Method Article

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה וניתוח למידת מכונה ללא תוויות של אורגנואידים במעי באמצעות הולוטומוגרפיה בקוהרנטיות נמוכה

DOI:

10.3791/68529

⸱

August 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Stem Cell and Regenerative Biology, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2Division of Pulmonary and Allergy Medicine, Department of Internal Medicine, Chungnam National University Hospital, 3Department of Physics, KAIST, 4KAIST Institute for Health Science and Technology, KAIST, 5Tomocube Inc., 6Center for Genome Engineering, Institute for Basic Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב להדמיה ברזולוציה גבוהה, ללא תוויות ותלת מימד של אורגנואידים באמצעות הולוטומוגרפיה קוהרנטית נמוכה. פרוטוקול זה מפרט הכנת תרבית אורגנואידים, רכישת הדמיה וניתוח תמונה חישובי, המאפשר הדמיה בזמן אמת של דינמיקה מבנית ותגובות תרופות באורגנואידים חיים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה מדויקת ונטולת תוויות של אורגנואידים במעי היא חיונית לחקר המורפולוגיה, דינמיקת הגדילה והתגובות שלהם לגירויים סביבתיים. הולוטומוגרפיה (HT) מספקת הדמיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה (3D) של אורגנואידים חיים ללא צורך בסמנים פלואורסצנטיים, ובכך ממזערת את הפוטוטוקסיות ושומרת על שלמות הדגימה. הדמיה מבוססת פאזה בזמן אמת מאפשרת מעקב רציף וללא תוויות של שינויים מבניים ותפקודיים. על ידי שימוש במקדם השבירה כניגודיות הדמיה פנימית, שיטה זו מאפשרת כימות של תכונות ביופיזיקליות כגון נפח, צפיפות חלבון ותכולת חלבון. נתוני ההדמיה מעובדים עוד יותר באמצעות פילוח מונע למידת מכונה וחילוץ תכונות כדי לתמוך בניתוח עקבי ובתפוקה גבוהה. פרוטוקול זה מפרט את זרימת העבודה הניסיונית המלאה לשימוש ב-HT קוהרנטי נמוך במחקר אורגנואידים, המכסה הכנת אורגנואידים, רכישת הדמיה וניתוח נתונים מבוסס למידת מכונה. על ידי שילוב פילוח חישובי והערכות כמותיות, גישה זו מאפשרת הערכה חסרת פניות של תכונות אורגנואידים מרכזיות, כולל כדאיות, ארגון מבני ותגובה לתרופות. היכולת ללכוד שינויים מורפולוגיים בזמן אמת ברזולוציה תת-תאית הופכת פרוטוקול זה לרלוונטי ביותר למחקרים מבוססי אורגנואידים ברפואה רגנרטיבית, מודלים של מחלות וסינון תרופות. המתודולוגיה שלב אחר שלב המתוארת כאן מאפשרת שחזור והסתגלות רחבה על פני מערכות אורגנואידים שונות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים הם גרסאות ממוזערות תלת מימדיות (3D) של איברים הגדלים מתאי גזע, המסוגלים לסכם מאפיינים מבניים ותפקודיים מרכזיים של איברים אמיתיים במבחנה1. חוקרים פיתחו מערכות אורגנואידים למגוון רחב של רקמות - כולל המעי, המוח, הריאות, הכבד והכליות - כל אחת מהן מדגימה את הארכיטקטורה המאורגנת את עצמה ואת מגוון סוגי התאים המזכירים את מקבילתה in vivo . על ידי שיקוף ארכיטקטורת איברים מקומיים ומורכבות רב-תאית, אורגנואידים משמשים כמערכות מודל עוצמתיות לחקר התפתחות אנושית, התחדשות רקמות ומנגנוני מחלה1. הם הפכו לכלים מרכזיים למידול מחלות וגילוי תרופות, ומאפשרים לחוקרים לחקור מסלולי מחלה ולבדוק טיפולים חדשים על רקמות תלת מימד ספציפיות לחולה במעבדה2. יש לציין כי אורגנואידים מבטיחים גם ברפואה רגנרטיבית3: ניתן להשתיל רקמות שמקורן באורגנואידים in vivo כדי לתקן נזקים, כפי שהודגם עם אורגנואידים במעי ובכבד, מה שמדגיש את הפוטנציאל שלהם לשיקום תפקוד האיברים4. רבגוניות זו הופכת את האורגנואידים לחיוניים במחקר ביו-רפואי מודרני וברפואה מותאמת אישית.

בהתחשב בהרכב הרב-תאי והמורכבות המבנית התלת-ממדית שלהם, לכידת וניתוח דינמיקת אורגנואידים היא קריטית. עם זאת, טכניקות הדמיה קונבנציונליות מתמודדות עם מגבלות משמעותיות בפתרון מבנים ודינמיקה של אורגנואידים, ולעתים קרובות מייצרות תמונות דו-ממדיות שאינן מייצגות את מצבן הפיזיולוגי המלא5.

מיקרוסקופיה של ברייטפילד היא שיטה בשימוש נרחב ולא פולשנית ללכידת אורגנואידים. הוא עוקב בנוחות אחר צמיחה ומורפולוגיה אך מספק ניגודיות מוגבלת בדגימות תלת מימד לא מוכתמות. בנוסף, הוא חסר חתך אופטי, וכתוצאה מכך רזולוציה ירודה של מבנים פנימיים. אורגנואידים נראים שקופים ברובם, מה שמפריע לזיהוי מאפיינים עדינים מתחת לפני השטח6. ניגודיות פאזה משפרת את הנראות על ידי המרת שינויי פאזה להבדלי עוצמה, וחושפת ארכיטקטורה כללית (למשל, לומן מרכזי) ללא כתמים. למרות התועלת שלו לתצפית בזמן אמת, ניגודיות הפאזה סובלת מחפצי הילה, רזולוציה נמוכה ועומק חדירה מוגבל, מה שהופך אותה לפחות יעילה עבור אורגנואידים עבים יותר7.

חתך סדרתי ואחריו צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) וצביעה חיסונית מבוססת נוגדנים נמצאת בשימוש נרחב לניתוח מיקרו-מבנה אורגנואיד והרכב תאי8. טכניקות עיבוד רקמות משופרות, כגון הטמעת פרפין קבוע בפורמלין (FFPE) והקפאה, משפרות את שימור המורפולוגיה, כאשר FFPE מציע תוצאות מעולות9. הטמעת אורגנואידים בהידרוג'לים כמו אגרוז וצנטריפוגה מיישרת מספר דגימות בקטע אחד, ומשפרת את יעילות הניתוח. קטעים מוכתמים ב-H&E של אורגנואידים של גידול שמקורם בחולה משקפים את ההיסטולוגיה המקורית של הגידול, בעוד צביעה אימונופלואורסצנטית מדגישה סמנים כמו CK8 לזיהוי תאים10. עם זאת, טכניקות אלה אינן יכולות לנטר אורגנואידים חיים ועלולות להכניס חפצים כגון קמטים או עיוות של רקמות במהלך החיתוך.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית נמצאת בשימוש נרחב להדמיה אורגנואידית, ומניבה חתכים אופטיים ברזולוציה גבוהה (תת-מיקרומטר) המאפשרים הדמיה מפורטת של ארכיטקטורת האורגנואידים והרכב התאים11,12. עם זאת, הדמיה קונפוקלית של אורגנואידים תלת מימדיים מוגבלת בדרך כלל לשכבות שטחיות (עד 100 מיקרומטר עומק) ויכולה להיות גוזלת זמן ופוטוטוקסית עקב תאורת לייזר סורקת נקודה13. מיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור (LSFM) מתגבר על חלק מהמגבלות הללו על ידי הארת מישור ההדמיה בלבד, ומשיג הדמיה נפחית מהירה של אורגנואידים שלמים עם מינימום פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיות14,15; עם זאת, טכניקה זו דורשת לעתים קרובות ניקוי רקמות להדמיה אופטימלית של דגימות עבות. בנוסף, עומק ההדמיה של LSFM מוגבל על ידי אי-התאמות של פיזור אור ומקדם שבירה (RI), שניתן להפחית באמצעות אופטיקה אדפטיבית, הדמיה מרובת תצוגות ואורכי גל עירור אופטימליים16. הרכבה לדוגמא מציגה גם עיוותים מבניים, בעוד שמערכי נתונים תלת מימדיים גדולים מציבים אתגרים חישוביים באחסון וניתוח. ההתקדמות האחרונה, כולל טכניקות תיוג גנטיות משופרות, ריאגנטים חדשים לניקוי, אופטיקה אדפטיבית וניתוח תמונה מונע בינה מלאכותית, מתייחסות למגבלות אלה, מה שהופך את LSFM לאפשרי יותר ויותר למחקר אורגנואידים7.

למרות ההתקדמות הללו, טכניקות הדמיה פלואורסצנטיות תלת מימדיות מציבות מספר אתגרים לניטור ארוך טווח של אורגנואידים חיים. ראשית, השימוש בתיוג פלואורסצנטי מציג השפעות פוטוטוקסיות ומפריע לתהליכים ביולוגיים, ומציב אתגרים למחקרי הדמיה חיים ממושכים17. שנית, תיוג מבוסס נוגדנים סובל מחדירה מוגבלת עקב מחסומי דיפוזיה בתוך מבנים אורגנואידים צפופים, הדורשים שיטות חדירה וניקוי רקמות מתקדמות, שלוקחות יותר מ-10 ימי דגירה לשימוש בנוגדנים ראשונים ומשניים18. שלישית, טרנספקציה וביטוי חלבון פלואורסצנטי יציב באורגנואידים נותרים לא יעילים, מכיוון שגישות העברת גנים קונבנציונליות נאבקות בסביבות תלת מימד19. רביעית, טכניקות ניקוי אופטיות, החיוניות להדמיה עמוקה, מובילות לעתים קרובות לאובדן אות פלואורסצנטי ועיוות רקמות, מה שמחייב פרוטוקולי ניקוי אופטימליים המאזנים שקיפות ושימור הקרינה20.

כדי להתמודד עם מגבלות אלה, הולוטומוגרפיה (HT) הוצגה כטכניקה להדמיית אורגנואידים חיים ללא תווית ברזולוציה גבוהה לאורך זמן. HT, הידוע גם בשם הדמיית פאזה כמותית תלת מימדית, הוא שיטה נטולת תוויות ברזולוציה גבוהה המאפשרת הדמיה כמותית בזמן אמת של אורגנואידים תוך שמירה על מצבם הפיזיולוגי המקורי. העיקרון של HT מקביל לטומוגרפיה ממוחשבת של קרני רנטגן; על ידי לכידת תמונות שדה אופטי דו-ממדיות מרובות בתנאי תאורה שונים, התפלגות ה-RI התלת-ממדית של דגימה לא מסומנת משוחזרת באמצעות פתרון משוואת גל הפוך 21,22,23. HT יושם באופן נרחב בתחומים ביולוגיים שונים, כולל המטולוגיה24,25, עיבוי פאזה בביולוגיה של התא26, מיקרוביולוגיה27 והיסטופתולוגיה28. לאחרונה, יכולת ההדמיה התלת-ממדית ברזולוציה גבוהה ונטולת תוויות מנוצלת יותר ויותר למחקר אורגנואידים 21,22,23,29, ומציעה גישה לא פולשנית לחקר הדינמיקה המבנית והתפקודית שלהם.

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשימוש ב-HT קוהרנטי נמוך בניטור ארוך טווח וללא תוויות של אורגנואידים במעי הדק (sIOs) של עכברים. שיטה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת של צמיחת אורגנואידים ותגובות לתרופות במשך 24 שעות תוך מתן מדידות כמותיות של נפח האורגנואידים, צפיפות החלבון ותכולת החלבון, מה שמקל על ניתוח קפדני ומונחה נתונים של התנהגות אורגנואידים. כדי לחקור שינויים מורפולוגיים באורגנואידים, טיפלנו בדגימות עם ציספלטין, חומר כימותרפי מבוסס פלטינה הידוע כגורם לאפופטוזיס על ידי יצירת קישורים צולבים של DNA ועיכוב שכפול תאים30. בעוד שהדמיית RI תלת מימדית לוכדת פרטים מבניים, ניתוח שיטתי חיוני לכימות דינמיקת אורגנואידים. כדי להשיג זאת, אנו משלבים את ilastik, ערכת כלים לפילוח מבוססת למידת מכונה31 כדי להבדיל בין אזורים אורגנואידים מהרקע. פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה המלאה, כולל הכנת תרבית אורגנואידים, רכישת HT תלת מימדית, פילוח מבוסס למידת מכונה וניתוח כמותי מטומוגרפיות RI. על ידי הצעת מסגרת הדמיה ניתנת להרחבה, ניתנת לשחזור ולא פולשנית, גישה זו קובעת סטנדרט חדש למחקר אורגנואידים עם יישומים רחבים במודלים של מחלות, רפואה רגנרטיבית וסינון תרופות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה מסופקים בטבלת החומרים. מוצרים מקבילים מיצרנים שונים עשויים לשמש כחלופות. תהליך סכמטי של הפרוטוקול כולו מוצג באיור 1.

1. הכנת מדגם

  1. הכנת מדיום תרבית sIO
    1. הכן את מדיום התרבות הזמין מסחרית על פי הוראות היצרן. עקר את מדיום התרבות על ידי סינון דרך יחידת פילטר של 0.22 מיקרומטר.
      הערה: אם המדיום מוכן כולו בתנאים סטריליים במכסה המנוע של תרבית תאים וכל הרכיבים מעוקרים מראש (למשל, מסופקים בבקבוקים ובקבוקונים סטריליים), ייתכן שלא יהיה צורך בסינון דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר.
    2. יש לצרוך 15 מ"ל של מדיום מוכן לצינורות אחסון סטריליים. יש לחמם את המדיום המצוין לטמפרטורת החדר (15 - 25 מעלות צלזיוס) לפני השימוש בתרבית אורגנואידים.
  2. הפשרת מלאי sIO
    1. הפשירו במהירות את ציר האורגנואידים הקפוא תוך 2 דקות באמצעות אמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. העבירו את תרחיף האורגנואיד המופשר לצינור מיקרוצנטריפוגה וצנטריפוגה ב-150 x גרם למשך 3 דקות כדי לגלול את האורגנואידים.
    2. הסר בזהירות את הסופרנטנט כדי לשטוף את ה-DMSO, ולמזער את ההשפעות הציטוטוקסיות הפוטנציאליות.
    3. הוסף מדיה ומטריצה חוץ-תאית טרייה (ECM) ביחס של 1:4 ופיפטה בעדינות כדי להבטיח השעיה אחידה של הגלולה. הוצא 15 מיקרוליטר לכל כיפה בכל באר של צלחת של 48 בארות. שמור על ECM על קרח כדי למנוע פילמור מוקדם.
    4. הנח את הצלחת הפוכה בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך שעה אחת כדי לאפשר פילמור ECM. לאחר פילמור יש להוסיף בזהירות 200 מיקרוליטר מדיה טרייה לכל באר.
      הערה: פרוטוקול זה תואם לצלחות הדמיה מסחריות שונות ולצלחות באר. כוונן את עוצמת המדיה בהתאם לסוג הבאר כדי להבטיח שכיפת ה-ECM שקועה במלואה.
  3. העברת sIOs
    הערה: אורגנואידים נוטים להיצמד לקצות הפיפטה. כדי למזער את ההיצמדות, קצות פיפטה רטובים מראש עם המדיום.
    1. לשאוף בילה בינוני. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת התאוששות תאים לכל באר ודגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להקל על פירוק ECM ואחזור אורגנואידים.
    2. אסוף את תרחיף האורגנואיד על ידי פיפטינג עדין והעביר אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה בחום של 150 x גרם למשך 3 דקות, ואז הסר בזהירות את הסופרנטנט.
    3. (אופציונלי) כדי לעבור כתאים בודדים, בצע אחת משיטות הדיסוציאציה הבאות:
      1. שיטה אנזימטית: הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת דיסוציאציה של תא בודד לגלולה ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 אינקובטור למשך 1-2 דקות. הוסף 150 מיקרוליטר מדיה לנטרול. בצע פיפטינג או הקשה עדינה. צנטריפוגה ב -150 x גרם למשך 3 דקות והסר את הסופרנטנט והשאיר רק את הכדור.
        הערה: הימנע מדגירת יתר, מכיוון שחשיפה ממושכת עלולה להזיק מאוד לתאים.
      2. דיסוציאציה מכנית: השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מדיום תרבית. בעזרת פיפטה P200, פיפטה למעלה ולמטה פי 20-30 כדי לפרק מכנית אורגנואידים לשברים קטנים יותר או לתאים בודדים. צנטריפוגה ב-150 x גרם למשך 3 דקות, ואז שואבים את הסופרנטנט ושומרים על הגלולה.
    4. הוסף מדיה ו-ECM טרי ביחס של 1:4 ופיפטה בעדינות כדי להבטיח השעיה אחידה של הגלולה. הוצא 15 מיקרוליטר לכל כיפה בכל באר של צלחת של 48 בארות.
    5. הנח את הצלחת הפוכה בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך שעה אחת כדי לאפשר ל-ECM להתפלמר.
    6. לאחר פילמור יש להוסיף 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית טרי לכל באר ולמלא את הבארות החיצוניות הריקות ב- PBS כדי למנוע אידוי. החלף את מדיום התרבות כל 2-3 ימים והעביר את האורגנואידים מדי שבוע. התאם את מרווח המעבר בהתאם לגודל האורגנואיד הרצוי.
  4. טיפול תרופתי
    1. הכן תמיסת מלאי של 10 מ"מ של ציספלטין על ידי המסת 3.00 מ"ג אבקת ציספלטין (MW ≈ 300.05 גרם/מול) ב-1 מ"ל של DMSO. מערבולת קצרה והגנה על התמיסה מפני אור באמצעות צינורות ענבר או על ידי עטיפתם בנייר אלומיניום.
    2. כדי להכין את מדיום הטיפול, יש לדלל את מלאי הציספלטין של 10 מ"מ 1:1,000 במדיום תרבית sIO שלם כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מיקרומטר ציספלטין ו-0.1% DMSO.
    3. לבקרת הרכב, הכן 0.1% DMSO במדיום תרבית כדי להתאים לריכוז ה-DMSO הסופי ללא ציספלטין.
    4. הסר את המדיום המושקע מתרביות sIO והחלף אותו בעדינות במדיום המכיל ציספלטין של 10 מיקרומטר או מדיום בקרה DMSO בלבד.
    5. לאחר הטיפול יש להעביר את הדגימות לחממת מערכת ההדמיה.

2. הדמיית הולוטומוגרפיה בקוהרנטיות נמוכה באמצעות תוכנת הפעלה

  1. הכנת מדגם להדמיה
    1. הוצא 15 מיקרוליטר של כיפת אורגנואיד-ECM על צלחת הדמיה תחתונה #1.5 על ידי ביצוע ההליך המתואר בשלבים 1.3.1-1.3.4. מניחים כל כיפה בכלי קרוב ככל האפשר למרכז להדמיה אופטימלית.
    2. לפני הפילמור, יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת כדי לאפשר לאורגנואידים להתיישב לתחתית.
    3. הנח את הצלחת הפוכה בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך שעה אחת כדי לפלמר את ה-ECM. לאחר מכן, הוסף בעדינות מספיק מדיום תרבית כדי לטבול את האורגנואידים במלואם.
      הערה: כוונן את עוצמת הקול הבינונית כדי להבטיח שהאורגנואידים שקועים במלואם בהתאם לגודל צלחת ההדמיה עם תחתית הכיסוי.
    4. 5 ימים לאחר המעבר, שטפו את הדגימה פי 2-3 עם PBS מיד לפני ההדמיה כדי להסיר פסולת ולהפחית חפצים אופטיים.
  2. הגדרת הדמיה
    1. הפעל את הבקר הסביבתי כדי לשמור על כדאיות הדגימה. יחידת בקר התא מתאימה אוטומטית את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס ואת ריכוז ה-CO2 ל-5%.
    2. לחץ על כפתור הדלת בחזית המכשיר כדי לפתוח את הדלת. הוסף מים ליצירת שכבה דקה בתוך באר החדר כדי למנוע את התייבשות אמצעי התרבות.
    3. הנח את צלחת ההדמיה במחזיק כלי מתאים, הכנס אותה לתא ההדמיה ואבטח אותה באמצעות סיכה כדי למנוע תנועה. ודא שהמנה מחוברת היטב למחזיק הכלי ללא הטיה.
    4. סגור את דלת המכשיר באמצעות לחצן הדלת כדי לחסום הפרעות אור חיצוניות.
    5. הפעל את תוכנת TomoStudio X והיכנס. לחץ על התחל כדי לפתוח את החלון הראשי.
    6. לחץ על הוסף פרויקט בפינה השמאלית העליונה והקצה פרמטרים ניסיוניים (למשל, שם פרויקט, סוג בינוני, סוג מדגם וכו'). לוח הדגימה ייווצר אוטומטית. ודא שסוג המדיום הנכון מוקצה לשימוש ב-RI המתאים בניסוי.
    7. לחץ על הבאר הרצויה בחלונית ולחץ על צור בחלק העליון כדי לרשום את הבארות כדגימות.
    8. לחץ על הגדרת החזר ROI בפינה השמאלית העליונה כדי להגדיר את אזור העניין (ROI) במנה. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על הפעל ניסוי בפינה השמאלית התחתונה כדי לפתוח את חלון רכישת התמונות.
    9. לחץ על Load Vessel בפינה השמאלית העליונה. תופיע תמונת שדה בהיר. כוונן את מיקום Z באמצעות הלחצנים +Z ו-Z כדי להתמקד.
    10. בכרטיסייה הדמיה בודדת, התאם את גודל ההחזר על ההשקעה. לכוד אורגנואידים בשדה ראייה של 160 μm x 160 μm ורכוש ערימות ציריות בעומק של עד 140 μm. עבור אורגנואידים גדולים יותר, רכוש טומוגרמות RI מרובות ותפר תמונות על-ידי בחירה בתיבת הסימון Tile Imaging בתחתית.
    11. נווט אל הכרטיסייה הדמיה של קיטועי זמן כדי לקבוע תצורה של הדמיה לטווח ארוך. הגדר את משך הזמן וזמן המרווח לפי הצורך. בניסוי זה, הדמיית זמן-lapse בוצעה במרווחים של 10 דקות על פני תקופה של 24 שעות, והניתוח נערך במרווחים של שעתיים לאורך אותו משך זמן.
    12. לחץ על סריקה סמל כדי ללכוד את מיקום ההחזר הנוכחי על ההשקעה. מרכז ידנית את כיפת ה-ECM באמצעות הדמיית שדה בהיר. לחץ על כפתור BF כדי להתאים את ערכי העוצמה והחשיפה להדמיית שדה בהיר.
    13. בחר ROI על-ידי הזזת תיבת ה-ROI שמופיעה בחלונית Preview. לאחר מציאת ההחזר על ההשקעה הרצוי, לחץ על הוסף נקודה בתחתית. רשימת נקודות ההדמיה תופיע.
    14. לחץ על השג כדי להתחיל בהדמיה. נתוני התמונה הגולמיים יירכשו.
  3. רכישת תמונות
    הערה: תהליך זה יוצר קובץ משותף של Tomocube (TCF) מנתוני תמונה גולמיים. יש לעבד את נתוני התמונה הגולמית לקובץ TCF, המכיל מספר סוגים של תמונות, כגון טומוגרפיה של RI והקרנה בעוצמה מרבית. הטומוגרפיה של RI מייצגת את התפלגות ה-RI התלת-ממדית של הדגימה, והקרנת העוצמה המקסימלית מציגה את ערך ה-RI הגבוה ביותר עבור כל מיקום רוחבי במישור ה-XY.
    1. גרור ושחרר קובצי תמונה גולמיים לשרת העיבוד של HTX. נקישה תהליך כדי ליצור קובץ TCF מקובץ התמונה הגולמית.
    2. כדי להציג את הטומוגרפיות של RI שנוצרו בקובץ TCF, השתמש ב- TomoAnalysis Viewer, MATLAB או Python. כדי להציג קובץ TCF ב-MATLAB, השתמש בפונקציות כמו h5info ו-h5read. באופן דומה, ב-Python, השתמש בחבילת h5py לקריאת קבצי H5.

3. ניתוח תמונות

  1. פילוח תמונות מבוסס למידת מכונה
    1. ייצא קובץ תמונה TCF לפורמט HDF5 (קובץ קידוד משלים 1) כדי להבטיח שהנתונים יהיו בפורמט רב מימדי התואם ל-ilastik.
    2. פתח את ilastik ונווט אל קובץ > פרויקט חדש. בחר סיווג פיקסלים במקטע זרימות עבודה של סגמנטציה. שמור את קובץ הפרוייקט בספריה ייעודית.
    3. טען את קובץ HDF5 על ידי ניווט אל 1. הכרטיסיה נתוני קלט. לחץ על Add New File, בחר את ערכת הנתונים H5 המתאימה וודא שערוצי התמונה הנכונים מוקצו.
    4. נווט אל 2. הכרטיסייה בחירת תכונה לבחירת תכונות רלוונטיות (צבע/עוצמה, קצה, מרקם) כדי לייעל את הפילוח.
      הערה: בחירת התכונה עשויה להשתנות בהתאם למערך הנתונים ולמאפייני התמונה. עבור הניתוח הנוכחי, התכונות שנבחרו כללו: צבע/עוצמה (σ = 1.60), קצה (σ = 3.50) ומרקם (σ = 1.60). אופטימיזציה המבוססת על גישה היוריסטית עשויה להידרש בהתאם למורכבות התמונה. לחלופין, ניתן להשתמש בפונקציית Suggest Features > Run Feature Selection ב-ilastik כדי לזהות קבוצה אופטימלית של פרמטרים.
    5. ב 3. כרטיסיית אימון, סמן אזורים אורגנואידים ולא אורגנואידים על-ידי החלת משיכות מברשת בצבעים מובחנים. כדי לשפר את נאמנות הפילוח, הוסף בזהירות ביאורים לאזורים סביב הגבולות.
    6. לחץ על Live Update כדי להציג תצוגה מקדימה של תוצאות הפילוח ולבצע שיפורים בהתאם לצורך.
    7. נווט אל 4. ייצוא חיזוי. בבחירת המקור, בחר פילוח פשוט כדי לייצא תחזיות עם תוויות. לחץ על ייצוא הכל, וודא שפורמט הפלט מוגדר ל-.h5 או .tiff, בהתאם לדרישות הניתוח במורד הזרם.
  2. ניתוח תכונות כמותי
    הערה: שלב פרוטוקול זה מבוצע ב-MATLAB, כאשר כל הליך מפורט בקובץ קידוד משלים 2.
    1. על-ידי שילוב הטומוגרפיה של RI עם תמונת המסיכה, צור תמונת RI עם מסיכה הכוללת רק את האזור האורגנואידי.
    2. באמצעות תמונת ה-RI המוסווה, חשב פרמטרים כמותיים כגון נפח אורגנואיד, צפיפות חלבון ותכולת חלבון.
      1. נפח: חשב את הנפח הכולל של האורגנואיד על-ידי הכפלת מספר הפיקסלים במסיכה המפולחת ברזולוציית הפיקסלים עבור X, Y ו- Z. חשב את מספר הפיקסלים על-ידי ספירת כל ערכי הווקסל במערך המסיכה המסומן בתווית אורגנואיד, באמצעות הפונקציה המובנית MATLAB Sum.
        הערה: רזולוציית הפיקסלים נקבעת על-ידי מערכת ההדמיה וניתן למצוא אותה תחת Data > 3D attributes group במבנה HDF5.
      2. צפיפות חלבון: חשב את צפיפות החלבון על ידי הפחתת ערך ה-RI הבינוני מה-RI האורגנואיד הממוצע וחלוקתו בתוספת מקדם שבירת החלבון.
        1. RI בינוני: מדוד את ה-RI של המדיום שמסביב באמצעות רפרקטומטר לפני הניתוח.
        2. ערך RI ממוצע: קבע את ה-RI הממוצע של האורגנואיד על ידי חישוב ממוצע ערכי ה-RI של ווקסלים הממוקמים בתוך מסכת האורגנואיד.
        3. תוספת מקדם שבירה של חלבון (α): השתמש בקבוע אמפירי שדווח בעבר הנגזר ממחקרי תוספת מקדם שבירה.
      3. תכולת חלבון: חשב את תכולת החלבון הכוללת על ידי הכפלת הנפח שנקבע בשלב 3.2.2.1 בצפיפות החלבון המתקבלת בשלב 3.2.2.2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 ממחיש את זרימת העבודה הסכמטית עבור הדמיה 4D וניתוח כמותי של sIOs. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה חיה רציפה והערכה מקיפה של sIOs באמצעות תהליך בן ארבעה שלבים: תרבית, הדמיה 4D, עיבוד תמונה וניתוח כמותי (איור 1D).

לאחר תקופת דגירה של 5 ימים, sIOs בוגרים הועברו לצלחות הדמיה עם תחתית כיסוי לצורך הדמיה באמצעות הולוטומוגרפיה קוהרנטית נמוכה (HT) (איור 1A). טכניקת הדמיה זו משחזרת טומוגרמות RI באמצעות אלגוריתם דה-ק...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הולוטומוגרפיה מציגה גישה רבת עוצמה להדמיה ללא תוויות ברזולוציה גבוהה של אורגנואידים חיים, המתגברת על אתגרים רבים הקשורים לטכניקות הדמיה קונבנציונליות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים מתודולוגיה מקיפה ליישום HT קוהרנטי נמוך במחקר sIO, המאפשרת הדמיה כמותית בזמן אמת של מורפולוגיה אורגנואידית, דינמיקת גדילה ותגובות לטיפול תרופתי. השילוב של פילוח מבוסס למידת מכונה וניתוח כמותי משפר עוד יותר את היכולת האנליטית של גישת הדמיה זו, ומספק הערכות בלתי מוטות וניתנות לשחזור של התנהגות אורגנואידים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ל-M.J.L., J.H.L., S.M.L. ו-Y.K.P. יש אינטרסים פיננסיים ב-Tomocube Inc., חברה שמסחרה הולוטומוגרפיה ומכשירי הדמיית פאזה כמותיים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (RS-2024-00442348, RS-2024-00440577, 2022M3H4A1A02074314), המכון הקוריאני לקידום טכנולוגיה (KIAT) באמצעות תוכנית המו"פ השיתופית הבינלאומית (P0028463), ומענק הקרן הקוריאנית לרפואה רגנרטיבית (KFRM) במימון ממשלת קוריאה (משרד המדע והתקשוב ומשרד הבריאות והרווחה) (21A0101L1-12). איסוף הנתונים בוצע על ידי M.J.L. ו-J.H.L., כאשר J.H.L. אחראי על עיבוד הנתונים ו-J.M.C. לניתוח נתונים. כל המחברים תרמו לכתיבת כתב היד. אנו מודים לצ'ולמין או ולצ'ונגה לי על דיונים טכניים חשובים וסיוע בהכנת הדמות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צלחת 48 בארות קורנינג3548מנת תרבות
פתרון לשחזור תאים קורנינג354253פירוק מטריג'ל 
ציספלטיןסופלקוPHR1624לא ישים
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אולדריץ'D2650הרכב
צינור אפנדורףקורנינגMCT-175-C-Sלא ישים
שרת עיבוד HTXTomocube Inc., קוריאהלא ישיםשרת עיבוד נתונים
HT-X1Tomocube Inc., קוריאהלא ישיםתוכנת הפעלה
אילסטיקלא ישיםלא ישיםערכת כלים לפילוח מבוססת למידת מכונה
מחזיק כלי הדמיה Tomocube Inc., קוריאהלא ישיםמחזיק צלחת הדמיה
מדיום גידול אורגנואיד IntestiCult (עכבר)טכנולוגיות STEMCELL#06005מדיום תרבית מוכן מראש זמין מסחרית 
מטלבמת'וורקסמטלב 2024aתוכנה לעיבוד תמונה
מטריגלקורנינג356231ECM עבור אורגנואידים תלת-ממדיים
מיליפור  סטריטופ  מסנן עליון של בקבוק ואקוםמרקS2GPT05RE0.22 μ יחידת סינון M לעיקור בינוני
אורגנואידים במעיים של עכבריםטכנולוגיות STEMCELL#70931לא ישים
רפרקטומטראטגוR-5000מחשבון מקדם שבירה
טומודישTomocube Inc., קוריאה901002-02#1.5 צלחת הדמיה עם תחתית החלקה
טומוסטודיו XTomocube Inc., קוריאהלא ישיםתוכנת הדמיה
טריפלג'יבקו12604דיסוציאציה של תא בודד

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  2. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  3. Arjmand, B., et al. Advancement of organoid technology in regenerative medicine. Regen Eng Transl Med. 9 (1), 83-96 (2023).
  4. Zhang, W., et al. Patch grafting of organoids of stem/progenitors into solid organs can correct genetic-based disease states. Biomaterials. 288, 121647(2022).
  5. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  6. Park, J., et al. Artificial intelligence-enabled quantitative phase imaging methods for life sciences. Nat Meth. 20 (11), 1645-1660 (2023).
  7. Fei, K., Zhang, J., Yuan, J., Xiao, P. Present application and perspectives of organoid imaging technology. Bioengineering. 9 (3), 121(2022).
  8. Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. J Toxicol Pathol. 31 (1), 81-85 (2018).
  9. Yoshimoto, S., Taguchi, M., Sumi, S., Oka, K., Okamura, K. Establishment of a novel protocol for formalin-fixed paraffin-embedded organoids and spheroids. Biol Open. 12 (5), bio059882(2023).
  10. Badder, L. M., et al. 3D imaging of colorectal cancer organoids identifies responses to Tankyrase inhibitors. PLoS One. 15 (8), e0235319(2020).
  11. Lacin, M. E., Yildirim, M. Applications of multiphoton microscopy in imaging cerebral and retinal organoids. Front Neurosci. 18, 1360482(2024).
  12. Brémond Martin, C., Simon Chane, C., Clouchoux, C., Histace, A. Recent trends and perspectives in cerebral organoids imaging and analysis. Fronti Neurosci. 15, 629067(2021).
  13. Smits, L. M., Schwamborn, J. C. Midbrain organoids: a new tool to investigate Parkinson's disease. Front Cell Dev Biol. 8, 359(2020).
  14. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  15. Delgado-Rodriguez, P., Brooks, C. J., Vaquero, J. J., Munoz-Barrutia, A. Innovations in ex vivo light sheet fluorescence microscopy. Prog Biophys Mol Biol. 168, 37-51 (2022).
  16. Masson, A., et al. High-resolution in-depth imaging of optically cleared thick samples using an adaptive SPIM. Sci Rep. 5 (1), 16898(2015).
  17. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra-and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  18. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. elife. 9, e52904(2020).
  19. Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucl Acids Res. 46 (12), e70-e70 (2018).
  20. Susaki, E., Takasato, M. Perspective: Extending the Utility of Three-Dimensional Organoids by Tissue Clearing Technologies. Front Cell Dev Biol. 9, 1-12 (2021).
  21. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nat Photon. 12 (10), 578-589 (2018).
  22. Kim, G., et al. Holotomography. Nat Rev Meth Primers. 4 (1), 51(2024).
  23. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Comm. 1 (4), 153-156 (1969).
  24. Kim, H., et al. Integrating holotomography and deep learning for rapid detection of NPM1 mutations in AML. Sci Rep. 14 (1), 23780(2024).
  25. Kim, S. Y., et al. Label-free imaging and evaluation of characteristic properties of asthma-derived eosinophils using optical diffraction tomography. Biochem BiophysRes Comm. 587, 42-48 (2022).
  26. Kim, T., et al. RNA-mediated demixing transition of low-density condensates. Nat Comm. 14 (1), 2425(2023).
  27. Kim, G., et al. Rapid species identification of pathogenic bacteria from a minute quantity exploiting three-dimensional quantitative phase imaging and artificial neural network. Light Sci Appl. 11 (1), 190(2022).
  28. Hugonnet, H., et al. Multiscale label-free volumetric holographic histopathology of thick-tissue slides with subcellular resolution. Adv Photon. 3 (2), 026004-026004 (2021).
  29. Lee, M. J., et al. Long-term three-dimensional high-resolution imaging of live unlabeled small intestinal organoids via low-coherence holotomography. Exp Mol Med. 56 (10), 2162-2170 (2024).
  30. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nat Rev Drug Discov. 4 (4), 307-320 (2005).
  31. Berg, S., et al. Ilastik: interactive machine learning for (bio) image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  32. Sbrana, F., et al. Label-free three-dimensional imaging and quantitative analysis of living fibroblasts and myofibroblasts by holotomographic microscopy. Microscopy Res Tech. 87 (11), 2757-2773 (2024).
  33. Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. On the distribution of protein refractive index increments. Biophys J. 100 (9), 2309-2317 (2011).
  34. Wallaeys, C., Garcia-Gonzalez, N., Libert, C. Paneth cells as the cornerstones of intestinal and organismal health: a primer. EMBO Mol Med. 15 (2), e16427(2023).
  35. Hooper, L. V. Epithelial cell contributions to intestinal immunity. Adv Immunol. 126, 129-172 (2015).
  36. Atanga, R., Singh, V., In, J. G. Intestinal enteroendocrine cells: present and future druggable targets. Int J Mol Sci. 24 (10), 8836(2023).
  37. Dicarlo, M., et al. Quercetin exposure suppresses the inflammatory pathway in intestinal organoids from winnie mice. Int J Mol Sci. 20 (22), 5771(2019).
  38. Miura, S., Suzuki, A. Generation of mouse and human organoid-forming intestinal progenitor cells by direct lineage reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (4), 456-471.e5 (2017).
  39. Barer, R. Determination of dry mass, thickness, solid and water concentration in living cells. Nature. 172 (4389), 1097-1098 (1953).
  40. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C538-C544 (2008).
  41. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. Sci Rep. 8 (1), 9183(2018).
  42. Kim, Y. S., et al. Combining three-dimensional quantitative phase imaging and fluorescence microscopy for the study of cell pathophysiology. Yale Biol Med. 91 (3), 267(2018).
  43. Liu, C., et al. Simultaneous dual-contrast three-dimensional imaging in live cells via optical diffraction tomography and fluorescence. Photonics Res. 7 (9), 1042-1050 (2019).
  44. Schlüßler, R., et al. Combined fluorescence, optical diffraction tomography and Brillouin microscopy. bioRvix. , (2020).
  45. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomed Optics Exp. 8 (5), 2496-2518 (2017).
  46. Jo, Y., et al. Label-free multiplexed microtomography of endogenous subcellular dynamics using generalizable deep learning. Nat Cell Biol. 23 (12), 1329-1337 (2021).
  47. Oh, C., Hugonnet, H., Lee, M., Park, Y. Digital aberration correction for enhanced thick tissue imaging exploiting aberration matrix and tilt-tilt correlation from the optical memory effect. Nat Comm. 16 (1), 1685(2025).
  48. Yasuhiko, O., Takeuchi, K. In-silico clearing approach for deep refractive index tomography by partial reconstruction and wave-backpropagation. Light Sci Appl. 12 (1), 101(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Holotomography ImagingIntestinal OrganoidsLabel Free Imaging3D Organoid ImagingMachine Learning SegmentationRefractive Index MappingOrganoid MorphologyProtein Density QuantificationDrug Response AnalysisTime Lapse Imaging

Related Articles