מאמר שיטה

גרימת היפרתרמיה קלה ממוקדת במודלים של גידולי עכברים באמצעות המרה פוטותרמית של אור קרוב לאינפרא אדום על ידי ננו-מוטות זהב תוך-גידוליים

DOI:

10.3791/68656

⸱

10 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Dalhousie University, 2Sona Nanotech Inc., 3Department of Surgery, Dalhousie University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג טכניקות ומתודולוגיה הנחוצות לטיפול היפרתרמי ממוקד במודלים של גידולים מוצקים. הגישה ממנפת את ההמרה הפוטותרמית של אור אינפרא אדום קרוב על ידי ננו-מוטות זהב המוזרקים תוך גידול כדי לגרום לחימום מקומי בתוך מיקרו-סביבת הגידול.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היפרתרמיה קלה (42-48 מעלות צלזיוס) היא שיטה טיפולית מבוססת שיכולה לגרום למוות מבוקר של תאי גידול ולעורר תגובות חיסוניות אנטי-סרטניות. עם זאת, העברת חום בדיוק לרקמת הגידול תוך שמירה על רקמה בריאה מסביב נותרה אתגר משמעותי. שיטות היפרתרמיה מסורתיות, כגון זלוף גפיים מבודדות, דורשות הליכים מורכבים ופולשניים וטומנות בחובן סיכון משמעותי לרעילות מקומית ותחלואה של חולים. לעומת זאת, טיפול פוטותרמי באמצעות ננו-חלקיקי זהב המופעלים על ידי אור אינפרא אדום קרוב (NIR) התגלה כאסטרטגיה מבטיחה ופחות פולשנית להשגת היפרתרמיה מקומית. ננו-מוטות זהב (GNR), במיוחד, מציגים תכונות אופטיות ניתנות לכוונון ויעילות המרה פוטותרמית גבוהה, מה שהופך אותם למועמדים אידיאליים לאפנון תרמי מדויק של אתרי גידול. למרות שטכניקה זו הראתה הבטחה ניכרת, במיוחד עבור גידולים שטחיים ונגישים, אספקה ניתנת לשחזור, כליאה מרחבית ובטיחות נותרו אזורי עידון פעילים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים את השיטה המאומתת והאופטימלית שלנו להשגת היפרתרמיה מקומית קלה באמצעות הזרקה תוך-גידולית של GNRs תואמים ביולוגית ואחריה חשיפה קצרת טווח וממוקדת ללייזר NIR. גישה זו מאפשרת חימום מהיר ומבוקר בטווח הטיפולי, מקדם מוות של תאי גידול אימונוגניים וממריץ תגובות חיסוניות מולדות, מנגנונים רלוונטיים במיוחד לגידולים "קרים" מבחינה אימונולוגית. ניטור טמפרטורה בזמן אמת ואספקה מקומית מבטיחים יכולת שחזור, בטיחות וחשיפה מערכתית מינימלית. פרוטוקול יעיל זה מציע פלטפורמה חזקה ונגישה למחקרים פרה-קליניים, התומכת במאמצים רחבים יותר לרתום היפרתרמיה קלה באימונותרפיה של סרטן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נותרו אתגרים משמעותיים בטיפול בסרטן, כולל עמידות לתרופות, התחמקות חיסונית ורעילות מחוץ למטרה, כל אלה פוגעים בהצלחה ארוכת הטווח של טיפולים קונבנציונליים. מגבלות אלו הניעו את הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות משלימות שנועדו להתגבר על מנגנוני עמידות תוך מזעור נזק אגבי לרקמות בריאות. היפרתרמיה קלה, המוגדרת כעלייה בטמפרטורות הרקמה ל-42-48 מעלות צלזיוס, הוכרה זה מכבר כתוספת יעילה לטיפולים סטנדרטיים בסרטן1. מבחינה היסטורית, היפרתרמיה קלה שימשה בשילוב עם ניתוח, כימותרפיה או הקרנות כדי לשפר את היעילות של טיפולים אלה על ידי הגברת זלוף הגידול, שיבוש ארכיטקטורת הסטרומה ורגישות תאים ממאירים לחומרים ציטוטוקסיים1. לאחרונה, עם ההצלחה הגוברת של אימונותרפיה באונקולוגיה, יש עניין גובר במינוף הפוטנציאל האימונומודולטורי הגלום בהיפרתרמיה קלה כדי לשפר את התגובות החיסוניות האנטי-גידוליות 1,2,3.

למרות היתרונות הקליניים המוכחים שלה, היישום הרחב יותר של היפרתרמיה של הגידול נותר מוגבל עקב אתגרים בהשגת חימום מקומי, נשלט וניתן לשחזור של גידולים תוך הימנעות מנזק לרקמות מחוץ למטרה4. טכניקות היפרתרמיה קליניות וניסיוניות עכשוויות, כגון זלוף גפיים אזורי או גישות מבוססות ננו-חלקיקים המועברות באופן מערכתי, סובלות לעתים קרובות מדיוק מרחבי מוגבל, קליטת גידול משתנה ופוטנציאל לרעילות מערכתית 2,5,6,7,8,9 . טיפול היפרתרמי ממוקד הוא שיטה מתפתחת בתחום זה של טיפול בסרטן, שנועדה להעלות באופן סלקטיבי את טמפרטורות הגידול תוך מזעור הנזק לרקמות הבריאות שמסביב. ליתר דיוק, אספקה ממוקדת של ננו-מוטות זהב (GNRs) היא שיטה מבטיחה להתגברות על המגבלות הנוכחיות של דיוק ורעילות היפרתרמיה קלה של גידול. GNRs מתאימים במיוחד ליישומים פוטותרמיים בשל תהודת הפלזמון הניתנת לכוונון שלהם באזור ה-NIR, יעילות המרה פוטותרמית גבוהה ופרופילי הפצה ביולוגית נוחים בהשוואה לננו-מבני זהב אחרים10,11. היענותם לאורכי גל של NIR מאפשרת ספיגת אור יעילה וחימום מקומי גם ברקמות עמוקות יותר, עם נזק מינימלי למבנים שמסביב. ככזה, GNRs יכולים לספק יעילות, מיקוד ובטיחות משופרים בטיפולים היפרתרמיים.

מטרת שיטה זו היא לספק פרוטוקול יעיל ביותר, עתיר משאבים וניתן לשחזור להשגת היפרתרמיה קלה בתיווך ננו-מוט זהב בגידולים מוצקים. טכניקה זו, המכונה טיפול היפרתרמי ממוקד בתיווך GNR (THT), מטפלת במגבלות העיקריות של גישות היפרתרמיה קונבנציונליות על ידי שילוב של הזרקת GNR תוך-גידולית ישירה עם הפעלת אור NIR חיצוני. זה מבטיח ריכוז ננו-חלקיקים מקומי גבוה, ומשפר את יכולת השחזור והבטיחות, במיוחד עבור גידולים קטנים או בעלי כלי דם גרועים שעשויים שלא לצבור ביעילות חומרים המועברים באופן מערכתי. בנוסף, שימוש בהזרקה תוך-גידולית ישירה של GNRs ואחריה חשיפה לאור קרוב לאינפרא אדום (NIR) מבטיח חימום מדויק, מבוקר ומקומי של גידולים, תוך מזעור חשיפה מערכתית, רעילות והשפעות מחוץ למטרה הקשורות לטכניקות היפרתרמיה אזוריות קונבנציונליות.

סוגי סרטן רבים מציגים מנגנונים מורכבים ומגוונים של בריחה חיסונית, המאפשרים להם להתנגד לאימונותרפיה באמצעים שונים, ככל הנראה, באמצעות חדירה לקויה של תאי חיסון למיקרו-סביבת הגידול 2,4,5. היפרתרמיה קלה מציעה פתרון סינרגטי בשילוב עם אימונותרפיה. בנוסף להשפעות ציטוטוקסיות ישירות, היפרתרמיה קלה גורמת באופן מועדף למוות תאים אימונוגני (ICD), מה שמוביל לשחרור אנטיגנים הקשורים לגידול (TAAs) ודפוסים מולקולריים הקשורים לנזק (DAMPs)1,2. אותות אלה מפעילים מסלולים חיסוניים מולדים, משפרים את הצגת האנטיגן של הגידול, מקדמים התבגרות תאים דנדריטיים ומשפרים את תחול תאי T, ובסופו של דבר מגבירים את חדירת תאי החיסון למיקרו-סביבת הגידול 1,6,12. במודלים הפרה-קליניים שלנו, טכניקת THT זו בתיווך GNR תפקדה להפעלת תגובות חיסוניות מקומיות ולהגברת החדירה החיסונית של הגידול13. בשילוב עם טיפול תוך-גידולי באינטרלוקין-2 (IL-2) או עיכוב מחסום מערכתי נגד PD1, טכניקת THT זו בתיווך GNR הגבירה עוד יותר את החסינות נגד הגידול ועלתה על כל המונותרפיה בלבד במודלים של סרטן השד ומלנומה13. תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם גוף הולך וגדל של ראיות התומכות בסינרגיה בין היפרתרמיה בתיווך ננו-חלקיקים ואימונותרפיה בגידולים מוצקים, כולל סרטן השד 14,15,16 וגידולי מוח 17,18. בקיצור, על ידי המרת גידולים 'קרים' מבחינה אימונולוגית לגידולים 'חמים', THT בתיווך GNR יכול לשפר את ההיענות לאימונותרפיה, כולל מעכבי נקודות ביקורת 1,2,12.

פרוטוקול THT בתיווך GNR המוצג כאן הוא עתיר משאבים נמוך, פשוט מבחינה טכנית וניתן להתאמה רחבה לגידולים תת עוריים או שטחיים. טכניקה זו מתאימה במיוחד לחוקרים העובדים עם מודלים עכבריים של גידולים תת עוריים או שטחיים, כולל מלנומה וסרטן השד. עם זאת, עם שינויים קלים, ניתן להרחיב אותו לסוגי גידולים אחרים ולאתרים אנטומיים. בנוסף, טכניקה זו מציעה פלטפורמה רב-תכליתית לשילוב היפרתרמיה מבוקרת מרחבית במחקרי סרטן פרה-קליניים, במיוחד אלה החוקרים אסטרטגיות לשיפור אימונותרפיה, ומחפשים לחקור היפרתרמיה קלה כדי לשפר את התגובה לטיפול או להתגבר על עמידות לטיפולים אימונותרפיים. יתר על כן, הידע והציוד הנדרשים ליישום טכניקה זו נגישים וניתנים להתאמה למגוון מסגרות בריאות, מה שמשפר את היתכנותה בשימוש קליני רחב יותר3.

בכתב יד זה, אנו מספקים הוראות מפורטות שלב אחר שלב ליישום פרוטוקול THT בתיווך GNR שלנו במודלים של עכברים באמצעות מערכת לייזר NIR הפועלת ב-860 ננומטר. הצלחת פרוטוקול זה תלויה בהפעלה יעילה של רקמות עמוקות של ננו-מוטות זהב תוך שימוש באורך הגל המתאים של אור אינפרא אדום קרוב. אנו גם מדגישים שיקולים פרוצדורליים להשגת מינון היפרתרמי קל עקבי, בטוח ויעיל במודלים של גידולי עכברים, כגון ניטור מדויק בזמן אמת של טמפרטורת הגידול הפנימית לאורך כל ההליך. שיטה זו מתבססת ומאחדת היבטים של גישות היפרתרמיה של ננו-חלקיקים שדווחו בעבר, ומציעה אלטרנטיבה מקיפה, מאומתת, מדויקת מאוד וניתנת לשחזור למחקר סרטן פרה-קליני. בסך הכל, פרוטוקול זה מציע שיטה בטוחה ביולוגית, חסכונית ורעילות נמוכה לאספקת היפרתרמיה מקומית לגידול, עם פוטנציאל חזק לשפר את היעילות של אימונותרפיה קיימת לסרטן ולהרחיב את התועלת הקלינית של היפרתרמיה באונקולוגיה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה האוניברסיטאית לחיות מעבדה באוניברסיטת דלהאוזי על פי הנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים. כל ההנחיות הבינלאומיות, הלאומיות והמוסדיות הרלוונטיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים בוצעו. עיין בטבלת החומרים לפרטים על כל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. דרישות מתקן לייזר וטיפול

  1. גישה מאובטחת למערכת לייזר מכוילת במלואה המסוגלת לספק אור באורך גל של 860 ± 10 ננומטר בעוצמה של עד 4,000 mA. ודא שלמערכת הלייזר יש מנגנוני כיבוי מתאימים.
    הערה: במחקר זה, השתמשנו בלייזר שתוכנן בהתאמה אישית. לדגם המשמש בפרוטוקול זה יש מפתח הפעלת לייזר, כפתור עצירת חירום ומגשר נעילה (ניתן לחבר את המגשר המחובר גם למתג בטיחות המשמש לעמידה בבטיחות, למשל, גישה לדלת לחדר לייזר Class 4).
  2. חבר בדיקת טמפרטורה הניתנת להחדרה ומכוילת לניטור טמפרטורה תוך גידולית המסוגלת להעביר נתוני טמפרטורה חיים באמצעות תוכנת הקלטת הצמד התרמי המתאימה.
  3. הכנת חדר לייזר ייעודי העומד בתקני הבטיחות הנדרשים למחלקת הלייזר. ודא שיש אזור עבודה ללא הפרעה, עם אוורור טוב, תאורה מתאימה וכל המשטחים הרפלקטיביים מכוסים. הגבל את הגישה לחדר במהלך פעולת הלייזר כדי למנוע חשיפה לא מכוונת. ודא שכל הצוות המעורב במחקר עבר הכשרה מלאה בתפעול לייזר ובפרוטוקולי בטיחות וללבוש PPE והגנה על העיניים המתאימות.
  4. צור סביבת עבודה בתוך חדר הלייזר המתאימה למכונת הרדמה בסמיכות למערך הלייזר. ודא שהלייזר מותקן היטב, אך מתכוונן, כאשר ניתן למקם את נבדק הניסוי במרחק של כ-1-2 ס"מ ממקור קרן הלייזר כדי להבטיח מיקוד מדויק של אתר הגידול.
  5. השתמש במצלמת הדמיה תרמית על חצובה, הממוקמת כדי ללכוד קריאות טמפרטורה מפני השטח של הנושא, במהלך חשיפת הלייזר.

2. תרבית תאים וחיסון (הזרקת תאי גידול)

  1. בחר מודלים עכבריים מתאימים על סמך סוג הגידול המעניין, בהתאם לטכניקות הכנה ותחזוקה סטנדרטיות של תרבית תאי מעבדה. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, בחר עכברי BALB/c נקבות בנות 6-8 שבועות לחיסון גידול CT26.
    הערה: ניתן להשתמש בעכברים בעלי יכולת חיסונית או מדוכאי חיסון בגילאים וזנים שונים, בהתאם לדרישות המחקר.
  2. תרבית קו תאי סרטן CT26 במדיום RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ו-2 מ"מ גלוטמין. שמור על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5% CO2. חידוש מדיום כל 2-3 ימים, ותאי תת-תרבית במפגש של 70-80% באמצעות יחס פיצול של 1:4 עד 1:10. השתמש בתאים במעברים מוקדמים (למשל, ≤10 מעברים) כדי להבטיח צמיחה עקבית ויעילות חיסון. הרחב תרביות לפי הצורך כדי להשיג את מספר התאים הנדרש לחיסון.
    הערה: מספר התאים הדרושים לעכבר ישתנה בהתאם למודל, לדוגמה, עבור מודל סרטן המעי הגס של עכברים CT26, נדרשנו 5 × 105 תאים לעכבר.
  3. נתק תאים דבקים באמצעות טריפסיניזציה ושטוף פי 2 עם PBS סטרילי 1x. השעו מחדש בתמיסת PBS סטרילית 1x כדי להשיג את הריכוז הרצוי של 5 × 106 תאים/מ"ל. אחסן את תרחיף התאים בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 2 מ"ל על קרח למשך שעה אחת לכל היותר לפני ההזרקה.
  4. לפני ההזרקה יש להרדים עכברים באמצעות תא אינדוקציה עם איזופלורן מאודה 4% בקצב זרימה של 0.8 ליטר לדקה. לאחר ההרדמה, הפחיתו את האיזופלורן ל-2% ושמרו על הרדמה עם חרוט אף במהלך הליך החיסון. אשר את עומק ההרדמה באמצעות בדיקת צביטה בבוהן כדי להבטיח היעדר תגובת כאב. יש למרוח חומר סיכה לעיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות ולמזער נזקי לייזר פוטנציאליים.
  5. גלח את מקום ההזרקה (למשל, הצד השמאלי של דגם CT26 הטרוטופי זה) באמצעות מכונת גילוח חשמלית ונקה את האזור עם מגבון אלכוהול כדי להסיר פסולת ולחטא את העור. צובטים את העור במקום ההזרקה ומזריקים 100 מיקרוליטר מתרחיף התאים ב-5 ×-106 תאים/מ"ל תת עורי באמצעות מחט 26 גרם ומזרק 1 מ"ל. לאחר ההזרקה, הוציאו את העכבר מחרוט האף והחזירו אותו לכלוב שלו להתאוששות על שמיכה מחממת למשך שעה.

3. גדילה ומדידה של גידול

  1. התחל במדידות הגידול היומיות, בדרך כלל החל מהיום השביעי לאחר ההזרקה, באמצעות קליפר למדידת גידול. מדוד את מידות הגידול בשלושה צירים: רוחב, אורך וגובה וחשב את נפחי הגידול באמצעות נוסחת נפח גידול אליפסואידית של π/6 × אורך × רוחב × גובה.
  2. תכנן להתחיל THT בתיווך GNR ברגע שהגידולים יגיעו לנפח משוער של 50 מ"מ3 (± 20 מ"מ3).
    הערה: עבור מודל ה-CT26 שלנו, נפח גידול זה הושג בין הימים 10 ל-12 לאחר הזרקת תאי הגידול).
  3. לפני הטיפול בלייזר, יש להקפיד על הקצאה אקראית של עכברים לקבוצות ביקורת וטיפול. קבוצת הטיפול תקבל זריקת GNR תוך גידולית ואחריה חשיפה ללייזר; וקבוצת הביקורת תקבל זריקת PBS תוך גידולית (נפח זהה לזריקת GNR) במקום GNRs, ואחריה חשיפה ללייזר.

4. המרה פוטותרמית של אור NIR באמצעות GNRs תוך-גידוליים

  1. בארון בטיחות ביולוגי סטרילי, השתמש במזרק של 0.3-1 מ"ל עם מחט 31 G כדי לשרטט את הנפח המתאים של GNRs על סמך כל נפח גידול.
  2. להרדים את העכבר באותו אופן כמו להזרקת תאים סרטניים (עם חרוט אף המספק 2% איזופלורן בקצב זרימה של 0.8 ליטר לדקה ולאשר עומק הרדמה הולם באמצעות בדיקת צביטה בבוהן).
  3. לאחר ההרדמה, הפחיתו את האיזופלורן ל-2% והניחו את העכבר במצב שכיבה על פלטפורמת הלייזר תוך שמירה על הרדמה באמצעות חרוט אף. יש למרוח חומר סיכה לעיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות ולמזער נזקי לייזר פוטנציאליים.
  4. גלח פרווה עודפת סביב הגידול, במידת הצורך, כדי להבטיח חשיפה של פני העור ללייזר. השתמש באתנול כדי לחטא את פני הגידול, לנגב כל פרווה/פסולת.
    הערה: במחקר זה, השתמשנו ב-GNRs המותאמים לספיגה ב-860 ננומטר. אם אתה משתמש במוצר GNR שונה מהמוצע כאן, ודא שאספקת אורך גל NIR בלייזר ממוטבת בהתאם לספקטרום הספיגה של ה-GNR.
  5. לפני החשיפה ללייזר, יש להזריק GNRs תוך גידולי בריכוז של 1 מיקרוגרם/מ"מ3 מנפח הגידול. במידת הצורך, פצלו את ההזרקה בין שני אתרים תוך-גידוליים כדי להבטיח פיזור יעיל של GNRs בתוך הגידול.
    הערה: בסרטון פרוטוקול זה נעשה שימוש ב-GNRs בריכוז של 2 מיקרוגרם/מיקרוליטר; לכן, עבור גידול בגודל 50 מ"מ3 , הוזרקו 25 מיקרוליטר של GNRs לגידול. הקפד לנגב את כל עודפי ה-GNR על פני העור לאחר ההזרקות המתאימות.
  6. עבור עכברים מקבוצת הביקורת, יש לתת זריקה תוך-גידולית של PBS סטרילי בנפח שווה ערך המשמש לקבוצת הזרקת GNR (למשל, להזריק 25 מיקרוליטר של PBS במקרה של גידול50 מ"מ 3).
  7. יש לחטא את בדיקת הטמפרטורה התוך-גידולית באתנול ולהכניס אותו בעדינות לאמצע מסת הגידול.
  8. יש למרוח שכבה אחידה של ג'ל אלוורה בעובי של כ-5 מ"מ על פני הגידול כדי למנוע כיב בעור ולמזער את הסיכון לפגיעה תרמית במהלך הטיפול.
  9. ודא שהלייזר מותאם כך שיתיישר ישירות מעל אמצע הגידול. השתמש בטבלת חיפוש הקרינה (טבלה 1) כדי לקבוע את גובה הלייזר המתאים על סמך קוטר קרן הלייזר הנדרש לכיסוי שטח הפנים של הגידול. מטב את גובה הלייזר על סמך קוטר הגידול כדי להבטיח אספקת אנרגיה עקבית.
    הערה: בניסוי שלנו, גידול בקוטר 1.3 ס"מ דרש גובה לייזר של 1.5 ס"מ).
  10. הפעל את מקור הקירור החשמלי של הלייזר והתרמוס (TEC), ולאחר מכן חבר את מערכת הלייזר למקור החשמל (מותאם לפי פרוטוקול היצרן). הפעל את מקור הקירור החשמלי התרמוס; המתן עד שהנורית הכחולה תידלק, והטמפרטורה של מקור ה-TEC של הלייזר תתייצב על 25 מעלות צלזיוס לאחר 30 שניות.
  11. השתמש בטבלת בדיקת הקרינה (טבלה 1) כדי להשיג קרינת יעד של 1 W/cm2 ±-0.2 W/cm2 על ידי התאמת פלט זרם הלייזר (סובב את כפתור מקור הלייזר לנקודת הגדרת הזרם הרצויה).
    הערה: בניסוי שלנו, גובה לייזר של 1.5 ס"מ, קוטר קרן של 1.3 ס"מ וזרם לייזר של 1,800 mA הביאו לערך קרינה של 0.82 W/cm2, אשר מותאם למודל גידול זה.
    מנקודה זו ואילך, ודא שכל האנשים בחדר ניתוח הלייזר מרכיבים משקפי בטיחות לייזר מוסמכים לאורך הגל של האור המשמש.
  12. הגדר את מצלמת התרמו הסמוכה לפלטפורמת הלייזר, המכוונת לעכבר, כדי לנטר את טמפרטורת פני העור במהלך הליך הלייזר.
  13. בתוכנת ההקלטה של הצמד התרמי, צור קובץ חדש ולחץ על כפתור ההקלטה . ודא שגרף טמפרטורת הגידול הפנימי לעומת הזמן מוצג בזמן אמת.
  14. סובב את מקש הבטיחות כדי לאפשר פלט מקור לייזר. התחל במתן לייזר על ידי לחיצה כלפי מטה על דוושת כף הרגל.
    הערה: בפרוטוקול זה, בקר Raspberry Pi הוא הממשק הפנימי בין דוושת הרגל למקור הלייזר.
  15. בדוק וודא שתוכנת המחשב מזהה עלייה בטמפרטורת הגידול ברגע שהגידול המוזרק GNR נחשף לקרן הלייזר.
    הערה: טמפרטורת הגידול הפנימית תתחיל לעלות בזמן התחלת הלייזר, וייקח כ-15 שניות עד 2 דקות להיכנס לטווח היעד של היפרתרמיה של 42 מעלות צלזיוס, תלוי בגודל ובסוג מודל הגידול.
  16. שמור על טמפרטורת הגידול הפנימית בטווח היפרתרמי (בין 42 מעלות צלזיוס ל-48 מעלות צלזיוס) למשך 5 דקות שלמות. עקוב באופן רציף אחר טמפרטורת הגידול הפנימית, ואם היא מתקרבת ל-48 מעלות צלזיוס, הסר את כף הרגל מהדוושה ואפשר לטמפרטורה לרדת בחזרה. חפש את הירידה הזו בטמפרטורה בזמן אמת בגרף תצוגת הטמפרטורה לעומת הזמן. לאחר שטמפרטורת הגידול הפנימית ירדה ל-~43 מעלות צלזיוס, הפעל מחדש את מתן הלייזר על ידי לחיצה נוספת על הדוושה. המשך בדפוס זה של הפעלה/כיבוי של רכיבה על דוושת לייזר כדי לשמור על טמפרטורת הגידול הפנימית בטווח ההיפרתרמי המתאים למשך 5 דקות שלמות, ועקוב אחר גרף תצוגת הטמפרטורה לעומת הזמן.
    1. אם טמפרטורת הגידול יורדת מתחת ל-42 מעלות צלזיוס בכל נקודה במהלך תקופת ההיפרתרמיה של 5 דקות, הגדל את זמן ההיפרתרמיה כדי לפצות על הזמן שאבד. לדוגמה, אם הטמפרטורה יורדת מתחת ל-42 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, הוסף 20 שניות בסוף הזמן הראשוני של 5 דקות. חלק מהגידולים המוזרקים עם GNRs עשויים שלא להגיע ל-48 מעלות צלזיוס, ולא יהיה צורך במחזור הפעלה/כיבוי בלייזר.
      הערה: בעכברי ביקורת שהוזרקו תוך גידול עם PBS, הגידולים לא יגיעו לטווח ההיפרתרמי. אם תרצה, מחזור הפעלה/כיבוי של הלייזר עבור עכברי ביקורת צריך לעקוב אחר אותו דפוס שנקבע עבור הקבוצה שטופלה ב-GNR, למרות היעדר התגובה ההיפרתרמית הצפויה.
  17. לאורך כל התחזוקה של היפרתרמיה של הגידול, עקוב באופן רציף אחר טמפרטורת פני העור כדי להבטיח שהיא תישאר מתחת ל-50 מעלות צלזיוס. ללא קשר לטמפרטורת הגידול הפנימית, אם טמפרטורת פני העור מגיעה ל-50 מעלות צלזיוס, כבה את הלייזר כדי לאפשר קירור. אם הטמפרטורה הפנימית אינה יכולה להגיע לטווח ההיפרתרמי הרצוי מבלי לגרום לטמפרטורת העור לעלות על 50 מעלות צלזיוס, הפחת את עוצמת הלייזר ו/או מרח אלוורה נוספת על אתר הגידול כדי לסייע בפיזור החום. לאחר 5 דקות בטווח ההיפרתרמי, שחרר את דוושת כף הרגל כדי להפסיק את מתן הלייזר ולאפשר לטמפרטורת הגידול הפנימית לרדת ל-~37 מעלות צלזיוס ולכבות את מפתח הבטיחות בלייזר.
    הערה: חשוב למזער את הנזק לעור שעלול להוביל לכיב בגידול על ידי שמירה על טמפרטורת העור מתחת ל-50 מעלות צלזיוס19.
  18. עקוב אחר בדיקת טמפרטורת הגידול הפנימית, ואפשר לטמפרטורת הגידול לרדת חזרה לכ-37 מעלות צלזיוס. הסר בעדינות את בדיקת הטמפרטורה מהגידול ונגב את שאריות ג'ל האלוורה על פני הגידול.
  19. הסר את העכבר מההרדמה של חרוט האף ועקוב אחר עוררות בעלי החיים לפני החזרתו לכלוב. הנח את הכלוב בחלקו על כרית חום של 37 מעלות צלזיוס במהלך תקופת ההתאוששות לאחר ההליך, מה שמאפשר לעכברים לנוע בין אזורים חמים וקרים יותר לפי הצורך כדי לווסת את טמפרטורת גופם. עקוב אחר כל עכבר כדי להבטיח חזרה להתנהגות רגילה לפני החזרתו למתקן הדיור שלו.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול THT זה בתיווך GNR היא לחמם גידולים מוצקים באופן עקבי ואמין לטווח ההיפרתרמי הקל הרצוי של 42-48 מעלות צלזיוס. השלבים העיקריים של הליך זה מתוארים באיור 1. הצלחתו של פרוטוקול זה תלויה בביסוס ותחזוקה של היפרתרמיה קלה מבוקרת וניתנת לשחזור בתוך מודל גידול מוצק נתון. ה-GNRs ששימשו סונתזו בשיטה נטולת CTAB המוגנת בפטנט, שבה מלח זהב הופחת בתמיסת פעילי שטח קניינית כדי לקדם צמיחת גבישים בצורת מוט. לאחר הסינתזה, חומרים פעילי שטח מקומיים הוחלפו ברובם ב-PEG בעל משקל מולקולרי נמוך כדי לשפר את התאימות הביולוגית. ה-GNRs שהתקבלו היו אחידים בגודלם (51.1 ±-10.8 ננומטר על 12.2 ±-1.9 ננומטר), היו בעלי אורך גל עירור אופטימלי של 860 ±-10 ננומטר, והיו נקיים מאנדוטוקסינים הניתנים לזיהוי.

כדי להבטיח חימום תקין של הגידול ומעקב טמפרטורה מדויק, יש להכניס בדיקת טמפרטורה תוך גידולית למרכז הגידול. בנוסף, ניטור טמפרטורת פני העור לאורך כל ההליך באמצעות הדמיה תרמית הוא קריטי. ייתכן, במיוחד עבור גידולים קטנים יותר בנפחם, ש-GNRs המוזרקים תוך גידול יכולים להתפזר לחלל הפרי-גידולי ו/או התת עורי סביב הגידול. בחשיפה לאור קרינה בלתי מייננת, הדבר עלול לגרום לחימום העור מעל הרמות הפיזיולוגיות הבסיסיות, ואם העור מגיע לטמפרטורות מעל רמות היפרתרמיות קלות (מעל 50 מעלות צלזיוס), הדבר עלול להוביל לנזק לעור כגון שפשוף ו/או כיב19. מריחת שכבה של ג'ל אלוורה על פני הגידול היא צעד זהירות חשוב כדי לסייע בוויסות טמפרטורת פני העור ולמנוע נזק תרמי במהלך חשיפה ללייזר NIR. בכל מקרה, מומלץ לעקוב אחר האזור המטופל לאיתור סימני כיב במהלך 48 השעות שלאחר THT. איור 2 מתאר ייצוג חזותי של ההגדרה המוצעת לייעול ניהול טמפרטורת הגידול, המראה את המיקום של בדיקת טמפרטורת הגידול הפנימית ושכבת ג'ל האלוורה ביחס לבדיקת הלייזר NIR.

ניתן לקבוע את ההצלחה היחסית של פרוטוקול ניסיוני זה מהתבוננות בטמפרטורת הגידול הפנימי לעומת גרף הזמן לאורך פעולת הלייזר. עבור עכברים שהוזרקו תוך גידול עם GNRs, הגידולים צפויים להתחמם לטווח ההיפרתרמי הקל (42-48 מעלות צלזיוס) תוך 15 שניות עד 2 דקות. לאחר שטמפרטורת הגידול הפנימית נכנסה לטווח ההיפרתרמי הקל, היא צפויה להתייצב בטווח המתאים או לדרוש מחזור הפעלה/כיבוי של מתן לייזר כדי להבטיח שטמפרטורת הגידול הפנימית לא תעלה מעל 48 מעלות צלזיוס (כפי שמוצג באיור 3A). תחזוקה מוצלחת של היפרתרמיה קלה למשך 5 דקות נחשבת לתוצאה חיובית. עבור עכברים שהוזרקו תוך גידול עם PBS, הגידולים אינם צפויים להתחמם לטווח ההיפרתרמי. חשיפה לאור NIR באורך גל של 860 ננומטר אינה מספיקה לבדה כדי לגרום לחימום רקמות לטווח ההיפרתרמי הקל, וגידולי בקרה צפויים להתייצב סביב 39-40 מעלות צלזיוס. איור 3B מציג טמפרטורת גידול פנימית לעומת גרף זמן בין GNR לעכברי ביקורת (הזרקת PBS) לאורך ההליך של 5 דקות. אם גידול המוזרק על ידי GNR אינו מסוגל להגיע לטווח היפרתרמי בחשיפה לאור NIR או אינו מסוגל לשמור על הטווח ההיפרתרמי המתאים למשך 5 דקות שלמות, הדבר נחשב לתוצאה שלילית.

ניתוח נוסף במורד הזרם כדי לקבוע את ההצלחה של פרוטוקול THT זה בתיווך GNR כולל מדידת שינויים בנפח הגידול לאחר ההליך. THT שבוצע בהצלחה בתיווך GNR גורם למוות ממוקד של תאי גידול ולהפעלת תגובות חיסוניות אנטי-סרטניות, מה שמוביל לרגרסיה של הגידול ולהפחתת נפח הגידולהנלווית 13. איור 4 מציג שינויים בנפח הגידול בעקבות THT בתיווך GNR עבור שני מודלים של סרטן עכברים תת עורי (B16-מלנומה ו-CT26-מודל סרטן המעי הגס ההטרוטופי CT26) ומודל סרטן עכברי כרית שומן שד אחד (סרטן שד 4T1). בכל מודל, ניכרת ירידה משמעותית בנפח הגידול בהשוואה לביקורת 48-72 שעות לאחר הליך THT בתיווך GNR. ציר הזמן והגודל של הפחתת נפח הגידול לאחר ההליך צפויים להשתנות בהתאם לזן העכבר ולמודל הסרטן. בנוסף להפחתת הגידול, ראינו תגובה חיסונית מולדת חזקה תוך 48 שעות של THT בתיווך GNR, המאופיינת בביטוי מוגבר של גנים המעורבים במסלול STING-cGAS ובוויסות והפעלה של תאים דנדריטיים, מקרופאגים ותאי NK הן במודלים B16F10 והן ב-4T113. יש לציין כי במודל גידול דו-צדדי 4T1, THT המופעל על ידי GNR גרם לתגובה חיסונית מערכתית, כפי שמעידה חדירה מוגברת של תאי CD8+ T לגידולים נגדיים לא מטופלים13. ממצאים אלה תומכים עוד יותר בפוטנציאל של גישה זו לעורר הן השפעות ציטוטוקסיות ישירות והן השפעות אנטי-סרטניות אימונומודולטוריות רחבות יותר.

טבלה 1: טבלת בדיקת מידע של קרינה. טבלה המספקת ערכי קרינה (W/cm²) עבור הגדרות פלט זרם לייזר שונות (mA) ומרחקי עבודה (ס"מ). הטבלה משמשת לקביעת גובה הלייזר המתאים על סמך קוטר הקרן הנדרש לכיסוי פני הגידול ולהשגת קרינת מטרה של 1 W/cm2 ±-0.2 W/cm2. ערכים מודגשים בירוק מציינים רמות קרינה אופטימליות ליד 1 W/cm2. טבלת הקרנה זו היא ספציפית ללייזר LDX וסופקה על ידי היצרן. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

figure-results-1
איור 1: סכימה גרפית של נוהל THT בתיווך GNR. מתודולוגיה של טיפול היפרתרמי ממוקד בתיווך זהב-ננו-רוד לגידולי צד תת עורי במודל עכברי. לאחר הקמת גידול מוחשי (כ-50 מ"מ3) והרדמת עכבר, (1) להזריק GNRs תוך גידולי בריכוז של 1 מיקרוגרם/מ"מ3, (2) להכניס בדיקת טמפרטורה תוך-גידולית באמצע מסת הגידול, (3) למרוח שכבה של ~5 מ"מ של ג'ל אלוורה על פני הגידול, (4) להתחיל במתן לייזר NIR, ו-(5) לשמור על טמפרטורת הגידול הפנימית בטווח היפרתרמי קל (42 °C-48 °C) למשך 5 דקות. קיצורים: GNR = ננו-מוט זהב; THT = טיפול היפרתרמי ממוקד; NIR = קרוב לאינפרא אדום. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ייצוג חזותי של מערך ניסוי. עכבר BALB/c הנושא גידול הטרוטופי במעי הגס עם בדיקת טמפרטורה תוך-גידולית שהוחדרה במרכז, ושכבת ג'ל אלוורה מקומית המונחת ישירות מתחת לחשיפה לקרן לייזר אינפרא אדום קרובה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: גרפי טמפרטורה פנימיים בזמן-אמת. פרופיל טמפרטורת הגידול הפנימי המייצג לאורך זמן (באלפיות השנייה) שנרשמו על ידי בדיקת הטמפרטורה הפנימית במהלך חשיפת הגידול ללייזר ה-NIR. (A) דפוס מחזור לייזר NIR מופעל/כבוי בעכבר המוזרק GNR הנדרש לשמירה על טמפרטורת הגידול הפנימית בטווח היפרתרמי קל (42°C-48°C) למשך 5 דקות. זה מדגיש את החשיבות של ניטור צמוד של טמפרטורת הגידול הפנימית ומחזור מתן הלייזר כדי לשמור על הטווח ההיפותרמי לאורך כל ההליך. (B) הבדל ממוצע בטמפרטורת הגידול הפנימית בין עכברי GNR שהוזרקו (n = 15) לבין עכברי ביקורת (n = 8) במהלך חשיפה ללייזר NIR למשך 5 דקות. גידולים של עכברים שהוזרקו ב-PBS אינם מתחממים לטווח היפותרמי קל ומתייצבים סביב 39-40 מעלות צלזיוס למרות קבלת אותו אורך של חשיפה ללייזר NIR כמו הקבוצה שהוזרקה ב-GNR, שהגידולים שלה מגיעים לטמפרטורות היפרתרמיות של 42-48 מעלות צלזיוס. קיצורים: GNR = ננו-מוט זהב; NIR = קרוב לאינפרא אדום. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: גרפים של נפח הגידול בעקבות THT בתיווך GNR. THT בתיווך GNR גורם להתכווצות נפח הגידול על פני מספר מודלים של סרטן עכברים תוך 48-72 שעות לאחר הטיפול. (A) מדידות נפח הגידול במודל 4T1 (סרטן השד) בעקבות THT בתיווך GNR (n= 24 PBS, n = 28 THT). (B) מדידות נפח הגידול במודל B16-F10 (מלנומה) בעקבות THT בתיווך GNR (n = 19 PBS, n = 23 THT). (C) מדידות נפח הגידול במודל CT26 (סרטן המעי הגס) בעקבות THT בתיווך GNR (n = 9 PBS, n = 9 THT). הפחתה או האטה של צמיחת נפח הגידול תוך 48-72 שעות לאחר הטיפול מעידה על תוצאה חיובית. נתוני נפח הגידול עבור מודל CT26 בנקודת הזמן '24 שעות לפני' אינם ממוזגים - הערכים דומים וחופפים. קווי שגיאה מייצגים SEM. * p < 0.05. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים קריטיים בפרוטוקול
התכנון והיישום של טכניקת THT זו בתיווך GNR מספקים את היכולת לבצע חימום ממוקד, מדויק, עתיר משאבים וניתן לשחזור של גידולים מוצקים in vivo. יתרון מרכזי של מערכת זו טמון בדיוק המרחבי ובבקרה התרמית שלה, המאפשרת טיפול מקומי מבלי לפגוע ברקמות הסובבות. צעד קריטי אחד להמרה פוטותרמית מוצלחת הוא הבטחת תאימות בין ה-GNR המשמשים למקור האור NIR. במחקר זה, השתמשנו ב-GNRs המותאמים לספיגה ב-860 ננומטר. באורך גל זה, האור חודר לרקמה ביעילות, וחום נוצר באופן סלקטיבי בגידולים המכילים GNR, בעוד הרקמה הבריאה שמסביב נשארת קרוב לטמפרטורה הפיזיולוגית20. בנוסף, בעת ביצוע פרוטוקול זה, ניטור מדויק בזמן אמת של טמפרטורת הגידול הפנימית הוא חיוני לאישור הושג טווח היפרתרמי קל וכי הטיפול ניתן באופן עקבי. מיקום בדיקת טמפרטורת הגידול, כפי שמוצג באיור 2, מאפשר ניטור בזמן אמת של המינון התרמי של הגידול, כפי שניתן לראות באיור 3B.

פתרון בעיות בטכניקה
בהתאם למודל in vivo ולסוג הגידול, ייתכן שיהיה צורך בשינויים קלים בפרוטוקול כדי לייעל את התוצאות. לדוגמה, במודלים של מלנומה של עכברים, סרטן המעי הגס וסרטן השד המוזכרים באיור 4, ביצענו אופטימיזציה של ריכוז נפח GNR לגידול ב-1 מיקרוגרם/מ"מ3. כמו כן, ייעלנו את היעילות של פרוטוקול זה על ידי ביצוע חשיפה ללייזר NIR ישירות לאחר הזרקת GNR, מכיוון שלא נצפו הבדלים ביעילות הטיפול כאשר השוו את ההזרקה ותזמון הטיפול למרווחים ארוכים יותר של 0.5, 1, 4, 18 או 24 שעות. עבור מודלים של גידולים השונים מהמודלים שלנו מבחינת פתופיזיולוגיה של הגידול או לוקליזציה של הגוף, ריכוז GNR שונה, המוזרק בנקודת זמן שונה, עשוי להיות אופטימלי להשגה ו/או להישאר בטווח ההיפרתרמי. לאחר הליך זה, יש לבצע מדידות יומיות של נפח הגידול כדי לתעד שינויים בנפח הגידול. רגרסיה של הגידול תוך 2-3 ימים היא אינדיקטור חיובי להצלחת הטיפול.

בשל אופיו של פרוטוקול הלייזר, כוויות וכיבים שטחיים בעור מהווים גורם סיכון פוטנציאלי, במיוחד בעור פיגמנטי או רגיש. ייתכן שיהיה צורך בהתאמות לתפוקת זרם הלייזר לשמירה על איזון מתאים בין פני העור לטמפרטורת הגידול הפנימית, בהתאם למודל in vivo בו נעשה שימוש. לדוגמה, מצאנו שבגלל הבדלים בתכולת המים ופיגמנט המלנין בעור21, עכברי C57Bl/6 דורשים מתן לייזר NIR בזרם נמוך יותר בהשוואה לעכברי BALB/c, כדי לשמור על טמפרטורת העור מתחת ל-50 מעלות צלזיוס. בעת שינוי פלט זרם הלייזר, ודא שגובה הלייזר מותאם בהתאם כדי לשמור על קרינת מטרה של 1 W/cm2 ±-0.2 W/cm2 תוך כיסוי רוב משטח הגידול בקוטר קרן הלייזר. לחלופין, מריחת ג'ל אלוורה נוסף יכולה לסייע בהורדת טמפרטורת העור במהלך ההליך מבלי להשפיע באופן דרסטי על טמפרטורת הגידול הפנימית. שמירה על טמפרטורת פני העור המתאימה באמצעות שינויים נדרשים חשובה כדי למזער את הסיכון לכיב, אשר נצפה כתופעת לוואי פוטנציאלית של טיפול זה. בעת ביצוע שינויים בשכבת ג'ל האלוורה, הקפד להפסיק לרגע את מתן קרן הלייזר NIR. בימים שלאחר פרוטוקול הלייזר, ודא שהעכברים נמצאים במעקב צמוד אחר כוויות ו/או כיבים פוטנציאליים.

מגבלות של THT בתיווך GNR
דאגה בטיחותית מרכזית שיש להתייחס אליה בעת ביצוע הליך זה היא השימוש במשקפי בטיחות לייזר מוסמכים לאורך הגל של האור המשמש במהלך פעולת הלייזר. מערכת הלייזר צריכה לכלול תכונות בטיחות מובנות, כגון מנעול מפתח, כדי למנוע הפעלה בשוגג. עם זאת, נדרש ציוד מגן אישי נוסף - במיוחד משקפי בטיחות לייזר מתאימים - כדי להגן מפני חשיפה פוטנציאלית מקרניים מוחזרות או מפוזרות. העין היא הפגיעה ביותר לפגיעה מקרן לייזר, כאשר כוויות ברשתית מהוות דאגה מרכזית בלייזר NIR22. לבסוף, כל הצוות המפעיל את הלייזר חייב להיות בעל הכשרה מתאימה.

פרוטוקול זה בחר בהזרקה תוך-גידולית של GNRs על פני הזרקה מערכתית כדי למזער את רעילות המערכת, להגביל את התפלגות הננו-חלקיקים באיברים מחוץ למטרה כגון הכבד, הטחול והכליות, ולשפר את הדיוק, היעילות ופרופיל הבטיחות של טיפול היפרתרמי. עם זאת, מכיוון שפרוטוקול זה דורש זריקות תוך גידוליות של GNRs, הוא עשוי להיות מוגבל ביכולתו לגרום להיפרתרמיה במודלים מסוימים של גידולים. עד כה הוכחנו את יעילותה של שיטה זו בגידולים תת עוריים וגידולי כריות שומן חלביות, שניהם שוכנים קרוב לפני העור ונגישים בקלות מבחינת הזרקת GNR וחשיפה לאור NIR. קשיים לוגיסטיים עלולים להיווצר בהתמקדות בגידולים השוכנים בתוך חללי הגוף, כגון הצפק, או כאשר מנסים להתמקד באתרים גרורתיים של גידול ראשוני. שינוי פוטנציאלי בפרוטוקול זה יכול לכלול הזרקת GNR מערכתית, בתנאי שהננו-חלקיקים מהונדסים או משתנים כדי להבטיח הצטברות יעילה באתרי גידול לפני חשיפה ל-NIR23. בנוסף, ייתכן שהזרקת GNR תוך גידולית עלולה לגרום לפיזור ננו-חלקיקים לא אחיד בגידול, ולהשפיע על אחידות החימום. עם זאת, לחימום גידול לא אחיד לא צפויה להיות השפעה גדולה על מידת יעילות הטיפול, בהתחשב בכך שהתוצאה העיקרית של פרוטוקול THT זה בתיווך GNR היא השראת ICD להפעלת חסינות אנטי-סרטנית. לבסוף, קריאת הטמפרטורה התוך-גידולית תלויה במיקום בדיקת הטמפרטורה בתוך הגידול. אמצע הגידול הוא המיקום האופטימלי ביותר עבור הגשושית כדי לשקף במדויק את טמפרטורת הגידול הממוצעת הכוללת. עם זאת, אם קשה להבטיח ו/או לאשר החדרת בדיקה מרכזית בגלל גודל הגידול ו/או צורתו, ייתכן שיהיה צורך להקליט באמצעות שני בדיקות טמפרטורה או יותר במקומות שונים.

משמעויות ביחס לשיטות הקיימות
כתב יד זה מספק פרוטוקול מקיף, אופטימלי וניתן לשחזור עבור THT בתיווך GNR בגידולים מוצקים ונגישים באופן שטחי. בהשוואה לשיטות אחרות להשראת היפרתרמיה, טכניקה זו מציעה יתרונות ברורים, כלומר, היא עתירת משאבים נמוכה, מדויקת מרחבית וקשורה לרעילות מערכתית מינימלית. בעוד שהשימוש ב-GNRs לטיפול פוטותרמי מתועד היטב, נותרה שונות משמעותית בספרות באופן שבו פרוטוקולים אלה מיושמים. אלמנטים פרוצדורליים מרכזיים כגון משך הקרנת NIR, בחירת כלי ניטור תרמי (בדיקות צמד תרמי או מצלמה תרמית), הכנת תמיסת GNR ושיטות הזרקת GNR משתנים לעתים קרובות בין מחקרים.

לדוגמה, שיטות אחרות דרשו מינונים ארוכים יותר (20 דקות)24 או מינונים מרובים (4 x 15 דקות)25 של חשיפה לקרינה בלתי מייננת כדי להשיג תוצאות דומות לשלנו. יתר על כן, רוב הפרוטוקולים משתמשים בבדיקות צמד תרמי או במצלמות תרמיות אך לעתים רחוקות משלבים את שני הכלים26,27. בנוסף, פתרונות GNR מוכנים לרוב עם CTAB 28,29,30, ושיטת האספקה שלהם משתנה בין זריקות סיסטמיות 24,30 לזריקות תוך-גידוליות31, מה שיכול להשפיע על פיזורם/מיקומם בתוך ה-TME. ככזה, טרם הוקמה שיטה מקיפה וניתנת להתאמה עבור THT בתיווך GNR הממטבת ומשפרת את הפרוטוקולים הנוכחיים.

הפרוטוקול שלנו מטפל בחסרונות אלה על ידי שילוב הרכיבים היעילים והניתנים לשחזור מהספרות לגישה סטנדרטית אחת. באופן ספציפי, אנו משתמשים בניטור תרמי כפול (הן צמד תרמי והן מצלמה תרמית) כדי להבטיח אספקת חום מדויקת ובטוחה; אנו משתמשים בהזרקה תוך-גידולית של GNRs נטולי CTAB כדי למקסם את לוקליזציה של הגידול ולמזער את הרעילות; ואנו משלבים שימוש בג'ל אלוורה להגנה מפני כוויות עור שטחיות. בנוסף, ה-GNR המשמשים בפרוטוקול זה ממוטבים עבור המרה פוטותרמית יעילה ב-860 nm NIR, מה שמאפשר השגה מהירה של טמפרטורות היפרתרמיות קלות תוך שניות. ברגע שמגיעים לטווח טמפרטורות זה, ניתן לשמור עליו ביציבות למשך 5 דקות טיפול, שקבענו כמספיק כדי לגרום למוות של תאים אימונוגניים והפעלה חיסונית. אורך הגל של 860 ננומטר NIR עצמו מספק גם איזון חיובי בין עומק חדירת הרקמות לבטיחות, ומשפר עוד יותר את החלון הטיפולי של שיטה זו.

לסיכום, הפרוטוקול שלנו מציע אלטרנטיבה מאוחדת, מאומתת ויעילה ביולוגית לגישות היפרתרמיה קיימות בתיווך GNR, וממלא פער קריטי בתחום על ידי מתן שיטה מפורטת וניתנת להתאמה המתאימה למחקר סרטן פרה-קליני ופיתוח טיפולים משולבים.

יישומים עתידיים של הטכניקה
לבסוף, למרות שניתן לשלב פרוטוקול זה בקלות עם טיפולים שונים בסרטן, הוא מתאים במיוחד לשיפור היעילות של אימונותרפיה, בהתחשב ביכולתו המובנית של THT לעורר חסינות אנטי-סרטנית. על ידי גרימת מוות של תאים אימונוגניים, קידום שחרור אנטיגנים ספציפיים לגידול והגדלת מספר תאי החיסון המולדים המגויסים ל-TME תוך 48 שעות לאחר הטיפול, THT בתיווך GNR מסייע 'לעורר רגישות מחדש' של גידולים קרים מבחינה אימונולוגית לזיהוי ותקיפה על ידי מערכת החיסון13. כתוצאה מכך, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לשפר את היעילות של אימונותרפיה בטיפול בסרטן שאולי פיתח בעבר עמידות, ומציעה אסטרטגיה פוטנציאלית להתגברות על מחסומי טיפול בסרטן והתקדמות המחלה13.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי מחקר זה קיבל מימון מ-Sona Nanotech Inc. למממן הייתה המעורבות הבאה במחקר: מתן המימון לחומרים ולמשאבים הדרושים למחקר, כמו גם תמיכה ביעדי הפרויקט הכוללים. כרמן ג'קומנטוניו היא המנהלת הרפואית הראשית של Sona Nanotech Inc.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים בהכרת תודה על התמיכה הכספית של Sona Nanotech Inc. ברצוננו להודות גם לקרן סידני קרוסבי, לד"ר מארק ג'ונסטון, למחלקה לכירורגיה באוניברסיטת דלהוזי, ליו"ר המרכז למדעי הבריאות ע"ש ג'ובראן וג'מיל ראמיה QEII בקרן המחקר לאונקולוגיה כירורגית, ולמענק ציוד ההון של DMRF על תרומתם הנדיבה, שכולם תמכו במחקר זה. תודה לריק ולינדזי קלארק על שסיפקו ציוד צילום ועזרו בבימוי הסצנה. איור 1 נוצר עם https://BioRender.com.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין תרמו פישר סיינטיפיק25200-056
10 מ"ל סטריפטפישר סיינטיפיק7200574
שפופרת פלקון 15 מ"לקורנינג352095
מזרק 1 מ"לBD Biosciences3331431
מחט 28 גרםBD Biosciences1298811
קו תאי סרטן השד 4T1אוסף תרבות הטיפוס האמריקאיCRL-2539
5 מ"ל סטריפטפישר סיינטיפיק7200573
שפופרת פלקון 50 מ"לפישר סיינטיפיק14-432-22
70% אתנולאלכוהול מסחרי36195
ג'ל אלוורהמותג חיים57800985495
קו תאי מלנומה B16-F10אוסף תרבות הטיפוס האמריקאיCRL-6475
עיבוד ביולוגיביו-רינדרלא ישים
ארון דו-בטיחותינואירלא ישים
משקפי בטיחות לייזר Class 4 לייזר ויז'ןF22. P5P18.5000השתמשנו במסגרת P22 עם פילטר P5P18
אינקובטור CO2 (37 & deg; C, 5% CO<תת>2)נואירלא ישים
קורנינג 1-200 ומיקרו; L פיפט מתלה אוניברסלי  טיפיםקורנינג4865
פיפטה מסוננת קורנינג  טיפים, 30 ומיקרו; Lפישר סיינטיפיק07-200-265
קו תאי המעי הגס של עכברים CT26אוסף תרבות הטיפוס האמריקאיCRL-2638
DPBSתרמו פישר סיינטיפיק10010-049
צינורות אפנדורףתרמו פישר סיינטיפיק3451
נקבות עכברי BALB/cמעבדות צ'ארלס ריבר (מונטריאול, קנדה)028
נקבה C57Bl/6מעבדות צ'ארלס ריבר (מונטריאול, קנדה)027
סרום בקר עובריתרמו פישר מדעי invitrogen12483020
GNRסונה ננוטק בע"מלא ישים
בדיקת טמפרטורה תוך-גידוליתאומגהHYP1-30-1/2-T-G-60-SMP-Mבדיקה צמד תרמי דגם HYP-1
IsoTip 1000 ומיקרו; L פיפט אוניברסלי מסונן  טיפיםקורנינג4809
לייזר LDX (דגם: LDX- 3520-860-HHLFC)מינטרוניקסלא ישיםזרם לייזר עם נקודת הגדרה מקסימלית ב- 4600 mA
Optixcare סיכה לעינייםאוונטיקסלא ישים
פניצילין-סטרפטומיציןתרמו פישר סיינטיפיק15140148
פריזמה 10.6.0לוח גרפיםלא ישים
RPMI 1640 בינוניתרמו פישר סיינטיפיק11875119
תוכנת לוגר נתונים צמד תרמי TC-08 טכנולוגיית פיקופיקולוג גרסה 5.25.3
מצלמה תרמית היקמיקרוEA-1086922
צלחת תרבית רקמות 100 x 20 מ"מפישר סיינטיפיק877222
Trypan Blue Solution 0.4%תרמו פישר סיינטיפיק15250061
קליפר מדידת גידול ג'יילס סיינטיפיקתאגיד מיטוטיו500-321

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Crezee, J., Franken, N. A. P., Oei, A. L. Hyperthermia-based anti-cancer treatments. Cancers (Basel). 13 (6), 1-4 (2021).
  2. Zhang, Y., Li, Z., Huang, Y., Zou, B., Xu, Y. Amplifying cancer treatment: advances in tumor immunotherapy and nanoparticle-based hyperthermia. Front Immunol. 14, 1258786(2023).
  3. Huang, X., Lu, Y., Guo, M., Du, S., Han, N. Recent strategies for nano-based PTT combined with immunotherapy: from a biomaterial point of view. Theranostics. 11, 7546-7569 (2021).
  4. Yi, G. Y., Kim, M. J., Kim, H. I., Park, J., Baek, S. H. Hyperthermia treatment as a promising anti-cancer strategy: therapeutic targets, perspective mechanisms and synergistic combinations in experimental approaches. Antioxidants (Basel). 11, 625(2022).
  5. Hajebi, S., et al. Advances in stimuli-responsive gold nanorods for drug-delivery and targeted therapy systems. Biomed Pharmacother. 180, 117493(2024).
  6. Cancino-Bernardi, J., et al. Gold-based nanospheres and nanorods particles used as theranostic agents: an in vitro and in vivo toxicology studies. Chemosphere. 213, 41-52 (2018).
  7. Cheng, D., et al. Dual-responsive nanohybrid based on degradable silica-coated gold nanorods for triple-combination therapy for breast cancer. Acta Biomater. 128, 435-446 (2021).
  8. Qin, H., et al. Biosynthesized gold nanoparticles that activate Toll-like receptors and elicit localized light-converting hyperthermia for pleiotropic tumor immunoregulation. Nat Commun. 14, 5178(2023).
  9. Wu, L., et al. Enzyme-responsive multifunctional peptide coating of gold nanorods improves tumor targeting and photothermal therapy efficacy. Acta Biomater. 86, 363-372 (2019).
  10. Chatterjee, D. K., Diagaradjane, P., Krishnan, S. Nanoparticle-mediated hyperthermia in cancer therapy. Ther Deliv. 2, 1001-1014 (2011).
  11. Scutigliani, E. M., Liang, Y., Crezee, H., Kanaar, R., Krawczyk, P. M. Modulating the heat stress response to improve hyperthermia-based anticancer treatments. Cancers (Basel). 13 (6), 1-20 (2021).
  12. Liu, Y. T., Sun, Z. J. Turning cold tumors into hot tumors by improving T-cell infiltration. Theranostics. 11, 5365-5386 (2021).
  13. Kennedy, B. E., et al. Targeted intra-tumoral hyperthermia using uniquely biocompatible gold nanorods induces strong immunogenic cell death in two immunogenically 'cold' tumor models. Front Immunol. 15, 1512543(2025).
  14. Chen, H., et al. Depleting tumor-associated Tregs via nanoparticle-mediated hyperthermia to enhance anti-CTLA-4 immunotherapy. Nanomedicine (Lond). 15, 77-92 (2020).
  15. Oei, A. L., et al. Enhancing the abscopal effect of radiation and immune checkpoint inhibitor therapies with magnetic nanoparticle hyperthermia in a model of metastatic breast cancer. Int J Hyperthermia. 36, 47-63 (2019).
  16. Mouratidis, P. X. E., Costa, M., Rivens, I., Repasky, E. E., Ter Haar, G. Pulsed focused ultrasound can improve the anti-cancer effects of immune checkpoint inhibitors in murine pancreatic cancer. J R Soc Interface. 18, 20210266(2021).
  17. Liu, Y., et al. Plasmonic gold nanostar-mediated photothermal immunotherapy for brain tumor ablation and immunologic memory. Immunotherapy. 11, 1293-1302 (2019).
  18. Cano-Mejia, J., et al. Prussian blue nanoparticle-based photothermal therapy combined with checkpoint inhibition for photothermal immunotherapy of neuroblastoma. Nanomedicine. 13, 771-781 (2017).
  19. Okuyama, S., et al. Avoiding thermal injury during near-infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT): the importance of NIR light power density. Oncotarget. 8, 113194-113201 (2017).
  20. Ruggiero, E., Alonso-de Castro, S., Habtemariam, A., Salassa, L. Upconverting nanoparticles for the near infrared photoactivation of transition metal complexes: new opportunities and challenges in medicinal inorganic photochemistry. Dalton Trans. 45, 13012-13020 (2016).
  21. Sabino, C. P., et al. The optical properties of mouse skin in the visible and near infrared spectral regions. J Photochem Photobiol B. 160, 72-78 (2016).
  22. Lasers in health care. , Canadian Centre for Occupational Health and Safety. Available: https://www.ccohs.ca/oshanswers/phys_agents/lasers.html#section-6-hdr (2021).
  23. Kesharwani, P., et al. Gold nanoparticles and gold nanorods in the landscape of cancer therapy. Mol Cancer. 22, 98(2023).
  24. Zhang, Z., et al. Near infrared laser-induced targeted cancer therapy using thermoresponsive polymer encapsulated gold nanorods. J Am Chem Soc. 136, 7317-7326 (2014).
  25. Liu, X., et al. antigen-trapping gold nanorods elicit anticancer immunity against abscopal tumors by photothermal therapy-induced in situ vaccination. Biomaterials. 275, 120921(2021).
  26. Schuh, E. M., Portela, R., Gardner, H. L., Schoen, C., London, C. A. Safety and efficacy of targeted hyperthermia treatment utilizing gold nanorod therapy in spontaneous canine neoplasia. BMC Vet Res. 13, 294(2017).
  27. Dickerson, E. B., et al. Gold nanorod assisted near-infrared plasmonic photothermal therapy (PPTT) of squamous cell carcinoma in mice. Cancer Lett. 269, 57-66 (2008).
  28. Huff, T. B., et al. Hyperthermic effects of gold nanorods on tumor cells. Nanomedicine (Lond). 2, 125-132 (2007).
  29. Ghafarkhani, M., et al. Mild hyperthermia induced by gold nanorods acts as a dual-edge blade in the fate of SH-SY5Y cells via autophagy. Sci Rep. 11, 23984(2021).
  30. Gong, B., et al. Thermo-responsive polymer encapsulated gold nanorods for single continuous wave laser-induced photodynamic/photothermal tumour therapy. J Nanobiotechnology. 19, 41(2021).
  31. Hainfeld, J. F., et al. Gold nanoparticle hyperthermia reduces radiotherapy dose. Nanomedicine. 10, 1609-1617 (2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים