הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקמת מודלים במבחנה של תרבית גרעיני שורש גב: גישות משלימות לחקירת הצלבה בין סרטן לעצב

2.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68552

⸱

11 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cancer Biology and Genetics, Sinclair Cancer Research Institute, and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Laboratory of Mutagenesis and Oncogenetics, Department of General Biology - Center for Biological Science, State University of Londrina

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטות להקמת תרביות שלמות ומנותקות של גרעיני שורש הגב של העכבר (DRG) והשימוש בהן להערכת אינטראקציות גידול-עצב.

תקציר

התרומה של מערכת העצבים למיקרו-סביבת הגידול והחשיבות של פלישה עצבית כדרך להפצת סרטן זוכות להכרה הולכת וגוברת. אינטראקציות של תאים סרטניים עם נוירונים יכולות לקדם את פלישתם סביב העצבים ואליהם, מאפיין של סוגי סרטן רבים עם תוצאות קליניות גרועות. מודלים במבחנה לחקר אינטראקציות הדדיות בין נוירונים לתאים סרטניים מספקים כלים חשובים להבנת התפשטות הסרטן וזיהוי גישות להפחתתה.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד גרעיני שורש גב של עכברים (DRG) והקמת תרביות חד-שכבתיות שלמות ומנותקות שניתן להשתמש בהן כדי להמחיש מורפולוגיה של נוירונים וצמיחת נויריטים לאורך זמן. DRGs שלמים המותקנים במטריג'ל משמרים את ארכיטקטורת העצבים ואת התגובות לגירויים בסביבה הטרוגנית הדומה יותר לעצב in vivo , בעוד שתרביות עצבים מנותקות מאפשרות הערכה של אינטראקציות ישירות בין תאים לתאים. לאחר הקמת תרביות DRG, ניתן להוסיף תאים סרטניים כדי ליצור תרביות משותפות שניתן להשתמש בהן כדי לדמיין שינויים בצמיחת נויריטים ומורפולוגיה עצבית בתגובה לתאים סרטניים. ניתן להעריך צמיחה או תנועתיות של תאים סרטניים בתגובה לאותות שמקורם בעצבים לאורך זמן או בתנאים של גירוי או עיכוב גדילה, כמו גם להמחיש את ההשפעות של מגע ישיר בין תאים סרטניים להרחבות עצביות.

מכיוון שניתן ליצור את שני המודלים של קו-תרבית בו זמנית, פרוטוקול זה מספק מבט מקיף יותר על ההשפעה של אינטראקציות סרטן-נוירונים ומאפשר השוואות של תנאי טיפול ושילוב מידע מרמת התא והגרעינים השלמים. פרוטוקול זה יקל על חקר אינטראקציות עצב-גידול ויכול לשמש למגוון רחב של יישומים, כולל מחקרים של איתות תאים, סינון תרופות או חקר ההטרוגניות של סביבת הגידול-עצב ומנגנוני התפשטות הגידול לאורך העצבים.

מבוא

התפשטות הגידול, באמצעות פלישה מקומית וגרורות אזוריות או מרוחקות, היא הגורם העיקרי למוות הקשור לסרטן. למרות שהמחקר התמקד בדרכי התפשטות כלי הדם או הלימפה, פלישה עצבית לתאי גידול נצפית לעתים קרובות בגידולים מוצקים רבים, כולל סרטן הלבלב 1,2, הערמונית 3, ראש וצוואר4, שד5 וסרטן המעי הגס6. בשנים האחרונות, מחקרים רבים הדגישו את התפקיד המתהווה של עצבים בקידום צמיחה והתקדמות של גידול, וכדרכי התפשטות, המניעים התפתחות גרורות 7,8. בהקשר זה, מדעי המוח של הסרטן התגלו כתחום מחקר בולט, המציע נקודות מבט חדשות באונקולוגיה על ידי הבהרת האינטראקציות בין תאי הגידול לבין המרכיבים הבסיסיים של מערכת העצבים ההיקפית (PNS) שעשויים לתרום לתהליכים אלה 8,9.

ה-PNS מורכב הן מעצבים היקפיים והן מגרעיניה, שהם מבנים הטרוגניים המורכבים מסוגי תאים מגוונים, כולל נוירונים בגדלים ותפקודים שונים, שוואן ותאי גליה אחרים, פיברובלסטים, מקרופאגים, תאי פיטום, מלנוציטים ותאי אנדותל כלי דם היוצרים את כלי הדם המקומיים10. ה-PNS הוא מרכיב קריטי במיקרו-סביבת הגידול (TME), ותקשורת הדדית בין תאי סרטן ועצבים, בין אם ישירות באמצעות מגע פיזי או בעקיפין באמצעות שחרור גורמים נוירוטרופיים, נוירוטרנסמיטורים, גורמי גדילה ואותות אחרים, יכולה להקל על פלישה עצבית ולקדם פנוטיפים אגרסיביים יותר8.

ניתן להשתמש במודלים במבחנה כדי לאפיין את התהליכים התורמים לתחזוקה ותיקון עצבים ומשמשים יותר ויותר לבחינת אינטראקציות תאיות בין עצבים לתאים סרטניים11,12. מודל מבחנה בשימוש תכוף כולל גרעיני שורש גב של עכבר (DRG) שחולצו בתרבית משותפת עם תאי גידול11. מודלים אלה משתמשים לעתים קרובות בתרבית חד-שכבתית דו-ממדית (2D) של תאי DRG מנותקים כדי לחקור ביולוגיה עצבית במבחנה ושימשו למודל אינטראקציות תאיות ב-PNS13,14. עם זאת, תרבויות דו-ממדיות חסרות את המורכבות של מיקרו-סביבת העצבים ומייצגות בצורה גרועה את ארכיטקטורת ה-in vivo שלה. תושבות שלמות תלת מימדיות (תלת מימדיות) של נוירונים או גנגליונים היקפיים מציעות אלטרנטיבה המסכמת בצורה יעילה יותר את הפיזיולוגיה של העצבים ההיקפיים כדי לייצג אינטראקציות עצביות-סביבתיות בצורה הוליסטית יותר 15,16,17,18. עם זאת, ההטרוגניות של מודל זה מגבילה את היכולת לדמיין או לכמת אינטראקציות תא-תא, ומודלים אלה יעילים יותר להתבוננות בתגובות עצביות היקפיות כוללות מאשר לחקר אינטראקציות תאיות ספציפיות ותגובות מכניסטיות לגירויים. לפיכך, ברור שתרביות עצביות מנותקות ושלמות משלימות וכי הערכה של מודלים דו-ממדיים ותלת-ממדיים במקביל היא אופטימלית להערכת ההשפעות הכוללות ותגובות התאים הבודדים לגירויים.

פרוטוקול זה מתאר שיטות ליצירת תרביות עצב משלימות (2D) ו-3D-mount (3D) שניתן להשתמש בהן כדי להעריך אינטראקציות עצב ותאי סרטן הן ברמת התא והן ברמת הרקמה, ומספק מבט מקיף יותר על אינטראקציות אלה מאשר שיטות המשתמשות בסוג אחד בלבד של תרבית 1,13. ניתן להשתמש במודלים אלה כדי להמחיש ולהעריך תהליכים תאיים, כולל מורפולוגיה של תאי עצב וצמיחת נויריטים, כמו גם תגובות תאי גידול לחומרים כימוטקטיים המופרשים על ידי עצבים, כגון גורמים נוירוטרופיים, ודיבור צולב בין נוירונים חושיים לתאי גידול. זה גם מאפשר לחקור אינטראקציות פוטנציאליות בין תאי גידול ורכיבים אחרים של המיקרו-סביבה העצבית, כגון תאי חיסון, פיברובלסטים וגליה. אנו מדגישים את היישום של מודלים אלה לחקר אינטראקציות בין תאי עצב לסרטן לאורך זמן, המודגמות על ידי צביעת תאים חיים או אימונופלואורסצנטיות, כדוגמאות לגישות להערכה או לכימות אינטראקציות ותגובות תאים. יחד, התוצאות המתקבלות מהשימוש בשיטות אלה יכולות לקדם את ההבנה שלנו כיצד מערכת העצבים מקדמת צמיחה והתפשטות של סרטן, ולעזור לנו לפתח אסטרטגיות להתמקדות במנגנונים אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל עבודת העכברים נבדקה ואושרה על ידי משרד הוועדה האוניברסיטאית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קווינס (פרוטוקול מספר 2524). בעלי חיים הוחזקו והורדמו לאיסוף רקמות בהתאם להנחיות האתיות של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים, והמרכז הלאומי להחלפה, עידון והפחתה של בעלי חיים במחקר (בריטניה). בפרוטוקול זה, השתמשנו ברקמות שבודדו מחיות C57BL/6 אך השתמשנו בהצלחה גם בגנוטיפים אחרים, כולל חיות Rag2IL2Rγc KO. ניתן לבצע את סעיפים 1-6 בסביבה נקייה על ספסל מעבדה מעוקר על פני השטח (ראה איור 1), בעוד שסעיפים 7-9 חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי. להבנה טובה יותר, נוצרו ייצוגים סכמטיים של השלבים שהוזכרו (איור 1).

1. הכנת פתרונות מלאי

  1. הכן תמיסת פפאין ותמיסת קולגנאז IV/Dispase II. להמיס פפאין ב-PBS סטרילי (תמיסת מלח עם חוצץ פוספט) בריכוז של 30 U/mL; יש לאחסן בכמות של 1 מ"ל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. יש להמיס קולגנאז מסוג IV במינון של 1.25 מ"ג/מ"ל ו-Dispase II במינון של 2.5 מ"ג/מ"ל ב-PBS. יש לאחסן בכמות של 1 מ"ל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו מצע תרבית נוירובזאלי (F12) בתוספת תוסף B27 2% (תמיסת מלאי פי 50), סרום בקר עוברי 10% (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (Pen-Strep) (תמיסת מלאי פי 100).
  3. הכן את תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין (תמיסת מלאי פי 100).
    הערה: כדי לתמוך בהישרדות הראשונית של התאים ובהתקשרותם, נעשה שימוש במדיית F12 בתוספת 10% FBS לשיפור התבססות התרביות. עם זאת, FBS מקדם גם התפשטות של תאים שאינם עצביים, כולל פיברובלסטים. ניתן להשתמש במצבים מופחתים או נטולי סרום (למשל, F12 בתוספת B27 בלבד) כדי למזער את צמיחת התאים הלא עצביים בתרבית DRG ובתרבית משותפת לסרטן, אך עשויים להשפיע על ההישרדות, במיוחד של תרביות נוירונים מנותקים. יש לקחת בחשבון מדיה נטולת סרום גם בעת איסוף מדיה מותנית DRG כדי להעריך את השפעותיו על התנהגות תאים סרטניים.

2. הכנת ריאגנטים וחומרים לדיסקציה של DRGs (איור 1A)

  1. מכשירים כירורגיים לחיטוי. יש לעקר את המיקרוסקופ המנתח עם 70% אתנול ולהניח אותו על ספסל נקי.
  2. הוסף 6-8 מ"ל של HBSS-Pen-Strep (שלב 1.3) לשתי צלחות תרבית בגודל 10 ס"מ והניח על קרח.
    הערה: לוחות אלה ישמשו לאיסוף עמודי השדרה לאחר דיסקציה. בהתאם למספר חוטי השדרה המנותחים, ייתכן שיהיה צורך בלוחות נוספים.
  3. הוסף 8-10 מ"ל של HBSS-Pen-Strep לצינור חרוטי של 15 מ"ל, והניח על קרח.
  4. הוסף 3 מ"ל של HBSS-Pen-Strep לצלחת תרבית של 3 ס"מ, והניח על קרח.
    הערה: צינור ה-15 מ"ל שהוכן בשלב 2.3 ישמש לאיסוף DRGs לצורך דיסוציאציה, בעוד שלוחית התרבות בגודל 3 ס"מ (שלב 2.4) תשמש לאיסוף DRGs עבור הדגם השלם.

3. הכנת ריאגנטים וחומרים לתרבית DRG שלמה

הערה: שלבים מסוימים בסעיף זה עשויים לדרוש הכנה למשך הלילה. למרות שניתן להשתמש בכל סוג של צלחת תרבית רקמה עבור תרביות DRG, הנפחים וההוראות בפרוטוקול זה עברו אופטימיזציה עבור שקופיות תחתונות זכוכית עם 8 בארות, שסיפקו איכות הדמיה אופטימלית לניתוחים שלנו. שמור על שקופית תחתית זכוכית עם 8 בארות, קצות פיפטה ומטריגל על קרח בכל עת.

  1. יש להפשיר תמיסת מטריג'ל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (או לפחות 3 שעות) לפני השימוש. הקפידו לשמור על מטריג'ל מכוסה בקרח בכל עת.
  2. צננו את קצות הפיפטה ותחתית זכוכית 8 בארות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי למזער את הידבקות המטריגל לקצוות ולמנוע פילמור מוקדם של מטריג'ל בצלחת.
  3. יש לחמם חומר מוסף (שלב 1.2) ל-37 מעלות צלזיוס באמבט מים.

4. הכנת ריאגנטים וחומרים לתרבית DRG מנותקת

  1. יש להפשיר תמיסת פפאין ותמיסת קולגנאז IV/Dispase II (שלב 1.1) באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכנה לשימוש.
    הערה: עבור כל עכבר שנותח, השתמש ב-1 aliquot (1 מ"ל) כל אחד מתמיסת פפאין וקולגנאז IV/Dispase II.
  2. מצע תרבית משלים חם (שלב 1.2).

5. קצירת עמוד השדרה (איור 1B) וניתוח ה-DRGs (איור 1C)

  1. המתת חסד של עכברים בני 4-8 שבועות על ידי מנת יתר של איזופלורן ואחריה פריקת צוואר הרחם. השכיבו את החיה שעברה המתת חסד על בטנה וגילחו את פרוותה, תוך התמקדות באזור שמעל עמוד השדרה (איור 1B, שלבים 1,2).
  2. רססו את גב החיה באתנול 70% והסירו כל פרווה רופפת, נגבו אותה במגבות נייר מזנב לגולגולת כדי למנוע מהפרווה לזהם את הדיסקציה.
  3. בעזרת מספריים מעוקרים מבצעים חתך ישר לאורך משטח הגב המגולח, מהזנב ועד הגולגולת. החזירו את העור משני צידי החתך באמצעות מלקחיים קהים כדי לחשוף את עמוד השדרה (איור 1B, שלב 3).
  4. באמצעות זוג מלקחיים ומספריים טריים כדי למנוע זיהום בפרווה, בצעו חתך אופקי בבסיס (קצה הזנב) של עמוד השדרה (איור 1B, שלב 4).
  5. בצע שני חתכים אורכיים מקבילים בכל צד של עמוד השדרה כדי לשחרר אותו. השתמשו במלקחיים כדי להרים בעדינות את עמוד השדרה כדי להסיר את רקמת החיבור שמסביב (איור 1B, שלב 5).
  6. כדי לשחרר את עמוד השדרה במלואו, בצע חתך בחלק העליון של עמוד השדרה (פרוקסימלי לגולגולת). העבירו את עמוד השדרה ללוחות מקוררים מראש בגודל 10 ס"מ שמכילים HBSS-Pen-Strep על קרח (שלב 2.2) (איור 1C, שלב 6).
    הערה: נוח לאסוף את כל עמודי השדרה באותה צלחת של 10 ס"מ ולהעביר עמודים בודדים בזה אחר זה לצלחת נפרדת לשלבי דיסקציה נוספים.

6. ניתוח גרעיני השורש הגבי (DRGs)

  1. בעזרת מספריים קפיציים, הסירו את כל רקמת החיבור שנותרה סביב עמוד השדרה, וחשפו את החוליות (איור 1C, שלב 7). זה מאפשר הדמיה ברורה יותר של החוליה ומקל על חיתוך לאורך קו האמצע. אוספים עמודים גזומים בצלחת טרייה ומקוררת מראש של 10 ס"מ (שלב 2.2).
  2. בזה אחר זה, העבירו את חוט השדרה הקצוץ לשלב המיקרוסקופ לדיסקציה. פצלו בזהירות את עמוד השדרה במישור הסגיטלי באמצעות מספריים קפיציים (איור 1D, שלב 8).
  3. באמצעות מלקחיים בעלי קצה עדין, הסירו את חוט השדרה מעמוד השדרה, וחשפו את ה-DRG באופן דו-צדדי לאורך שורשי עצבי עמוד השדרה (איור 1D, שלב 9).
    הערה: יש לנקוט משנה זהירות בשלב זה מכיוון שניתן להסיר DRGs עם חוט השדרה אם מטפלים בו בצורה גסה מדי.
  4. חתכו את עצבי עמוד השדרה בעזרת מספריים קפיציים והסירו כל רקמת חיבור סביב ה-DRG (איור 1D, שלב 10).
    הערה: הסרת רקמת חיבור בשלב זה ממזערת פסולת בתרביות DRG.
  5. בעזרת מלקחיים עדינים, משוך בעדינות את ה-DRG כדי לחלץ אותו מהשורש הגבי. עבור תרבית הרכבה שלמה, הנח את ה-DRG בצלחת 3 ס"מ (שהוכנה בשלב 2.4) (איור 1D, שלב 11). אסוף את ה-DRG הנותרים בצינור חרוטי של 15 מ"ל (שהוכן בשלב 2.3) שישמש לדיסוציאציה.
    הערה: שמור צלחות וצינורות על קרח לאורך כל תהליך הדיסקציה.
  6. חזור על שלבים 6.4 עד 6.5 עד לחילוץ כל ה-DRG. חזור על כל השלבים לעיל עבור כל עמוד שדרה נוסף.
    הערה: לעכברים יש 30-31 זוגות DRG בהתאם לזן, מה שיאפשר איסוף של עד 60 DRG מכל חיה. אם אוספים DRGs רק מהחלק המותני של חוט השדרה, ניתן לחלץ 10 DRGs. שימוש ב-DRGs מאותה חיה כדי לבסס את שני מודלי התרבית מפחית את השונות התוך-ניסויית ומבטיח תוצאות עקביות וניתנות להשוואה בין ניסויים משלימים.
    הערה: כל השלבים לאחר חילוץ ה-DRGs חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי.

7. תרבית DRG להרכבה שלמה (איור 2)

  1. באמצעות קצות מקוררים מראש (שלב 3.2), פיפטה 2 מיקרוליטר של מטריג'ל צונן כדי ליצור טיפה בכל באר של מגלשת תחתית זכוכית של 8 בארות המונחת על קרח (איור 2A, שלב 1). כדי למנוע ממטריג'ל להתפלמר בטרם עת לפני הוספת ה-DRG, פיפטה רק טיפה אחת בכל פעם. כדי למנוע שריטות של משטח המגלשה, הנח את המגלשה בצלחת של 10 ס"מ לפני הנחתה על קרח.
  2. בעזרת מלקחיים בעלי קצה עדין, העבירו DRG אחד לצלחת יבשה והזיזו אותו בעדינות כדי להסיר עודפי HBSS, ולמנוע דילול נוסף של המטריגל בעת הוספת ה-DRG לטיפה של המטריגל. העבירו את ה-DRG לטיפת המטריגל (איור 2A, שלב 2).
    הערה: השתמש במלקחיים עדינים כדי לדחוף בעדינות את ה-DRG לתוך טיפת ה-Matrigel, וודא שה-DRG שקוע במלואו וממוקם במרכז הטיפה.
  3. חזור על שלבים 7.1 עד 7.2 עבור כל DRG שנוסף לטיפה של Matrigel.
  4. דגרו את המגלשה התחתונה מזכוכית עם 8 בארות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות באינקובטור לח כדי לאפשר למטריג'ל להתפלמר (איור 2A, שלב 3).
  5. מוסיפים בזהירות 200 מיקרוליטר של מצע תרבית חם בתוספת לכל באר ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 (איור 2B, שלב 4). החלף את המדיה במצע תרבית טרי כל 72 שעות.
  6. נטרו את ה-DRG באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר כדי להעריך את הכדאיות שלו ואת צמיחתו העצבית כל 24 שעות (איור 2C ואיור 3).
    הערה: ניתן להצביע על כדאיות על ידי עלייה באורך ובצפיפות של עצבים. ניתן ללכוד תמונות לאורך זמן כדי להדגים את ההתפתחות של הרחבות תאי DRG (איור 3).

8. תרבית DRG מנותקת (איור 4)

הערה: ניתן להשתמש בכל צלחת מרובת בארות כדי לזרוע את נוירוני ה-DRG המנותקים. עם זאת, בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בשקופיות עם תחתית זכוכית עם 8 בארות מכיוון שהן סיפקו מפגש תאים טוב יותר ואיכות הדמיה לניתוחי אימונופלואורסצנטיות.

  1. ציפוי צלחות תרבות בקולגן
    1. הכן תמיסת עבודה של 50 מיקרוגרם/מ"ל של קולגן מחומצן I בסטרילי 0.01 M HCl בארון בטיחות ביולוגי.
    2. פיפטה 100 מיקרוליטר של תמיסת קולגן I לכל באר של המגלשה התחתונה מזכוכית 8 בארות. הטה וסובב בעדינות את השקופית כדי להבטיח שתמיסת הקולגן מכסה את כל המשטח התחתון של כל באר באופן שווה. דגרו את המגלשה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה למשך שעה אחת כדי להבטיח פילמור קולגן I.
      הערה: במהלך זמן הדגירה, המשך לשלבים 8.2 ו-8.3.
    3. לאחר הדגירה, יש להסיר בעדינות את כל שאריות תמיסת הקולגן הלא מפולימר I מכל באר. שוטפים כל באר עם 100 מיקרוליטר PBS. יש להסיר עודפי PBS ולהשאיר שכבה דקה שנותרה כדי למנוע מהקולגן להתייבש.
      הערה: המגלשה התחתונה מזכוכית בעלת 8 בארות יכולה להישאר בארון הבטיחות הביולוגי עד שה-DRG המנותקים מוכנים לשלב הזריעה.
  2. עיכול אנזימטי
    1. צנטריפוגה בעדינות של שפופרת ה-15 מ"ל המכילה DRGs שחולצו (שלב 6.5) למשך 5 דקות ב-200 × גרם בטמפרטורת החדר כדי לגלול את ה-DRG. הסר בעדינות את ה-HBSS באמצעות פיפטה.
    2. שטפו את ה-DRG בחומרים משלימים שחוממו מראש, הקישו בעדינות על הצינור כדי לוודא שכל התכולה נשטפת וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-200 × גרם כדי לגלול את ה-DRG.
    3. הסירו את המדיה והוסיפו 1 מ"ל של תמיסת פפאין (איור 4A, שלב 1). מערבבים בעדינות ודוגרים במשך 20 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית רקמות. יש לנער בעדינות את השפופרת כדי לעורר אותה כל 5 דקות.
    4. לאחר 20 דקות, יש להוסיף 4.5 מ"ל של חומר מוסף ולערבב בעדינות כדי לנטרל את הפפאין. צינור צנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 400 × גרם לכדורי DRG. הסר בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה.
    5. יש להוסיף 1 מ"ל של תמיסת קולגנאז IV/Dispase II ולדגור במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה. נער בעדינות את הצינור כל 5 דקות (איור 4A, שלב 1).
    6. לאחר 20 דקות, יש להוסיף 4.5 מ"ל של חומר מוסף ולערבב בעדינות כדי לנטרל את תמיסת הקולגנאז IV/Dispase II. צינור צנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 400 × גרם לכדורי DRG. הסר בזהירות את חומר העלון באמצעות פיפטה.
    7. הוסף 2 מ"ל של חומר משלים והוסף DNase I לריכוז סופי של 0.2 מ"ג/מ"ל. בנקודה זו, ה-DRGs מתעכלים ביסודיות ועשויים להופיע כגוש רופף (איור 4A, שלב 2).
  3. דיסוציאציה מכנית
    1. טריטו בעדינות את ה-DRG, פיפטינג למעלה ולמטה פי 4-5 באמצעות קצה פיפטה מסנן של 1000 μL (איור 4A, שלב 2).
    2. בצע שלב טריטורציה שני באמצעות קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר 4-5x. אחרי השלב הזה, הדגימה נראית עכורה עם כמה גושי רקמה גלויים שנותרו (איור 4A, שלב 2).
    3. סנן את מתלה התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל. שטפו בהדרגה את המסננת עם 10 מ"ל מדיה כדי להבטיח סינון מלא של התאים דרך המסננת (איור 4A, שלב 3).
    4. צינור צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1,000 × גרם לתאי גלולה. הסר את המדיה מהגלולה והשהה מחדש ב-500 מיקרוליטר של מדיה משלימה (איור 4A, שלב 4).
    5. הסר את כל שאריות PBS מבארות המגלשה התחתונה מזכוכית 8 בארות. פזר את תרחיף ה-DRG המנותק בין הבארות המצופות בקולגן. דגרו את המגלשות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה עם 5% CO2. הוסף מדיה נוספת לפי הצורך והחלף מדיה במדיה משלימה חדשה כל 48 שעות (איור 4B, שלב 5).
      הערה: ניתן לספור תאים מנותקים DRG באמצעות המוציטומטר או תא ספירת תאים וצביעה כחולה טריפאן כדי להבטיח מספר עקבי של תאים לבאר. עבור פרוטוקול זה, בערך 1 × 105 תאים נזרעו בכל באר.
    6. עקוב אחר תאים שמקורם ב-DRG באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר כדי להעריך את הכדאיות ואת הצמיחה העצבית (איור 4C ואיור 5).
      הערה: נוירונים מופיעים כגופי תאים מעוגלים עם גבולות מוגדרים ועשויים לקחת 24 שעות או יותר להיצמד, בעוד שתאים שאינם עצביים בדרך כלל מתיישבים לפני הנוירונים. ניתן להבחין בצמיחת נויריטים מסוימת לאחר 24 שעות ומתגברת עם הזמן עד 7 ימים בתרבית. תאים מנותקים שמקורם ב-DRG ו-DRG שלם מודגרים מראש למשך 72 שעות לפני הוספת תאים סרטניים והקמת תרביות משותפות.

9. הכנת תרחיפי תאים סרטניים והקמת תרבויות משותפות

הערה: ניתן להשתמש בתאי סרטן דבקים מסוגים רבים. אמצעי הגידול ומספרי התאים עבור תרביות משותפות יהיו תלויים בקו התא. אנו ממליצים על בדיקה מקדימה לפני הניסוי כדי לקבוע תזמון לאיסוף תאים ומספרי זריעת תאים אופטימליים. הפרוטוקול המתואר כאן התבסס על שימוש בקווי תאי סרטן הלבלב האנושיים PanC1 ו-MiaPaCa2, וקו תאי סרטן הערמונית DU-145.

  1. שטפו תאים בחומר נטול סרום וטריפסיניזציה אותם במשך כ-3 דקות עם 2 מ"ל טריפסין/צלחת 10 ס"מ.
  2. נטרלו את הטריפסין על ידי הוספת 6 מ"ל של חומר משלים ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להבטיח תרחיף חד-תאי. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר וכתם כחול טריפאן.
  3. השעו את התאים הסרטניים בריכוז של 2 × 105 תאים/מ"ל במדיה משלימה (שלב 1.2).
    הערה: צפיפות התאים האופטימלית עשויה להשתנות בהתאם לגודל התא, זמן ההכפלה ומשך התרבית המשותפת וניתן לכוונן אותה לפי הצורך.
  4. DRG בהרכבה שלמה ותרבית משותפת של תאים סרטניים (איור 6B)
    1. שאפו את המדיה מכל תרבויות ה-DRG הר בשקופית תחתית הזכוכית בעלת 8 בארות.
    2. פיפטה בעדינות 200 מיקרוליטר של תרחיף התאים הסרטניים (שלב 9.3) על גבי טיפת המטריגל המכילה את כל התושבת DRG.
      הערה: זה מבטיח פיזור אחיד של תאים סרטניים סביב הטיפה. היזהר לא להפריע לטיפה של המטריגל עם קצה הפיפטה.
    3. דגרו את מגלשת התרבות המשותפת בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. רענן את המדיה מדי יום על-ידי שטיפה עם 200 מיקרוליטר של מדיה משלימה מחוממת פעם אחת, ולאחר מכן הוספת 300 מיקרוליטר של מדיה משלימה לכל באר.
      הערה: שאפו בעדינות את המדיה באמצעות פיפטה כדי למנוע הפרעה לתרבית משותפת של תאי סרטן DRG. עם הזמן, ככל שהתרבויות המשותפות הופכות מורכבות ומאורגנות יותר, הן גם הופכות רגישות יותר להפרעות שעלולות להשפיע על אינטראקציות תאיות ועל שלמות התרבות המשותפת.
    4. נטרו את התרבות המשותפת באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר או פלואורסצנטי במרווחים של 24 שעות כדי להעריך את התנהגות תאי הסרטן ואת האינטראקציות העצביות (איור 6B).
      הערה: ניתן לכוונן את תדירות התצפית על סמך ציר הזמן של הניסוי והאינטראקציות בין התאים המעניינים.
  5. DRG מנותק ותרבית משותפת של תאים סרטניים (איור 6C)
    1. שאפו את התקשורת מהתרבויות המנותקות בשקופית עם 8 בארות זכוכית.
    2. פזרו בעדינות 200 מיקרוליטר מתרחיף התאים הסרטניים (שלב 9.3) לכל באר. בצע את אותם שלבי דגירה, רענון מדיה וניטור כפי שתוארו עבור תרבויות משותפות שלמות (שלבים 9.4.3 ו-9.4.4).
      הערה: להדמיה טובה יותר של תהליכים תאיים ואינטראקציות תא-נוירונים סרטניים, ניתן להוסיף עוקבי תאים פלואורסצנטיים לתרבית, בהתאם לפרוטוקול היצרן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול שלנו מתאר בידוד של תאים ראשוניים שמקורם ב-DRG של עכבר והקמת שני מודלים משלימים של תרביות: DRG מנותק ותרביות DRG שלמות, המאפשרות לנו לחקור אינטראקציות בין תאי עצב-סרטן ברמות מורכבות שונות. יתרון מרכזי של פרוטוקול זה הוא שניתן לייצר את שני סוגי התרבית באמצעות DRGs המבודדים מאותה חיה, מה שממזער את השונות הבין-חייתית והבין-ניסויית ומאפשר לשלב את המידע שנוצר מכל מודל ביתר קלות, ומספק מבט מקיף יותר על הדינמיקה של התא ואינטראקציות תא-תא. ניתן להתאים מודלים תרבותיים אלה ליישומים רבים; ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטות משופרות להקמת תרביות עצבים ראשוניות DRG דו-ממדיות ותלת-ממדיות ויישומן בתרבית משותפת עם תאים סרטניים. פרוטוקול זה מתקדם בשיטות קודמות על ידי הקמת שני המודלים במקביל. מכיוון שמודלים דו-ממדיים ותלת-ממדיים מוקמים בו זמנית, תוך שימוש בעצבים ראשוניים המבודדים מאותם בעלי חיים, השונות הבין-חייתית והבין-ניסויית ממוזערת, וניתן להשוות או לשלב נתונים משני המודלים ביתר קלות, מה שמקל על תצפיות משלימות על התנהגות תאית ותגובות רקמות מורכבות. הפרוטוקול שלנו מייעל עוד יותר א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי תפעול מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (PJT-178274) (LMM), ועל ידי מלגת אונטריו לתארים מתקדמים (LCBO), ועל ידי מלגה מהתיאום לשיפור כוח האדם להשכלה גבוהה - ברזיל (CAPES) - קוד פיננסי 001 (ERP). LMM הוא קתדרת ברקן לגנטיקה ורפואה מולקולרית באוניברסיטת קווינס. חלק מהתמונות נוצרו בחלקן באמצעות Biorender.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>כלים
70 ומיקרו; מסננת תאים mפרוג'ן71-229483-ULTמשמש לסינון מתלי תאים
מגלשות תחתונות זכוכית 8 בארותIBidi, מינכן, גרמניה80807
דומונט #5 - מלקחיים עדיניםכלי מדע עדין, פוסטר סיטי, ארה"ב11254-20
דומונט #5 מלקחייםכלי מדע עדין, פוסטר סיטי, ארה"ב11252-20
מספריים עדיניםכלי מדע עדין, פוסטר סיטי, ארה"ב91460-11
מלקחיים דפוסכלי מדע עדין, פוסטר סיטי, ארה"ב91121-12
מספריים אביבייםכלי מדע עדין, פוסטר סיטי, ארה"ב91500-09
<חזק>ריאגנטים
1x מי מלח חוצץ פוספטסיגמא, סנט לואיס, ארה"בD8662-500 מ"למשמש להמסת אנזימים
תוסף B-27 (פי 50)תרמו פישר סיינטיפיק, מסצ'וסטס, ארה"ב17504044משמש בריכוז של 2% במדיית F12
קולגן בקר סוג ICorning Incorporated, ניו יורק, ארה"ב354231משמש לציפוי צלחות, פתרון עבודה 50 ומיקרו; גרם/מ"ל ב-0.01 M HCl
קולגנאז סוג IVסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, ארה"בC4-BIOCיש להמיס ב-PBS ב-1.25 מ"ג/מ"ל, במינון, לאחסן ב-20 מעלות; C
דיספזה IIRoche, Basel, שוויץ4942078001יש להמיס ב-PBS ב-2.5 מ"ג/מ"ל, במינון, לאחסן ב-20 מעלות; C
דנאס ארוש, באזל, שוויץ.11284932001נוסף בריכוז הסופי של  0.2 מ"ג/מ"ל במהלך דיסוציאציה
סרום בקר עוברי (FBS)סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, ארה"בF1051משמש בריכוז של 10% במדיית F12
HBSS (תמיסת המלח המאוזנת של האנק)סיגמא, סנט לואיס, ארה"בH6648-500 מ"למוכן עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין
מקדם גדילה מופחת של MatrigelCorning Incorporated, ניו יורק, ארה"ב356231הפשרה ב-4 מעלות; C למשך הלילה, שומרים על קרח
תערובת תזונתית F-12 חזירסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, ארה"בN6658-500 מ"למדיום בסיסי להכנת מצע תרבית משלים
פפאיןרוש, באזל, שוויץ.10108014001יש להמיס ב-PBS ב-30 יח'/מ"ל, לאחסן ב-20 מעלות; C
פניצילין-סטרפטומיצין (פי 100)סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, ארה"בP4333-100 מ"למשמש בריכוז של 1% במדיה
תמיסת טריפאן בלוסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, ארה"בT8154-100 מ"ללהעריך את כדאיות התאים
טריפ אקספרסתרמו פישר סיינטיפיק, מסצ'וסטס, ארה"ב12605-028לקצירת תאים סרטניים
<חזק>נוגדנים
&בטא;-נוגדן טובולין IIIAbcam (קיימברידג', בריטניה)AB15568דילול 1:200
אלקסה פלואור 488תרמו פישר סיינטיפיק, מסצ'וסטס, ארה"בא-11008דילול 1:2000
אלכסה פלואור 594תרמו פישר סיינטיפיק, מסצ'וסטס, ארה"בא-21442דילול 1:2000
אלקסה פלואור 647תרמו פישר סיינטיפיק, מסצ'וסטס, ארה"בא-21245דילול 1:2000
נוגדן NeuNסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, ארה"במב377דילול 1:100
<חזק>צבעים פלואורסצנטיים בדיקות
ActinGreen 488 מגיב ReadyProbes (פלואידין)תרמו פישר סיינטיפיק, מסצ'וסטס, ארה"ב₪7110דילול 1:40
CellTrace Calcein אדום-כתוםתרמו פישר סיינטיפיק, מסצ'וסטס, ארה"בC34851גשש תאים המשמש להדמיית נוירונים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי
הוכסט 33342תרמו פישר סיינטיפיק, מסצ'וסטס, ארה"בH3570דילול 1:5000

מקורות

  1. Thiel, V., et al. Characterization of single neurons reprogrammed by pancreatic cancer. Nature. 640 (8060), 1042-1051 (2025).
  2. Zhu, M., Luo, F., Xu, B., Xu, J. Research progress of neural invasion in pancreatic cancer. Curr Cancer Drug Targets. 24 (4), 397-410 (2024).
  3. Zareba, P., et al. Perineural invasion and risk of lethal prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 26 (5), 719-726 (2017).
  4. Fu, Y., et al. Worst pattern of perineural invasion redefines the spatial localization of nerves in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 11 (766902), (2021).
  5. Hu, J., Chen, W., Shen, L., Chen, Z., Huang, J. Crosstalk between the peripheral nervous system and breast cancer influences tumor progression. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (6), 188828(2022).
  6. Li, J., Mei, S., Zhou, S., Zhao, F., Liu, Q. Perineural invasion is a prognostic factor in stage ii colorectal cancer but not a treatment indicator for traditional chemotherapy: A retrospective cohort study. J Gastrointest Oncol. 13 (2), 710-721 (2022).
  7. Schmitd, L. B., Perez-Pacheco, C., D'silva, N. J. Nerve density in cancer: Less is better. FASEB Bioadv. 3 (10), 773-786 (2021).
  8. Zahalka, A. H., Frenette, P. S. Nerves in cancer. Nat Rev Cancer. 20 (3), 143-157 (2020).
  9. Winkler, F. Neuroscience and oncology: State-of-the-art and new perspectives. Curr Opin Neurol. 36 (6), 544-548 (2023).
  10. Lanigan, L. G., et al. Comparative pathology of the peripheral nervous system. Vet Pathol. 58 (1), 10-33 (2021).
  11. Jiang, S. -H., Zhang, S., Wang, H., Xue, J. -L., Zhang, Z. -G. Emerging experimental models for assessing perineural invasion in human cancers. Cancer Lett. 535 (215610), (2022).
  12. Moysidou, C. -M., Barberio, C., Owens, R. M. Advances in engineering human tissue models. Front. Bioeng. Biotechnol. 8 (620962), (2021).
  13. Bayat, F. K., et al. Adult mouse dorsal root ganglia neurons form aberrant glutamatergic connections in dissociated cultures. PloS ONE. 16 (3), e0246924(2021).
  14. Lin, Y. -T., Chen, J. -C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. J Vis Exp. (140), e57569(2018).
  15. Schmidt, H., Rathjen, F. G. Dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. (58), e3667(2011).
  16. Klimovich, P., Rubina, K., Sysoeva, V., Semina, E. Three-dimensional model of dorsal root ganglion explant as a method of studying neurotrophic factors in regenerative medicine. Biomedicines. 8 (3), 49(2020).
  17. Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3d organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS ONE. 12 (7), e0181612(2017).
  18. Melli, G., Höke, A. Dorsal root ganglia sensory neuronal cultures: A tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
  19. Du, J., Sudlow, L. C., Luzhansky, I. D., Berezin, M. Y. Drg explant model: Elucidating mechanisms of oxaliplatin-induced peripheral neuropathy and identifying potential therapeutic targets. bioRxiv. , (2023).
  20. Mo, Y. J., Kim, Y. -S., Kim, M. S., Lee, Y. -I. Advantages of adult mouse dorsal root ganglia explant culture in investigating myelination in an inherited neuropathic mice model. Methods Protoc. 5 (4), 66(2022).
  21. Nguyen, U. N., et al. Type i collagen concentration affects neurite outgrowth of adult rat drg explants by altering mechanical properties of hydrogels. J Biomater Sci Polym Ed. 35 (2), 164-189 (2024).
  22. Ito, K., et al. Histological effects of combined therapy involving scar resection, decellularized scaffolds, and human ipsc-ns/pcs transplantation in chronic complete spinal cord injury. Sci Rep. 14 (1), (2024).
  23. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L., Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).
  24. Berkovitch, Y., Seliktar, D. Semi-synthetic hydrogel composition and stiffness regulate neuronal morphogenesis - pubmed. Int J Pharm. 523 (2), 545-555 (2017).
  25. Carozzi, V. A., Salio, C., Rodriguez Menendez, V., Ciglieri, E., Ferrini, F. 2d vs 3d morphological analysis of dorsal root ganglia in health and painful neuropathy. Eur J Histochem. 65 (Suppl 1), 3276(2021).
  26. Smith, P. R., Meyer, A., Loerch, S., Campbell, Z. T. Protocol for the isolation and culture of mouse dorsal root ganglion neurons for imaging applications. STAR Protocols. 4 (4), (2023).
  27. Bunge, R. P. Expanding roles for the schwann cell: Ensheathment, myelination, trophism and regeneration - pubmed. Curr Opin Neurobiol. 3 (5), 805-809 (1993).
  28. Chen, Z., Fang, Y., Jiang, W. Important cells and factors from tumor microenvironment participated in perineural invasion. Cancers. 15 (5), 1360(2023).
  29. Jang, K., Garraway, S. M. A review of dorsal root ganglia and primary sensory neuron plasticity mediating inflammatory and chronic neuropathic pain. Neurobiol Pain. 15 (100151), (2024).
  30. Hanani, M., et al. Age-related changes in neurons and satellite glial cells in mouse dorsal root ganglia. Int J Mol Sci. 24 (3), 2677(2023).
  31. Martinelli, C., Sartori, P., Ledda, M., Pannese, E. Age-related quantitative changes in mitochondria of satellite cell sheaths enveloping spinal ganglion neurons in the rabbit. Brain Res Bull. 61 (2), 147-151 (2003).
  32. Niwa, H., et al. Differential age-dependent trophic responses of nodose, sensory, and sympathetic neurons to neurotrophins and gdnf: Potencies for neurite extension in explant culture. Neurochem Res. 27 (6), 485-496 (2002).
  33. Adler, J. E. Age-dependent differential regulation of sensory neuropeptides by glial cell line-derived neurotrophic factor. J Neurochem. 71 (1), 170-177 (1998).
  34. Podratz, J. L., et al. Neurotoxicity to drg neurons varies between rodent strains treated with cisplatin and bortezomib. J Neurol Sci. 362, 131-135 (2015).
  35. Lawson, S. N., Biscoe, T. J. Development of mouse dorsal root ganglia: An autoradiographic and quantitative study. J Neurocytol. 8 (3), 265-274 (1979).
  36. Monje, M., et al. Roadmap for the emerging field of cancer neuroscience. Cell. 181 (2), 219-222 (2020).
  37. Silverman, D. A., et al. Cancer-associated neurogenesis and nerve-cancer cross-talk. Cancer Res. 81 (6), 1431-1440 (2021).
  38. Vermeer, P. D., Restaino, A. C., Barr, J. L., Yaniv, D., Amit, M. Nerves at play: The peripheral nervous system in extracranial malignancies. Cancer Discov. 15 (1), 52-68 (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DRGWhole MountCo Culture
הקמת מודלים במבחנה של תרבית גרעיני שורש גב: גישות משלימות לחקירת הצלבה בין סרטן לעצב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.