מאמר שיטה

תכנון ויישום של פפטיד מעכב להפחתת ויסות מהיר במבחנה של רמות שינויים לאחר תרגום באתר ספציפי

DOI:

10.3791/68581

⸱

20 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Lab of Reproductive Medicine and Offspring Health, Nanjing Medical University, 2Department of Gynaecology and Obstetrics, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, 3Animal Experiment Center of Research Department, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, 4Hefei Cancer Hospital, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר את מפרטי התכנון, תקני בקרת האיכות ומערכת האימות הפונקציונלית של TAT-PIP, פפטיד מעכב שינוי לאחר תרגום.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבונים הם המוציאים לפועל העיקריים של פעילויות החיים ומווסתים ברמות שעתוק, תרגום ושינוי לאחר תרגום (PTM). יתר על כן, PTM מייצג מנגנון מסובך יותר לוויסות פעילויות חלבון שכן לחלבון יש בדרך כלל סוגים שונים של PTMs ואתרים מרובים עבור PTM ספציפי. ניתן להשתמש בטרנספקציה של פלסמיד או לנטי-וירוס ואדנווירוס בסינון ראשוני של אתר ה-PTM החשוב מבחינה תפקודית בין כל האתרים שזוהו; עם זאת, שיטות אלו תמיד מתמודדות עם אתגרים כמו יעילות נמוכה בכניסת תאים ורקמות, עלויות גבוהות וגוזלות זמן, תגובה חיסונית פוטנציאלית וכו'. כדי לטפל בכך, פיתחנו לאחרונה והשתמשנו בהצלחה בסוג של פפטיד משולב שנקרא TAT-PIP, TAT-מצומד PTM מעכב פפטיד. TAT-PIP מורכב ממודול TAT המאפשר כניסת תאים ורקמות ומודול PIP המפחית באופן ספציפי את ה-PTM באתרים ממוקדים באמצעות קשירה תחרותית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר את מפרטי התכנון, תקני בקרת האיכות ומערכת האימות הפונקציונלית של TAT-PIP. בסעיף העיצוב, אנו מתארים את העקביות, האורך האופציונלי, הספציפיות והשימור של TAT-PIP. לאחר מכן, אנו מציגים את דרישות בדיקת האיכות של TAT-PIP, המבטיחות את יעילותו ובטיחותו. ביישום החלק של TAT-PIP, הצגנו את מבחן שיפוע הריכוז של TAT-PIP, תהליך הדגירה של התאים שנבדקו והזיהוי הפנוטיפי שלאחר מכן. לסיכום, אנו מתארים שיטה יעילה לסינון אתרי PTM על ידי הפלה סלקטיבית של אתר ספציפי והתבוננות בפנוטיפ המתקבל כדי להסיק את תפקודו. בשל עלותה הסינתטית הנמוכה ויעילותה הגבוהה, שיטה זו מתגברת על מגבלות הטכנולוגיות הקיימות, כגון טרנספקציה של פלסמיד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבונים הם המוציאים לפועל העיקריים של פעילויות החיים, ותהליכי הבקרה הביולוגיים שלהם כוללים שני היבטים מרכזיים של ויסות ביטוי גנים - שעתוק גנים ותרגום mRNA. עם זאת, במהלך העשורים האחרונים, שינוי לאחר תרגום (PTM) הפך למנגנון הכרחי נוסף לוויסות תפקודים תאיים1. זרחון, ה-PTM המוכר ביותר לחוקרים, ממלא תפקיד חשוב במיוחד בתפקודים פיזיולוגיים. לדוגמה, לאחר שקינאז מווסת אותות חוץ-תאיים (ERK) עובר זרחון על ידי MEK קינאז באתרי Thr202 ו-Tyr204, הקונפורמציה שלו משתנה, וחושפת את האתר הפעיל, המפעיל חלבוני מטרה במורד הזרם, כגון גורמי שעתוק2. לעומת זאת, כאשר ה-N-terminal Ser9 של GSK-3β עובר זרחן על ידי Akt/PKB קינאז, כיס קשירת המצע שלו נחסם, מה שמוביל לאובדן פעילות קינאז3. Ubiquitination הוא PTM חשוב נוסף המווסת תהליכים תאיים שונים באמצעות התקשרות קוולנטית של מולקולות יוביקוויטין לחלבוני סובסטרט. יוביקוויטין מכיל 7 שאריות ליזין (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) ומתיונין N-terminal (M1). הקישור של שרשראות יוביקוויטין באתרים שונים מקנה גורלות שונים לחלבוני הסובסטרט. התפקיד העיקרי של ubiquitination המקושר ל-K48 הוא לסמן חלבוני סובסטרט לפירוק על ידי פרוטאזום4. לעומת זאת, התפקיד העיקרי של ubiquitination המקושר ל-K63 הוא לעסוק בהעברת אותות לא מתכלה, כגון תיקון נזק ל-DNA, תגובות דלקתיות ואנדוציטוזיס5. בשנים האחרונות, עם ההתקדמות המהירה של טכנולוגיות פרוטאומיקה, התגלה מספר הולך וגדל של PTMs חדשים. מעבר לאצטילציה קלאסית, זוהו אצילציות חדשות כגון פרופיונילציה, קרוטונילציה וגלוטרילציה6. בתחום השינויים בהיסטון, לקטוסילציה של היסטון מפריעה לשינוי RNA m6A ולהומאוסטזיס של המיקרו-סביבה החיסונית7. בתחום השינויים שאינם היסטונים, הפחתת הקרוטונילציה של ATP5O היא גורם מזיק עיקרי בוויסות הפחתה של חילוף החומרים של פוספוליפידים8.

ביצוע מחקר על PTM דורש קידום שיטתי של הניתוח של פרוטאום PTM9. תחום זה מקיף שני כיווני מחקר עיקריים: ניתוח פרופילי PTM ברמת הפרוטאום השלמה וזיהוי מקיף של אתרי PTM של חלבון ספציפי. למרות שספקטרומטריית מסה מודרנית יכולה לזהות ביעילות סוגים שונים של PTMs ואת האתרים הספציפיים, הסינון והאימות של אתרים פונקציונליים מרכזיים נותר אתגר מדעי מרכזי המגביל את התקדמות המחקר. קביעת אסטרטגיות סינון אתרים יעילות היא הצעד הראשון לקראת פתרון התפקוד של אתרי רגולציה מרכזיים. שיטות מסורתיות כוללות בניית פלסמידים מוטנטיים לאתרים ספציפיים (השבתת מוטציות, הפעלת מוטציות), החדרתם לתאי מטרה באמצעות טכניקות טרנספקציה במבחנה , והערכה שיטתית של שינויים באינדיקטורים פנוטיפיים כגון התפשטות תאים, אפופטוזיס ומתח חמצוני. עם זאת, אסטרטגיה זו עומדת בפני מכשולים טכניים משמעותיים במודלים של תאים שקטים מבחינה שעתוק כמו ביציות ומערכות תרבית רקמות ראשוניות. למרות שמערכת התמרה של לנטי-ויראלי או אדנו-וירוס יכולה להתגבר חלקית על נושא יעילות הטרנספקציה, היישום שלה עומד בפני אתגרים כפולים: עלויות כלכליות גבוהות ויעילות חדירה נמוכה של חלקיקים נגיפיים במודלים של רקמות מבחנה . בעוד שהאסטרטגיה של בניית עכברים מוטנטיים היא ארוכת טווח ויקרה ביותר. בסך הכל, דחוף לפתח אסטרטגיות כלכליות ויעילות לסינון ראשוני של אתרי PTM חשובים מבחינה תפקודית.

בשנים האחרונות, הצוות שלנו פיתח והשתמש בהצלחה בטכניקת ויסות PTM מהירה הנקראת TAT-PIP, פפטיד מעכב PTM מצומד TAT, המבוסס על עיכוב תחרותי של פוליפפטיד. היתרון המרכזי שלו הוא האוניברסליות והיעילות הגבוהה שלו לביצוע סינון ראשוני של אתרי PTM חשובים מבחינה תפקודית, המספק בסיס חיוני לניתוחים מעמיקים של המנגנונים המולקולריים של אתרי PTM מרכזיים. מחקר זה מבהיר באופן שיטתי את המסגרת העיקרית ותהליך היישום של TAT-PIP, ומדגים את יעילותו בוויסות רמת ה-PTM באתר ספציפי באמצעות נתונים ניסיוניים מייצגים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תכנון רצף TAT-PIP

הערה: TAT-PIP מורכב משני חלקים של פפטידים (איור 1): החלק הטרמינלי N הוא TAT, CYGRKKRQRRRR, אשר נשאר ללא שינוי עבור כל TAT-PIP ויכול לסייע בכניסה יעילה לתאים בתרבית במבחנה או לרקמות in vivo ; החלק הטרמינלי C הוא רצף פוליפפטיד סביב אתר ה-PTM הספציפי (איור 1, בדרך כלל ליזין בסמל "K", מודגש באדום) של חלבון אובייקט. אורך ה-PIP הוא כ-10-15 שאריות AA (אם ארוך יותר, העלות עולה; אם קצר יותר, הסגוליות יורדת משמעותית).

  1. אופטימיזציה של רצף PIP באמצעות ניתוח Blast (איור 2).
    1. היכנס ל-https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, לחץ על חיפוש הפיצוץ אחר רצפי חלבונים.
    2. העתק את רצף חלבון היעד לחלון הכניסה לרצף השאילתה .
    3. בבחירת חיפוש, בחר באפשרות מסדי נתונים רגילים. בחר באפשרות blastp (חלבון-חלבון BLAST) בבחירת התוכנית. לבסוף, לחץ על כפתור BLAST (איור 2B).
    4. בחר מקטעי פפטיד עם הספציפיות הגבוהה ביותר כ-PIPs מועמדים.
  2. ערכו השוואה הומולוגיה בין בני אדם לעכברים עבור ה-PIP הסופי.
    1. היכנס ל-https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, לחץ על חיפוש הפיצוץ אחר רצפי חלבונים.
    2. העתק את רצפי החלבון ממיני אדם ועכבר והדבק אותם בתיבת רצף הקלט.
    3. לחץ על כפתור השליחה כדי לקבל את התוצאות.
    4. בחר PIP עם 100% הומולוגיה בין אדם לעכבר (איור 2C).
  3. קבע את ההרכב של TAT-PIP, המורכב מ- TAT מסוף N ו- PIP מסוף C.

2. סינתזה ואימות איכות של TAT-PIP

  1. בחר חברה עם ניסיון רב בפרויקטים כדי להבטיח טוהר פפטידים של לא פחות מ-98% עם ספקטרומטריית מסה, תוך הימנעות מזיהומים שעלולים להשפיע על הניסויים הבאים.
    הערה: רמת האנדוטוקסין של הפוליפפטיד צריכה להיות ≤10, והיא צריכה להיות נטולת פתוגנים.

3. היישום של TAT-PIP

  1. השתמש במים טהורים במיוחד נטולי פתוגנים כדי להמיס TAT-PIP כדי להשיג ריכוז מלאי של 10 מ"ג/מ"ל. חלקו את המלאי לצינורות קטנים כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים, מה שיגרום לדנטורציה חלקית.
    הערה: הוספת 1% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) תסייע בהגנה על המבנה של TAT-PIP.
  2. טפל בתאים עם TAT-PIP.
    1. תרבית תאי כליה עוברית אנושית 293T במדיום הנשר המותאם של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין בתנאי תרבית סטנדרטיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
      הערה: לאחר הזריעה, התאים עברו תרבית במשך כ-12 שעות, וטיפול TAT-PIP בוצע כאשר המפגש הגיע לכ-70%.
    2. יש לדלל את ה-TAT המומס ל-1 מ"ג/מ"ל באמצעות PBS, ולאחר מכן להוסיף ישירות למדיום תרבית התאים במינון המתאים (הריכוז הסופי המומלץ של מדיום התרבית: 0.05 מ"ג/מ"ל, 0.1 מ"ג/מ"ל, 0.2 מ"ג/מ"ל, 0.4 מ"ג/מ"ל) למשך 24 שעות.
    3. שוטפים את התאים במדיום התרבות המקורי 3 פעמים.
    4. בצע ניתוח כתמים מערביים כדי לאמת את מידת הוויסות של ה-PTM.
      הערה: בהתבסס על הניסיון ותוצאות הניסוי שלאחר מכן, הריכוז הסופי האופטימלי של TAT-PIP הוא 0.1 מ"ג/מ"ל.

4. כתם מערבי

  1. הכן דגימות חלבון תאים.
    1. שטפו את התאים עם מי מלח עם פוספט (PBS) 3 פעמים, הוסיפו 200 מיקרוליטר של מאגר ליזה חזק של בדיקת רדיואימונומון-משקעים (RIPA) (עם תוספת מעכב פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד [PMSF]-פרוטאז) לתוך כדור התא, ודגרו למשך 5 דקות לליזה ראשונית, גרדו אותם בעזרת מגרד תאים.
    2. סוניקציה של התערובת באמצעות מגרסה אולטרסאונד בעוצמת אנרגיה של 12% למשך 5 שניות.
    3. מצננים את ליזאט התא על קרח למשך 30 דקות וצנטריפוגה בחום של 13400 גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    4. העבירו את החלבונים המכילים סופרנטנט לצינור צנטריפוגה מקורר מראש של 1.5 מ"ל. הוסף 1/4 נפח של מאגר דגימה פי 5 לסופרנטנט (ריכוז סופי פי 1).
    5. מערבלים את התערובת, מחממים אותה בחום של 95 מעלות למשך 5 דקות בתרמוסטט יבש, ומצננים על קרח למשך 2 דקות.
    6. מדוד את ריכוז החלבון הכולל באמצעות מבחן ברדפורד על Nanodrop.
  2. בצע אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE).
    1. השתמש בג'ל מסלק 12% ובג'ל ערימה של 4% עבור SDS-PAGE.
    2. פיפטה דגימות החלבון לבארות בהתאם לנפח שצוין.
    3. הפעל את מנגנון האלקטרופורזה והפעל תחילה ב-80 וולט, 300 mA למשך 30 דקות כדי ליישר את הרצועות בממשק בין ג'לי הערימה והפתרון. לאחר מכן, הפעל ב-120 וולט, 300 mA למשך 45 דקות כדי לפתור את החלבונים.
    4. העבירו את החלבונים מהג'ל לקרום הפוליווינילידן פלואוריד (PVDF) באמצעות מנגנון העברה מהיר.
  3. בצע חסימה, דגירה של נוגדנים והדמיה.
    1. יש לחסום את ממברנת ה-PVDF בחלב דל שומן 5% בתמיסת מלח עם Tris-buffered המכילה 0.1% Tween 20 (TBST) ולדגור בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה.
    2. דגרו את הממברנה עם הנוגדן העיקרי המדולל 1:1000 בחלב דל שומן 5% / PBST למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על מסובב.
    3. שוטפים את הממברנה שלוש פעמים עם TBST (10 דקות כל אחת).
    4. דגרו את הממברנה עם הנוגדן המשני המדולל 1:1000 בחלב דל שומן 5% / TBST ב-RT למשך שעה.
    5. שוטפים את הממברנה שלוש פעמים עם TBST (10 דקות כל אחת).
    6. חשוף את הממברנה בסדרת זמן (5 שניות, 10 שניות, 20 שניות, 30 שניות, 60 שניות, 120 שניות) כדי לקבל את התמונה האופטימלית תחת מכשיר כימילומינסנציה אלקטרו-גנרטור (ECL).

5. אימות תפקודי של TAT-PIP בתאים מתורבתים במבחנה

  1. זיהוי רמות של מיני חמצן תגובתי תאיים (ROS).
    1. צלחת תאי 293T בצפיפות אופטימלית של 1 x 105 תאים/באר בצלחת תרבית של 24 בארות.
    2. טפל בתאים עם פפטיד מעכב קרוטונילציה (THCIP) מצומד TAT 3 ליזין 116 (0.1 מ"ג/מ"ל) למשך 24 שעות, ולאחר מכן שטוף את התאים עם PBS.
    3. דגרו על התאים עם 10 מיקרומטר דיכלורו-דיהידרו-פלואורסצאין דיאצטט (DCFH-DA) ב-DMEM ללא סרום ב-37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 20 דקות.
    4. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך, ומדוד את עוצמת הקרינה באמצעות הפונקציה Measure ב-ImageJ.
      הערה: נעשה שימוש בערכת מסנני FITC, עם מסנן פליטה של 465-495 ננומטר, מראה דיכרואית 505A ומסנן פליטה שני של 512-550 ננומטר.
  2. בדיקת התפשטות תאים
    1. זרע תאי 293T בצפיפות אופטימלית של 1 x 105 תאים לבאר בצלחת תרבית של 24 בארות.
    2. הוסף 10 מיקרוליטר של מגיב CCK-8 לכל באר.
    3. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
    4. רשום את הספיגה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות והחסר את אות הרקע מהבארות הריקות (בינוני + CCK-8).
    5. נרמל את הנתונים כדי לחשב את כדאיות התא.
  3. זיהוי רמות ATP סלולרי
    1. ליז את התאים עם מאגר ליזה. צנטריפוגה את הליזאט ב-12,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. אסוף את הסופרנטנט לניתוח הבא.
    2. לדלל את התמיסה הסטנדרטית של ATP עם מאגר הליזה כדי ליצור שיפוע ריכוז של 0.5 מיקרומטר, 1 מיקרומטר, 2 מיקרומטר, 3 מיקרומטר, 4 מיקרומטר ו-5 מיקרומטר.
    3. הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת גילוי ATP לכל באר המכילה את הסופרנטנט של התא או תקן ATP.
    4. מדוד מיד את האות הזוהר באמצעות קורא מיקרו-פלטות.
      1. לחץ על פריסת לוח, בחר את תבנית הלוח המתאימה בשינוי תבנית לוח כדי להגדיר דוגמאות (תקנים ודוגמאות).
      2. לאחר מכן לחץ על פרוטוקול בצד שמאל, בחר בלחצן כימילומינסנציה ולאחר מכן לחץ על התחל כדי להתחיל בזיהוי.
    5. צור עקומה סטנדרטית מהאותות הזוהרים של תקני ה-ATP והשתמש בה כדי לכמת את ריכוז ה-ATP בסופרנטנט התא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתאר אסטרטגיה המשתמשת ב-TAT-PIP כדי להפחית את רמת ה-PTM של חלבון מטרה באתר ספציפי בהתבסס על עיכוב תחרותי. בדוגמה טיפוסית, ה-TAT-PIP כאן שונה במיוחד ל-THCIP. הוא מורכב משני מודולים פונקציונליים: (1), פפטיד חודר תא N-terminal TAT (CYGRKKRRQRRR), המאפשר ל-THCIP לחדור לתאים; (2) הרצף הטרמינלי C סביב K116 של H3, AIHAKRVTIMPKD, שמתחרה באופן ספציפי עם H3 האנדוגני שיש לעבור קרוטונילציה ב-K116 (איור 2A). הנוגדן הספציפי נגד אתר זה נקרא H3crHS (נוגדן H3 ליזין קרוטונילציה באתר מאה ושישה עשר).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, השלבים הבאים הם קריטיים. ראשית, תכנון TAT-PIP מתייחס לספציפיות של הפפטיד. שנית, לייעל את היישום והריכוז הסופי; יש לבדוק בקפידה את הריכוז האופטימלי כדי להשיג נוקדאון יעיל ומהיר. שלישית, כדי לאמת את ההשפעה של TAT-PIP, מומלץ לבצע ניסויים מרובים במקום להסתמך על ניסוי בודד כדי לאשר את ההשפעות הנוספות שלו.

בהשוואה בין השיטות הקיימות, שיטה זו מדגימה בעיקר שלושה יתרונות: ראשית, בהשוואה לטרנספקציה של פלסמיד וזיהום לנטי-ויראלי או אדנו-וירוס, TAT-PIP מפגין ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לכל חברי המעבדה על עזרתם הנדיבה. מחקר זה נתמך כספית על ידי תוכנית המו"פ הלאומית של סין לדונג ז'אנג (מענק מס': 2022YFC2702202).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מערכת הדמיה רב תכליתית אוטומטיתTanon4600מד החשיפה מזהה ומדמה את רצועות חלבון המטרה על ידי זיהוי אותות הקרינה או הכימילומינסנציה על הממברנה לאחר טיפול הפיתוח.
ערכת ספירת תאים-8GLPBIOGK10001בהתבסס על המתאם בין כדאיות מטבולית של תאים למספר התאים, שיטה זו מעריכה את יכולת ההתפשטות של תאים על ידי מדידת יכולת ההפחתה של תאים לריאגנטים CCK-8
Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium (DMEM)Gibco11995065מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco הוא מדיום בסיסי בשימוש נרחב לתמיכה בצמיחה של מגוון רחב של תאי יונקים.
מצע כימי ECLECL BiosharpBL520BECL מייצרים אותות אור באמצעות תגובות כימילומינסנציה המאפשרות זיהוי של חלבונים או חומצות גרעין ספציפיות.
מכשיר אלקטרופורזהTanonEPS600התפקיד העיקרי של מנגנון האלקטרופורזה הוא להפריד ולנתח מקרומולקולות ביולוגיות ‌
ערכת בדיקת ATP משופרתBeyotimeS0027הערכה יכולה לזהות ביעילות את רמת ה-ATP של דגימות
סרום בקר עוברי (FBS)Gibco16000-044סרום בקר עוברי (FBS) מספק חומרים מזינים חיוניים וגורמי גדילה לתחזוקה וצמיחה של תאים.
GenScript eBlotL1GenScriptL00686המכשיר יעיל ביותר והוא מסוגל להשיג במהירות העברת חלבון מג'ל פוליאקרילאמיד לקרום PVDF תוך 15 דקות
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךשל Olympus CorporationIX73מיקרוסקופ פלואורסצנטי משתמש באור אולטרה סגול כמקור אור כדי להקרין את האובייקט הנבדק כדי לגרום לו לפלוט פלואורסצנטי, ולאחר מכן להתבונן בצורה ובמיקום של האובייקט מתחת מיקרוסקופ.
ספקטרופוטומטר UV-Vis מיקרונפח NanoDrop2000 ThermoScientific2000NanoDrop שימש לקביעת ריכוז ה-DNA או RNA
PVDF ממברנהBioRAD1620177לסוג זה של קרום PVDF יש עמידות כימית מצוינת ויכולת קשירת חלבון גבוהה
ערכת בדיקת ROSBeyotimeS0033Sהערכה יכולה לזהות במדויק את רמת מיני החמצן התגובתי בתאים
מצומד TAT-H3K16 פפטיד מעכב קרוטונילציהנאנג'ינג טאופו ביוטכנולוגיה ושות', בע"מCN218107533Uזה יכול להתחרות באופן ספציפי עם ה-H3 האנדוגני לקרוטונילציה ב-K16 
TBSTBiosharpBL602ATBST יכול לנקות חומרים לא רלוונטיים על הממברנה, להפחית שגיאות ניסוי ולהבטיח את דיוק תוצאות הניסוי >
מגרסה אולטרסאונדחזזיתLC-AUD-150Pהפונקציות העיקריות של המנגנון כוללות פיצול תאים, פיזור חלקיקים ואמולסיה
VarioskanLUX Thermo FisherVL0000D0Microplate יכולים להשיג ניתוח כמותי בתפוקה גבוהה של דגימות ביולוגיות על ידי זיהוי האותות האופטיים (כגון ספיגה, פלואורסצנטיות או זוהר) של דגימות במיקרו-לוחות
מצעי קוראי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
  2. Li, R., et al. Metal-dependent protein phosphatase 1A functions as an extracellular signal-regulated kinase phosphatase. FEBS J. 280 (11), 2700-2711 (2013).
  3. Blankesteijn, W. M., van de Schans, V. A., ter Horst, P., Smits, J. F. The Wnt/frizzled/GSK-3 beta pathway: a novel therapeutic target for cardiac hypertrophy. Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 175-180 (2008).
  4. Sui, B., Zheng, J., Fu, Z., Zhao, L., Zhou, M. TRIM72 restricts lyssavirus infection by inducing K48-linked ubiquitination and proteasome degradation of the matrix protein. PLoS Pathog. 20 (2), e1011718(2024).
  5. Martínez-Férriz, A., Ferrando, A., Fathinajafabadi, A., Farràs, R. Ubiquitin-mediated mechanisms of translational control. Semin Cell Dev Biol. 132, 146-154 (2022).
  6. Li, X., Yu, T., Li, X., He, X., Zhang, B., Yang, Y. Role of novel protein acylation modifications in immunity and its related diseases. Immunology. 173 (1), 53-75 (2024).
  7. Zhao, S. S., Liu, J., Wu, Q. C., Zhou, X. L. Role of histone lactylation interference RNA m6A modification and immune microenvironment homeostasis in pulmonary arterial hypertension. Front Cell Dev Biol. 11, 1268646(2023).
  8. Chen, L. J., et al. ATP5O hypo-crotonylation caused by HDAC2 hyper-phosphorylation is a primary detrimental factor for downregulated phospholipid metabolism under chronic stress. Research (Wash D C). 2022, 9834963(2022).
  9. Fan, S., Kong, C., Zhou, R., Zheng, X., Ren, D., Yin, Z. Protein post-translational modifications based on proteomics: a potential regulatory role in animal science. J Agric Food Chem. 72 (12), 6077-6088 (2024).
  10. Li, C. R., et al. BIN2 inhibition suppress ovarian cancer progression meanwhile protect ovarian function through downregulating HDAC1 and RPS6 phosphorylation respectively. Clin Transl Med. 14 (10), e70051(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PTMTAT PIP
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים