פרוטוקול זה מתאר השתלת ביצית של תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה B ו-T (ALL) שמקורם בחולה, המתרחשת 4 ימים לאחר ההזרקה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ב Ovo Xenografting של תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) שמקורם בחולה (PDX-ALL)
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחקר זה מציג שיטה מהירה, חסכונית ויעילה להשתלת ביציות של תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) שמקורם בחולה , המקיפה שושלות של תאי B ותאי T. באמצעות עוברי תרנגולות מופרות, הזרקנו תאי B-ALL ו-T-ALL שמקורם בחולה לתוך כלי הדם של העוברים 11 ימים לאחר ההפריה (11dpf). למרבה הפלא, ארבעה ימים לאחר ההזרקה, תאי הלוקמיה האנושיים המושתלים הפגינו הישרדות משמעותית, התפשטות וקולוניזציה של כלי הדם בתוך עובר התרנגולת המתפתח. ב-15dpf, זיהינו עלייה ניכרת בתאי CD10/CD19+ B-ALL ו-CD4/CD8+ T-ALL בדגימות דם מכלי הדם של העובר, מה שאישר את ההשתלה המוצלחת. מערכת זו מאפשרת הערכה יעילה וניתנת לשחזור של התנהגות תאי לוקמיה באורגניזם חי ללא העלויות הניכרות והאילוצים האתיים הקשורים למודלים אחרים של בעלי חיים. גישה מהירה זו מספקת פלטפורמה in vivo בעלת תפוקה גבוהה ורלוונטית ביולוגית להערכת תרכובות טיפוליות פוטנציאליות. מערכת ה-xenograft שמקורה בחולה ביצית (PDX)-ALL המוצגת כאן מציעה כלי מבטיח לסינון תרופות פרה-קליניות, מחקרים מכניסטיים ופוטנציאל לגישות רפואה מותאמת אישית בחקר לוקמיה.
מבוא
הממברנה הכוריואלנטואית של הגוזל (CAM), מתחילה להתגבש ביום 7 לאחר ההפריה לאחר הדגירה, ומסתיימת ביום ה-12. ה-CAM מחזיק באור הזרקורים כמודל in vivo מתאים לאנגיוגנזה1 והשתלת תאים סרטניים 2,3,4,5,6,7,8,9,10, במיוחד תאי סרטן הקשורים לדם 11מכיוון שהוא חסר חיסון מטבעו ויש לו כלי דם מפותחי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הניסויים בוצעו על סמך הפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה באוניברסיטת קלגרי (REB15-1143; שם התקבלה הסכמה מדעת מכל הנבדקים) ומועצת האתיקה של מחקר הבריאות של ועדת הסרטן של אלברטה (HREBA). CC-17-0108_REN8). חולים עם ALL בעת האבחנה (לפני תחילת טיפול כלשהו), שהיו להם בלסטים במחזור (בלסטים לא רק במח אלא גם בדם), נכללו במחקר. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.
1. דגירה של ביצים
- רכשו ביצי עוף מופרות. השג ~10% יותר ביציות מהנדרש כדי לקחת בחשבון את מספר הביציות שנפגעו במהלך המשלוח או הליך הפיצוח.
- אחסן את הביצים המופרות עד שבועיים בטמפרטורה של 12 מעלות ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לקבוע אם ההשתלה של תאי ALL אנושיים בעוברי עוף מתפתחים הייתה מוצלחת, הוגברו הדורהשני של lentivirus הנושא mCherry והשתמשו בהם כדי לסמן קווי תאים B- ו-T-ALL, SEM ו-MOLT3 16,17, בהתאמה. כפי שמוצג באיור 1A, ~50% מהתאים B-(שני הפאנלים השמאליים העליונים) ו-T-(שני הפאנלים הימניים העליונים) סומנו ב-mCherry. לאחר מכן, תאי B-(#1 ו-#2) ו-T-(#3 ו-#4) שמקורם במטופל סומנו גם הם ב-mCherry (איור 1A, ארבעה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
זוהו שלושה שלבים קריטיים במהלךההשתלה בביצית כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי ולמקסם את ההישרדות של עוברי תרנגולות: כלומר, (1) עיקור פני קליפת הביצה עם 70% אתנול לפני יצירת החלון ו-(2) איטום הדוק של חלון קליפת הביצה עם צלוטייפ כדי למנוע אידוי של תוכן עובר התרנגולת במהלך הדגירה, ו-(3) שימוש במחט העדינה (למשל, 34 גרם) והזרקת כל התאים בנפח מינימלי (למשל, 100 מיקרוליטר) כדי להבטיח אספקה תקינה של כלי הדם ולמזער הפרעה מכנית. ניתוחי פתרון הבעיות שלנו גילו כי 1 x 107 תאי ALL המסומנ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
אנו מודים לד"ר אנדרו קונג מאוניברסיטת קולומביה על מתן FUW-Luc-mCherry-puro. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-CIHR (PJT-174983) ל-KYL ומקרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF; RS-2023-00284121) ל-KYL ו-M-YJ.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 34 גרם מחטים | BD פריסייף | ||
| Attune NxT זרימה ציטומטר | תרמו פישר | ||
| מזרק BD Perisafe (32 גרם) | BD פריסייף | ||
| אלבומין סרום בקר (BSA) | מיליפור סיגמא | א9647 | |
| מדיום הקפאת תאים | גיבקו, תרמו-פישר סיינטיפיק | 12648010 | |
| צנטריפוגה (צנטריפוגה Allegra X-22R) | בקמן קולטר | ||
| כפפות חד פעמיות | כפפות בחינת ניטריל Royal Touch300 | ||
| ניתוח מיקרוסקופ | לייקה MZ16FA | ||
| DMEM | גיבקו, תרמו-פישר סיינטיפיק | 11965092 | |
| DMSO | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| אינקובטור ביצים, חממת גלגול Vevitts 120 | ויקסט טריידינג ושות' | ||
| אלכוהול אתילי (95%) | VWR בינלאומי | BDH1158-4LP | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | גיבקו, תרמו-פישר סיינטיפיק | 26140079 | |
| תמיסת פיקול (פיקול?? פאקה פלוס) | מיליפורסיגמא | GE17-1440-02 | |
| נוגדן FITC-CD10 | סנטה קרוז ביוטק | SC-46656 FITC | |
| נוגדן FITC-CD4 | סנטה קרוז ביוטק | SC-19641 FITC | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | לייקה מיקרוסיסטמס | ||
| מקדחה ידנית (Dremel3000) | בוש | ||
| HEK293T | ATCC, VA, ארצות הברית | CRL-3216 | |
| המוציטומטר | VWR בינלאומי, Hausser Scientific | 15170-263 | |
| מלח נתרן הפרין מרירית מעי חזיר | מיליפור סיגמא | H3149 | |
| מבחנות Heparinized | שואב BD | ת"ד 366480 | |
| ליפופקטמין 3000 | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | L3000008 | |
| ערכת טיטר לנטיווירוס מולטיפלקס (ערכת טיטר qPCR Lentivirus) | אבם | LV900 | |
| NH4Cl (אמוניום chloride_ | מיליפור סיגמא | א9434 | |
| מיקרוסקופ הפוך אולימפוס IX71 | אולימפוס | ||
| נוגדן PE-CD19 | סנטה קרוז ביוטק | SC-19650 PE | |
| נוגדן PE-CD8 | סנטה קרוז ביוטק | SC-1177 PE | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל) | גיבקו, תרמו-פישר סיינטיפיק | 15140122 | |
| מי מלח חומציים פוספט (PBS) | סיגמא | עמ' 3813 | |
| פיפטות (נפח מתכוונן) | אפנדורף | ||
| פורומיצין | גיבקו, תרמו-פישר סיינטיפיק | A1113803 | |
| RPMI 1640 | גיבקו, תרמו-פישר סיינטיפיק | 11875093 | |
| סקוטייפ סלוטייפ | 3 דקות | ||
| צלחות סטריליות עם 6 בארות | חוות דעת על VWR international , קורנינג | 22250-140 | |
| צינורות צנטריפוגה סטריליים | Axygen Inc, קורנינג | AXYMCT-150-C-S | |
| צלוחיות תרבית סטריליות (75T) | VWR בינלאומי | 10062-872 | |
| צינורות בז סטריליים (15 מ"ל) | סרשטדט | 62.554.502 | |
| צינורות בז סטריליים (50 מ"ל) | סרשטדט | 62.547.254 | |
| מסנן סטרילי (0.45 ומיקרו; מסנן m) | VWR בינלאומי | 76778-974 | |
| מלקחיים סטריליים | VWR בינלאומי | 82027-404 | |
| מגלשות זכוכית סטריליות | VWR בינלאומי | 48300-031 | |
| קצות פיפטה סטריליות | VWR בינלאומי | 76322-136, 76322-134, 76322-154 | |
| מזרקים סטריליים | מזרק BD | 309628? | |
| טריפאן כחול | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | T10282 |
מקורות
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82 (1), 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sc....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
