הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בדיקת שביט לכימות נזק ל-DNA בתאי 32D המבטאים מוטציה FLT3 לאחר חשיפה למעכבי FLT3 מסוג I ו-II

1.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68469

⸱

17 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Department of Hematology, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, 4Taizhou University Affiliated Municipal Hospital, School of Medicine, Taizhou University, 5National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University, 7Department of Medical Ultrasound, Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לכימות ההבדל בנזק ל-DNA הנגרם על ידי מעכבים מסוג I וסוג II בתאים מוטנטיים מסוג FLT3 באמצעות יישום מבחן השביט.

תקציר

טירוזין קינאז 3 (FLT3) דמוי FMS, קולטן טירוזין קינאז מסוג III, מציג שכיחות מוטציה של כ-30% בחולי לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) ומהווה מטרה טיפולית קריטית. כמעכבי FLT3 מייצגים מסוג I וסוג II, בהתאמה, gilteritinib ו-Quizartinib (AC220) משמשים קלינית בניהול AML מוטנטי FLT3.

גילטריטיניב מעכב חלבוני FLT3 מופעלים ומושבתים, עם עיכוב נוסף של מטרות AXL כדי לסייע בהתגברות על עמידות. AC220 מעכב FLT3 מופעל. בדיקת השביט שימשה באופן שיטתי כדי לכמת ולהשוות דפוסי נזק ל-DNA הנגרמים על ידי מעכבי FLT3 מסוג I לעומת מעכבי FLT3 מסוג II בתאים מוטנטיים. תוצאות הניסוי חשפו כי נזק ה-DNA שנגרם על ידי AC220 היה גבוה משמעותית מזה שנגרם על ידי גילטריטיניב. עבור נזק חזק ל-DNA, ניתן לשלב מעכבי FLT3 עם מעכבי תיקון נזקי DNA כדי להתמקד בפגמים בתיקון DNA. התוצאות מספקות תמיכה ניסויית לאסטרטגיית השילוב הרציונלי של תרופות המכוונות לנזק DNA.

מבוא

לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) מייצגת הפרעה בתאי גזע המטופויאטיים משובטים המוגדרת על ידי התרחבות פתולוגית של אבות מיאלואידים לא מובחנים, וכתוצאה מכך דיכוי המטופויאטי וכשל במח העצם. ההטרוגניות המולקולרית המובנית של AML מציבה אתגרים טיפוליים משמעותיים1. חשיבות קלינית מיוחדת, מוטציות טירוזין קינאז 3 (FLT3) דמויות FMS מהוות את אחד השינויים הגנטיים השכיחים ביותר ב-AML, המתרחשים בכ-30% מהמקרים, ומדגימים מתאם חזק עם תוצאות קליניות שליליות2. קולטן FLT3 טירוזין קינאז עובר הפעלה בקרום הפלזמה כדי לתווך מפלי איתות PI3K/AKT ו-RAS/MAPK, ואילו הגרסה המוטנטית FLT3-ITD נשמרת בתוך הרטיקולום האנדופלזמי, וגורמת למתמר אותות מתמשך ומפעיל זרחון של שעתוק 5 (STAT5). שינויים גנטיים אלה מניעים לוקמוגנזה באמצעות מנגנונים אונקוגניים מרובים, בעיקר באמצעות חוסר ויסות העברת אותות, איתות פרוליפרטיבי בלתי מבוקר ועמידות אפופטוטית3.

AC220 ו-gilteritinib, כמעכבי FLT3 טיפוסיים, מעכבים את התפשטות התאים וגורמים לאפופטוזיס על ידי דיכוי ביטוי FLT3, אך עם מנגנוני פעולה שונים. גילטריטיניב (מעכב מסוג I) לא רק מכסה ספקטרום רחב יותר של מוטציות המפעילות FLT3 אלא גם מעכב את ה-AXL טירוזין קינאז, הקשור קשר הדוק ל-FLT3. באמצעות עיכוב כפול, גילטריטיניב יכול לחסום את הצמיחה של תאים סרטניים באופן מקיף יותר4. AC220 (מעכב מסוג II) מפעיל את השפעתו המעכבת באמצעות קשירה תחרותית לקונפורמציה של קינאז מופעל, המכוון במיוחד לכיס קשירת ה-ATP עם סגוליות גבוהה5. עיכוב זה עלול להוביל לעצירת מחזור התא וללחץ מוגבר על שכפול ה-DNA.

גילטריטיניב קשור לסיכון נמוך לעמידות ומיועד למונותרפיה ב-AML מוטנטי FLT3 חוזר/עמיד. AC220 יעיל וסלקטיבי למוטציות FLT3-ITD, עם שיעורי תגובה קליניים טובים, אך אינו יעיל למוטציות FLT3-TKD, ועשוי להיות עמיד למוטציות FLT3-TKD עקב מוטציות משניות של FLT3-TKD (למשל, D835 או F691L) לפיתוח עמידות. מעכבים אלה זכו לבולטות בטיפולי AML בהתבסס על יעילות קלינית מוכחת ומדדים טיפוליים משופרים6. עם זאת, השימוש הקליני בתרופות אלו מאותגר על ידי עמידות נרכשת והשפעות מחוץ למטרה. שימוש ארוך טווח ב-AC220 בקליניקה מוביל לעמידות עקב מוטציות FLT3-TKD, בעוד ששימוש ארוך טווח בגילטריטיניב עשוי להיות בעל מגבלות למוטציות מורכבות (למשל, FLT3-ITD בשילוב עם TKD) גם אם הוא אינו גורם לעמידות עקב מוטציות FLT3-TKD 7,8.

שתי מחלקות אלה של מעכבי FLT3 מפעילות אפקט טיפולי כפול על ידי גרימת מתח משכפל בעקיפין באמצעות עיכוב של FLT3 וחסימה של מסלול האיתות הפרוליפרטיבי-RAS-MAPK, PI3K-AKT-mTOR, איתות STAT5. חסימה של התפשטות תאים מובילה בדרך כלל לעצירת מחזור התא, הפרעות מטבוליות (חוסר ויסות של הומאוסטזיס חמצון חיזור), ובסופו של דבר לאפופטוזיס 9,10. מנגנון זה מייצר בסופו של דבר נגעי DNA המפעילים התאמות תיקון DNA מפצות באוכלוסיות תאים עמידות. בדיקת השביט מאפשרת השוואה כמותית של פרופילי נזק ל-DNA ספציפיים למעכב בתאים מוטנטיים FLT3. גישה ניסויית זו מספקת תובנות קריטיות לפיתוח טיפולים משולבים רציונליים המנצלים פגיעויות נזק ל-DNA, ובכך מתגברים על עמידות טיפולית נרכשת.

מתודולוגיות עכשוויות לזיהוי נזקי DNA כוללות ניתוח אימונוהיסטוכימי, אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של שברי DNA, תגובת שרשרת פולימראז (PCR) וריצוף מהדור הבא (NGS), כל אחד מהם מדגים רגישות אנליטית גבוהה וספציפיות11. עם זאת, גישות אלו מוגבלות על ידי דרישות כספיות משמעותיות, משכי עיבוד ממושכים ותנאי ניסוי מחמירים. זה מדגיש את ההכרח באימוץ אסטרטגיות זיהוי המאזנות בין דיוק אנליטי לפשטות תפעולית.

בדיקת השביט שימשה באופן נרחב בטוקסיקולוגיה סביבתית ובהערכת גנוטוקסיות בשל הרגישות המעולה שלה, הנגישות הטכנית, כימות נזק ל-DNA חזותי וישימות רחבה על פני מערכות ביולוגיות12,13. נקבעו שלוש גרסאות מתודולוגיות עיקריות: בדיקת שביט אלקליין לזיהוי שבירה חד-גדילית/כפולה, בדיקת שביט ניטרלי לניתוח שבירת גדיל כפול, ובדיקת שביט שונה באנזים לזיהוי נגעי DNA ספציפיים. 14

העיקרון המתודולוגי כולל: (1) אינדוקציה של גדיל DNA פורץ באמצעות טיפול ניסיוני; (2) פירוק בתיווך מאגר ליזה של ממברנות תאיות וגרעיניות, המאפשר דיפוזיה של חלבון ציטופלזמי/גרעיני ו-RNA למאגר אלקטרופורזה, בעוד DNA בעל משקל מולקולרי גבוה נשאר משותק במטריצת אגרוז; (3) דנטורציה אלקליין (pH > 13) הגורמת לפירוק DNA ושחרור של שברי DNA פגומים; (4) נדידה אנודית מונעת שדה אלקטרופורטי של DNA מקוטע היוצרת מורפולוגיה אופיינית של שביט, עם DNA שלם השומר על מבנה נוקלואיד כדורי15,16. כימות נזק ל-DNA מושג באמצעות ניתוח ממוחשב של אחוז ה-DNA של הזנב (TDP), המספק מדידה מדויקת של ההשפעה הגנוטוקסית ברזולוציה של תא בודד17.

מחקר זה השתמש במסגרת ניסויית שיטתית כדי להשוות את ההשפעות הגנוטוקסיות הדיפרנציאליות של גילטריטיניב ו-AC220 בתאי 32D מאומתים עם מוטציה של FLT3. תכנון הניסוי כלל שני מרכיבים עיקריים: (i) הקמת מודל נזק DNA ספציפי למוטציה FLT3, ו-(ii) הערכה כמותית של נזק DNA הנגרם על ידי תרופות באמצעות מתודולוגיית בדיקת שביט אלקליין. קו התאים 32D המוטנטי FLT3 נשמר בתנאי מבחנה סטנדרטיים לפני חשיפה למעכבי FLT3 מדוללים סדרתיים. הכדאיות התאית הוערכה באמצעות מבחני CCK-8, עם חישוב לאחר מכן של ערכי ריכוז מעכב חצי מקסימלי (IC50) באמצעות ניתוח רגרסיה לא ליניארית. ערך IC50 פי חמישה נבחר כסף השראת נזק ל-DNA. תאים שטופלו בתרופות נאספו והוטמעו באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה בשקופיות לניתוח שלאחר מכן. הפרדה אלקטרופורטית בוצעה ב-24 וולט (~0.74 וולט/ס"מ) ו-300 mA למשך 30 דקות במאגר אלקליין, שבמהלכו DNA מקוטע נדד באופן אנודי ליצירת מורפולוגיה אופיינית של שביט, בעוד ש-DNA שלם שמר על תצורת נוקלואיד כדורית. כימות נזק ל-DNA הושג באמצעות פרויקט תוכנת בדיקת שביט לניתוח תמונה ממוחשבת (CASP) למדידת מומנט זנב, עם ערכי מומנט זנב זית מוגברים בקורלציה ישירה עם מידת פיצול ה-DNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. בניית מודל נזק ל-DNA בתאי 32D עם מוטציות FLT3-ITD 18

  1. התאוששות תאים
    1. באמצעות מלקחיים, העבירו במהירות תאי FLT3-ITD מוטנטיים 32D שמורים בהקפאה (מאוחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס). אחזר קריוביאלים באמצעות מלקחיים וטבול אותם מיד באמבט מים מווסת טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס ± 0.5 מעלות צלזיוס) למשך 60 שניות בדיוק להשלמת הפשרה מבוקרת.
      הערה: במהלך ההפשרה, יש לנער לסירוגין את הקריוביאלים באמבט המים כדי להבטיח חימום אחיד.
    2. צנטריפוגה את הדגימות השמורות בהקפאה ב-150 × גרם למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס ±-1 מעלות צלזיוס. שאפו בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטות סרולוגיות סטריליות תוך שמירה על הכדור הסלולרי.
    3. הוסף 1 מ"ל של מצע גידול מלא (RPMI 1640 + 10% סרום בקר עוברי + 1% פניצילין/סטרפטומיצין) לצינור השימור בהקפאה. בצע טריטורציה עדינה באמצעות 10 מחזורי פיפטינג עוקבים (נפח 1 מ"ל) כדי להבטיח השעיה מלאה. העבירו את תרחיף התאים לתבנית תרבית תאים של 100 מ"מ והוסיפו 7 מ"ל של מדיום שלם כדי להשיג נפח סופי של 8 מ"ל.
    4. ערבבו בעדינות את כלי התרבות עם חמש תנועות אופקיות וחמש תנועות סיבוביות. שמור על תאים בחממה לחה בטמפרטורה של 37.0 מעלות צלזיוס ± 0.2 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ו-95% לחות. דגירה למשך 24 שעות לפני העיבוד הניסיוני.
  2. הערכת כדאיות תאים
    1. בחר תאים תלת-ממדיים מוטנטיים FLT3-ITD בשלב הצמיחה הלוגריתמית עם מצב תאי טוב לניסוי.
      הערה: לתאים בשלב הצמיחה הלוגריתמית יש בדרך כלל מחזור חלוקה קצר ותדירות גבוהה של חלוקת תאים.
      1. התבונן במורפולוגיה ובמצב הצמיחה של תאים תלת-ממדיים שעברו מוטציה ב-FLT3-ITD באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. ודא שהקריטריונים לסף התפשטות התאים מתקיימים: חפש תאי che שהם בצורת כדורית בודדת עם קצוות חלקים, פיזור אחיד, מעט אגרגטים, גודל תא אחיד, שלמות קרום פלזמה שלמה ופסולת סלולרית < 5%.
    2. השתמש במונה תאים כדי לקבוע את ריכוז תרחיף התאים.
      הערה: מערבבים את מתלי התאים (10 מחזורי פיפטינג עוקבים באמצעות קצות סטריליים של 1 מ"ל במהירות פיפטה מקסימלית של 50%).
    3. תקנן את תרחיף התאים ל-2.0 ×-105 תאים/מ"ל במצע גידול מלא באמצעות דילול איטרטיבי. בעזרת פיפטה, הזרימו 50 מיקרוליטר לבארות המרכזיות (B2-G7) של צלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות. מלאו את הבארות ההיקפיות (A1-H12) ב-100 מיקרוליטר של PBS סטרילי כדי לשמור על לחות ולמזער את השפעות אידוי הקצוות.
    4. הכנת מדיום המכיל מעכב FLT3: בחר תשע בארות בצלחת תרבית תאים של 12 בארות וסמן אותן לפי סולם ריכוז מעכבי FLT3 (0, 3.90625, 7.8125, 15.625, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 ו-1000 ננומטר). הוסף 400 מיקרוליטר של מדיום שלם לבארות המסומנות 10.0 מיקרומטר ו-200 מיקרוליטר של מדיום שלם לבארות הנותרות.
      1. דילול גילטריטיניב: הוסף 4 מיקרוליטר של 100 מיקרומטר מגיב גילטריטיניב (גילטריטיניב בדימתיל סולפוקסיד) לכל אחת מהבארות המסומנות 1000 ננומטר באמצעות אקדח פיפטה וערבב היטב את התמיסה. פיפטה 200 מיקרוליטר של 1000 ננומטר גילטריטיניב לתוך הבארות המסומנות 500 ננומטר ומערבבים; ואז פיפטה 200 מיקרוליטר של 500 ננומטר גילטריטיניב לבארות המסומנות 250 ננומטר ומערבבים. בכל פעם, קחו 200 מיקרוליטר מהדילול הקודם לבאר הבאה וערבבו כדי להשיג את הריכוז הרצוי.
      2. דילול AC220: הוסף 4 מיקרוליטר של מגיב AC100 מיקרומטר AC220 (AC220 בדימתיל סולפוקסיד) לכל אחת מהבארות המסומנות 1000 ננומטר באמצעות אקדח פיפטה. בצע את שלב 1.2.4.1 עבור הבארות האחרות.
        הערה: ודא שתמיסת מלאי מעכבי FLT3 בפיפטה מועברת לחלוטין לבארות כדי למנוע שאריות תמיסה. ודא שהתמיסה מעורבבת היטב לפני שתמשיך בדילול.
    5. דגירה: הוצא מדיה המכילה מעכב FLT3 לבארות ייעודיות (50 מיקרוליטר לבאר) באמצעות פיפטה. שמור על צלחת 96 בארות בתנאי תרבית פיזיולוגיים (37.0 מעלות צלזיוס ± 0.2 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 95% לחות) למשך 72 שעות ± 15 דקות בדיוק.
    6. יש להקצות 10 מיקרוליטר של מגיב CCK-8 לכל בארות הבקרה הניסיוניות והריקות באמצעות פיפטה. הגן על הצלחת מפני אור ודגר אותה בתנאים נורמוקסיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך 2.0 שעות ± 10 דקות.
      הערה: הוצא את המגיב במהירות פיפטה נמוכה עם עומק טבילה של קצה 2 מ"מ כדי למזער את היווצרות הבועה. הימנע מבועות אוויר במהלך הוספת דגימה כדי למנוע הפרעה לקריאות OD.
    7. הסר את צלחת 96 הבארות מהחממה ומדוד את הספיגה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות. רשום את התוצאות.
    8. חשב את אחוז העיכוב לפי נוסחת החישוב IC50 :
      עיכוב (%) = figure-protocol-1 × 100%
      באר הניסוי של התרופה מציינת בארות תאים שטופלו בתרופה. באר בקרת תאים מציינת בארות תאים שלא טופלו בתרופה. בארות בקרה ריקות מצביעות על מדיום בלבד ללא תאים.
    9. לנתח את נתוני התגובה למינון המנורמל באמצעות רגרסיה לא ליניארית, תוך שימוש במודל לוגיסטי של ארבעה פרמטרים. לחצו על הלחצן 'התאמת עקומה' להתאמת עקומה. גזור את ריכוז העיכוב החצי-מקסימלי (IC50) מהתכנסות המודל (R2 > 0.98, סכום שיורי של ריבועים < 0.15) וחשב את מרווחי הסמך של 95% באמצעות דגימה מחדש של 1000 איטרציות.
  3. ניסוי נזק ל-DNA של תאים תלת-ממדיים עם מוטציה ב-FLT3-ITD הנגרמת על ידי מעכב FLT3
    1. בחר תאים 32D מוטנטיים FLT3-ITD המציגים קפיצת גדילה (זמן הכפלת האוכלוסייה < 24 שעות) להערכת נזק ל-DNA.
    2. ספור את התאים (ראה שלב 1.2.2 לפרטים).
    3. זריעת תאים: התאם את צפיפות תרחיף התאים ל -1 × 106 תאים למנה, באמצעות צלחת בקוטר 6 ס"מ ו -4 מ"ל תרחיף תאים למנה.
    4. הכן שלושה שכפולים לכל ריכוז מעכב: 55 ננומטר גילטריטיניב: 4 מ"ל בינוני + 2.2 מיקרוליטר של 100 מיקרומטר, 0.15 ננומטר AC220: 4 מ"ל בינוני + 6 מיקרוליטר של 100 ננומטר. מערבבים את התמיסות ומאזנים אותן ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות; יש לנער בעדינות את הצינורות כדי להבטיח ערבוב נאות. שאפו את המדיום המקורי והחליפו אותו ב-4 מ"ל לצלחת של מדיום טרי המכיל מעכב באמצעות פיפטות סרולוגיות סטריליות.
    5. דגירה על התאים המטופלים בתנאים פיזיולוגיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 95% לחות) למרווחים מוגדרים (0, 2, 4, 6 שעות). עבד בקרות זמן אפס באופן מיידי להערכת נזק ל-DNA בסיסי.
    6. בדיקת אי הכללה של Trypan blue
      1. צנטריפוגה את התאים שנאספו ב -150 × גרם למשך דקה אחת. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים עם 1 מ"ל של מדיום תרבית.
      2. פיפטה 100 מיקרוליטר של תאים תלויים לתוך צינור צנטריפוגה מפלסטיק, מוסיפים 100 מיקרוליטר כתם כחול טריפן (2x), מערבבים בעדינות ומכתימים למשך 3 דקות.
      3. ספור את התאים (ראה שלב 1.2.2 לפרטים).
      4. חשב את כדאיות התא באופן הבא:
        % הישרדות תאים = figure-protocol-2 × 100%
        הערה: רק דגימות עם כדאיות ≥90% עובדו לבדיקת השביט.

2. הכנת ריאגנטים והכנת דגימת תאים

  1. אזנו את תמיסת הליזיס (המכילה 2.5 M NaCl, 100 מ"מ EDTA, 10 מ"מ טריס, pH 10, 1% טריטון X-100, 10% DMSO) ב-4 מעלות צלזיוס ±-0.5 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמצעות מקרר.
  2. ממיסים אגרוז נמס נמוך (LMA) ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן שומרים אותו באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס כדי למנוע התמצקות.
  3. הכן את מאגר האלקטרופורזה האלקליין (300 מ"מ NaOH, 1 מ"מ EDTA, pH >13) על ידי שקילת 12 גרם NaOH באמצעות איזון אלקטרוני, פיפטה של 2 מ"ל של תמיסת EDTA של 500 מ"מ, ולאחר מכן הוספת ddH2O כדי ליצור עד 1 ליטר של המאגר.
  4. קצירת תאים
    1. אסוף את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. צנטריפוגה מתלה התא בטמפרטורה של 800 × גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנטים באמצעות סינון ואקום.
      1. השעו בעדינות את התאים ב-1 מ"ל של מדיום שלם באמצעות קצות פיפטה רחבים של 1 מ"ל, ואחריהם 10 היפוכים אנכיים.
      2. ספור את התאים כמו בשלב 1.2.
      3. צנטריפוגה את תרחיף התא בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ב-150 × גרם למשך 5 דקות כדי להסיר את המדיום השלם. השעו מחדש את התאים השטופים ב-PBS נטול סידן ל-~5.0 ×-105 תאים/מ"ל.

3. נוהל בדיקת שביט

  1. הכן שקופיות בדיקת שביט ודגימות תאים מראש. מכינים תערובת של 10:1 (v/v) של אגרוז LMA ותרחיף תאים (5 × 105 תאים/מ"ל) בצינורות של 1.5 מ"ל בעזרת פיפטה ומערבבים בעדינות. הוצא 55 מיקרוליטר של תערובת תאי האגרוז על מגלשות שביט באמצעות פיפטה המוחזקת בזווית של 45 מעלות, תוך שמירה על מרחק של 2 מ"מ ממשטח המגלשה. מניחים את השקופיות המצופות בתערובת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי למנוע אור.
    הערה: במהלך הוספת תערובת ה-LMA והתאים לשקופיות בדיקת השביט, הוצא את התרחיף לאט ובאופן שווה כדי למנוע היווצרות בועות ולהבטיח פיזור ג'ל הומוגני.
  2. טבלו את השקופיות המוצקות בתמיסת ליזה מקוררת מראש (המכילה 2.5 M NaCl, 100 מ"מ EDTA, 10 מ"מ טריס, pH 10, 1% טריטון X-100, 10% DMSO) ובצעו ליזה למשך ≥1 שעות ב-4 מעלות צלזיוס בתנאים מוגנים מאור.
  3. לאחר הליזיס, הסר את המגלשה מהליזאט והשתמש באקדח פיפטה כדי לשאוב כמה שיותר נוזלים סביב ההנעה. לאחר מכן הנח את המגלשה במאגר אלקטרופורזה אלקליין (300 מ"מ NaOH, 1 מ"מ EDTA, pH >13) ושיווי משקל מראש למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס, תוך הקפדה על הימנעות מאור.
  4. אלקטרופורזה: מקם את המגלשות בתא אלקטרופורזה והוסף תמיסת אלקטרופורזה אלקליין מספקת כדי לטבול את השקופיות. אלקטרופורזה מוליכה ב-24 וולט (שווה ערך ל-0.74 וולט/ס"מ) עם זרם קבוע (300 mA) למשך 30 דקות באמצעות מאגר מאוזן מראש (4 מעלות צלזיוס) כדי למזער נזק ל-DNA.
  5. נטרול: לאחר אלקטרופורזה, השתמש באקדח פיפטה כדי לשאוב את תמיסת האלקטרופורזה האלקליין מהשקופית, הטביע את השקופיות למשך 2 x 5 דקות ב-dH2O, ולאחר מכן הטביע אותן באתנול 70% למשך 5 דקות. יבש את השקופיות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  6. מכתים: יש למרוח כמות של 100 מיקרוליטר של 1x כתם חומצת גרעין YeaRed לכל באר ולדגור למשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה בתנאים מוגנים מפני אור. הסר את עודפי הכתמים על ידי שטיפה מימית עדינה ואחריה ייבוש תרמי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  7. הדמיה: בצע הדמיה פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במטרה פי 4, עם רכישת תמונה דיגיטלית המתבצעת בתנאי חשיפה סטנדרטיים.

4. עיבוד נתונים

  1. בצע ניתוח תמונה כמותי כדי לקבוע פרמטרים סטנדרטיים של שביט, כולל DNA זנב (%), מומנט זנב זית ואורך זנב (מיקרומטר).
    1. פתח את ממשק התוכנה (איור 5).
    2. ייבא/י תמונה לתוכנה, לחץ/י על ״קובץ״ ולאחר מכן לחץ/י על ״בחר קובץ ״ כדי לייבא את התמונה שברצונך לנתח לתוכנה. לאחר מכן, החזק את לחצן העכבר לחוץ וגרור עד להופעת תיבה כחולה. גרור את התיבה הכחולה כדי לוודא שהתא שברצונך לנתח מוקף בתוך התיבה. ניתן להשתמש באפשרות Adjust באיור כדי לכוונן את מיקום המסגרת כך שתכלול את התא כולו (איור 5).
    3. לפני שתתחיל בניתוח, לחץ על התחל ולאחר מכן לחץ על ניתוח. תוצאות ניתוח התא הבודד יוצגו בצד ימין תחת 'פרופילים'. לאחר ניתוח כל תא, לחץ על שמור. הפרמטרים שניתן לזהות מוצגים בצד ימין של 'פרופילים', והערכים המספריים של פרמטרים שונים מוצגים בתחתית. לבסוף, לחץ על קובץ | ייצוא תוצאות. התוצאות שהתקבלו כוללות את HeadArea, TailArea, HeadDNA, TailDNA, HeadDNA%, TailDNA%, HeadRadius, TailLength, CometLength, HeadMeanX, TailMeanX, TailMoment, ו-OliveTailMoment.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בדיקת השביט שימשה באופן שיטתי כדי לכמת פרופילי נזק דיפרנציאלי ל-DNA הנגרמים על ידי גילטריטיניב ו-AC220 בשורות תאים מוטנטיות FLT3. ניתוחים הראו כי ההבדל בנזק ל-DNA בין אוכלוסיות תאים שלא טופלו ב-gilteritinib ו-AC220 לא היה מובהק סטטיסטית (P > 0.05). עליות תלויות מינון בערכי ה-DNA של הזנב (%) ו-Olive Moment Tail (OMT) השיגו מובהקות סטטיסטית (P < 0.05) לאחר חשיפות של 2-6 שעות. OMT מייצג את המכפלה של % ה-DNA בזנב ואת 'המרחק בין מרכז הכובד של הקרינה של ראש-זנב'. הבדלים בדנ"א זנב (%) וזנב מומנט זית (OMT) מצביעים על כך ש-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בדיקת השביט מייצגת התקדמות משמעותית במתודולוגיות הערכת גנוטוקסיות. טכניקה זו מציעה יתרונות מובהקים על פני גישות קונבנציונליות באמצעות הנגישות הטכנית שלה, רזולוציית תא בודד והדמיה ישירה של דפוסי נזק באמצעות פרופילי הגירה אלקטרופורטיים. בפיתוח טיפולי AML, בדיקת השביט מאפשרת הערכה שיטתית של הפרופילים הגנוטוקסיים של סוכנים מועמדים במהלך שלבי אימות המטרה, ומספקת נתונים פרמקודינמיים קריטיים לאופטימיזציה פרה-קלינית19,20.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי צוות המחקר החדשני של המוסד להשכלה גבוהה של ג'יאנגסו למדע וטכנולוגיה (2021), התוכנית של מרכז המחקר הטכנולוגי להנדסה של המכללה המקצועית של ג'יאנגסו (2023), התוכנית למדע וטכנולוגיה רפואית ובריאותית של מחוז ג'ג'יאנג (2025KY1861), קרן המפתח למדעי הטבע של מוסדות ההשכלה הגבוהה של ג'יאנגסו בסין (מענק מס' 24KJA310008), התוכניות של המכללה לבריאות מקצועית של סוג'ואו (מענק מס'. SZWZYTD202201, szwzy202406), ופרויקט של מעבדת המפתח הממלכתית לרפואת קרינה והגנה, אוניברסיטת סוצ'ו (GZK12023013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5 מ' EDTAביוטייםST066
1x כתם חומצת גרעין YeaRedיאסן10202ES
תא 32DקוביירCBP60995
AC220טרגטמולT2066
ערכת ספירת תאים-8DojindoCK04
צלחת ספירת תאיםצ'יוג'ינגXB-K-25
אינקובטור CO2תרמו51032872
פרויקט תוכנה לבדיקת שביט (CASP)
ערכת בדיקת שביט טרוויגןברקוד 4250-050-K
ציטציה 5ביוטק16280004
FBSפאןST30-3302
גילטריטיניבטרגטמולT4409
פריזמה GraphPad 9.0
צנטריפוגה מהירהתרמו  9AQ2861
L-1000XLS+ פיפטותריינין17014382
L-20XLS+ פיפטותריינין17014392
מיכל חנקן נוזלימווקריוג'י"ד-175-216
פוטומטר מיקרו-פלייט Multiskan FCתרמו1410101
Na2OHדמאו1588
PBSסולארביועמ' 1020
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100xביוטייםג0222
RPMI 1640 בינוניג'יבקוC22400500BT
מיקרוסקופ תאים חיים טרינוקולרימוטיק1.1001ה+12
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחדHaireV118574

מקורות

  1. Swaminathan, M., Wang, E. S. Novel therapies for AML: A round-up for clinicians. Expert Rev Clin Pharmacol. 13 (12), 1389-1400 (2020).
  2. Daver, N., Schlenk, R. F., Russell, N. H., Levis, M. J. Targeting flt3 mutations in AML: Review of current knowledge and evidence. Leukemia. 33 (2), 299-312 (2019).
  3. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  4. Mori, M., et al. a FLT3/AXL inhibitor, shows antileukemic activity in mouse models of FLT3-mutated acute myeloid leukemia. Invest New Drugs. 35 (5), 556-565 (2017).
  5. Papaemmanuil, E., Döhner, H., Campbell, P. J. Genomic classification in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 375 (9), 900-901 (2016).
  6. Cortes, J. Quizartinib: A potent and selective FLT3 inhibitor for the treatment of patients with FLT3-ITD-positive AML. J Hematol Oncol. 17 (1), 111(2024).
  7. Döhner, H., Wei, A. H., Löwenberg, B. Towards precision medicine for AML. Nat Rev Clin Oncol. 18 (9), 577-590 (2021).
  8. Kantarjian, H., et al. Acute myeloid leukemia: Current progress and future directions. Blood Cancer J. 11 (2), 41(2021).
  9. Miyamoto, K., Minami, Y. Cutting edge molecular therapy for acute myeloid leukemia. Int J Mol Sci. 21 (14), (2020).
  10. Yang, X., Wang, J. Precision therapy for acute myeloid leukemia. J Hematol Oncol. 11 (1), 3(2018).
  11. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  12. Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).
  13. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: Principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  14. Azqueta, A., et al. Technical recommendations to perform the alkaline standard and enzyme-modified comet assay in human biomonitoring studies. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 843, 24-32 (2019).
  15. Cotelle, S., Férard, J. F. Comet assay in genetic ecotoxicology: A review. Environ Mol Mutagen. 34 (4), 246-255 (1999).
  16. Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: Guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
  17. Pu, X., Wang, Z., Klaunig, J. E. Alkaline comet assay for assessing DNA damage in individual cells. Curr Protoc Toxicol. 65, 3.12.11-13.12.11 (2015).
  18. Liu, S. B., et al. Impact of flt3-itd length on prognosis of acute myeloid leukemia. Haematologica. 104 (1), e9-e12 (2019).
  19. Wang, Y., Lin, X., Wang, Y., Wang, G. Synergistic effect of adavosertib and fimepinostat on acute myeloid leukemia cells by enhancing the induction of DNA damage. Invest New Drugs. 42 (1), 70-79 (2024).
  20. Kumar, S., Yedjou, C. G., Tchounwou, P. B. Arsenic trioxide induces oxidative stress, DNA damage, and mitochondrial pathway of apoptosis in human leukemia (hl-60) cells. J Exp Clin Cancer Res. 33 (1), 42(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FLT3III
בדיקת שביט לכימות נזק ל-DNA בתאי 32D המבטאים מוטציה FLT3 לאחר חשיפה למעכבי FLT3 מסוג I ו-II
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.