חיישנים ביולוגיים של חלבון G מבוססי BRET למדידת פעילות קולטן מצמד חלבון G בתאים חיים

קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) מייצגים את משפחת העל הגדולה ביותר של קולטנים טרנסממברניים, האחראים על התמרת גירויים חוץ-תאיים למפלי איתות תוך-תאיים וכתוצאה מכך תגובות ביולוגיות ספציפיות. הם מטרות פרמקולוגיות מרכזיות, כאשר כ-30% מהתרופות המשווקות פועלות על GPCRs¹. קשירת ליגנד GPCR גורמת לשינויים קונפורמטיביים בקולטן, מה שמקל על אינטראקציות עם חלבוני G הטרוטרימריים ו/או GPCR קינאזות (GRKs) ו-β-עצרים, ובכך יוזמת איתות במורד הזרם או הפנמת קולטן².

חלבוני G הטרוטרימריים משמשים כמתמרים התוך-תאיים העיקריים של איתות GPCR ומורכבים משלוש יחידות משנה: G_α, G_β ו-G_γ. הטרוטרימרים אלה מסווגים לארבע משפחות - G_i/o, G_s, G_q ו- G_12/13 - בהתבסס על תת-הסוג G_α , שכל אחד מהם מפעיל מסלולי איתות נפרדים: תת-סוג G_i/o מעכב אדנילט ציקלאז בעוד G_s מגרה אותו, G_q מפעיל פוספוליפאז C-β, ו-G_12/13 מווסת GTPases ממשפחת Rho.

הפעלת GPCR מובילה לסידור מחדש של הקונפורמציה שלהם, מה שמאפשר מעורבות מהירה של חלבון G בתוך קינטיקה תת-שנייה. תהליך זה גורם לשינויים קונפורמטיביים של חלבון G, ומקדם חילופי תמ"ג-GTP ביחידת המשנה G_α. קשירת GTP משנה עוד יותר את קונפורמציה של תת-יחידה G_α, וכתוצאה מכך להתנתק מהדימר G_βγ, ומאפשר התפשטות אותות. חלבוני G הם אפוא חיוניים בוויסות הספציפיות והדינמיקה הזמנית של תגובות תאיות על ידי ויסות חלבוני אפקטור מגוונים כגון אדנילט ציקלאז או תעלות יונים ^3,4,5.

פרוטוקול זה מתאר את מדידת ההפעלה או ההשבתה של חלבון G באמצעות חיישנים ביולוגיים מבוססי העברת אנרגיה בתהודה ביולוגית (BRET) על גירוי ליגנד GPCR בתאים חיים. בהשראת עבודה חלוצית על חיישנים ביולוגיים של חלבון G ^6,7,8,9, מערכת G-CASE (חיישני פעילות תלת-ציסטרוניים של חלבון G), שהוצגה על ידי Schihada et ^al.10, מבוססת על BRET בין תת-יחידות G_α ו-G_βγ מסומנות ומציעה גישה יעילה הדורשת טרנספקציה אחת בלבד של פלסמיד. תכונה זו משפרת את הרגישות ומפחיתה אתגרים הקשורים לטרנספקציה משותפת של פלסמידים מרובים המקודדים לשלוש יחידות המשנה (G_α, G_β ו-G_γ) של חלבון G ההטרוטרימרי. חיישנים אלה הפכו לזמינים לקבוצות מחקר אקדמיות באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים).

BRET מציע יתרונות משמעותיים על פני העברת אנרגיה תהודה (FRET) של Förster. ב-BRET, העברת אנרגיה מתרחשת בין תורם ביולומינסנט למקבל פלואורסצנטי ללא צורך במקורות אור חיצוניים. ביולומינסנציה פנימית זו מפחיתה בעיות הקשורות ל-FRET, כגון אוטופלואורסצנציה ופיזור אור, וכתוצאה מכך אות רקע נמוך יותר ורגישות משופרת לבדיקה ^6,7,11.

היעדר עירור חיצוני זה ב-BRET ממזער את ההשפעות הפוטו-הלבנה והפוטוטוקסיות, מה שמוביל לאותות רקע נמוכים יותר בהשוואה ל-FRET. כתוצאה מכך, מבחני BRET מציגים לרוב רגישות מוגברת, המאפשרת מדידה של הפעלת חלבון G של GPCRs פעילים מבחינה מכוננת. הרגישות המוגברת של מבחני BRET מקלה על זיהוי אינטראקציות ביולוגיות עדינות, דבר בעל ערך במיוחד במחקרים פרמקולוגיים שבהם מדידה מדויקת של פעילות הקולטן היא קריטית.

ניתן לתרגם את החיישנים הביולוגיים הללו להקרנה בתפוקה גבוהה בצלחות של 96 בארות או 384 בארות, כפי שהודגם לאחרונה על ידי סקוט-דניס ואחרים, שם פותחה שיטה המשתמשת בחיישנים ביולוגיים אלה בבדיקת 384 בארות מבוססת ממברנה לניתוח הפעילות של קולטני קנבינואידים CB1R ו-CB2R¹². מאמר זה מתאר את השימוש בחיישנים ביולוגיים אלה בצלחות של 96 בארות בתאים חיים על ידי מדידת הפעילות של β2-AR כאב טיפוס GPCR מסוג A, הקושר את חלבון G_s ואת ה-CB1R השייך ל-GPCRs מסוג A ומפעיל את חלבון משפחת G_i/o . השימוש בשני חיישנים ביולוגיים G-CASE מאומת: G_s ו-G_i3 בתאי HEK 293T עם ה-GPCR באופן חולף (עם β2-AR) או מבוטא ביציבות (עם ה-CB1R).

חשוב לציין כי ניתן לבצע ניסוי זה בקווי תאים שונים, מה שמדגים את הרבגוניות והחוסן של טכניקה זו בהקשרים תאיים שונים. זה מבטיח שניתן ליישם את השיטה על מודלים ניסיוניים מגוונים, מה שהופך אותה לכלי רב ערך לחקר איתות GPCR במסגרות פיזיולוגיות ופרמקולוגיות שונות. איור 1 ממחיש את העיקרון של חיישני פעילות חלבון G מבוססי BRET.

איור 1: העיקרון של חיישני פעילות חלבון G מבוססי BRET. חיישני חלבון G מורכבים משלוש יחידות משנה: G_α, G_β מקורי ו-G_γ. תת-היחידה G_α מאוחה ל-NanoLuciferase הקטן והבהיר (Nluc), בעוד שתת-היחידה G_γ מסומנת באופן N-terminally עם נוגה מעגלית (cpVenus¹⁷³). הגנים המקודדים את יחידות המשנה של חלבון G המהונדסות הללו משולבים לפלסמיד יחיד. קשירת ליגנד ל-GPCRs גורמת לשינויים קונפורמטיביים של GPCR, מקדמת גיוס חלבון G ודיסוציאציה לאחר מכן ואחריה הידרוליזה של GTP. דיסוציאציה זו משבשת את העברת האנרגיה בין השותפים, וכתוצאה מכך ירידה באות ה-BRET. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. זריעת צלחת באר (יום 1)

הערה: עקוב אחר כל פרוטוקולי תרבית התאים במכסה זרימה למינרי סטרילי כדי לשמור על תנאים סטריליים. לוחות באר לבנים עם תחתית שטוחה שקופה משמשים למעקב אחר צמיחת התאים וכדאיותם. השתמש בצלחת הבאר הלבנה המלאה כדי להימנע משימוש במדבקה בשלב 3.2.1.

1. ובכן ציפוי צלחת
   הערה: ניתן להשתמש בצלחות מצופות מראש כדי לעקוף שלב זה.
   1. יוצקים למאגר רב-ערוצי כ-6 מ"ל של תמיסת פולי-L-ליזין (PLL) סטרילית מסוננת (0.01%). בעזרת פיפטה רב-ערוצית, מלאו כל באר של 96 מיקרופלייט לבן עם 60 מיקרוליטר PLL.
   2. הניחו את המיקרופלייט במקום חשוך ודגרו למשך 20 דקות.
   3. במהלך הדגירה, המשך בהכנת התאים כמתואר בשלבים 1.2.1-1.2.3.
   4. שאפו את תמיסת ה-PLL עם הפיפטה הרב-ערוצית ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בצינור של 15 מ"ל.
   5. שטפו את הצלחת שלוש פעמים עם DPBS על מנת להסיר PLL חופשי שעלול לגרום להתדרדרות התאים.
2. הכנת תאים וציפוי
   1. תרבית תאי HEK293 במדיום הנשר המותאם של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂.
      הערה: FBS מתווסף למדיום התרבית כדי לספק את החומרים המזינים וגורמי הגדילה הדרושים לקיום תאים תקין.
   2. הסר את המדיום ושטוף את התאים עם 2 מ"ל DPBS.
   3. מוסיפים 0.5 מ"ל טריפסין ודוגרים במשך 3-5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על מנת לנתק את התאים.
   4. הוסף 4.5 מ"ל של DMEM לבקבוק כדי לנטרל טריפסין, ואז פיפטה למעלה ולמטה שוב ושוב כדי לנתק את התאים ולהשעות אותם מחדש.
   5. העבירו את התאים המנותקים לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 1000 x גרם (בטמפרטורת החדר, RT).
   6. הסר את ה-supernatant והשהה מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של DMEM.
   7. ספרו את התאים עם תא ספירה Malassez והכינו 9 מ"ל ב-300,000 תאים/מ"ל. הכניסו אותם למאגר רב-ערוצי וזרעו את המיקרו-צלחת של 96 בארות על ידי יציקת 100 מיקרוליטר לבאר עם הפיפטה הרב-ערוצית (צפיפות סופית של 30,000 תאים לבאר).
   8. דגרו את המיקרופלייט à 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך כ-24 שעות.
      הערה: התאים צריכים להגיע לסביבות 70%-80% מפגש לטרנספקציה יעילה.

2. טרנספקציה של פלסמיד (יום 2)

הערה: ניתן לבצע טרנספקציה של תאים ביום הראשון על תאים תלויים לפני הציפוי, במהלך שלב 1.2.7 ורכישת נתונים ביום 3.

1. לדלל 10 מיקרוגרם מה-DNA של הפלסמידים הרצויים (למשל, 5 מיקרוגרם של קולטן β2-אדרנרגי ו-5 מיקרוגרם של G_s (קצר)-CASE בתאי HEK wt או רק 10 מיקרוגרם של G_i3-CASE בתאי HEK CB1) ו-20 מיקרוליטר ליפופקטמין בצינורות המכילים 500 מיקרוליטר של מדיום Opti-MEM. דגירה ב- RT למשך 5 דקות.
   1. לבקרה שלילית, החלף את הקולטן β2-אדרנרגי ב-pcDNA פלסמיד ריק 3.1 באותו ריכוז. שלב את התמיסות לצינור אחד וערבב לקבלת תערובת טרנספקציה (1 מ"ל).
2. דגרו את תערובת הטרנספקציה ב-RT למשך 20 דקות.
3. הוסף 10 מיקרוליטר של תערובת טרנספקציה משלב 2.2 טיפתית לכל באר, ונדנד בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה כדי להבטיח ערבוב מלא.
   הערה: מתקבל ריכוז סופי של 100 ננוגרם DNA לבאר.
4. דגרו את המיקרופלייט בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 24 שעות.

3. רכישת נתונים (יום 3)

1. הכנת ליגנד
   הערה: מאגר תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) של האנק: NaCl 140 מ"מ, אשלגן כלורי 5 מ"מ, סידן כלורי 1 מ"מ, מגנזיום גופרתי הפטאהידרט 0.4 מ"מ, מגנזיום כלוריד הקסהידרט 0.5 מ"מ, נתרן פוספט דיהידרט 0.3 מ"מ, אשלגן פוספט מונוביסיק 0.4 מ"מ, D-גלוקוז (דקסטרוז) 6 מ"מ, נתרן ביקרבונט 4 מ"מ, pH 7.4, מסונן 0.22 מיקרומטר.
   1. הכן תמיסת מלאי בריכוז הגבוה ביותר האפשרי בממס המסיס המתאים לליגנדים השונים (בפרוטוקול זה, איזופרוטרנול מוכן ב- H₂0 mQ ו- WIN-55.212-2 ב- DMSO).
      הערה: יש להתאים את הריכוז של תמיסת מלאי הליגנד בהתאם למסיסות וקבוע הדיסוציאציה הידוע (K_d) של הליגנד.
   2. ממלאי זה, הכינו דילול סדרתי של ליגנד הנע סביב ה-K_d של הליגנד, של 10 מיקרוליטר בממס המסיס המתאים. אחסן את הדילול הסדרתי הזה ב-20 מעלות צלזיוס.
      הערה: בהתאם לליגנד, ניתן להקפיא ולהפשיר את טווח הדילול הסדרתי עד עשר פעמים לפני שמתרחשת השפלה. הכן תמיסה המכילה רק את הממס המשמש לפירוק ליגנד כדי לכלול מצב רכב (בפרוטוקול זה, H₂0 או DMSO).
   3. עבור כל ריכוז ליגנד ורכב, בצע דילול של 1/100 ב-HBSS על ידי הוספת 1.3 מיקרוליטר מכל ריכוז לנפח כולל של 130 מיקרוליטר. התוצאה היא ריכוז סופי של 1% רכב ב-HBSS.
      הערה: טווח הדילול הסופי הזה הוא זה המשמש לניסויים על ידי הוספת 10 מיקרוליטר כדי להשיג נפח כולל של 100 מיקרוליטר לבאר. התוצאה היא ריכוז סופי של 0.1% רכב בכל הבארות. נפח 130 מיקרוליטר תואם את הכמות הדרושה למילוי שורה אחת של צלחת של 96 בארות: (10 x 12) ± 10%. כל שורה מתאימה לריכוז ליגנד שונה, כאשר השורה האחרונה משמשת כבקרת הרכב.
   4. הכן 980 מיקרוליטר של דילול Furimazine 1/100 מתמיסת המלאי (9.8 μL ב-970.2 μL של HBSS כדי לקבל נפח כולל של 980 μL).
      הערה: הכינו תמיסה טרייה של פורימזין ותנו לה לדגור לפחות 3 דקות. לאחר מכן, הוסף אותו מיד לפני הרכישה. אין להכין אותו מוקדם מדי, מכיוון שלאות יש זמן מחצית חיים של כ -120 דקות בטמפרטורת החדר. כדי להתגבר על מגבלה זו, ניתן להשתמש בנגזרות פורימזין ארוכות טווח, כגון ויבזין ואנדורזין. מצעים אלה שומרים על אות BRET יציב עד 48 שעות.
2. קריאות צלחות
   הערה: השתמש בקורא לוחות רב-מצבים. התאם את המדידה לתנאים שנחקרו ולמספר השכפולים. כאן, איסוף הנתונים מחולק לשלוש קריאות של 4 עמודות, המקבילות ל -32 בארות. כל הקריאות נעשות עם אופטיקה עליונה עם מכסה שקוף למניעת אידוי חיץ. לפני כל הקריאות, התאם את רווח המדידה. במחקר זה, הרווח נקבע על 3600. ניתן להימנע מהוספת ליגנד ידנית על ידי שימוש במזרק או מערכת מזרק אוטומטית, הזמינה בקוראי צלחות רבים.
   1. הסר את המדיום מארבעת העמודים הראשונים של צלחת 96 הבארות. שוטפים כל באר עם 100 מיקרוליטר HBSS ומוסיפים 80 מיקרוליטר HBSS. הדביקו מדבקה לבנה בצד התחתון של הצלחת. זה משפר את מדידות הקרינה ו/או הביו-לומינסנציה.
   2. הקלטה של ספקטרום הזוהר של חלבון G: הכנס את צלחת 96 הבארות לקורא הצלחות. רשום את פליטת cpVenus¹⁷³ באמצעות מונוכרומטור של 535/30 ננומטר ומדוד את פליטת הזוהר בין 500 ל-600 ננומטר ברזולוציה של 2 ננומטר.
      הערה: הקלטה זו היא בקרה כדי להבטיח שהפלואורסצנטיות נפלטת עם עירור cpVenus¹⁷³ .
   3. הקלטה של ספקטרום זוהר של חלבון G: הקלט את עוצמת פליטת ה-Nluc באמצעות מונוכרומטור של 450/40 ננומטר ומדוד את פליטת הזוהר בין 400 ננומטר ל-600 ננומטר ברזולוציה של 5 ננומטר.
      הערה: הקלטה זו היא בקרה כדי להבטיח שלא נפלטת ביולומינסנציה לפני הוספת מצע Nluc, furimazine.
   4. הסר את הצלחת מקורא הצלחות והוסף 10 מיקרוליטר מתמיסת הפורימזין שהוכנה בעבר (שלב 3.1.4.) בכל באר בעזרת פיפטה רב ערוצית.
   5. חזור על שלב 3.2.3.
      הערה: הקלטה זו היא בקרה כדי להבטיח שביו-לומינסנציה נפלטת עם הוספת פורימזין. המשך ישירות לשלב 3.2.6 לאחר מדידה זו כדי למנוע שינוי אות עקב צריכת פורימזין ו/או השפלה. וריאציה של אות BRET יכולה להתרחש עקב צריכת פורימזין ו/או פירוק ותהליכים רגולטוריים המתרחשים כדי לסיים את התגובה הנגרמת על ידי גירוי אגוניסטי. כדי להתגבר על מגבלה זו, ניתן להשתמש במעכבי GRK (CMPD101) ומעכבי הפנמה (dynasore) או תאים ערוכים גנטית ללא GRKs או עצירות.
   6. הקלטה של חלבון G BRET בסיסי: לפני הוספת ליגנד GPCRs, רשום את עוצמת הפליטה של Nluc ו-cpVenus¹⁷³ באמצעות מונוכרומטור 450/40 ננומטר ו-535/30 ננומטר, בהתאמה. מדוד 3 מחזורים של 60 שניות עם זמן מרווח מדידה של 0.30 שניות (זמן קריאה כולל של 3 דקות).
      הערה: הגדלת זמן מרווח המדידה ל-0.90 שניות בדרך כלל משפרת את יחס האות לרעש באופן משמעותי אך מביאה לזמן קריאה ארוך בהרבה. הנסיין צריך להחליט אם הרזולוציה הזמנית הגבוהה יותר או יחס האות לרעש המשופר חשובים יותר ליישומם.
   7. הסר את הצלחת מקורא הצלחות והוסף 10 מיקרוליטר מטווח הדילול שהוכן בעבר של ליגנד GPCR (שלב 3.1) בהתאמה בכל באר של עמודה אחת בעזרת פיפטה רב-ערוצית. בצע את אותו הליך עבור 3 העמודות האחרות.
   8. הקלטה של BRET המושרה על ידי ליגנד חלבון G: הקלט את עוצמת הפליטה של Nluc ו-cpVenus¹⁷³ באמצעות מונוכרומטור 450/40 ננומטר ו-535/30 ננומטר, בהתאמה. מדוד 16 מחזורים של 60 שניות עם זמן מרווח מדידה של 0.30 שניות (זמן קריאה כולל של 16 דקות).
      הערה: הגדר את פרמטרי המדידה למדידת הבארות בעמודות. כפילויות נקראות בהפרש זמן של 2.4 שניות.
   9. חזור על שלב 3.2. בארבעת הטורים הבאים פעמיים.

4. ניתוח נתונים

הערה: אסוף את הנתונים של כל קריאה בקבצי גיליון נתונים נפרדים.

1. קריאות בקרה
   1. שרטט את עוצמת הפליטה כנגד אורך הגל.
2. קריאות BRET בזאליות
   1. עבור כל באר, חשב את יחס ה-BRET של שלוש הקריאות. יחס ה-BRET מוגדר כפליטת מקבל/פליטת תורם.
      
   2. עבור כל באר, חשב את הממוצע של שלושת יחסי ה-BRET לפני הוספת ליגנד. ערך זה נקרא יחס BRET הבסיסי לפני גירוי ליגנד: יחס_בזאלי.
   3. כדי לנרמל את יחסי ה-BRET הקודמים של כל הבארות, עבור כל אחת משלוש המדידות, בהתאמה הפחיתו את ערך יחס ה-BRET המחושב מבארות בקרת הרכב מיחס ה-BRET בזמן המדידה המתאים.
      הערה: הנתונים שנותחו תואמים לנקודות הזמן לפני הוספת ליגנד. מכיוון שהבארות שבהן מתווסף הליגנד ידועות, ניתן לזהות את בארות הבקרה של הרכב בהתאם.
3. קריאות BRET המושרות על ידי ליגנד חלבון G
   1. עבור כל באר, חשב את יחס ה-BRET של כל קריאה, כמתואר בסעיף 4.2.1. ערכים אלה נקראים Ratio_stim.
   2. כדי לכמת שינויים הנגרמים על ידי ליגנד, חשב את ה-ΔBRET עבור כל_גירוי יחס של כל באר כאחוז מעל הבסיס. לשם כך, השתמש ביחס_הבזאלי המתאים שחושב בעבר בסעיף 4.2.2.
      
   3. חשב את ה-ΔBRET (%) כדי לנרמל את ערכי ה-ΔBRET של כל באר. לשם כך, הפחיתו את ערכי ה-ΔBRET המתאימים של הרכב.
   4. כדי לדמיין את קינטיקה של ΔBRET בגיליון אלקטרוני של נתונים, הוסף את שלוש קריאות ה-BRET הבסיסיות המנורמלות בשלב 4.2.3. לפני ערכי ה-ΔBRET (%) המתאימים המחושבים עבור כל באר בסעיף 4.3.3.
   5. התווה את הנתונים הקודמים כנגד זמן הקריאה כדי לקבל גרף קינטי.
   6. כאשר מגיעים לרמה, קחו את ערכי ה-ΔBRET (%) בזמן שנבחר ושרטטו אותם כנגד ריכוז הליגנד בו נעשה שימוש, שכן כל באר מתאימה לריכוז ליגנד שונה. מתקבלת עקומת מינון-תגובה.
      הערה: הרמה מושגת בדרך כלל בסביבות 5 דקות לאחר גירוי ליגנד. בפרוטוקול זה משורטטים הערכים המתקבלים לאחר גירוי ליגנד של 15 דקות. כדי להשוות נתונים מניסויים שונים, התאימו את הזמן בהתאם לקינטית ההפעלה.
   7. שרטטו את הנתונים הקודמים בתוכנת ניתוח והתאימו באמצעות התאמה סיגמואידית של שלושה פרמטרים בין מינון לתגובת מינון על סמך המשוואה הבאה:
      
      כאשר, X הוא ריכוז הליגנד בו נעשה שימוש, Y הוא ערכי ΔBRET(%), למעלה ולמטה מייצגים את המישורים, ו-EC₅₀ הוא ריכוז הליגנד הנדרש כדי להגיע ל-50% מהאפקט המקסימלי. זה מאפשר להשיג את ה-E_max ו-EC₅₀.
   8. השווה נתונים מתנאי הבקרה באמצעות מבחן מאן-וויטני לא פרמטרי. התוצאות נחשבות מובהקות ב-p < 0.05.

איור 2: שלבים עיקריים לביצוע בדיקת BRET. סקירה כללית של שלושת השלבים הניסיוניים העיקריים המתוארים בפרוטוקול זה (זריעת תאים, טרנספקציה של תאים ורכישת אותות BRET) ומדריך מפורט לרכישת נתונים. מערך ניסוי: ביום הראשון, התאים נזרעים בצלחת לבנה מצופה מראש של 96 בארות עם תחתית שטוחה ושקופה בצפיפות של 30,000 תאים לבאר. ביום השני, התאים עוברים טרנספטציה עם חיישן חלבון G שנבחר יחד עם הפלסמידים GPCR או pcDNA3.1 שנחקרו. לאחר 24 שעות דגירה, פעילות חיישן חלבון G נמדדת באמצעות קריאות ביולומינסנציה ופלואורסצנטיות עם הוספת ליגנד. רכישת נתונים: לאחר שטיפת HBSS של התאים, 80 מיקרוליטר של HBSS מתווספים לבארות, ופליטת הקרינה cpVenus¹⁷³ נמדדת בין 500 ננומטר ל-600 ננומטר באמצעות מונוכרומטור 535/30 ננומטר (1). לאחר מכן, ביולומינסנציה של Nluc נמדדת בין 400 ננומטר ל-600 ננומטר באמצעות מונוכרומטור של 450/40 ננומטר, הן לפני (2) והן אחרי (3) הוספת פורימזין. לבסוף, אות ה-BRET לפעילות חלבון G המושרה על ידי ליגנד נמדד באמצעות מונוכרומטורים של 450/40 ננומטר ו-535/30 ננומטר, בהתאמה, במשך 3 דקות (3 מחזורים של 60 שניות עם מרווח מדידה של 0.30 שניות) (4) ו-16 דקות (16 מחזורים של 60 שניות עם מרווח מדידה של 0.30 שניות) (5). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

סכימה כללית של הגדרת הניסוי וביצועו מפורטת באיור 2. ההפעלה של חלבונים ממשפחת Gs או Gi/o לאחר הפעלת ליגנד של שני GPCRs הוערכה באמצעות החיישנים הביולוגיים G-CASE. ראשית, נחקרה משפחה אב-טיפוסית A GPCR, ה-β2-AR עבר טרנספטציה זמנית בתאי HEK 293T. כאשר אגוניסט (כלומר, איזופרוטרנול) הוחל על תאי HEK wt המבטאים את β2-AR יחד עם חיישן החלבון Gs(short)-CASE, נצפתה ירידה תלוית ריכוז באות ה-BRET, מה שמעיד על הפעלה של חלבון Gs (איור 3B). ערכי ΔBRET ירדו עם ריכוז הליגנד עד שהושגה רוויה, עם רמה שנצפתה כ-5 דקות לאחר גירוי הליגנד. לעומת זאת, תאי HEK wt שהועברו עם הפלסמיד הריק pcDNA3.1 וחיישן החלבון Gs(short)-CASE הראו תגובה הפוכה אך נמוכה ולא משמעותית לגירוי איזופרוטרנול (איור 3B). בפרוטוקול זה משורטטים ערכים המתקבלים לאחר 15 דקות של גירוי ליגנד. כדי להבטיח עקביות בתוצאות ועצמאות מבחירת הזמן, יש לבדוק נקודות זמן אחרות, כדי להבטיח שהושג שיווי משקל. בנוסף, כדי להשוות תוצאות על פני ניסויים שונים, יש להתאים את בחירת הזמן על סמך קינטיקה ההפעלה של כל ניסוי.

כדי ליצור את עקומות המינון-תגובה הסיגמואידיות המוצגות באיור 3C, ערכי ה-ΔBRET שנמדדו ב-15 דקות לאחר הגירוי (כאשר הרמה מתייצבת) תווו כנגד ריכוזי הליגנדים השונים. ה-EC50 הנצפה (9.4 ננומטר ±-2.1 ננומטר) נמצא בערכי הטווח של ה-Kd הידוע של הקולטן עבור איזופרוטרנול (13 ננומטר ±-6 ננומטר)13,14 (איור 3C,D). תוצאות אלו מדגימות את היעילות של חיישני G-CASE בהערכת הפעלת חלבון G עם תגובה נצפית הקשורה במיוחד לנוכחות β2-AR.

איור 3: הערכת חיישן חלבון Gs בתאי משקל HEK. קריאות ΔBRET קינטיות עם הוספת איזופרוטרנול האגוניסט לתאי HEK wt שהועברו עם חיישן חלבון Gs ו-β2-AR (A) או pcDNA3.1 (B). (C) עקומות מינון-תגובה המתקבלות על ידי התאמת ערכי ΔBRET (%) לאחר גירוי ליגנד של 15 דקות בריכוזי ליגנד משתנים. (D) השוואת ערכים מקסימליים של ΔBRET בין תאי הבקרה pcDNA3.1 ו-β2-AR שעברו גירוי עם איזופרוטרנול. ההבדל הסטטיסטי למצב pcDNA3.1 נבדק באמצעות מבחן מאן-וויטני לא פרמטרי (**p < 0.01). הנתונים מראים ± SEM ממוצע של שלושה ניסויים עצמאיים שבוצעו בשכפול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

שנית, החיישנים הביולוגיים נבדקו בתאי HEK CB1, קו תאים HEK 293T המבטא ביציבות את ה-CB1R. תאים אלה הועברו באופן חולף עם חיישן החלבון Gi3-CASE. גירוי עם אגוניסט CB1R WIN-55,212-2 גרם לאות ΔBRET תלוי ריכוז, המצביע על הפעלה של מסלול Gi3 (איור 4A). לעומת זאת, תאי HEK wt שהועברו עם חיישן החלבון Gi3-CASE ועוררו באותם תנאים לא הראו תגובה כלשהי, מה שאישר את הספציפיות של הפעלת CB1R (איור 4B). הרמה הושגה כ-5 דקות לאחר הפעלת הליגנד. עקומת המינון-תגובה המתאימה הדגישה את תגובת ה-ΔBRET תלוית הריכוז הנגרמת על ידי גירוי WIN-55,212-2 בתאי HEK-CB1, בעוד שלא נצפתה תגובה כזו בתאי HEK wt (איור 4C). ה-EC50 הנצפה (112 ננומטר ±-25 ננומטר) נמצא בערכי הטווח של ה-EC50 הידוע של הקולטן עבור WIN-55,212-2 (354 ננומטר ±-62 ננומטר)15 (איור 4C, D). לבסוף, השוואה של ערכי ΔBRET שהתקבלה 15 דקות לאחר גירוי אגוניסטי עם 10 מיקרומטר של WIN-55,212-2 בתאי HEK CB1, ותאי HEK wt ממחישה את ההפעלה התלויה ב-CB1R של מסלול האיתות Gi3 (איור 4D).

איור 4: הערכת חיישן חלבון Gi3 בתאי HEK CB1. קריאות ΔBRET קינטיות עם הוספת האגוניסט WIN-55,212-2 לתאי HEK CB1 (A) או HEK wt (B). עקומות מינון-תגובה המתקבלות על ידי התאמת ערכי ΔBRET (%) לאחר 15 דקות של גירוי ליגנד כנגד ריכוז הליגנד (C). השוואת ערכים מקסימליים של ΔBRET בין תאי הבקרה HEK wt ו-HEK CB1 מגורים עם WIN-55.212-2 (D). ההבדל הסטטיסטי למצב HEK wt נבדק באמצעות מבחן מאן-וויטני לא פרמטרי (****p < 0.0001). הנתונים מראים ± SEM ממוצע של חמישה ניסויים עצמאיים שבוצעו בכפולות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

למחברים אין מה לחשוף.