Method Article

הבנת השינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית באמצעות מיקרוגרפים פלואורסצנטיים דינמיים ותלת מימדיים

DOI:

10.3791/68478

⸱

August 15th, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Stellenbosch University, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Electrical and Electronic Engineering, Stellenbosch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים את לוקלייזר האירועים המיטוכונדריאלי (MEL), תוסף ImageJ שימושי בכימות השינויים התלת-ממדיים בביקוע המיטוכונדריאלי ובפעילות ההיתוך לאורך זמן. אנו מתארים גם צינור עיבוד תמונה שימושי לניקוי מיקרוגרפים לפני ניתוח ב-ImageJ.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה הם אברונים דינמיים ביותר החיוניים להישרדותו של כל בעל חיים, ועוברים אירועי ביקוע והיתוך קבועים בתגובה לצרכים או ללחצים של המארח, מה שמוביל לעיצוב מחדש מתמיד של הרשת המיטוכונדריאלית. מסיבה זו, היכולת להעריך את הרשת המיטוכונדריאלית בתלת מימד, כמו גם לאורך זמן, מציעה יתרון בהבנת האופן שבו המערכת מגיבה לגורמים כמו לחץ או התערבות תרופתית. הדמיה פלואורסצנטית של הרשתות המיטוכונדריאליות של התאים מאפשרת את היכולת לדמיין ולנטר את השינויים הללו. עם זאת, הרשת המיטוכונדריאלית מתוארת לעתים קרובות כמבנה דו-ממדי וסטטי המוגדר על ידי מדדים לא סטנדרטיים. לכן, יצאנו לתאר צינור המאפשר למשתמש להכין את התמונות שלו ללוקלייזר האירועים המיטוכונדריאלי (MEL), כלי תוסף ImageJ המזהה אירועי ביקוע והיתוך ברשת המיטוכונדריאלית לאורך זמן ובאופן תלת מימדי, ובכך מציע תובנה לגבי השינויים הדינמיים שרשת זו עוברת. בנוסף, אנו מתארים את היתרונות של הבנת ביקוע והיתוך לאור השינויים בספירת המיטוכונדריה והשינויים המורפולוגיים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה הם אברונים דינמיים ביותר הקיימים בכל התאים האיקריוטיים, המספקים להם אנרגיה ומווסתים את חילוף החומרים שלהם. לפיכך, המיטוכונדריה נמצאים בצומת דרכים של מוות תאי והישרדות. מיטוכונדריה הוכחה כחיונית למגוון תהליכים, החל מהחמצה ליזוזומלית ופעולה מוטורית מולקולרית ועד התכווצות שרירים וירי סינפסות 1,2.

המיטוכונדריה עוברים אירועי ביקוע ואיחוי קבועים כדי לשמור על רשת מיטוכונדריאלית המייצרת ביעילות ATP בתגובה לדרישה המטבולית והלחץ של התא. ואכן, הוכח כי מיטוכונדריה עוברת ביקוע כדי להקל על מיטוכונדריה, הסרה סלקטיבית של שברי מיטוכונדריה. לפיכך, רק מיטו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. טיפול בתאים ורכישת מיקרוסקופיה

  1. תרבית תאי GT1-7 ב-8 צלחות תאיות ב-DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% Penstrep (מדיה מלאה). אפשר לתאים להיצמד למשך הלילה ולאחר מכן טפל ב-2.5 מ"מ מטפורמין הידרוכלוריד המיוצר ב-DMEM עם 10% FBS למשך 72 שעות, הקפד להחליף את המדיה כל 24 שעות. לטפל בתאים עם 10 מיקרומטר CCCP 6 שעות לפני ההדמיה ו-400 ננומטר של בפילומיצין A1 (Baf) 4 שעות לפני ההדמיה.
    הערה: ניתן לעשות זאת עם כל קו תאים אוקריוטי לבחירה.
  2. לפני ההדמיה, הכינו קוקטייל של מדיה שלמה שחוממה מראש המכילה 5 ננומטר Hoechst ו-100 ננומטר TMRE.
  3. החלף את אמצעי הטיפול בתאים בקוקטייל ההדמיה ואפשר זמן דגירה של 10 דקות לפני ה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בחירת תאים מתאימים
על המשתמשים להיות מודעים לכך שהרשת המיטוכונדריאלית משתנה בהתאם למצב המיטוטי של התא. אם הגרעין נראה בצורת משקולת או U, או אם יש חלל ליד הגרעין עם חוסר אות פלואורסצנטי, הדבר עשוי להצביע על כך שהתא מתקרב למיטוזה. במצב זה, סביר להניח שהמיטוכונדריה עוברים ביקוע עקב חלוקת תאים ולא בגלל ההתערבות הטיפולית והשפעתה על הרשת (איור משלים S8).

מטפורמין היא תרופה נגד סוכרת שהוכחה כגורמת לאיחוי מיטוכונדריאלי22. תאי היפותלמוס של עכ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שקיימות מספר הולך וגדל של גישות לתיאור מורפולוגיה מיטוכונדריאלית, קיימות טכניקות מוגבלות ללכוד כראוי את הדינמיקה המיטוכונדריאלית בצורה כמותית. בנוסף, יש לציין כי מורפולוגיה של רשת מיטוכונדריאלית כמו גם המנגנונים השולטים במורפולוגיה זו מגוונים באופיים. התוצאה היא רשתות המקושרות לצרכי התא, החל מתצורה מסועפת לתפוקת אנרגיה משופרת ועד לאזורי ביקוע נפרדים זמנית כדי להקל על מיטופגיה 24,25. פרוטוקול זה נועד למדוד את השינוי באירועי .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי אוניברסיטת סטלנבוש, דרום אפריקה, מועצת המחקר הרפואי של דרום אפריקה (SAMRC) וקרן המחקר הלאומית (NRF) של דרום אפריקה, כמו גם המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR) ומועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
8 כלים קאמרייםתרמו-פישר#Z734853
סף מותאםhttps://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold
בפילומיצין A1מעבדות LKT#B0026
קרבוניל ציאניד כלורופנילהידרזון (CCCP)מרק#C2759
מיקרוסקופ קונפוקליקארל זייס AGפלטפורמת LSM780 ELYRA PS.1 ברזולוציה גבוהה
מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)תרמו-פישר#341956062
סרום בקר עוברי (FBS)סיגמא-אולדריץ'#F0679
קישור Githubhttps://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin
GraphPad פריזמה v7.06
תאי GT1-7ATCCSCC116
הוקשטסיגמא-אולדריץ'H6024
ImageJ v1.53tפיג׳י
פקודות מאקרוhttps://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections
מטפורמיןפרמקופיאה אירופאיתM06050000
פניצילין/סטרפטומיצין (PenStrep)סיגמא-אולדריץ'#P4333
T25ביו-סמארט סיינטיפיק#70025
TMREתרמו-פישר#T669
טריפסיןסיגמא-אולדריץ'#T4049

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  2. Bhabha, G., Johnson, G. T., Schroeder, C. M., Vale, R. D. How dynein moves along microtubules. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial MorphologyMitochondrial DynamicsFluorescence MicrographsMitochondrial FissionMitochondrial FusionThree Dimensional ImagingImageJ AnalysisMitochondrial NetworkDeconvolution MicroscopyMitochondrial Event Localizer

Related Articles