מאמר שיטה

הדמיה גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ספקטרלית כדי למזער פלואורסצנטיות רקמות לא ספציפיות

DOI:

10.3791/68644

⸱

28 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1McMaster Immunology Research Centre, Department of Medicine, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 2Schroeder Allergy and Immunology Research Institute, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 3Carl Zeiss Canada MicroImaging, 4Division of Otolaryngology, Department of Surgery, McMaster University Medical Centre, McMaster University Medical Centre

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הלבנה איטרטיבית ספקטרלית מרחיבה ריבוי (IBEX) מתבססת על טכניקת IBEX הבסיסית על ידי הוספת חסימת הפרין כדי למזער קשירה לא ספציפית ומינוף זיהוי ספקטרלי עם פירוק חישובי כדי לדכא אוטופלואורסצנטיות. גישה זו מאיצה את רכישת התמונה תוך הפחתת מקורות הרקע, ומאפשרת ניתוחים פרוטאומיים מרחביים רב-עגולים ובעלי פרמטרים גבוהים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה מרובת מאוד מאפשרת לחקור תאים מגוונים מבחינה תפקודית והנישות שלהם בסביבות הרקמה הטבעיות שלהם. הלבנה איטרטיבית מרחיבה ריבוי (IBEX) היא טכניקת תיוג חיסוני מחזורית והפעלת פלואורופור המאפשרת לדמיין מספר סמנים על אותו קטע רקמה. לאחר מכן ניתן לנתח תמונות שצולמו כדי לרכוש נתונים של תא בודד כדי להגדיר אשכולות תאים, הלוקליזציה שלהם וסוגי התאים השכנים. פירוש נתונים אלה מסתמך על היכולת להבחין בין ביטויי סמנים אמיתיים לבין מקורות רקע הטבועים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. IBEX ספקטרלי, עיבוד של פרוטוקול IBEX, משלב זיהוי קונפוקלי ספקטרלי עם פירוק חישובי ומשלב חסימת הפרין כדי להפחית קשירה מחוץ למטרה מבוססת מטען. שילוב זה משפר את יחס האות לרקע, מדכא אוטופלואורסצנטיות של רקמות וממזער דימום תוך הפחתת זמן הרכישה בהשוואה להדמיה קונפוקלית רב-מסלולית קונבנציונלית. יישום על רקמת פוליפ באף אנושי, מודל המאופיין בתכולת אאוזינופילים גבוהה ואוטופלואורסצנציה חזקה, הראה הדמיה אמינה של 26 סמנים על פני תאים מבניים, חיסוניים ומצב תא במשך שישה סבבי הדמיה. זרימת העבודה המתקבלת מייצרת מידע פרוטאומי בעל מימד גבוה ונפתר מרחבית הלוכד ארכיטקטורת רקמות מורכבת ונישות תאיות. יחד, גישה אופטימלית זו מספקת אסטרטגיה חזקה וישימה רחבה להדמיה מרובבת, המתאימה במיוחד לרקמות שבהן אוטופלואורסצנטיות וצביעה לא ספציפית מגבילים גישות קונבנציונליות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות מורכבות מקבוצה מגוונת של תאים בעלי פונקציות מיוחדות המתארגנות למבנים תלת מימדיים ובאמצעות אינטראקציה מתאמות את התהליכים הביולוגיים הנחוצים לחיים. פתולוגיה מתעוררת כאשר שיבושים בהרכב התא או בארכיטקטורת הרקמות מפריעים לאינטראקציות אלה ופוגעים בהומאוסטזיס של הרקמות1. נדרש ידע על האופן שבו סוגי התאים המיוחדים הרבים מתמקמים ומתקשרים בתוך הרקמות שלנו על מנת להבין את הביולוגיה העומדת בבסיס בריאות האדם ומחלותיו.

התקדמות בטכנולוגיות פרופיל של תא בודד ברמה הטרנסקריפטומית, האפיגנומית והפרוטאומית חשפה מגוון יוצא דופן של סוגי תאים מיוחדים. 2,3 טכנולוגיות כגון ריצוף RNA של תא בודד וציטומטריית זרימה ספקטרלית יכולות למדוד את מספר הפרמטרים הנדרשים לאפיון אוכלוסיות הטרוגניות אלה. עם זאת, גישות אלו חסרות מידע מרחבי, מכיוון שיש לנתק תאים מסביבת הרקמה הטבעית שלהם לתרחיפים של תאבודד 4,5. ככאלה, זוהו סוגי תאים הקשורים להקשרי מחלה שונים, אך האינטראקציות שלהם בתוך הרקמה ותרומתם להנצחת המחלה נותרו לא ברורות.

כדי להתמודד עם חלק מהמגבלות הללו, פותחו מספר טכנולוגיות מרחביות-אומיקה כדי ללכוד הטרוגניות תאית בתוך רקמה תוך שמירה על המיקום של כל תא6. לדוגמה, ניתן למדוד שעתוק גנים על ידי הגברת RNA בנקודות רסטר על פני קטע רקמה (למשל, Visium) או על ידי שימוש בבדיקות הכלאה של RNA המכוונות לפאנל של גנים ספציפיים המצולמים ברזולוציה של תא בודד (למשל, קסניום)7,8. שיטות אלו יעילות למעקב אחר דפוסי שעתוק ומנגנוני ויסות בתוך רקמות. עם זאת, פרופילי שעתוק לרוב נמצאים בקורלציה גרועה עם ביטוי חלבון, מה שמשקף באופן ישיר יותר את היכולות התפקודיות של תא9. ניתן לזהות ביטוי חלבון באמצעות נוגדנים ספציפיים המצומדים לפלואורופורים, אותם ניתן לזהות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי10,11. השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית מסורתית יכול לאפשר הדמיה בדידה של למעלה משישה פלואורופורים מצומדים לנוגדנים כאלה. עם זאת, פרופילי העירור והפליטה החופפים של פלואורופורים אלה גורמים לאי ודאות לגבי מקור אות הקרינה בכל ערוץנתון 12.

הלבנה איטרטיבית מרחיבה ריבוי (IBEX) היא שיטת הדמיה בעלת תוכן גבוה שפותחה כדי להתגבר על מגבלה זו של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית 13,14,15. IBEX משתמש בליתיום בורוהידריד (LiBH4) כדי לנטרל כימית פלואורופורים לאחר ההדמיה, מה שמאפשר לצבוע מחדש את אותה דגימת רקמה עם סבב עוקב של נוגדנים מצומדים פלואורופור לפני הדמיה מחדש. IBEX שומר על שלמות הרקמות, ומאפשר סבבים רבים של הדמיה כדי לדמיין מספר בלתי מוגבל תיאורטית של סמנים באותו קטע רקמה. יישור חישובי של התמונות הנרכשות מספק אפיון ברמת אומיקס ברזולוציה של תא בודד תוך שמירה על נתונים מרחביים כדי לחשוף נישות תאיות. נתונים אלה יכולים גם לחשוף אינטראקציות תאיות משוערות, אם כי יש לאמת אותן באמצעות טכניקות אחרות16. IBEX היא שיטת קוד פתוח התואמת לפלואורופורים זמינים מסחרית ונתמכת על ידי קהילה בינלאומית של חוקרים שאימתו ריאגנטים ומשתפים נתונים באופן ציבורי כדי לקדם נגישות, אימוץ מהיר ויצירת נתונים באיכות גבוהה17,18.

בעבודה זו, פרוטוקול שונה של IBEX תוכנן כדי להתגבר על שני אתגרים עיקריים של הטכניקה: אוטופלואורסצנציה של רקמות וקשירה לא ספציפית של בדיקות נוגדנים מצומדות פלואורופור (המכונה ביחד רקע). אוטופלואורסצנטיות מתעוררת כאשר עירור של מולקולות פלואורסצנטיות אנדוגניות לרקמה פולט אור החופף לאות הרצוי המתקבל מפלואורופורים מצומדים לנוגדנים19,20. קשירה מחוץ למטרה או לא ספציפית של נוגדנים מצומדים פלואורופור גורמת לפלואורסצנטיות מתאים או מבנים שאינם מבטאים את חלבון המטרה21,22. חפצים אלה יכולים לגרום למסקנה לא מדויקת שתא מבטא סמן שהוא לא באמת מבטא, ובכך לסבך ניתוחים חישוביים והקצאה מדויקת של סוג התא. על ידי שילוב של נטרול מטען מבוסס הפרין של אות מחוץ למטרה עם רכישה ספקטרלית מלאה וניתוק חישובי, IBEX ספקטרלי מפחית באופן ניכר את הדימום, משפר את יחס האות לרקע (SBR) ומפחית בחצי את זמן הרכישה לכל סיבוב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות פוליפ באף ששימשו במחקר זה נאספו במהלך ניתוח סינוסים במדעי הבריאות של המילטון באישור אתי של מועצת האתיקה המשולבת של המחקר של המילטון. הסכמה מדעת הושגה מכל המשתתפים.

1. איסוף דוגמאות

  1. השג דגימות במהלך הליכי כריתת פוליפקטומיה שגרתיים המבוצעים בחולים עם רינוסינוסיטיס כרונית. לאחר הסרה כירורגית, הניחו את הדגימות בבקבוקון המכיל מי מלח רפואיים על קרח להובלה ועבדו אותן מיד להדמיה כדי לשמור על שלמות הרקמות.

2. הכנת ריאגנטים

  1. הכן תמיסת קיבוע וחדירה על ידי דילול תמיסת הקיבוע והחדירה המתקבלת ב-1:4 ב-PBS. הכן תמיסת שימור בהקפאה כ-30% סוכרוז ב-PBS. הכן מאגר דילול כ-0.1% v/v Triton X-100 ב-PBS.
  2. הכן מגיב בלוק BSA כ-1% w/v אלבומין בסרום בקר במאגר דילול. הכן את מגיב בלוק הפרין כמלח נתרן הפרין 10KU ב-1 מ"ל PBS. הכן מאגר חוסם על ידי ערבוב מגיב בלוק הפרין (1:50) עם מגיב בלוק Fc (1:100) במגיב בלוק BSA.
  3. הכן תערובת מכתים כנוגדנים בדילול מתאים במאגר חוסם. הכן תמיסת הלבנה על ידי הוספת 10 מ"ג LiBH4 ב-10 מ"ל מים טהורים במיוחד.

3. עיבוד רקמות וגרוס

  1. בדוק רקמות במיקרוסקופ דיסקציה (בדרך כלל בהגדלה של ~פי 15, אם כי זה עשוי להשתנות בהתאם לדגימה ולמיקרוסקופ) והסר שומן ועצם בעזרת מלקחיים ואזמל. כדי לשמר את הרקמה בצורה הטובה ביותר, השתמש במכשירים נקיים, עבוד על משטח קר ורטוב ומזער את משך העיבוד.
  2. רקמות ברוטו > בעובי 0.5 ס"מ לפרוסות של 4-5 מ"מ עם אזמל23. טבלו פרוסות בתמיסת קיבוע וחדירות וסובבו בטמפרטורה מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
    הערה: הנפח של תמיסה זו והאחרות בשלב 3.3 צריך להיות בערך פי 20 מנפח הדגימה, בשפופרת בגודל מתאים.
  3. העבירו את הטישו ל-PBS ושטפו למשך 5 דקות. טבלו רקמה בתמיסת שימור בהקפאה ודגרו בטמפרטורה של מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. אין לשטוף לאחר שלב זה, מכיוון שהדבר יכניס מחדש מים לרקמה.

4. הקפאת רקמות

  1. סמן צלחת של 6 בארות עם הניסוי ופרטי הדגימה מעל כל באר והניח אותה במקפיא של -20 מעלות צלזיוס להתקרר למשך 20 דקות לפחות.
  2. מלאו קריומולד בגודל מתאים בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT). הימנעו מיצירת בועות ב-OCT. גררו בועות גדולות לקצוות הקריומולד באמצעות מחט או קצה פיפטה.
    הערה: ניתן להכין קריומולד באמצעות נייר אלומיניום עטוף סביב בקבוקון או צינור קטן עם תחתית שטוחה.
  3. הסר את הרקמה מתמיסת השימור בהקפאה. טפחו בעדינות את הטישו על מגבון טישו נטול מוך כדי להסיר עודפי נוזלים, מכיוון שהדבר עלול לפגוע בהקפאה.
  4. מלאו של 250 מ"ל בכ-100-150 מ"ל איזופנטן במכסה אדים והניחו אותה בקופסת קצף או צידנית מלאה חלקית בחנקן נוזלי.
    הערה: האיזופנטן מתאדה אם משאירים אותו פתוח יותר משעתיים; יש להשתמש מיד לאחר הפתיחה. האיזופנטן מקל על הקפאה אחידה ומהירה של הרקמה. האיזופנטן עשוי לקפוא לאט עם הזמן. אם הוא קופא מוצק, הסר את הכוס מהחנקן הנוזלי ואפשר לה להפשיר. ניתן למזוג את האיזופנטן לבקבוק זכוכית עם מכסה לשימוש חוזר עד פי 5. רמת האיזופנטן צריכה להיות גבוהה יותר מהחנקן הנוזלי כדי למנוע מהכוס לצוף או להתהפך.
  5. התאם את כיוון הרקמה כרצונך בתוך ה-OCT תחת מיקרוסקופ דיסקציה.
    הערה: עבור רקמות פוליפ באף, אנו בדרך כלל מכוונים את הדגימה לאורך הציר הארוך שלה כדי לקבל חתכים סימטריים הלוכדים את שטח החתך הגדול ביותר האפשרי. עיין במדריכים היסטולוגיים עבור הרקמה המעניינת לכיוון הטמעה אופטימלי.
  6. טובלים את תחתית הקריומולד לתוך האיזופנטן. הסר את הקריומולד מהאיזופנטן כאשר מרכז הרקמה לבן ואטום לחלוטין. הימנע מטבילה מוחלטת של הקריומולט; הבלוק עלול להיסדק ולפגוע בחיתוך.
  7. הוציאו בעדינות את הבלוק מהקריומולד על ידי הפעלת לחץ על הגב והניחו אותו בצלחת 6 בארות מקוררת מראש בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. לאחר הקפאת כל הדגימות, העבירו את הצלחת למקפיא של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח הארוך.
    הערה: זוהי נקודת הפסקה. ניתן לאחסן רקמות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך שנים.

5. הכנת שקופיות וחתך בהקפאה

  1. פיפטה 10-1 מיקרוליטר של דבק ג'לטין אלום כרום על שקופיות; מורחים באופן שווה ומייבשים באוויר למשך 15 דקות. להדבקה אופטימלית, מרחו דבק ג'לטין כרום אלום על כוסות כיסוי תא 2x-3x, והוסיפו 5 מיקרוליטר ליישום (סה"כ 15 מיקרוליטר).
  2. לאחר הייבוש מכניסים את השקופיות לתנור בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי להבטיח ייבוש מלא. אם משתמשים בכוס כיסוי תא, השאירו אותה לייבוש ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, מכיוון שהפלסטיק עלול להימס ב-80 מעלות צלזיוס.
    הערה: לאחר ציפוי וייבוש השקופיות, ניתן לאחסן אותן בטמפרטורת החדר למשך ימים עד לשימוש. יש לכסות אותם כדי למנוע אבק.
  3. העבירו רקמות מ-80 מעלות צלזיוס ל-20 מעלות צלזיוס (או לתוך הקריוסטט בטמפרטורת החיתוך) כדי לאזן ולצנן מראש למשך שעה אחת לפני החיתוך. חותכים קטעים של 10-2 מיקרומטר על קריוסטט24.
    1. אם חותכים לזכוכית כיסוי בתא, הרם בעדינות את החלק באמצעות מלקחיים לאחר הרמת הצלחת נגד גלגול. השתמש במכחול כדי להניח אותו שטוח על הזכוכית שבתוך החדר. לחץ על האגודל מתחת לדגימה בתחתית זכוכית הכיסוי כדי להמיס את החלק על הזכוכית.
  4. מגלשות יבשות בטמפרטורה של 3 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת או בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
    הערה: אם נעשה שימוש מיידי בשקופיות, ניתן לאחסן אותן באופן זמני בטמפרטורת החדר בקופסת שקופיות כדי להגן עליהן מפני אבק בזמן ההכנה לצביעה. עם זאת, אם לא משתמשים בהם מיד, יש לאחסן אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי לשמור על שלמות הרקמה. זוהי נקודת הפסקה. אם שקופיות מאוחסנות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, ניתן להשהות את התהליך כאן.

6. חסימה ותיוג חיסוני של נוגדנים

  1. צייר עיגול על הזכוכית סביב הרקמה באמצעות עט PAP כדי ליצור מחסום הידרופובי המכיל את הנוזל במהלך הצביעה או שלבים אחרים. אין למשוך מעל ה-OCT, מכיוון שהדיו ההידרופובי יישטף כאשר ה-OCT יתמוסס.
    הערה: שלב זה אינו נחוץ עבור זכוכית הכיסוי בתא, מכיוון שהקירות מחזיקים את הנוזל בבאר.
  2. הוסף ~100 מיקרוליטר PBS לכל רקמה ודגר במשך ~2 דקות בטמפרטורת החדר כדי להחזיר לחות לרקמות ולשטוף את OCT. השתמש ב~1 מ"ל PBS לזכוכית כיסוי תא.
    הערה: כדי למנוע את הרמת הרקמה מהזכוכית, אין לשפוך נוזל ישירות על הדגימה.
  3. שאפו את ה-PBS והוסיפו 100 מיקרוליטר של המאגר החוסם. דגירה בטמפרטורת החדר בתא לחות מכוסה למשך שעה. השתמש ב~400 מיקרוליטר של מאגר חוסם עבור זכוכית כיסוי בתא.
  4. שאפו את המאגר החוסם והוסיפו 100 מיקרוליטר מתערובת הצביעה. דוגרים בתא לחות מקורה, מונח בתוך המקרר (4 מעלות צלזיוס) למשך הלילה. השתמש ב~400 מיקרוליטר מתערובת הצביעה לזכוכית כיסוי תא. הכן קטעים מוכתמים רק באחד מהפלואורופורים בלוח, ובקרה שלילית ללא כתמים, כדי להגדיר את הספקטרום של הפלואורופורים ואת האוטו-פלואורסצנציה של הרקמות.
    הערה: יש לבצע אופטימיזציה של דילול נוגדנים באופן ניסיוני על ידי טיטרציה ל-1:50, 1:100 ו-1:200, או דילול אחר לפי הצורך. בחר את הכמות המינימלית של נוגדן שתניב את האות האופטימלי. שאפו לכך שהעוצמות של כל הנוגדנים בפאנל יהיו שוות ערך בערך כדי למקסם את יעילות הערבוב הספקטרלי. הגן על דגימות מאור מעבר לשלב זה כדי למזער את ההלבנה של פלואורופורים.
  5. יש לערבב את הכתמים ולשטוף 3 פעמים עם PBS (10 מיקרוליטר, 2 דקות כל אחד), לשאוב נוזל בין כל כביסה. השתמש ב~1 מ"ל של PBS עבור זכוכית כיסוי תא.
  6. הוסף ~10 מיקרוליטר של מדיית הרכבה לכל חלק. פיפטה לאט כדי למנוע בועות אוויר שייצרו סטיות אופטיות בזמן ההדמיה. שאפו החוצה את כל הבועות שנוצרות באמצעות פיפטה. עבור זכוכית כיסוי תא, הוסף 1 מ"ל של מדיית הרכבה לכל באר.
    הערה: השלבים הבאים, 6.7 ו-6.8, אינם נחוצים עבור זכוכית הכיסוי בתא.
  7. הנח בעדינות את זכוכית הכיסוי מס' 1 22 מ"מ x 50 מ"מ על הדגימה.
    הערה: ניתן למזער בועות על ידי לחיצה חזקה על קצה אחד של זכוכית הכיסוי על אמצעי ההרכבה ומתן אפשרות לזכוכית ליפול על הדגימה, לפזר את המדיום באופן שווה. עובי זכוכית הכיסוי צריך להתאים למפרט של עדשת המטרה (למשל, כיסוי #1.5 עבור רוב יעדי הצמצם המספריים הגבוהים). אם לעדשת האובייקט יש צווארון תיקון, ודא שהיא מותאמת לגודל החלקת הכיסוי הנכון. שימוש בקביעת עובי או צווארון שגויים עלול לגרום לעיוות כדורי ולגרום לטשטוש או עיוות של תמונות.
  8. הפוך את השקופית ולחץ בעדינות כלפי מטה על מגבון נטול מוך כדי לדחוף החוצה את אמצעי ההרכבה העודף.
    הערה: הימנע מלדחוף כלפי מטה עם יותר מדי כוח על המגלשה. כוח מופרז עלול לפגוע או לעוות את הרקמה, מה שעלול להשפיע על היישור בין סבבי ההדמיה.

7. הגדרת מיקרוסקופ והדמיה

הערה: פרוטוקול זה מתייחס באופן ספציפי ל-ZEISS LSM980 ולמערכות ZEISS אחרות. שלבים אלה עשויים להיות שונים במערכות אחרות. שני זרימות עבודה מפורטות: קונפוקלי מסורתי + ביטול ערבוב (רכישה מרובת מסלולים עם ביטול ערבוב ספקטרלי חישובי פוסט הוק), שניתן להשתמש בו כאשר גלאי ספקטרלי אינו זמין, אך יש לו זמני רכישה ארוכים יותר וכמה דימום שיורי; וזיהוי ספקטרלי מלא (מעבר יחיד, רכישה ספקטרלית של 34 ערוצים), השיטה המועדפת עלינו, מכיוון שהיא מספקת את ה-SBR הטוב ביותר, הצלבה כמעט אפסית וזמני ההדמיה המהירים ביותר.

  1. מיקרוסקופיה קונפוקלית מסורתית
    1. הפעל את מערכת המיקרוסקופ (כולל לייזרים, גלאים והמחשב) כ-30 דקות לפני ההדמיה.
    2. במסך הבקרה של המיקרוסקופ שאליו מגיעים על ידי לחיצה על מיקרוסקופ > מטרות, בחר את עדשת המטרה המתאימה (למשל, 20x 0.8 NA) ונקה אותה עם מגבון בטוח לעדשה במידת הצורך.
    3. הרכיב את הדגימה בצורה מאובטחת על הבמה. נסה ליישר את תא הזכוכית או הזכוכית המכסה כנגד אותה פינה/קצה של מחזיק ההחלקה כדי להקל על יישור XY של סיבובים רצופים. זה יהיה תלוי במחזיק המותקן.
    4. התמקד בדגימה באמצעות העיניות בתאורת GFP, YFP או RFP, ולאחר מכן עבור לכרטיסייה רכישה במסך המחשב.
      הערה: אל תשתמש במסנן DAPI בעת מיקוד הדגימה באמצעות העיניות מכיוון שחשיפת כתם ה-DAPI לאור UV (באמצעות קוביית המסנן DAPI) תגרום לו להמיר למולקולה ירוקה-פלואורסצנטית (איור משלים 1A).
    5. הגדר מסלולי הדמיה הממזערים חפיפה ועירור צולב לייזר (טבלה משלימה 1, טבלה משלימה 2 מדווחת על הגדרות רכישה עבור ניסויי מיקרוסקופיה קונפוקלית מסורתיים המוצגים כאן).
      הערה: שילובים אידיאליים כוללים שיאי עירור ופליטה ברורים, כגון DAPI או AF488 יחד עם AF594, AF647 או AF700.
      1. הקצה את לייזר העירור האופטימלי עבור כל מסלול. התאם את גודל החור ל-1 AU או יחידה אוורירית עבור כל רצועה לחיתוך אופטי אופטימלי.
      2. התאם את טווח אורכי הגל של הרכישה עבור כל גלאי מתכוונן במסלול בנפרד, בהתאם לפלואורופורים של המסלול.
      3. כוונן את הגדרות כוח הלייזר והרווח של הגלאי כדי למקסם את ה-SBR. ודא שמעט מאוד פיקסלים, אם בכלל, מגיעים לעוצמה מרבית.
        הערה: כדי למנוע פוטוהלבנה ו/או חשיפת יתר של הגלאים, שמור על עוצמת הלייזר נמוכה ככל האפשר. מטב את דילול הנוגדנים כך שיזוהה אות חזק מעל הרקע.
    6. לחץ על לחצן מצב סריקה רציפה כדי להציג תצוגה מקדימה של הדגימה ולהגדיר את פרמטרי הסריקה (מהירות סריקה, רזולוציה וממוצע במידת הצורך).
      הערה: עבור אריחים קטנים וכדי למזער את הרקע, מומלץ זמן השתהות בין 0.2-0.3 מיקרון, עם 1-2 סיבובי חישוב ממוצע. כדי למקסם את המהירות תוך שמירה על פילוח ורזולוציה של תא בודד, השתמש במהירות הסריקה המהירה ביותר ללא ממוצע ובגודל פיקסלים של 0.2-0. מיקרומטר/פיקסל. לדוגמה, הדמיה ברזולוציה של 2048 x 2048 פיקסלים לאריח עם אובייקט של 20x/0.80 NA מניבה 0.20 מיקרומטר/פיקסל בשדה של 424.26 x 424.2 מיקרומטר2.
    7. בצע סריקות בדיקה עבור כל רצועה כדי לבדוק אם יש ערב-דיבור או דימום.
      1. בשקופית המוכתמת בכל הסמנים, במצב סריקה רציפה, הפעל כל לייזר בעוצמה נמוכה והרם אותו רק עד שהסמן נראה בבירור ללא רוויה (השתמש במחוון LUT/רוויה).
        הערה: במידת האפשר, מומלץ להשתמש בדגימה משוכפלת או באזור לא רצוי כדי לייעל את הגדרות המיקרוסקופ לפני הדמיית הדגימה הניסיונית. זה חשוב במיוחד בעת צביעה עם DAPI (כדי למנוע את הסיכון להמרה לאור) או פלואורופורים שפוטו-מלבינים במהירות (למשל, PE).
      2. עבור לבקרה המוכתמת היחידה עבור אותו פלואורופור. התאם את עוצמת הלייזר ואת רווח הגלאי כך שהאות יהיה בהיר ובלתי רווי.
      3. באותה שקופית מוכתמת אחת, סרוק את כל ערוצי הזיהוי האחרים. אם עוצמת מחוץ לערוץ עולה על הרקע, צמצם את חלון הזיהוי ו/או עירור/רווח נמוך יותר.
      4. חזור על 7.1.7.1-7.1.7.2 עבור כל פלואורופור. לאחר כל התאמה, בדוק בקצרה כתמים שעברו אופטימיזציה בעבר כדי לשמור על עוצמות דומות, במיוחד עבור סמנים שמתמקמים במשותף.
    8. הפעל את התכונה אריחים והגדר אזור רכישת אריחים.
      1. מטב את המיקוד לאזור רכישת האריחים במרכז הרקמה. מצא תכונה ייחודית (קבוצת תאים בסידור מסוים) כהתייחסות ליישור בסבבים מאוחרים יותר.
    9. הפעל את תכונת Z-stack ועבור לכרטיסייה Z-stack . עבור אל הכרטיסיה מרכז. הגדר את מספר הפרוסות בערימת Z ל-6 לפחות, עם מרווח של לפחות 1 מיקרומטר בין פרוסות. לאחר מכן, לחץ על הלחצן Center כדי למקם את נקודת המיקוד הנוכחית (שנקבעה בשלב 6.1.8.1) כפרוסה האמצעית של הערימה.
    10. לחץ על כפתור התחל ניסוי כדי להתחיל להשיג את התמונות. שמור הגדרות רכישה וגבה את נתוני התמונה על-ידי לחיצה ימנית על התמונה הממוזערת ובחירה בשמירה בשם. לאחר מכן, בחר את מיקום הקובץ ותן שם לתמונה.
    11. בטל את ערבוב התמונה באמצעות אותן הגדרות מותאמות מרכישת האזור המרוצף, לכוד Snap מכל פקד מוכתם יחיד כדי לקבל את ספקטרום האותות האמיתי ומהבקרה הלא מוכתמת כדי ללכוד רקע/אוטו-פלואורסצנטי, שהוכן בשלב 6.4.
      1. תמונות אלה משמשות לפירוק ספקטרלי; אל תבחר אות אמיתי מדגימות מרובות. ודא שהאזור שנבחר באמת מייצג את האות על ידי הבטחת העוצמה/מורפולוגיה נעדרת או שווה ערך לרקע בבקרה הלא מוכתמת ולאחר מכן התאמת הלוקליזציה הצפויה של הסמן (למשל, ממברנה לעומת גרעינית לעומת ציטופלזמה לעומת דפוסים מופרשים).
      2. פתח את תמונת ההצמדה. לחץ על הכרטיסייה Unmixing . השתמש באחד מכלי בחירת האזור תחת הכרטיסייה כלי Unmix כדי לצייר החזר ROI סביב האות החיובי (יופיע ספקטרום של אזור זה). חזור על פעולה זו עבור כל תמונת הצמדה של כל פלואורופור כדי ליצור ספקטרום ייחוס לביטול הערבוב.
        1. השווה ספקטרום זה לספקטרום התיאורטי של הפלואורופור כדי להבטיח שהאזור שנבחר מייצג את האות האמיתי. תן שם לספקטרום לפי כל פלואורופור ושמור אותו במסד הנתונים הספקטרלי.
          הערה: ניתן לזהות ספקטרום לאוטופלואורסצנציה ולהתייחס אליו כפלואורופור נפרד כדי לנתק אותו מאותות אחרים. לאחר אופטימיזציה מלאה של הפאנל, אין צורך ברכישת הפניות חדשות, מכיוון שניתן לעשות שימוש חוזר באותן הגדרות כל עוד נעשה שימוש באותו פרוטוקול וסוג רקמה.
      3. טען את התמונה באריחים ונווט אל הכלי Unmixing. השתמש בלחצן + כדי להוסיף את ספקטרום הייחוס עבור כל פלואורופור לרשימת הערבוב, ולאחר מכן לחץ על כפתור ביטול הערבוב הליניארי .
    12. שמור את התמונה הלא מעורבת לניתוח מאוחר יותר.
      הערה: הפלט הוא תמונה מרובת אריחים עם ערוץ לכל סמן. ניתן לעצור את הניסוי כאן לפני שממשיכים.
    13. רכישת תמונת הפניה להצללה
      1. באמצעות אותה הגדרה מדויקת המשמשת להדמיית הדגימה, רכוש תמונה של שקופית כיול DAPI. שמרו את התמונה, ולאחר מכן חלצו רק את ערוץ DAPI שישמש כהפניה להצללה. הפלט הוא תמונת שדה שטוח (איור משלים 1B).
        הערה: אין צורך לרכוש תמונת ייחוס עבור כל דגימה. כל עוד נעשה שימוש באותו מכשיר עם אותן הגדרות, ההתייחסות צריכה להיות זהה. אין צורך בהתייחסות זו אם לתמונות שנרכשו אין חפצי הצללה, כפי שמוצג באיור משלים 1C.
  2. מיקרוסקופיה קונפוקלית ספקטרלית
    1. הפעל את מערכת המיקרוסקופ (כולל לייזרים, גלאים ומחשב). בחר את עדשת המטרה המתאימה (למשל, 20x 0.8 NA, או כל מטרה אחרת) ונקה במידת הצורך.
    2. הרכיב את הדגימה בצורה מאובטחת על הבמה. ודא שהכיסוי פונה למטרה.
    3. התמקד בדגימה באמצעות שדה בהיר או DIC, ולאחר מכן עבור למצב פלואורסצנטי. הגדר רכישה ספקטרלית. טבלה משלימה 3 מדווחת על הגדרות רכישה עבור ניסויי מיקרוסקופיה קונפוקלית ספקטרלית המוצגים כאן.
      1. הקצה את הלייזרים הנכונים.
        הערה: לייזרים מסוימים יכולים לעורר פלואורופורים מרובים. לכן, ייתכן שלא יהיה צורך בלייזר ייחודי לכל פלואורופור.
      2. בחר מפצל קרן המתאים לקווי הלייזר הנמצאים בשימוש. אפשר לכל הגלאים ללכוד כמה שיותר מהספקטרום. התאם את גודל החור ל-1 AU לחיתוך אופטי אופטימלי.
    4. בצע אופטימיזציה של הגדרת הלייזר
      1. באמצעות קטע מוכתם בכל הסמנים, התחל מצב סריקה רציפה עם לייזרים בעוצמה נמוכה. כוונן את העוצמה של כל לייזר עד שניתן יהיה לזהות סמנים ב-SBR טוב.
        הערה: אמנם זה לא יאפשר התאמה מדויקת עבור פלואורופורים חופפים ספקטרלית, אך זה יעזור למזער את מספר הפעמים שיש להעביר את השקופיות המוכתמות הבודדות למיקרוסקופ.
      2. השתמש בקטעים עם כתמים בודדים כדי לכוונן את עוצמות הלייזר עבור כל פלואורופור. עבור באופן איטרטיבי מקטעים של כתם בודד בחזרה לקטע עם כל הסמנים עד שניתן יהיה לדמיין את האות של כל סמן ללא רוויה יתר.
        הערה: בכל פעם שמותאמת עוצמת לייזר או הגדרת הגברה, בקר שוב בשקופיות עם כתם יחיד שעברו אופטימיזציה כדי להבטיח שהאות יישאר אופטימלי. לניתוק האופטימלי ביותר, רמות עוצמת האות צריכות להיות דומות ככל האפשר בין הסמנים, במיוחד בקרב סמנים שמתמקמים. במידת האפשר, מומלץ להשתמש בדגימה משוכפלת או באזור לא רצוי כדי לייעל את הגדרות המיקרוסקופ לפני הדמיית הדגימה הניסיונית. זה חשוב במיוחד בעת צביעה עם DAPI (כדי למנוע את הסיכון להמרה לאור) או פלואורופורים שפוטו-מלבינים במהירות (למשל, PE).
    5. בצע את שלבים 7.1.8 - 7.1.14.

8. הסרת הכיסוי (חל רק על מגלשות, לא זכוכית כיסוי תא)

  1. טבלו את השקופית ב-PBS ואפשרו לכיסוי להתנתק. אל תנסה לכפות את החלקת הכיסוי, מכיוון שהדבר עלול לעוות את הרקמה, ולגרום לבעיות יישור בסבבי ההדמיה הבאים או לניתוק מוחלט מהשקופית. השתמש במיכל גדול מספיק כדי להתאים למגלשה וודא שניתן לטבול אותה לחלוטין ב-PBS.

9. הלבנת פלואורופור ורכיבה על אופניים

  1. עבור זכוכית כיסוי תא בלבד: שאפו החוצה כמה שיותר אמצעי הרכבה באמצעות פיפטה, תוך הקפדה לא לפגוע ברקמה.
    הערה: הטיית החדר הצידה יכולה להקל על השאיפה.
  2. שטפו 3x עם ~1 מ"ל (זכוכית כיסוי תאית) או ~100 מיקרוליטר (שקופיות) של PBS למשך 2 דקות עד להסרת מדיית ההרכבה לחלוטין.
  3. הכן את תמיסת ההלבנה במכסה האדים. שוקלים 10 מ"ג LiBH4 ישירות לכוס יבשה באמצעות מיקרו מרית. מוסיפים בזהירות 10 מ"ל מים טהורים במיוחד ישירות לכוס המכילה LiBH4 ומערבבים עד להמסה מלאה לקבלת תמיסת ההלבנה.
    הערה: יש להתכונן מיד לפני השימוש לתגובתיות מרבית.
    זהירות: LiBH4 דליק ביותר, ולכן שלב זה דורש זהירות יתרה - ודא שנעשה שימוש נכון במכסה האדים (כלומר, אבנט בגובה מתאים, PPE מתאים וכו') ועבוד רק עם <10 מ"ג של LiBH4 בכל פעם. ודא שהכוס יבשה לחלוטין לפני הוספת LiBH4 - אי ביצוע זה עלול לגרום לשריפה.
  4. הוסף ~100 מיקרוליטר של תמיסת הלבנה, באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית, לכל קטע רקמה ודגר בטמפרטורת החדר במכסה האדים למשך 15 דקות. השתמש ב -2 מ"ל של תמיסת הלבנה למגלשות תא.
  5. אם מלבינים צבעי BV (למשל, BV421, BV510 וכו '), העבר בזהירות את הבאר למיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. בחר את מסנן ה-DAPI, מקד את הדגימה והאיר אותה במלוא העוצמה.
    1. השתמש במטרה פי 5 לשדה תאורה גדול יותר. הורד את הבמה נמוך ככל האפשר כדי למנוע פגיעה במטרות ובדיור.
  6. הוציאו את תמיסת ה-LiBH4 מהבאר באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית והוסיפו אותה בחזרה לכוס של תמיסת LiBH4 .
    הערה: זה עכשיו פסולת LiBH4; לא ניתן לאחסן את הפתרון לשימוש עתידי.
  7. שטפו את השקופיות פי 3 עם מאגר דילול ודגרו למשך ~3 דקות. הנפח הכולל הוא 2 מ"ל עבור מגלשות החדר.
  8. הוסף תערובת נוגדנים וכתם לפי הפרוטוקול הרגיל (שלבים 6.3 - 6.8).
  9. הוסף 2N H2SO4 טיפה לפסולת LiBH4 במכסה האדים, תוך ערבוב קבוע.
    זהירות: LiBH4 יבעבע באגרסיביות. בועות אלו הן גז H2 המשתחרר מה-LiBH4; H2 דליק מאוד אז היזהר מאוד בשלב זה והוסף H2SO4 לאט מאוד.
  10. יוצקים אותו למשטח סופג כאשר התמיסה כבר לא מבעבעת. שטפו את הכוס במים טהורים במיוחד ושפכו אותה לתוך הכרית התחתונה הסופגת.
    זהירות: הכניסו את המשטח התחתון הסופג לשקית כימיקלים/ביולוגיים, אבטחו אותה והשליכו בהתאם להנחיות המקומיות לסיכון כימי.

10. עיבוד תמונה לאחר רכישה

  1. פתח את תמונת ההתייחסות (משלב 7.1.14) בתוכנת Zen על ידי לחיצה על קובץ > פתח > בחר תמונת התייחסות.
    הערה: ניתן לבצע את שלבי עיבוד התמונה לאחר הרכישה בחבילות תוכנה בקוד פתוח. (למשל, ImageJ).
  2. כוונן את הבהירות והניגודיות כדי למטב את הטווח הדינמי על-ידי לחיצה על Processing > Intensity > Contrast Stretch > Auto > Apply.
  3. שנה את סוג הפיקסלים ל- 32 סיביות על-ידי לחיצה על Processing > Image > Convert Pixel Type >- 32 סיביות (Float).
  4. נרמלו את תמונת ההתייחסות בלחיצה על Processing > Intensity > Normalize (רוויה פיקסלים = 0%) > Apply.
  5. החלק את תמונת ההתייחסות על ידי לחיצה על עיבוד > החלקה > גאוס > הזן רדיוס (למשל, 2-5 פיקסלים) > החל (איור משלים 1B).
    הערה: מטב את רדיוס הטשטוש הגאוסי על-ידי ניסיון ערכים שונים. כדי לדעת את הערך הנכון לחלק (מחשבון תהליך > תמונה) תמונת הייחוס הגולמית לפי התמונה המעובדת והתמונה המתקבלת צריכה להיות בעלת עוצמה אחידה (כל הפיקסלים בערך אותו ערך).
  6. פתח את התמונה מרובת האריחים לתיקון על-ידי לחיצה על קובץ > פתח > בחר תמונה מרובת אריחים.
  7. החל תיקון תפירה והצללה באמצעות ההפניה המעובדת על ידי לחיצה על עיבוד > תפירה עם הפרמטרים הבאים.
    1. סמן את תיבת המיזוג. סמן את תיבת ההצללה הנכונה ומהתפריט הנפתח בחר את תמונת ההתייחסות המעובדת (שלב 10.5). שמור על כל הפרמטרים האחרים זהים.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך לכוונן פרמטרים כדי לקבל את התוצאות הטובות ביותר.
    2. בתפריט Input/Output, בחרו בתמונה מרובת האריחים כקלט ובהפניה להצללה כהפניה.
    3. לחץ על כפתור החל בחלק העליון, ותיווצר תמונה חדשה עם תפירה והצללה מתוקנת (איור משלים 1D).
      הערה: תיקון תפרים (איור משלים 1I-J) נחוץ כדי להבטיח את דיוק יישור התמונה בהמשך התהליך.
    4. שמור את התמונה המתוקנת על-ידי לחיצה על קובץ > שמור > בחר תיקיה.

11. יישור תמונה

  1. המר את התמונות המעובדות מכל פורמט שבו הן (.czs, .tif וכו') לפורמט Imaris באמצעות הכלי ממיר קבצים של Imaris.
    הערה: ניתן להוריד ולהתקין את הכלי על ידי ביצוע ההוראות באתר זה (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter).
  2. הפעל את כלי רישום ההרחבות של Imaris כדי לרשום (ליישר) את התמונות מכל הסיבובים לתמונה אחת עם כל הערוצים.
    הערה: כדי להתקין את הכלי וליישר בהצלחה את התמונות, עקוב אחר ההוראות באתר הבא (https://github.com/niaid/imaris_extensions).
  3. לחץ על כפתור הרחבות Imaris . בחר SimpleITK Utilities > ייצוא הגדרות ערוץ ל-CSV.
  4. לחצו על 'עיון', נווטו לתמונת .ims (מאחד הסיבובים), בחרו בה ולחצו על 'פתח'.
  5. לחץ על ייצוא ובחר מיקום לשמירת קובץ ה- CSV. הזן שם ולחץ על שמור.
  6. פתח את קובץ ה- CSV שנשמר וודא ששמות הערוצים נכונים. ערוך במידת הצורך.
  7. אם מתבצעות עריכות, עבור אל Imaris Extensions > SimpleITK Utilities > Batch Configure Channel Settings.
    הערה: שלב זה אינו נחוץ אם לא בוצעו פעולות עריכה בשלב הקודם.
  8. לחץ על עיון, נווט אל קובץ ה- CSV, בחר אותו ולחץ על פתח. לחץ על הבא ולאחר מכן על עיון שוב כדי לבחור את אותה תמונת .ims ולחץ על פתח.
  9. לחץ על קביעת תצורה כדי להחיל את השינויים. חזור על שלבים 11.3-11.8 עבור כל התמונות מסבבים שונים.
  10. לאחר שהערוצים קיבלו שמות נכונים, עבור אל הרחבות Imaris > אלגוריתמים של SimpleITK > רישום אפיני של z-stacks באמצעות ערוץ משותף.
  11. לחצו על 'עיון', נווטו לתיקייה הכוללת את כל הסיבובים, בחרו את כל התמונות ולחצו על 'פתח'.
  12. לחץ על הבא, בחר את ערוץ הרישום (ערוץ נאמן). עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש בערוץ DAPI. לאחר מכן בחר את התמונה הקבועה.
    הערה: בחר ערוץ/סמן שנשאר קבוע לאורך סיבובים ועמיד בפני כימיקלים או פוטו-הלבנה (למשל, צבעים גרעיניים כמו DAPI). לאחר מכן בחר את התמונה הקבועה.
  13. לחץ על Advanced Registration Settings, סמן את כל התיבות מלבד Auto Mask, והגדר את סיגמת ההחלקה של גאוס ל-5.0.
  14. לחץ/י על ״סיום״ ולאחר מכן על ״הירשם ״ כדי לבצע את היישור. לאחר השלמת הרישום, לחץ על Resample ושמור תמונה משולבת.
  15. לאחר הדגימה מחדש, בחר בערוץ הנאמנות ולחץ על חשב מתאם. קובצי הפלט כוללים תמונת output.ims מיושרת, שני קובצי PDF המציגים את איכות היישור לפני ואחרי הרישום, קובץ JSON המכיל את ההגדרות ששימשו לרישום וקובץ TXT עם היומן של התהליך כולו.

12. יישור תמונה

  1. פילוח תאים/אובייקטים באמצעות CellPose (v2.5)25
  2. עבור כל מערך נתונים של כתם בודד, צור מסיכת פילוח אחת מערוץ הזיהוי של הסמן עצמו (דוגמה: עבור הכתם הבודד CD20, צור את המסכה מערוץ הזיהוי AF488 (הערוץ המיועד ל-CD20)).
  3. החל את מסכת הפילוח משלב 2 על כל ערוץ באותו מערך נתונים (בדוגמה של CD20, המסכה הנגזרת מ-AF488 מוחלת על AF488 כדי למדוד אות אמיתי ועל כל ערוצי הזיהוי האחרים כדי למדוד דימום).
  4. חלץ עוצמות ואזורים לכל אובייקט ב-Python באמצעות scikit-image (regionprops_table) ו-NumPy.
  5. יחס אות לרקע (SBR)
    1. חשב את עוצמת האובייקט הממוצעת על פני כל החזר ה-ROI המפולח בערוץ הזיהוי המיועד של הסמן.
    2. הגדר את עוצמת הרקע כעוצמה הממוצעת של כל הפיקסלים מחוץ להחזר על ההשקעה באותו שדה ראייה, לא כולל ריווח בעל ערך אפס או פיקסלים מחוץ לתחום.
      חשב SBR כ:
      figure-protocol-1
    3. הצג באופן חזותי התפלגויות SBR עם עלילות כינור, והצג ערכים לכל אובייקט כנקודות (או ערכי שדה כאשר מצוין).
  6. כימות גלישה
    1. עבור כל ערוץ לא מיועד, חשב גלישה (%) באמצעות אותם החזר ROI מהמסיכה בשלב 12.2:
      figure-protocol-2
    2. הערה: ערכים אלכסוניים שווים ל-100%, מכיוון שבערוץ המיועד של תמונה עם כתם יחיד, המונה והמכנה זהים (אות סמן אמיתי נמדד בערוץ משלו).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שני אתגרים בסיסיים העומדים בפני טכניקות הדמיה אימונופלואורסצנטיות הם קשירה לא ספציפית של בדיקות נוגדנים מצומדים פלואורופור ואוטופלואורסצנציה של רקמות. פרוטוקול זה נועד לעזור להבחין בין אות אמיתי לרקע כדי לייעל טכניקות אימונופלואורסצנטיות מרובות.

חסימת הפרין מפחיתה את קשירת הפלואורופור הלא ספציפית תוך שמירה על האות

גרנו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IBEX ספקטרלי, עיבוד של פרוטוקול IBEX, מטפל בהצלחה בשתי סוגיות מרכזיות בהדמיה אימונופלואורסצנטית: קשירה לא ספציפית ואוטופלואורסצנטיות. טיפול ברקמות אאוזינופיליות מאוד עם הפרין ושימוש בפירוק ספקטרלי כדי למנוע אוטופלואורסצנציה וחפיפה ספקטרלית בין ערוצים הגדילו משמעותית את זיהוי האות האמיתי מעל הרקע. לכידת כל הסמנים במעבר אחד מפחיתה את זמן הרכישה, מה שעשוי להגביר את קצב הרכיבה של IBEX. בעוד שניתן להשתמש ברכישה קונפוקלית קונבנציונלית עם ביטול ערבוב חישובי כאשר גלאים ספקטרליים אינם זמינים, מומ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JFEK, MJ מקבלים מימון מ-ALK Abello A/S. JFEK מקבל דמי ייעוץ מ-Merida Biosciences.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר אנדריאה רדטקה וד"ר זיו יניב על תמיכתם בעת ההצטרפות והאיטרציה של IBEX. אנו מודים לד"ר ז'ואאו ברונזה דה פירמינו ולד"ר מוהנד באבי על התמיכה במיקרוסקופיה ופתרון בעיות, ולמרכז למיקרוסקופיית אור מתקדמת במקמאסטר על הגישה למיקרוסקופים שלהם. אנו מודים לטינה ווקר, ג'יאנפינג וון ורנגאנה טאלפה גורוג על התמיכה הטכנית. עבודה זו נתמכת על ידי מענק מחקר אלרגיה למזון שנבדק על ידי עמיתים במימון משותף של המכון לזיהום וחסינות של CIHR (CIHR-III), המכון לבריאות מחזור הדם והנשימה של CIHR (CIHR-ICRH) והקרן הקנדית לאלרגיה, אסתמה ואימונולוגיה (CAAIF). עבודה זו מומנה על ידי המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (PJT-198169; JFEK), מענק מחקר רפואי של קרן ג'יי.פי ביקל (JFEK), הקרן הקנדית לאסתמה ואימונולוגיה לאלרגיה (JFEK, MJ), האגודה הקנדית לאלרגיה ואימונולוגיה קלינית (VO, MJ), קרן שרדר (JFEK, SW, MJ), אלרגיה למזון קנדה (JFEK, SW, MJ), ALK Abello A/S (JFEK, MJ), משפחת זיך (SW, MJ), משפחת באקרל (JFEK), מלגת אונטריו לתואר שני (SD), והתוכנית לתואר ראשון במדעי הבריאות באוניברסיטת מקמאסטר (VO).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת חומצה גופרתית 2N (H2SO4)לא זמיןלא זמיןכל מה שזמין או בשימוש במעבדה
בקבוק 500 מ"ללא זמיןלא זמיןכל מה שזמין או בשימוש במעבדה
לוח 6 בארותלא זמיןלא זמיןכל מה שזמין או בשימוש במעבדה
Bcl-6 - אלקסה פלואר 647BD ביוסיינסס561525מקדם דילול 1:100
ערכת קיבוע/פרמיאביליזציה BD Cytofix/CytopermBD ביוסיינסס554722
מיקרוסקופ דיסקציה על הספסללא זמיןלא זמיןכל מה שזמין או בשימוש במעבדה
אלבומין סרום בקר (BSA)סיגמה-אלדריץ'A4503
CD11c - אלקסה פלור 700BD ביוסיינסס561352מקדם דילול 1:100
CD138/Syndecan-1 - PEביולג'נד356503מקדם דילול 1:200
CD20 - אלקסה פלור 488Invitrogen53020282מקדם דילול 1:100
CD21 - אלקסה פלואר 532NovusBioNBP2-60733AF532מקדם דילול 1:100
CD23 - PEביולג'נד338507מקדם דילול 1:200
CD3 - iFluor 594AAT ביוקווסט100320C0מקדם דילול 1:100
CD31 - אלקסה פלואר 700ביולג'נד303134מקדם דילול 1:100
CD34 - iFluor 594AAT ביוקווסט103400C0מקדם דילול 1:100
CD38 - Alexa Fluor 700ביולג'נד303523מקדם דילול 1:100
CD4 - Alexa Fluor 647ביולג'נד300520מקדם דילול 1:100
CD45 - אלקסה פלואר 532תרמופישר סיינטיפיק58045942מקדם דילול 1:100
CD54/ICAM-1 - אלקסה פלואר 647ביולג'נד353113מקדם דילול 1:100
דבק ג'לטין אלום כרוםNewcomer Supply1033A
קריומולדפישר סיינטיפיק  NC9511236כמו כן, קטלוג מס' 50-465-347 לדגימות גדולות יותר
שקופית כיול DAPIאגר סיינטיפיקAG2273
תמיסת DAPI, 1 mg/mLתרמופישר סיינטיפיק62248מקדם דילול 1:3000
E-cadherin/CD324 - Alexa Fluor 647ביולג'נד147307מקדם דילול 1:100
EpCAM/CD326 - אלקסה פלור 594ביולג'נד324228מקדם דילול 1:100
צינורות אפנדורף/פלקוןלא זמיןלא זמיןכל מה שזמין או בשימוש במעבדה
פלואורומאונט-Gסאות'רן ביוטק0100-01
מלקחייםלא זמיןלא זמיןכל מה שזמין או בשימוש במעבדה
FoxP3 - eFluor 660תרמופישר סיינטיפיק50577382מקדם דילול 1:100
שקופיות מיקרוסקופ עם קצה קרבןכימסיינסGEW45-2575-W
GL7 - אלקסה פלואר 488תרמופישר סיינטיפיק53590282מקדם דילול 1:100
מלח נתרן הפאריןסיגמה-אלדריץ'H339310KU
HLA-DR - חינוך גופניNovusBioNB100-77855PEמקדם דילול 1:200
Human TruStain FcX (פתרון חסימת קולטני Fc)ביולג'נד422302מקדם דילול 1:100
תא לחותלא זמיןלא זמיןכל מה שזמין או בשימוש במעבדה
דלי קרח עם מכסהלא זמיןלא זמיןכל מה שזמין או בשימוש במעבדה
IgD - אלקסה פלואר 488ביולג'נד348215מקדם דילול 1:100
IL4Ra/CD124 - PEביולג'נד144803מקדם דילול 1:200
ממיר קבצים אימאריסכלי אוקספורדלא זמיןכיסוי כל פורמט קובץ תמונה לפורמט .ims (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)
איזופטן (2-מתילבוטן)לא זמיןלא זמיןכל מה שזמין או בשימוש במעבדה
Ki-67 - אלקסה פלואר 488BD ביוסיינסס558616מקדם דילול 1:100
Kimberly-Clark Professional Kimwipes Kimwipes Science למגבים עדינים למשימות 1-פליימדעי קים-טק06-666
מלקחיים גדולים (כלומר, באורך 25 ס"מ)לא זמיןלא זמיןכל מה שזמין או בשימוש במעבדה
חנקן נוזלילא זמיןלא זמיןכל מה שזמין או בשימוש במעבדה
ליתיום בורוהידריד (LiBH4)סיגמה-אלדריץ'222356
MECA-79 - אלקסה פלואר 488Invitrogen53603680מקדם דילול 1:100
זכוכית כיסוי שקופית למיקרוסקופ מס' 1 בגודל 22x50 מ"מפישר סיינטיפיק  12-542A
מי מילי-קיולא זמיןלא זמיןכל מה שזמין או בשימוש במעבדה
MUC2 - אלקסה פלואר 488NovusBioNB120-11197AF488מקדם דילול 1:100
זכוכית כיסוי עם תא Nunc Lab-Tekתרמופישר סיינטיפיק155380
עט PAPאבקאםAB2601
תמיסת מי מלח מפוספט (PBS)לא זמיןלא זמיןכל מה שזמין או בשימוש במעבדה
סכין מנתחלא זמיןלא זמיןכל מה שזמין או בשימוש במעבדה
הרחבות SimpleITK Imarisלא זמיןלא זמיןתוכנה המשמשת ליישור תמונות מסיבובים שונים (https://github.com/niaid/imaris_extensions)
סוקרוזהסיגמה-אלדריץ'S0389
Tissue-Tek O.C.T. תרכובתסאקורה פינטק ארה"ב4583
טריטון X-100סיגמה-אלדריץ'X100
צייס LSM 980מיקרוסקופיית ZEISSלא זמיןמערכת ההדמיה ששימשה במחקר זה
זן בלומיקרוסקופיית ZEISSלא זמיןהתוכנה המשמשת לעיבוד תמונות לאחר רכישה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hagios, C., Lochter, A., Bissell, M. J. Tissue architecture: The ultimate regulator of epithelial function. Philosoph Trans Royal Soc B: Biol Sci. 353 (1370), (1998).
  2. Mincarelli, L., Lister, A., Lipscombe, J., Macaulay, I. C. Defining Cell Identity with Single-Cell Omics. Proteomics. 18 (18), (2018).
  3. Macaulay, I. C., Voet, T. Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives. PLoS Genet. 10 (1), (2014).
  4. de Vries, N. L., Mahfouz, A., Koning, F., de Miranda, N. F. C. C. Unraveling the Complexity of the Cancer Microenvironment With Multidimensional Genomic and Cytometric Technologies. Front Oncol. , 10(2020).
  5. van Dam, S., Baars, M. J. D., Vercoulen, Y. Multiplex Tissue Imaging: Spatial Revelations in the Tumor Microenvironment. Cancers. 14 (13), (2022).
  6. Bressan, D., Battistoni, G., Hannon, G. J. The dawn of spatial omics. Science. 381 (6657), (2023).
  7. Williams, C. G., Lee, H. J., Asatsuma, T., Vento-Tormo, R., Haque, A. An introduction to spatial transcriptomics for biomedical research. Gen Med. 14 (1), (2022).
  8. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), (2016).
  9. Pascal, L. E., et al. Correlation of mRNA and protein levels: Cell type-specific gene expression of cluster designation antigens in the prostate. BMC Genom. 9, (2008).
  10. Patel, S. S., Rodig, S. J. Overview of Tissue Imaging Methods. Methods Mol Biol. 2055, (2020).
  11. Ohno, M., Karagiannis, P., Taniguchi, Y. Protein expression analyses at the single cell level. Molecules. 19 (9), (2014).
  12. Zimmermann, T., Marrison, J., Hogg, K., O’Toole, P. Clearing up the signal: Spectral imaging and linear unmixing in fluorescence microscopy. Methods Mol Biol. , 1075(2014).
  13. Radtke, A. J., et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), (2022).
  14. Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Aca Sci U S A. 117 (52), (2020).
  15. Kothurkar, A. A., et al. ’Iterative Bleaching Extends Multiplexity’ facilitates simultaneous identification of all major retinal cell types. J Cell Sci. 137 (23), (2024).
  16. Cohn, D. E., et al. Delineating spatial cell-cell interactions in the solid tumour microenvironment through the lens of highly multiplexed imaging. Front Immunol. 14, (2023).
  17. Radtke, A. J., et al. IBEX: An open and extensible method for high content multiplex imaging of diverse tissues. arXiv. , (2021).
  18. Radtke, A. J., et al. The IBEX Knowledge-Base: A central resource for multiplexed imaging techniques. PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).
  19. Croce, A. C. Light and Autofluorescence, Multitasking Features in Living Organisms. Photochem. 1 (2), (2021).
  20. Wizenty, J., et al. Autofluorescence: A potential pitfall in immunofluorescence-based inflammation grading. J Immunol Methods. 456, (2018).
  21. Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Curr Protoc Cell Biol. 69 (1), 4.3.1-4.3.7 (2015).
  22. Sicherre, E., Favier, A. L., Riccobono, D., Nikovics, K. Non-specific binding, a limitation of the immunofluorescence method to study macrophages in situ. Genes. 12 (5), (2021).
  23. Monique Hartlen Histotechnology Lab Manual. , NSCC. (2022).
  24. Stephen Peters Frozen Section Technique. , Pathology Innovations, LLC. https://pathology-innovations.squarespace.com/frozen-section-technique (2023).
  25. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nat Methods. 18 (1), (2021).
  26. Mayeno, A. N., Hamann, K. J., Gleich, G. J. Granule-associated flavin adenine dinucleotide (FAD) is responsible for eosinophil autofluorescence. J Leukocyte Biol. 51 (2), (1992).
  27. Jenvey, C. J., Stabel, J. R. Autofluorescence and Nonspecific Immunofluorescent Labeling in Frozen Bovine Intestinal Tissue Sections: Solutions for Multicolor Immunofluorescence Experiments. J Histochem Cytochem. 65 (9), (2017).
  28. Vlaminck, S., et al. The importance of local eosinophilia in the surgical outcome of chronic rhinosinusitis: A 3-year prospective observational study. Am J Rhinol Allergy. 28 (3), (2014).
  29. Skinner, B. M., Johnson, E. E. P. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), (2017).
  30. Duhamel, R. C., Johnson, D. A. Use of nonfat dry milk to block nonspecific nuclear and membrane staining by avidin conjugates. J Histochem Cytochem. 33 (7), (1985).
  31. Valnes, K., Brandtzaeg, P. Selective inhibition of nonspecific eosinophil staining or identification of eosinophilic granulocytes by paired counterstaining in immunofluorescence studies. J Histochem Cytochem. 29 (5), (1981).
  32. Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47 (9), (1999).
  33. Bystrom, J., Amin, K., Bishop-Bailey, D. Analysing the eosinophil cationic protein - a clue to the function of the eosinophil granulocyte. Respiratory Res. , 12(2011).
  34. Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments. Cyt Part A. 89 (6), (2016).
  35. Saitou, T., et al. Tissue intrinsic fluorescence spectra-based digital pathology of liver fibrosis by marker-controlled segmentation. Front Med. 5 (DEC), (2018).
  36. Acuña-Rodriguez, J. P., Mena-Vega, J. P., Argüello-Miranda, O. Live-cell fluorescence spectral imaging as a data science challenge. Biophys Rev. 14 (2), (2022).
  37. Constantinou, P., Dacosta, R. S., Wilson, B. C. Extending immunofluorescence detection limits in whole paraffin-embedded formalin fixed tissues using hyperspectral confocal fluorescence imaging. J Microscopy. 234 (2), (2009).
  38. Enninful, A., Baysoy, A., Fan, R. Unmixing for ultra-high-plex fluorescence imaging. Nat Comm. 13 (1), (2022).
  39. Chang, Q., et al. Imaging Mass Cytometry. Cyt Part A. 91 (2), (2017).
  40. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nat Med. 20 (4), (2014).
  41. Baharlou, H., Canete, N. P., Cunningham, A. L., Harman, A. N., Patrick, E. Mass Cytometry Imaging for the Study of Human Diseases—Applications and Data Analysis Strategies. Front Immunol. 10, (2019).
  42. Goltsev, Y., Nolan, G. CODEX multiplexed tissue imaging. Nat Rev Immunol. 23 (10), 613-613 (2023).
  43. Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nat Protoc. 16 (8), (2021).
  44. Vorobjev, I. A., Kussanova, A., Barteneva, N. S. Development of Spectral Imaging Cytometry. Methods Mol Biol. 2635, (2023).
  45. Hernandez, S., et al. Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification for Immune Cell Profiling of Paraffin-Embedded Tumor Tissues. Front Mol Biosci. 8, (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Multiplexed Immunolabeling

מאמרים קשורים