), e59629(2019).
  10. Ali, L. R., et al. PD-1 blockade and CDK4/6 inhibition augment nonoverlapping features of T cell activation in cancer. J Exp Med. 220 (4), e20220729(2023).
  11. Wang, T., et al. Proteomic and Metabolomic Characterization of SARS-CoV-2-Infected Cynomolgus Macaque at Early Stage. Front Immunol. 13, 954121(2022).
  12. Ruella, M., et al. Overcoming the immunosuppressive tumor microenvironment of Hodgkin lymphoma using chimeric antigen receptor T cells. Cancer Dis. 7 (10), 1154-1167 (2017).
  13. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunol Res. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Smith, A., et al. A Novel Three-Dimensional Skin Disease Model to Assess Macrophage Function in Diabetes. Tissue Eng Meth. 27 (2), 49-58 (2021).
  16. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  17. Ajith, A., et al. Humanized Mouse Model as a Novel Approach in the Assessment of Human Allogeneic Responses in Organ Transplantation. Front Immunol. 12, 687715(2021).
  18. Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Exp Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
  19. Hickman, D. L. Minimal Exposure Times for Irreversible Euthanasia with Carbon Dioxide in Mice and Rats. J Am Assoc Lab Animal Sci. 61 (3), 283-286 (2022).
  20. Zhou, R., Mei, L. Neural Development: Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2013).
  21. Gutierrez-Ruiz, O. L., et al. Ectopic expression of DOCK8 regulates lysosome-mediated pancreatic tumor cell invasion. Cell Rep. 42 (9), 113042(2023).
  22. Kirkiles-Smith, N. C., et al. Development of a Humanized Mouse Model to Study the Role of Macrophages in Allograft Injury. Transplantation. 87 (2), 189-197 (2009).
  23. Chuprin, J., et al. Humanized mouse models for immuno-oncology research. Nat Rev Clin Oncol. 20 (3), 192-206 (2023).
  24. Yun, K., et al. Intrinsic immunosuppressive features of monocytes suppress CAR-T19 through IL-1 pathway modulation in mantle cell lymphoma. Mol Ther Oncol. 33 (2), 200985(2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In VitroIn Vivo

מאמרים קשורים