מאמר שיטה

מודל האי החדש למחקר תלת-ממדי של אינטראקציות בין אנדותל לתאי β: רלוונטיות לסקר סוכנים מגנים ציטו

DOI:

10.3791/68220

⸱

17 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Regenerative Nanomedicine (RNM), UMR 1260, INSERM (French National Institute of Health and Medical Research), University of Strasbourg, 2Department of Emergency, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Research Center, CHU de Québec -Laval University, 4Department of Microbiology-Infectiology and Immunology, Faculty of Medicine, Laval University, 5Department of Diabetes and Nutrition Endocrinology, University Hospital of Strasbourg, 6Faculty of Medicine, University of Strasbourg, 7Faculty of Pharmacy, University of Strasbourg

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק הליך מפורט ליצירת ספרואידים יציבים של איי לבלב עכברים, ושיטות מפורטות לצביעה, ניקוי והרכבה תלת-ממדית, המותאמות לגודלם הקטן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט שיטה אופטימלית לייצור ספרואידים קטנים ויציבים, התרבית שלהם והדמיה תלת-ממדית, לחקר האינטראקציות בין תאי β המייצרים אנדותל ואינסולין במודל תלת-ממדי של איי לבלב. הספרואידים בגודל 150-200 מיקרון, המשקפים את טווח גודל האיים הנמוך ביותר, הוכנו מתוך יחס נבחר ששילב תא אנדותל אחד בתוך האי (תאי MS-1) ל-20 תאים מפרישי אינסולין (β-TC-6). אתגרי צביעה, ניקוי והרכבה של ספרואידים קטנים והתמודדותם באמצעות שימוש באגרוז בנקודת התכה נמוכה וטכניקת ניקוי CUBIC מפורטים, וכן נקודות מפתח לניתוח יעיל של המבנה התלת-ממדי עם גשושים שונים. הנתונים מצביעים על כך ש-NTPDASE-אקטונוקלאוטידאז 3 אינו מתחבר לאינסולין במודל הספרואיד, מה שמרמז על בגרות ורמות תפקוד משתנות של β-TC6, וכי ההליך המלא יכול להיות מיושם גם באיים מבודדים בלבלב, עם בדיקה ברורה של כלי הדם התוך-איים. ממצאים אלו מדגישים את יעילות פרוטוקול ההדמיה התלת-ממדית בחשיפת ארגון מורכב של תאי הלבלב והאינטראקציות בתוך מודל האי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתלת איים בלבלב מסובכת לעיתים קרובות על ידי תגובה דלקתית מיידית בתיווך דם (IBMIR), אשר פוגעת משמעותית בתאי האנדותל התוך-איים (IEC) ומשפיעה על פרפוזיית השתל ותפקודה. בטווח הארוך, מסה מופחתת של איים תפקודיים ואובדן עצמאות לאינסולין מתוארים אצל מטופלים, 4 שנים לאחר ההשתלה1. בעוד שפותחו מודלים של השתלת איים על עכברים או חולדות, מודלים סטנדרטיים לחקר מטרות פרמקולוגיות להכנה מוקדמת של איים קטנים, בעלי חשיבות מיוחדת בהקשר של נזק לשתל מונע ציטוקין שנגרם על ידי IBMIR, חסרים2. אכן, מבנה ספרואידי מתאים במיוחד לזיהוי מטרות פרמקולוגיות חדשות ולהערכת מולקולות ציטופרופטן נגד תפקוד לקוי של תאים הנגרמות על ידי ציטוקין. יתרה מזאת, היא מציעה גישה חלופית להגבלת השימוש במודלים בעלי חיים של סוכרת סוג 1 והשתלת איים.

מציאת צביעות מתאימות, ניקוי אופטי ותנאי הרכבה לספרואידים קטנים בטווח גודל האי נשאר מאתגר. בספרות, מעט מאוד מחקרים מתארים את הטיפול בספירואידים קטנים ואת המאפיינים המבניים המרכזיים שלהם. הקושי נובע גם מהצורך לאזן בין חדירת רקמות, שימור אותות ושלמות מבנית, תוך שמירה על אופיים העדין של מבני התאים התלת-ממדיים המיניאטוריים הללו. בנוסף, שיטות צביעה קונבנציונליות לעיתים קרובות מתקשות להשיג תיוג אחיד של ספרואידים. בעיה זו מחמירה בשל הארגון התאים הצפוף, שעלול לעכב את הפצת תגובות בשל חדירה מוגבלת של נוגדנים וצבעים 3,4. לבסוף, תהליך הניקוי האופטי, החיוני להפחתת רקע פיזור האור ולשיפור עומק הדימות, חייב להיות מאופטם בקפידה כדי למנוע הפרעה למבנה הספרואיד או לשנות תכונות ביולוגיות5.

הרכבת ספרואידים קטנים למיקרוסקופיה תלת-ממדית מציבה אתגר נוסף. מדיות הרכבה מסורתיות עלולות שלא לספק תמיכה מספקת למבנים העדינים הללו, מה שעלול להוביל לעיוותם או לקריסתם במהלך ההדמיה. יתרה מזאת, יש לשלוט במדויק בהתאמת מקדם השבירה הנדרשת לאיכות הדמיה אופטימלית כדי להבטיח ויזואליזציה מדויקת לאורך כל עומק הספרואיד 6,7. פיתוח פרוטוקולים המותאמים לספרואידים קטנים מסתבך עוד יותר בשל המגוון הרחב של סוגי התאים והתנאים הניסיוניים המשמשים בתרביות ספרואידים3. לבסוף, הצורך בגישות מיוחדות לשמירה על שלמות אוכלוסיות תאים מרובות לאורך תהליכי הצביעה והניקוי הוא קריטי להערכת תגובות התאים.

כדי להתמודד עם האתגרים הספציפיים של מחקר לחץ באיים המתווכים על ידי IBMIR, תוכנן מודל ספרואידי של 2000 תאים, המשלב תאי β מהפריש IEC בככוס ותאי אינסולין, עם יחס של 1:20 בין תאי IEC ל-β תאי דומה לזה שנצפה באי לבלב. בנוסף, ניסויים קודמים הראו שהמבנה שומר על כדאיות למשך 96 שעות, ובכך מספק מודל תלת-ממדי פיזיולוגי רלוונטי לתצפית על תגובות תא קצרות (טווח שעות) או ארוך יותר (ימים) ומודולציה פרמקולוגית שלהן. המודל הספירואידי מורכב מתאי אנדותל בתוך האי של כב MS-1, מאפייני מיקרווסקולטורה באי, ותאי β המפרישים אינסולין β-TC-68. הוא תוכנן לחקות מקרוב את טווח הממדים הקטן ביותר של איי הלבלב (בקוטר 50-200 מיקרון) ואת מספר התאים הממוצעשלהם 9.

מדווח על שיטת קציר וצביעה חדשנית המותאמת במיוחד לטיפול בכדורים קטנים (בקוטר 150-200 מיקרון), המאפשרת חדירה מיטבית של צבעים פלואורסצנטיים ונוגדנים בכל מבנה הספירואיד והרקע המינימלי. הפרוטוקול כולל הליך התקנה המשתמש באגרוז בנקודת התכה נמוכה (LMPA) כדי לספק תמיכה מבנית עדינה לספירואידים עדינים תוך מתן התאמה מיטבית למקדם השבירה. LMPA היא צורה מותאמת של אגרוז עם ג'לינג מופחת (כ-27 מעלות צלזיוס) וטמפרטורת התכה (כ-65 מעלות צלזיוס) השומרת על שלמות הדגימה במהלך ההטמעה, ויוצרת מטריצה אופטית שקופה עם אוטופלואורסצנציה מינימלית 4,6. לבסוף, שיטת CUBIC)10 של הדמיית מוח/גוף שקופה וללא הפרעה משמשת לניקוי אופטי כדי לאפשר ויזואליזציה מקסימלית של מבנים פנימיים ושימור שלמות האינטראקציות העדינות בין תא 5,6,10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש ברקמת הלבלב האנושית וכל הפרוטוקולים הניסיוניים אושר על ידי משרד ההשכלה הגבוהה והמחקר של ממשלת צרפת (המנהל הכללי למחקר וחדשנות, יחידת ביואתיקה) ונרשם תחת מספר DC-2019-3439. הסכמה מדעת התקבלה מהאפוטרופוסים המשפטיים של כל הנבדקים.

1. הכנת ספרואיד

הערה: קו העכברים IEC MS-1 וקו התאים β-לבלב העכברים β-TC6 גודלו בו-זמנית כדי לקבל כמות תאים מספקת לתרבות ספרואיד. MS-1 גודלו בבקבוקים של תאי דבק T75 במדיום DMEM גבוה גלוקוז המכיל 4.5 גרם לליטר גלוקוז, עם 5% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין באטמוספירה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. המעברים בוצעו בנקודת מפגש (תרבית של יומיים) לאחר הניתוק באמצעות טריפסין EDTA פעם אחת ושלוש שטיפות בתמיסת האנק מאוזנת (HBSS). β-TC6 גודלו ב-T75 עבור תאים דבקים קשים במדיום DMEM גבוה גלוקוז המכיל 4.5 גרם לליטר גלוקוז, עם 15% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין באטמוספירה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. המעברים בוצעו במפגש β-TC6 (תרבית של 10 ימים) לאחר ניתוק באמצעות Trypsin EDTA 1x ו-3 שטיפות בתמיסת Hank Balanced (HBSS).

  1. הכינו את צלחת תרבות הספרואיד
  2. שטוף את הפלטה עם 500 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה נגד היצמדות שסופקה על ידי היצרן כדי למנוע הידבקות תאים ולקדם היווצרות ספרואידים.
  3. צנטריפוגה את הלוח בעוצמה של 1,300 x g למשך 5 דקות ברוטור דלי מתנדנד עם מחזיקי לוחות בטמפרטורת החדר.
  4. התבונן בצלחת תחת מיקרוסקופ קל כדי לוודא שלא יישארו בועות במיקרובארות. אם כן, יש צנטריפוגה פעם שנייה ב-1,300 x g למשך 5 דקות.
  5. השליכו שטיפה נגד היצמדות ושטפו את הבאר 3 פעמים עם 1 מ"ל HBSS חם.
  6. השליכו את HBSS והחליפו ב-500 מיקרוליטר של מדיום ספרואידי חם: DMEM עם רמת סוכר גבוהה המכילה 4.5 גרם לליטר גלוקוז, 10% סרום בקר עוברי, ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
  7. שמור על הלוח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה בזמן הכנת המתלה הספרואידי.
  8. דגרו את MS-1 ו-β-TC6 בו-זמנית עם תמיסת טריפסין וספירו את התאים החיים בכל שושלת.
    הערה: בעת הזריעה, הספרואידים נוצרים באמצעות יחס תאים של 1 IEC ל-20 β האופייני לאיי הלבלב. השתמשו בלוח תרבית ספרואידים של 24 בארות, כאשר כל באר מכילה 300 מיקרובארות שיכולות להכיל ספרואיד אחד המורכב מ-2000 תאים, לסך הכל 600,000 תאים בכל באר. במחקר הנוכחי, המדידות חשפו נפחי ספרואיד זהים שתפוסים קווי התאים β-TC6 ו-MS1 שנבחרו לאחר תרבית הספרואיד של 48 שעות.
  9. מערבבים את שני קווי התאים יחד כדי להתאים ליחס של 1 ל-20 עבור 24 בארות ואז תלויים אותן ב-24 מ"ל של מדיום ספרואיד.
    הערה: השתמש בפיפטה של 10 מ"ל או 25 מ"ל בתנועת יניקה וזרימה כדי להומוגן את המתלה.
  10. פיפט של 1 מ"ל לכל באר והמשך בתנועת יניבה-זרימה כדי לפזר את תליית התא באופן שווה בבאר.
  11. צנטריפוגה את הפלטה בעוצמה של 130 x g למשך 5 דקות ברוטור דלי מתנדנד עם מחזיקי לוחות בטמפרטורת החדר.
  12. התבונן בצלחת תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים מפוזרים באופן שווה בין המיקרובארות.
    הערה: במהלך שלב הצנטריפוגציה הזה, השתמש בקצבי תאוצה והאטה גבוהים (70%-90% מסולמות ההאצה וההאטה), אחרת גושי התאים יזוז לצד המיקרובאר.
  13. דגור את הפלטה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2.
  14. עוקבים אחרי היווצרות וצמיחה של ספרואידים באמצעות מיקרוסקופ אור.
    הערה: ספרואידים β-TC6 / MS-1 אמורים להתחיל להיווצר לאחר 24 שעות של תרבות, ולקבל צורת כדור לאחר 48 שעות. ניתן לעקוב אחר הקיימות באמצעות טריפן בלו לאחר הפרעה ספרואידי על ידי טריפסין בדגימות כפולות, ונשמרה במשך 96 שעות (80%-90%).

2. קטיף וצביעה של ספרואידים

  1. החזירו את הספרואידים לתלות בעדינות עם פיפטה P1000 במדיום שלהם.
  2. הוציא את הספרואידים לנפחים קטנים ב-15 מ"ל פלקון וצנטריפוגה בעוצמה של 130 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר
  3. שאפו בעדינות את המדיום תוך הימנעות מהכדור המכיל את הספירואידים.
  4. שטפו את הכדור פעמיים עם 2 מ"ל HBSS בעדינות, כדי למנוע התנתקות של הספרואידים, וצנטריפוגה ב-130 x גרם למשך 5 דקות.
  5. מתחת למכסה כימי, השליכו את ה-HBSS והחזירו את הספרואידים ל-1 מ"ל של תמיסת PFA של 4% למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C כדי להתקבע.
  6. צנטריפוגה את הצינור ב-130 x גרם למשך 5 דקות, זרוק את תמיסת 4% PFA, ושוטף 3 פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS (מוכן במים אולטרה-טהורים במעבדה).
  7. תשעה מחדש ב-2.5 מ"ל של HBSS.
  8. שחרר את המתלה הספרואידי לפלטת 6 בארות.
  9. מתחת לזכוכית מגדלת בינוקולרית, בחר ידנית 20 עד 30 ספרואידים עם פיפטה P200 ומניח אותם בצינור של 1.5 מ"ל.
    הערה: כל צינור בנפח 1.5 מ"ל הוא מצב צביעה המכיל 20 עד 30 ספרואידים. מתחת ל-20 ספרואידים שנקטפו, קשה לראות אותם כאשר הם מושלים מחדש.
  10. איזון את נפחי הצינורות והצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ב-800 x g למשך 5 דקות.
    הערה: מנקודה זו ואילך, כל שלבי שאיפת התמיסה מתבצעים בעזרת זכוכית מגדלת. קשה מאוד לראות ספרואידים תחת אור מלאכותי. תמיד בצע את השלבים הבאים במהלך היום, כאשר הצינורות מוחזקים מול אור היום. כל התמיסות הן אספריות עם קצה P1000 עם קצה P10 בקצהו.
  11. להסיר כמה שיותר HBSS בלי להחזיר את הספרואידים.
  12. החזירו את הספרואידים ל-400 מיקרוליטר של תמיסת קירור (0.5 מיליון גליצין ב-1x PBS (pH 7-7.4)) כדי למנוע רעש רקע עתידי שנגרם על ידי אלדהידים שנותרו מקיבוע ה-PFA. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
  13. צנטריפוגה בעוצמה של 800 x g למשך 5 דקות ומניחים פיפטה מהתמיסת הקירור.
  14. השעתי מחדש ב-400 מיקרוליטר של בופר חדירה (0.2% טריטון X-100, 0.3 מיליון גליצין, 20% DMSO ב-1x PBS). זה יסייע לשפר את חדירת הנוגדנים והגשושים הגרעיניים. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
    הערה: משלב זה ואילך, הספרואידים מתיישבים מעצמם ואינם נדבקים עוד לדופן הצינור. צנטריפוגציה כבר אינה נחוצה אם נפחים נשאבים בעדינות מבלי להפריע לכדור הספירואיד. אם צריך, צנטריפוגה ב-800 x g למשך 5 דקות.
  15. השליכו את בופר החדירה ודוגרו ב-400 מיקרוליטר של בופר חוסם (0.2% טריטון X-100, 1% BSA, 10% DMSO, 5% סרום עזים ב-1x PBS) למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  16. השליכו את הבופר החוסם ודגרו במשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-300 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית (0.2% בגיל 20, 1% BSA, 5% DMSO, 5% סרום עז ב-1x PBS).
    הערה: נוגדנים ראשוניים בשימוש הם: אנטי-CD31 (ריכוז סופי של 2.2 מיקרוגרם/מ"ל), אנטי-אינטגרין β1 (1.43 מיקרוגרם/מ"ל), אנטי-אינסולין (0.66 מיקרוגרם/מ"ל), ואנטי-עכברים NTPDase311 (דילול 1:1000) ( ראו טבלת חומרים). יש לאמת IgG בקרה של איזוטיפים זהים באותו מבנה כדי לקבוע סימון חיובי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  17. להשליך את תמיסת הנוגדן הראשית ולשטוף 3 פעמים עם 400 מיקרוליטר של בופר כביסה (0.2% בגיל 20, 1% BSA ב-1x PBS). נער במשך 5 דקות בין הכביסה.
  18. דגרו 300 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדן המשנית (DAPI (2 מיקרוגרם/מ"ל), 0.2% בגיל 20, 1% BSA, 5% DMSO, 5% סרום עזים ב-1x PBS) במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הגן על הצינורות עם נייר אלומיניום.
    הערה: יש להוסיף תמיד DAPI לתנאי הצביעה, שכן זה מקל על מציאת ספרואידים בהדמיה מיקרוסקופית ועוזר לא להבהיר את הפלואורופורים/צבעים השונים. כל הנוגדנים המשניים הם בעלי ריכוז סופי של 2 מיקרוגרם/מ"ל (ראו טבלת חומרים).
  19. להשליך את תמיסת הנוגדן המשנית ולשטוף 3 פעמים עם 400 מיקרוליטר של בופר שטיפה שני: 0.2% ב-Tween 20, 1% BSA ב-1x PBS. שמור את השטיפה האחרונה ואחסן את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להתקנה באותו יום.

3. הכנת תמיסה

  1. הכנת תמיסת ניקוי אופטי
    הערה: פתרון הניקוי האופטי עוקב אחרי פרוצדורת CUBIC10 , והוכן כפי שהוצע על ידי גונאסינג' ואח'4. פרופורציות הרכיבים ניתנות באחוזים ממשקל התמיסה הסופי (w/w), מכיוון שקוואדרול/N,N,N′,N′-טטראקיס (2-הידרוקסיפרופיל) אתילנדיאמין צמיגי מדי לפיפטה ויש לשקול אותו.
    1. בבקבוק זכוכית, משקל 9% (רוחב/רוחב) של N,N′,N′-טטראקיס (2-הידרוקסיפרופיל) אתילנדיאמין, 22% (עם רוחב) של אוראה, 44% (עם רוחב) של סוכרוז, 0.1% (ברוחב) של טריטון X-100, ו-24.9% (עם רוחב) של מים אולטרה-טהורים בדרגת מעבדה.
      הערה: כ-60 גרם תמיסה נדרשות כדי לפנות צלחת עם 24 בארים.
    2. הוסיפו מוט מגנטי המותאם לקוטר הבקבוק.
    3. חממו וערבבו את התמיסה ל-56 מעלות צלזיוס. שמור בקבוק זכוכית בקרה מלא במים על אותה צלחת כדי לעקוב אחרי עליית הטמפרטורה.
    4. שלוט במהירות הערבוב כדי לשמור על מערבולת נוזלית חלקה וערבב את התמיסה עד שכל התרכובות מומסות לחלוטין. התמיסה צריכה להיות נוזלית ושקופה לחלוטין. זה עשוי לקחת עד שעה.
    5. שמור על טמפרטורת החדר, מוגן מהאור.
      הערה: תמיסת הניקוי חייבת להיות מוכנה לפחות 24 שעות לפני ניקוי אופטי, כדי לאפשר לתמיסה להתרוקן מהגזים ולהסיר בועות שעשויות להכיל. כדי למנוע הכנסת בועות, אל תנער את התמיסה שוב. לעולם אל תאחסן באחסון קר.
  2. הכנת תמיסת LMPA של 2%
    1. שקלו 0.5 גרם LMPA על איזון מדויק והניחו אותו בבקבוק Erlenmeyer בנפח 100 מ"ל.
      אזהרה: אל תיקח ארלנמאייר בנפח קטן יותר, שכן יש סיכון לשריפות אם הוא עולה על המים.
    2. המיס ב-25 מ"ל של 1x PBS בטמפרטורת החדר.
    3. שלבו היטב את האבקה ב-1x PBS על ידי ערבוב עדין של בקבוק ארלןמאייר.
      אזהרה: לשלב הבא, חיוני להשתמש בציוד מגן: כפפות ומסכה לעיניים ולפנים, כדי להגן מפני התזות וכוויות.
    4. חממו את הבקבוקון של ארלנמאייר במיקרוגל.
    5. שימו לב מתי התמיסה מתחילה לרתוח (נוכחות בועות בנוזל), והסר אותה מיד לפני שהיא מתפתחת.
    6. ערבבו בעדינות את הארלנמאייר כדי לשלב את האבקה.
      זהירות: אל תערבב חזק מדי, כי הנוזל עלול לגלוש/לרתח יתר על המידה ולהתזות.
    7. מחזירים את ה-Erlenmeyer למיקרוגל, חוזרים על הפעולה עד שה-LMPA נמס לחלוטין.
    8. הסר את הארלנמאייר, ולפני שה-LMPA מתמצק, מחברים במהירות 1 מ"ל של תמיסת 2% LMPA לצינורות של 1.5 מ"ל. אחסן בטמפרטורת החדר.
      הערה: התהליך גוזל זמן. הכינו את התמיסה מראש ואחסנו אותה לשימוש מאוחר יותר.

4. התקנה וניקוי אופטי

  1. חימום הצנטריפוגה של הפלטה ל-40 מעלות צלזיוס, תוך מחזור ארוך להכנת פלטת הדגימה.
    הערה: LMPA מתייצב בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. אין להפעיל את הצנטריפוגה מתחת ל-40 מעלות צלזיוס. אם הצנטריפוגה מאפשרת זאת, העלה את הטמפרטורה ל-50 מעלות צלזיוס.
  2. לנוזל את ה-2% LMPA באמבט מים או בחימום צינור בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 5 עד 10 דקות.
  3. הורידו ושמרו על טמפרטורת ה-2% LMPA ב-55 מעלות צלזיוס.
  4. הנח את פלטת ההדמיה בעדינות על המשטח המחמם שחומם מראש ל-50 מעלות צלזיוס.
    הערה: היזהרו לא לשבור או לשרוט את הפולימר השברירי ששימש כבסיס לבארות.
  5. היזהר שהפלטה חמה לפני שמוסיפים את ה-2% LMPA. אסור שזה יתחבר בשלב זה.
  6. פיפטה 200 מיקרוליטר עם 2% LMPA לכל באר. כסו את כל תחתית התמיכה כדי לקבל בסיס נוזלי ראשון, שמאפשר פיזור נוזלי יותר של הספרואידים.
  7. השלכו את בופר השטיפה מהצינורות, תלו מחדש את הספרואידים ב-300 מיקרו ליטר של 2% LMPA, והפיפט ישירות לבאר שלהם. תמיד בצע תלייה עדינה כדי למנוע בועות.
  8. כסה את הפלטה בנייר אלומיניום כדי להגן על הפלואורופורים.
  9. שקלו במהירות את הפלטה בלי נייר האלומיניום והחזירו אותה למחמם הצלחת.
  10. הכינו צלחת עם 24 בארות, הוסיפו מים לאיזון.
  11. הסר במהירות את הפלטה עם נייר האלומיניום מחמם הלוח כדי להגן על הפלואורופורים המחוברים לנוגדנים המשניים. להחזיק ביד, אל תשים על משטח קר.
  12. הסר את נייר האלומיניום והנח אותו בצנטריפוגה של הצלחת.
  13. צנטריפוגה ב-1000 x g למשך 15 דקות ב-40 מעלות צלזיוס. בדוק את טמפרטורת הרוטור, שצריכה להיות בטמפרטורת החדר.
  14. במהלך הצנטריפוגה, הכינו מגש קרח: שטחו את הקרח כך שניתן יהיה להניח את הצלחת על משטח שטוח.
  15. הסר את הצלחת והניח אותה על הקרח, וכסה את המגש או הצלחת בנייר אלומיניום. השאירו את הצלחת על הקרח למשך 10 דקות.
  16. הסר את הצלחת מהקרח והשאר אותו באלומיניום כדי להתייצב בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  17. פיפט של 1 עד 1.5 מ"ל של תמיסת הניקוי לכל באר, כסה בנייר אלומיניום, והשאר לניקוי אופטי בטמפרטורת החדר, מוגן מאור, לפחות 48 שעות.
    הערה: לעולם אל תאחסן את הצלחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ה-LMPA עשוי להתכווץ, להתנתק מתחתית הבאר ולצוף בתמיסת הניקוי. תמונה תוך שבוע מהניקוי.

5. הדמיה

  1. השתמש במיקרוסקופ דיסק מסתובב קונפוקלי, בחר (לפחות) את האובייקטיב של 30x.
  2. שמור על תמיסות הניקוי, כי הן תורמות להומוגניזציה של מקדם השבירה ולהקל על ההדמיה התלת-ממדית.
  3. מצא את הספרואידים על ידי בחירת ערוץ DAPI כדי למנוע הלבנת הפלואורופורים האחרים.
  4. רכוש תמונות באמצעות פונקציית Z-stack. בחר את החלק העליון והתחתון של הספרואיד ומרחיק את הפרוסות האופטיות במרחק של 10 מיקרון.
    הערה: רכישת תמונות וניתוח תמונות בוצעו על פלטפורמת ההדמיה של CRBS, PIC-STRA UMS 38, אינסרם, יוניסטרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להעריך את יעילות הסימון והניקוי האופטי, מספר מודלים עברו את אותו פרוטוקול ובהמשך תוקנו (איור 1). ספרואידים עם יחס של 1 IEC ל-20 תאי β ו-1 IEC ל-50 תאי β גודלו לפי השיטה שתוארה לעיל. ראוי לציון, יחס 1 IEC ל-20 תאי β מתקרב לזה של אי לבלב אנושי. שימוש בכחול טריפן לצביעת ספרואידים מופרעים אישר שהם שומרים על תאים חיים (80-90% תאים חיים) לאורך 96 שעות. תצפית זו חשובה במיוחד לחקר השינויים המתקדמים בתאים הנגרמים על ידי ציטוקינים של IBMIR בהקשר של השתלת איים וזיה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פותח מודל ספרואידי המשלב תאי IEC של MS-1 ותאי β עכברים β-TC6 המדמה את המבנה התלת-ממדי של איי לבלב. מודל זה מתאים לניתוח תפקוד לקוי של IEC שנגרם מלחץ במשך 72 שעות והשפעתו על חיוניות ותפקוד תאי β, עם רלוונטיות למחקר השתלות איים. חשוב לציין שהספרואיד המורכב מתאי עכברים היה הומוגני בטבעו ועם שושלת אנדותלית תוך-איים רלוונטית.

הישג משמעותי הוא פיתוח ואימות פרוטוקול לקציר, צביעה וניקוי אופטי של ספרואידים קטנים (150-200 מיקרון), המתמודד עם אתגרים בהדמיה תלת-ממדית, כול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם ניגוד עניינים

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים חייבים תודה לפסקל קסלר, מפלטפורמת ההדמיה PICSTRA, על סיוע מקצועי במיקרוסקופיית דיסק מסתובב ובחילוץ נתוני התיוג הגולמיים ממערכת Z. המחברים מבקשים להודות למתנה הטובה של איים אנושיים מטוהרים מאת ד"ר וו. ביטיגר, ד"ר א. לנגלואה וד"ר ק. בוזקרי מהמרכז האירופי לחקר סוכרת (CEED, שטרסבורג, צרפת)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
µ-plate 24 באר Black ID 14 mm IBIDI82426
אגרוול 800 (24 בארות)StemCell34815
פתרון לשטיפה נגד היצמדות StemCell7010
נוגדן אנטי-CD31 [P2B1]אבקאםAB24590ריכוז סופי 2.2 ומיקרו; g/mL
אנטי-אינטגרין ובטא; נוגדן אחד, שיבוט MB1.2מרקMAB1997 ריכוז סופי 1.43 ומיקרו; g/mL
בקבוק תרבית תאים, T-75, משטח , משטח  : תא+, מכסה סינוןסארסטדט83.3911.302β-תרבות TC6
בקבוק תרבית תאים, T-75, שטח: סטנדרטי, פקק בורג דו-מצביסארסטדט83.3911.02תרבות MS-1
DAPI דיהידרוכלורידתרמופישר,D1306ריכוז סופי 2 ומיקרו; g/mL
דימתיל סולפוקסיד סיגמאD8418-250ML
DMEM, סוכר גבוה, GlutaMAX&Trade; תוסף, פירובטתרמופישר סיינטי31966047
דולאגלוטיד
דולאגלוטידליליעט Trulicity 1.5 מ"ג
סרום בקר עובריביוווסטS1810-500
גליציןסיגמאG7126-1KG
נוגדן משני שנספג מאוד מוצלב נגד חזיר העז IgG (H+L), Alexa Fluor&Trade; 555תרמופישרA21435ריכוז סופי 2 ומיקרו; g/mL
נוגדן משני נגד עכבר IgG (H+L) של עזים עם ספיגת רוחב גבוהה, Alexa Fluor&Trade; 488תרמופישר  A-11029ריכוז סופי 2 ומיקרו; g/mL
נוגדן משני אנטי-ארנב עז (H+L) שנספח מאוד, Alexa Fluor&Trade; 633תרמופישרA-21071ריכוז סופי 2 ומיקרו; g/mL
נוגדן משני מוצלב נגד עכברים IgG (H+L), Alexa Fluor&Trade; 555תרמופישרA21434ריכוז סופי 2 ומיקרו; g/mL
סרום עזיםסיגמאS26-100ML
HBSS ללא סידן ו-Calcium מגנזיום  & פנול אדוםקורנינג21-022-CV
אינסולין (C27C9) Rabbit mAbאיתות סלולרי3014Sריכוז סופי 0.66 ומיקרו; g/mL
אי לבלב אנושי מבודד סנטר אירופה ואיקיוט; en d'Etude du Diabete (CeeD)מתנה נדיבה מד"ר קרים בוזקרי. דרגה קלינית, מבודדת לפי ההנחיות.
טמפרטורת ג'לינג נמוכה אגרוזמרקA9414-10G
תאי MS-1ATCCCRL-2279
תמיסת פאראפורמלדהיד, 4% ב-PBS 1xפישר סיינטי15670799
PBS 10xיורומדקסET330-Aמדולל פי 1 במים אולטרה-טהורים במעבדה
פניצילין-סטרפטומיציןPAN BiotechP06-07100
נוגדני NTPDase3 נגד עכבר לחזיר ניסיונות פוליקלונליmN3-1CI4; mN3-2C (I4,I5); mN3-3C(I4,I5) https://ectonucleotidases-ab.com/Antibodies.phpדילול 1:1000
Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl) אתילנדיאמין סיגמא122262-1L
דיסק מסתובב אולימפוס IXplore SPIN פתרונות מדעיים של אולימפוס
סוכרוז לביולוגיה מולקולריתסיגמאS0389-1KG 
דירוג מעבדת BioQuality Triton X-100יורומדקס2000-A
טריפסין/EDTA (10x)PAN BiotechP10-025100
טווין-20יורומדקס//
אוריאהסיגמאU-5128
תאי β-TC6ATCCCRL-11506

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langlois, A., Pinget, M., Kessler, L., Bouzakri, K. Islet transplantation: Current limitations and challenges for successful outcomes. Cells. 13 (21), 1783(2024).
  2. Li, X., Meng, Q., Zhang, L. The fate of allogeneic pancreatic islets following intraportal transplantation: Challenges and solutions. J Immunol Res. 2018, 1-13 (2018).
  3. Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Front Mol Biosci. 7, 20(2020).
  4. Gunasingh, G., Browning, A. P., Haass, N. K. Rapid optical clearing for semi-high-throughput analysis of tumor spheroids. J Vis Exp. 2022 (186), e64103(2022).
  5. Paysan, J. The art of tissue clearing. , John Wiley & Sons Ltd. West Sussex. (2021).
  6. Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnol Bioeng. 116 (10), 2742-2763 (2019).
  7. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369(2021).
  8. Poitout, V., et al. Morphological and functional characterization of βTC-6 cells: An insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
  9. Ionescu-Tirgoviste, C., et al. A 3D map of the islet routes throughout the healthy human pancreas. Sci Rep. 5 (1), 14634(2015).
  10. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  11. Munkonda, M. N., et al. Characterization of a monoclonal antibody as the first specific inhibitor of human NTP diphosphohydrolase-3: partial characterization of the inhibitory epitope and potential applications. FEBS J. 276 (2), 479-496 (2009).
  12. Sbat, N. Study of the endothelial-to-mesenchymal transition of intra-islet endothelial cells in mice and its pharmacological modulation: Relevance for pancreatic islet transplantation. , Université Paris Cité. https://theses.hal.science/tel-03873595 (2021).
  13. Barillaro, M., Schuurman, M., Wang, R. β1-integrin: A key player in controlling pancreatic beta-cell insulin secretion via interplay with SNARE proteins. Endocrinology. 164 (1), bqac179(2023).
  14. Lavoie, E. G., et al. Identification of the ectonucleotidases expressed in mouse, rat, and human Langerhans islets: potential role of NTPDase3 in insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 299 (4), E647-E656 (2010).
  15. Giuliani, A. L., Sarti, A. C., Di Virgilio, F. Ectonucleotidases in acute and chronic inflammation. Front Pharmacol. 11, 619458(2021).
  16. Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-3 antibody targets adult human pancreatic β cells for in vitro and in vivo analysis. Cell Metab. 29 (3), 745-754.e4 (2019).
  17. Syed, S. K., et al. Ectonucleotidase NTPDase3 is abundant in pancreatic β-cells and regulates glucose-induced insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (10), E1319-E1326 (2013).
  18. Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868(2012).
  19. Rane, T. D., Armani, A. M. Two-photon microscopy analysis of gold nanoparticle uptake in 3D cell spheroids. PLoS One. 11 (12), e0167548(2016).
  20. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer multicellular spheroid analysis by two-photon microscopy. Biomed Opt Express. 13 (5), 3120(2022).
  21. Diosdi, A., et al. Single-cell light-sheet fluorescence 3D images of tumour-stroma spheroid multicultures. Sci Data. 12 (1), 492(2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CUBIC

מאמרים קשורים