מאמר שיטה

נביטה אסימביוטית והתחדשות מבוססת עלים של סחלב המרפא בסכנת הכחדה Hemipilia cucullata מזרעים בוגרים

1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68541

⸱

19 בספטמבר 2025

 ,  ,  , 
1Zhejiang Province Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation, College of Life Sciences and Medicine, Zhejiang Sci-Tech University, 2Laboratory of Systematic & Evolutionary Botany and Biodiversity, College of Life Sciences, Zhejiang University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאופטימיזציה של נביטת זרעים אסימביוטית, התפתחות שתילים והתארכות יורה ב-Hemipilia cucullata. הפרוטוקול מאפשר גם אינדוקציה של גופים דמויי פרוטוקום מצמחי עלים סטריליים, מה שמאפשר ריבוי יעיל במבחנה לשימור ושימוש בר-קיימא בסחלב מרפא זה הנמצא בסכנת הכחדה.

תקציר

Hemipilia cucullata (Orchidaceae) הוא סחלב יבשתי המוערך מאוד בשל תכונותיו הרפואיות ומשיכתו לנוי, אך אוכלוסיות הבר שלו נמצאות בסכנת הכחדה עקב הרס בתי הגידול, כדאיות זרעים נמוכה והצלחת האבקה מוגבלת. כדי לתמוך בשימורו ובניצול בר-קיימא שלו, מחקר זה פיתח פרוטוקול אופטימלי לנביטה אסימביוטית של זרעים בוגרים, התפתחות פרוטוקורם, התארכות יורה ואינדוקציה של גוף דמוי פרוטוקור (PLB) מצמחי עלים סטריליים. זרעים שגודלו במדיום נוזלי של 1/2 MS בתוספת של 0.5 מ"ג/ליטר NAA הראו שיעור נביטה של 72 ± 6%, גבוה משמעותית מהמדיום הביקורת (46%) והמדיום המוצק (31%), כאשר הנביטה החלה כ-21 יום מוקדם יותר בתרבית נוזלית. פרוטוקורים עברו תת-תרבית על מדיום B5 המכיל 0.5 מ"ג/ליטר BA, 0.2 מ"ג/ליטר NAA ו-100 מ"ל/ליטר מי קוקוס, מה שהוביל לשגשוג יעיל. לאחר 5-6 שבועות, הצמחים הועברו למדיום התארכות יורה (B5 בתוספת 0.5 מ"ג/ליטר BA ו-1 מ"ג/ליטר NAA), שם הם הפגינו התארכות נבטים חזקה והיווצרות עלים בריאה. עבור השראת PLB, שיעור האינדוקציה הגבוה ביותר (44.3 ± 5.1%) הושג במדיום MS המכיל BA (3 מ"ג/ליטר) ו-NAA (0.2 מ"ג/ליטר). פרוטוקול מקיף וניתן לשחזור זה יכול להוות פלטפורמה יעילה להתפשטות בקנה מידה גדול ולשימור מחוץ לאתרו של H. cucullata, ולהציע תמיכה רבת ערך למאמצי ההתאוששות של סחלב זה בסכנת הכחדה.

מבוא

Hemipilia cucullata (L.) Y.Tang, H.Peng & T.Yukawa, הידוע בכינויו cucullate neottianthe orchid, הוא סחלב יבשתי פראי שמקורו באירואסיה הממוזגת ומופץ באופן נרחב מפולין ועד יפן1. מין זה, שסווג בתחילה בסוג Neottianthe, הוקצה לאחרונה מחדש לסוג Hemipilia, סעיף Neottianthe, על סמך ראיות מולקולריות2. הצמח גדל מפקעות תת קרקעיות ומגיע לגובה של עד 30 ס"מ, ומייצר פרחים ורדרדים או סגולים-אדומים המסודרים בשפיץ חד צדדי. בשל הצורה האלגנטית והצבעוניות האטרקטיבית של פרחיו, יש לו ערך נוי משמעותי. בנוסף, הצמח כולו מוכר כצמח מרפא במספר מדינות, שבהן הוא נמצא בשימוש נרחב למטרות טיפוליות שונות, כולל טיפול במצבי לב, שיפור זרימת הדם, הקלה על חבורות וקידום ריפוי שברים 3,4. מחקרים פיטוכימיים אחרונים זיהו מספר אנתוציאנינים במין זה, כגון ציאנידין 3-אוקסלילגלוקוזיד, חרצית וציאנין, בעלי תכונות נוגדות חמצון והגנה על כלי הדם ועשויים לתרום להשפעות הרפואיות שלו 5,6.

נכון לעכשיו, אוכלוסיות הבר של H. cucullata מתמודדות עם איומים של אובדן בתי גידול והפרעות סביבתיות, מה שמוביל לירידה חמורה באוכלוסייה, ובאזורים מסוימים, מביא את המין קרוב להכחדה 3,7,8. עם זאת, שימור מין זה מאתגר במיוחד בשל קשיים בריבוי הטבעי שלו. בטבע, H. cucullata מתרבה הן מבחינה שיבוטית והן מבחינה מינית, אך שני המצבים אינם יעילים. ריבוי שיבוטים טבעי הוא איטי ונדיר, בעוד שהרבייה המינית מוגבלת על ידי הצלחת האבקה גרועה וכדאיות זרעים נמוכה 9,10. יתר על כן, מחקרי שטח חשפו מבנה גילאים לא מאוזן באופן ניכר, עם מחסור בפרטים צעירים וגיוס טבעי מוגבל, במיוחד בתנאי עקה אנתרופוגניים או פירוגניים 7,8,11. הזרעים של H. cucullata, כמו סחלבים רבים, הם זעירים, חסרי אנדוספרם ודורשים שותפים פטרייתיים ספציפיים לנביטה, מה שמסבך עוד יותר את ההתחדשות הטבעית. כתוצאה מכך, למרות תפוצתו הגיאוגרפית הרחבה, גודל האוכלוסייה ומבנה הגיל של אוכלוסיות הבר מצטמצמים, וסיכוני ההכחדה המקומייםגדלים. לכן, הקמת שיטה יעילה לריבוי מהיר מלאכותי חיונית הן לשימור משאבי הג'רמפלזמה והן לניצול בר-קיימא של מין סחלב זה.

בין טכניקות הריבוי הזמינות, נביטה סימביוטית - המסתמכת על הקשר עם פטריות מיקוריזה של סחלבים - יכולה לדמות תהליכים טבעיים אך לעתים קרובות קשה לתקן אותה בשל תלותה בשותפים פטרייתיים ספציפיים למין 12,13,14. לעומת זאת, נביטה אסימביוטית מציעה אלטרנטיבה פשוטה וניתנת לשחזור יותר שנמצאת בשימוש נרחב במערכות תרבית רקמות סחלבים15. למרות שפותחו פרוטוקולי נביטה אסימביוטיים והתפשטות מהירה עבור מספר סחלבים רפואיים כגון Bletilla, Dendrobium ו-Cypripedium 16,17,18,19, עדיין נדרשת אופטימיזציה ספציפית למין של אמצעי התרבות ותנאי תרבית הרקמה עבור H. cucullata.

במחקר זה, השתמשנו בזרעים בוגרים של H. cucullata שהושגו באמצעות האבקה צולבת ידנית של פרטים פראיים (איור 1A) בהר טיאנמו במזרח סין (30°20′ N, 119°22′ E) כדי לבסס ולייעל פרוטוקול יעיל לנביטת זרעים אסימביוטית, התפתחות שתילים והתארכות יורה. בנוסף, פיתחנו מערכת התחדשות מצמחי עלים באמצעות אינדוקציה של PLBs, ובכך תרמנו לשימור וטיפוח של סחלב מרפא זה הנמצא בסכנת הכחדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: לפני תחילת הניסוי, יש ללבוש ציוד מגן אישי, כולל כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי מגן. בצע את כל ההליכים מתחת למכסה המנוע למינרי לסטריליות. טפל באתנול ונתרן היפוכלוריט בזהירות והשליך פסולת בהתאם לתקנות הבטיחות במעבדה.

1. עיקור כמוסות ומיצוי זרעים

  1. מניחים את הקפסולה בכוס. הוסף 1-2 טיפות חומר ניקוי ושטוף היטב במי ברז כדי להסיר מזהמים על פני השטח.
  2. שטפו את הקפסולה תחת מים זורמים למשך 5 דקות. סופגים את מי פני השטח עם נייר סופג סטרילי.
  3. העבירו את הקפסולה לשולחן עבודה סטרילי לחיטוי נוסף.
  4. טבלו את הקפסולה באתנול 75% (v/v) למשך 30 שניות.
  5. עקר את הקפסולה על ידי טבילתה ב-50 מ"ל של תמיסת נתרן היפוכלוריט של 20% (v/v) (מדוללת מאקונומיקה מסחרית המכילה ~5% כלור זמין), בתוספת 2 טיפות של חומר ניקוי לשטיפת כלים ביתית לא מדוללת למשך 10-12 דקות.
  6. שטפו את הקפסולה חמש פעמים במים מזוקקים סטריליים כדי להסיר שאריות חומר חיטוי.
  7. בעזרת אזמל סטרילי, יש להסיר כ-1 מ"מ הן מהקודקוד והן מהבסיס (קצה הפדיקל) של הקפסולה.
  8. בצע חתך קטן בקצה העליון של הקפסולה כדי לחשוף את הזרעים. מניחים את הקפסולה בצלחת פטרי סטרילית למיצוי זרעים.

2. הכנת מדיום תרבות

  1. הכן 1/2 מדיום נוזלי MS: השתמש במחצית מריכוזי המאקרו-נוטריינטים של מדיום MS הסטנדרטי, שמור על כל שאר הרכיבים כמו במדיום MS, הוסף 20 גרם/ליטר סוכרוז וחומצה α-נפתלינאצטית (NAA, 0.5 מ"ג/ליטר), והתאם את ה-pH ל-5.8.
  2. לאחר הרתיחה יש להוציא את המדיום לבקבוקי תרבות של 500 מ"ל מיד (ניתן לכוונן את מספר הבקבוקים בהתאם לסולם ההתפשטות הרצוי).
  3. מניחים את המדיום המחולק בחיטוי ומעקרים בחום של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר העיקור, הוציאו את המדיום מהחיטוי והניחו לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.

3. נביטת זרעים

  1. השתמש במלקחיים סטריליים כדי לפזר באופן שווה כ-500-600 זרעים לכל בקבוק מדיום (הוכן בשלב 2.3). הניחו לזרעים לספוג מים ולהתייצב בתחתית המדיום הנוזלי.
  2. שמור על תרביות ב-25 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך של 12 שעות ועוצמת אור של 36 מיקרומול·מ"ר-2·שניות-1.
  3. צפו בנביטת הזרעים מדי שבוע, רשמו שינויים מורפולוגיים וצלמו תמונות לתיעוד.
  4. לאחר כ -12 שבועות, כאשר רוב הזרעים נבטו, ספרו את מספר הזרעים שנבטו וחשבו את קצב הנביטה. השתמש בלולאת חיסון סטרילית כדי לאסוף באופן אקראי לולאה אחת של מדיום נוזלי המכיל זרעים. העבירו את הזרעים שנדגמו לצלחת פטרי או לשקופית זכוכית והתבוננו תחת סטריאומיקרוסקופ.
  5. ספרו את מספר הזרעים שיצרו פרוטוקורמים כנבטו. חשב את קצב הנביטה באמצעות הנוסחה הבאה:
    קצב נביטה (%) = (מספר הזרעים הנבטים / מספר הזרעים הכולל בדגימה) × 100.

4. תת-תרבות והתפשטות של פרוטוקורם

  1. הכן את מדיום הריבוי על ידי תוספת מדיום B5 (3.21 גרם/ליטר) עם מי קוקוס (100 מ"ל/ליטר), 6-בנזילמינופורין (BA, 0.5 מ"ג/ליטר) ו-NAA (0.2 מ"ג/ליטר). הוסף 20 גרם/ליטר סוכרוז ו-7.3 גרם/ליטר אגר, והתאם את ה-pH ל-5.8.
  2. לאחר הרתיחה יש להוציא את המדיום לבקבוקי תרבית של 150 מ"ל מיד (ניתן לכוונן את מספר הבקבוקים בהתאם לסולם הריבוי הרצוי).
  3. מניחים את המדיום המחולק בחיטוי ומעקרים בחום של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הניחו למדיום להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  4. העבירו באופן אספטי 10-15 פרוטוקורמים מונבטים (בגודל 0.3-1 ס"מ) לבקבוק על מצע התרבית שהוכן בשלב 4.3.
  5. לאחר תקופת גידול של 5 שבועות, העריכו את מצב הריבוי ורשמו את מספר הפרוטוקורים החדשים שנוצרו לבקבוק.
  6. המשך לגדל את הפרוטוקורים המתרבים במשך 4-6 שבועות נוספים כדי לאפשר התפתחות לצמחים עם קודקוד יורה גלוי ומבנים דמויי ריזואיד לפני ההעברה להתארכות נבט.
    הערה: שמור על תרביות ב-25 מעלות צלזיוס, עם מחזור אור/חושך של 12 שעות ועוצמת אור של 36 מיקרומול·מ"ר-2·שניות-1.

5. התארכות יורה

  1. הכן את המדיום להארכת יורה על ידי תוספת B5 בינוני (3.21 גרם/ליטר) עם BA (0.5 מ"ג/ליטר) ו-NAA (1 מ"ג/ליטר). הוסף 20 גרם/ליטר סוכרוז ו-7.3 גרם/ליטר אגר, והתאם את ה-pH ל-5.8.
  2. לאחר הרתיחה יש להוציא את המדיום לבקבוקי תרבית של 150 מ"ל (ניתן לכוונן את מספר הבקבוקים בהתאם לקנה המידה הרצוי של הריבוי).
  3. בחר צמחים בריאים (בגודל 1-2 ס"מ, ללא השחרה ברורה או הצהבה מלאה) להארכת יורה. בעזרת מלקחיים מעוקרים ומקוררים, העבירו באופן אספטי 8-12 צמחים לכל בקבוק תרבית של 150 מ"ל המכיל מדיום טרי שהוכן בשלב 5.1. ודא שהשתילים מפוזרים באופן שווה בתוך כל בקבוק.
  4. לאחר תקופת התארכות יורה של 5 שבועות, בחר שתילים עם יורה מפותח לחלוטין ועלים בריאים לדגימת עלים.
    הערה: שמור על תרביות ב-25 מעלות צלזיוס, עם מחזור אור/חושך של 12 שעות ועוצמת אור של 36 מיקרומול·מ"ר-2·שניות-1.

6. אינדוקציה של PLBs מצמחי עלים

  1. הכן את מדיום האינדוקציה PLBs על ידי השלמת מדיום בסיסי MS (4.43 גרם/ליטר) עם BA (3 מ"ג/ליטר) ו-NAA (0.2 מ"ג/ליטר). הוסף 20 גרם/ליטר סוכרוז ו-7.3 גרם/ליטר אגר, והתאם את ה-pH ל-5.8.
  2. לאחר הרתיחה יש להוציא את המדיום לבקבוקי תרבית של 150 מ"ל (ניתן לכוונן את מספר הבקבוקים בהתאם לקנה המידה הרצוי של הריבוי).
  3. בחר צמחים בריאים לאחר 5 שבועות של התארכות יורה (שלב 5.4). כורתים עלים סטריליים מורחבים לחלוטין, מסירים את האזור האפיקלי והשוליים וחותכים כל עלה למקטעים × 0.5 ס"מ בעזרת אזמל סטרילי בתנאים אספטיים.
  4. הנח את 10 מקטעי העלים על מדיום האינדוקציה PLB כשהמשטח האדקסיאלי פונה כלפי מעלה, ומבטיח מגע איתן עם המשטח הבינוני.
  5. לאחר 5 שבועות של תרבית, העריכו את מספר ה-PLBs שהושרו בהצלחה וחשבו את שיעור האינדוקציה (%). בנוסף, רשום את גובה הניצן הממוצע (ס"מ) ואת מספר הניצנים שנוצרו בכל צמח.
    הערה: שמור על תרביות ב-25 מעלות צלזיוס, עם מחזור אור/חושך של 12 שעות ועוצמת אור של 36 מיקרומול·מ"ר-2·שניות-1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שלבי הפרוטוקול המוצגים במחקר זה מייצגים את המתודולוגיה האופטימלית שפותחה באמצעות סדרה של ניסויים השוואתיים שמטרתם לשפר את נביטת הזרעים האסימביוטית, התפשטות פרוטוקורם, התארכות יורה ואינדוקציה PLB ב-H. cucullata. לדוגמה, בבחירת PGRs לקידום נביטת זרעים, NAA משפר את התפתחות העובר וספיגת המים, בעוד BA מקדם התמיינות ניצנים וחלוקת תאים. הוכח כי השפעתם הסינרגטית משפרת את שיעורי הנביטה ואת צמיחת השתילים המוקדמת בתרבות זרעי סחלב17. כל שלב בפרוטוקול שוכלל על סמך מדדי ביצועים שנגזרו מניסויים משוכפלים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כמוסות סחלבים מכילות בדרך כלל זרעים רבים, לרוב העולים על עשרת אלפים, אך הנביטה הטבעית שלהם מוגבלת ביותר בשל היעדר אנדוספרם ותלותם הגבוהה באסוציאציות פטרייתיות סימביוטיות וברמזים סביבתיים ספציפיים20. פרוטוקולי נביטה אסימביוטיים אומצו אפוא באופן נרחב כדי לעקוף את המגבלות הללו ולאפשר ריבוי שתילים יעיל בתנאים מבוקרים. לדוגמה, Chen et al15 דיווחו על שיעור נביטה של 93% ב-Bletilla באמצעות מדיום טרשת נפוצה עם טיפול מקדים כהה ראשוני של 14 י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1/2 מלחי בסיס MS עם ויטמיניםקולברPM1061
6-בנזילמינופוריןשנחאי מקלין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ1214-39-7
אגר פאוורבייג'ינג Chembase טכנולוגיה ושות', בע"מ1400
ספסל נקיסוג'ואו טיהור ציוד ושות', בע"מSW-CJ-2G
מי קוקוסחקלאי טובhttps://e.tb.cn/h.6F8GTrHG7pif7Tj?tk=jFTyVPU3OBs
מחטאליבי מדע וטכנולוגיה6920174756784
גמבורג B5 בינונימעבדות פיטוטכנולוגיהG398
בקבוק זכוכיתמורבטר ביוטכנולוגיה ושות', בע"מMBT-BL-240
מוראשיג'ה & מלחי בסיס סקוגמעבדות פיטוטכנולוגיהM519
פיפטהאפנדורף3123000268
איזון מדויקמטלר טולדו30834109
אס.פי.אס.אסתאגיד מכונות עסקיות בינלאומיתוכנה המשמשת לבדיקת מובהקות סטטיסטית
סוכרוזסינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מ20210802
תידיאזורוןשנחאי מקלין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ51707-55-2
&אלפא;-חומצה נפתלינאצטיתשנחאי מקלין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ86-87-3

מקורות

  1. Chen, X., et al. Flora of China. , Science Press and Missouri Botanical Garden Press. Beijing, St. Louis, MO. (2009).
  2. Tang, Y., Yukawa, T., Bateman, M., Jiang, H., Peng, H. Phylogeny and classification of the East Asia Amitostigma alliance (Orchidaceae: Orchideae) based on six DNA markers. BMC Evol Biol. 15 (1), 1-32 (2015).
  3. Minarchenko, M. Threatened medicinal plants of Ukraine: An assessment of the current protection status. J Plant Dev. 24, 117-131 (2017).
  4. Pant, B., Raskoti, B. Medicinal Orchids of Nepal. , Himalayan Map House Pv Ltd. Kathmandu, Nepal. (2013).
  5. Strack, D., Busch, E., Wray, V., Grotjahn, L., Klein, E. Cyanid 3oxalylglucoside in orchids. Naturforsch C. 41 (7-8), 707-711 (1986).
  6. Strack, D., Busch, E., Klein, E. Anthocyanin patterns in European orchids and their taxonomic and phylogenetic relevance. Phytochemistry. 28 (8), 2127-2139 (1989).
  7. Ilyina, N., Kozlovskaya, O. V. Dynamics of the population structure and abundance of the rare species Neottianthe cucullata (L Schlechter under conditions of pyrogenic load in the territory adjacent to the Buzuluksky Bor National Park (Samara region). Samara J Sci. 13 (2), 35-41 (2024).
  8. Khapugin, A., Chugunov, G., Silaeva, T., Kunaeva, E. Neottianthe cucullata (L Schltr. (Orchidacea Juss.), an endangered orchid in central Russia. Wulfenia. 23, 189-202 (2016).
  9. A method for the rapid propagation of Hemipilia cucullata. using its floral bracts as explants. China patent. , CN106993535A (2017).
  10. Johnson, D., Edwards, T. The structure and function of orchid pollinaria. Plant Syst Evol. 222, 243-269 (2000).
  11. Ilyina, V., Senator, S., Mitroshenkova, A., Kozlovskaya, O. Peculiarities of the Neottianthe cucullata population structure under industrial loads (Samara Oblast). AIP Conf Proc. 3184 (1), 8(2024).
  12. Zhang, L., et al. Symbiotic culture of three closely related Dendrobium species reveals a growth bottleneck and differences in mycorrhizal specificity at early developmental stages. Diversity. 14 (12), 1119(2022).
  13. Leng, C., Hou, M., Xing, Y., Chen, J. Perspective and challenges of mycorrhizal symbiosis in orchid medicinal plants. Chin Herb Med. 16, 172-179 (2024).
  14. Zoubi, L. Complexities and innovations in orchid germination: A review of symbiotic and asymbiotic techniques. J Plant Sci. 12 (4), 90-94 (2024).
  15. Chen, J., et al. Symbiotic and asymbiotic germination of Dendrobium officinale (Orchidaceae) respond differently to exogenous gibberellins. Int J Mol Sci. 21 (17), 6104(2020).
  16. JinYing, C., Xuefeng, W., Baocai, L., Yuqing, Z. Efficient germination system in asymbiotic culture of Bletilla striata (Thunb Reichb). f. Fujian J Agric Sci. 33 (2), 131-135 (2018).
  17. Mei, H., JiJun, K., ZhenYong, X., LiMing, Z., Hong, J. Study on seedlings of nonsymbiotic germination of Paphiopedilum wenshanense. J West China For Sci. 49 (3), 56-59 (2020).
  18. Teixeirada Silva, A., Cardoso, J. C., Dobránszki, J., Zeng, S. Dendrobium micropropagation: A review. Plant Cell Rep. 34, 671-704 (2015).
  19. Zeng, S., et al. Seed biology and vitro seed germination of Cypripedium. Crit Rev Biotechnol. 34 (4), 358-371 (2014).
  20. Cozzolino, S., Widmer, A. Orchid diversity: An evolutionary consequence of deception. Trends Ecol Evol. 20 (9), 487-494 (2005).
  21. Miura, C., et al. Autoactivation of mycorrhizal symbiosis signaling through gibberellin deactivation in orchid seed germination. Plant Physiol. 194 (1), 546-563 (2023).
  22. Bustam, B., Dixon, K., Bunn, E. vitro propagation of temperate Australian terrestrial orchids: Revisiting asymbiotic compared with symbiotic germination. Bot J Linn Soc. 176 (4), 556-566 (2014).
  23. Gogoi, K., Kumaria, S., Tandon, P. Ex situ conservation of Cymbidium eburneum Lindl.: a threatened and vulnerable orchid, by asymbiotic seed germination. 3 Biotech. 2, 337-343 (2012).
  24. Robinson, E. J., Kakati, J. P., Sebastinraj, S., Suriya, K. I vitro seed germination of Cymbidium aloifolium L Sw., a potential medicinal orchid from Eastern ghats of Tamil Nadu India. J Plant Biotechnol. 44, 343-348 (2017).
  25. Hossain, M., Sharma, M., Teixeirada Silva, J. A., Pathak, P. Seed germination and tissue culture of Cymbidium giganteum Wall. Lindl. Sci Hortic. 123 (4), 479-487 (2010).
  26. Ibrahim, L., Jenkinson, P. Effect of artificial culture media on germination, growth, virulence and surface properties of the entomopathogenic hyphomycete Metarhizium anisopliae. Mycol Res. 106 (6), 705-715 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PLBex situ

מאמרים קשורים