מאמר שיטה

שיפור טכנולוגיית קולטני אנטיגן כימריים-שלפוחיות חוץ-תאיות (CAR-EV): עתיד הטיפול בסרטן

DOI:

10.3791/68726

⸱

19 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INOVIQ Ltd., 2Centre for Clinical Research, Faculty of Medicine, The University of Queensland

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ליישום הטיפולי של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) יש פוטנציאל לחולל מהפכה בטיפול בסרטן ובמתן תרופות. EVs שמקורם בתאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR) (CAR-EVs) שבודדו באמצעות כרומטוגרפיה של חילופי יונים מציגים קיבולת מטען מוגברת, מה שמשפר משמעותית את יעילותם התפקודית. מחקר זה מאפיין עוד יותר את ה-CAR-EVs כדי להבהיר את הפעילות הביולוגית והפוטנציאל הטיפולי שלהם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפולים בתאי CAR קידמו משמעותית את הטיפול המותאם אישית למספר ממאירויות המטולוגיות. נכון לעכשיו, שבעה מוצרי תאי CAR מאושרים על ידי מינהל המזון והתרופות (FDA) ושישה על ידי סוכנות התרופות האירופית (EMA) לטיפול בלימפומה, מיאלומה נפוצה ולוקמיה לימפוציטית כרונית. נותרו מספר אתגרים ומגבלות, כאשר תסמונת שחרור ציטוקינים (CRS) ותסמונת נוירוטוקסיות הקשורה לתאי אפקטור חיסוני (ICANS) הן המשמעותיות ביותר. טיפולים נטולי תאים, כגון CAR-EVs, מציעים יתרונות מהותיים על פני עמיתיהם התאיים. אלה כוללים חדירת גידול משופרת ופוטנציאל למתן חוזר תוך מזעור הסיכונים ל-CRS, ICANS ותופעות לוואי שליליות אחרות. בנוסף, ניתן לכוונן את העוצמה של CAR-EVs על ידי הנדסת הכללה של חומרים ציטוטוקסיים וחומצות ריבונוקלאיות משנות תפקוד (RNA). כאן, אנו מדווחים על פיתוח פלטפורמת CAR-EV ניתנת להרחבה לייצור רכבי CAR-EV מתכווננים. פלטפורמה זו כוללת הנדסה והתניה מוקדמת של תאי יצרן EV (למשל, תאי הרג טבעי CAR-T ו-CAR-NK), בידוד והעשרה של רכבי CAR-EV באמצעות פלטפורמת כרומטוגרפיה של חילופי יונים (IEX) בדרגת תנאי ייצור נאותים (GMP), ניתוח תת-אוכלוסיית EV אוטומטי לחלוטין בתפוקה גבוהה ובמבחנה הערכת פעילות ציטוטוקסית תפקודית של CAR-EV. הפלטפורמה אומתה באמצעות CAR-NK-EVs ו-CAR-T-EVs עבור קווי תאי גידול המטולוגיים ומוצקים כאחד. פלטפורמת CAR-EV מייצגת גישה מבטיחה לפיתוח מהיר של רכבי CAR-EV טיפוליים מדף המותאמים להתוויות מחלה ספציפיות, עם פוטנציאל להפחית תופעות לוואי שליליות הקשורות לטיפולים מבוססי תאי CAR.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפולים מבוססי תאי CAR אושרו לטיפול בגידולים המטולוגיים, עם זאת, אתגרים ומגבלות משמעותיים נמשכים1. יש לציין כי הסיכונים של CRS ו-ICANS נותרו גורמים קריטיים בעת הערכת התאמת המטופל לטיפול ב-CAR, מה שמדגיש את הצורך בהתקדמות מתמשכת באסטרטגיות הטיפול2.

רכבים חשמליים שמקורם בתאי CAR (CAR-EVs) התגלו כאופציה טיפולית אלוגנית יעילה יותר ובטוחה יותר. EVs כאלה מציעים מספר יתרונות, כולל אימונוגניות מופחתת, סיכון נמוך יותר ל-CRS, חדירת גידול משופרת, התאמה למינון חוזר, פוטנציאל לטיפולים משולבים, כמו גם תהליכי ייצור ואחסון יעילים3. ניתן להנדס EVs שמקורם ביולוגית כדי לבטא מולקולות מכוונות לסרטן הנקשרות בזיקה גבוהה לקולטני שטח ספציפיים על תאים סרטניים. לאחר השינוי, רכבים חשמליים אלה מציגים אסטרטגיה מבטיחה לאספקת מטען טיפולי באופן סלקטיבי, עם פוטנציאל למזער השפעות מחוץ למטרה. נגזרים מתאי CAR, רכבים חשמליים חמושים אלה מציגים תכונות פונקציונליות משופרות המאפשרות אספקה טיפולית מדויקת ועוצמתית יותר. המאפיינים הטבועים בהם מעניקים יתרונות מרובים התורמים ביחד לשיפור יעילות הטיפול.

שני מכשולים עיקריים לשימוש יעיל ברכבים חשמליים במרפאה הם קנה מידה ויעילות. המתודולוגיות המתוארות כאן מציגות מדרגיות מובנית וניתנות להתאמה בקלות על פני ספקטרום רחב של פרדיגמות ניסיוניות. שדרוג ייצור EV לייצור ברמה קלינית הוא תחום של פיתוח פעיל אך דורש אופטימיזציה נוספת כדי לייצר כמויות מספיקות של חומר ברמה קלינית4. חשוב לציין, מחקרים אחרונים הראו גישות מבטיחות לשיפור יעילות EV, כגון התניה מוקדמת של תאי אב עם אינטרלוקינים (למשל, IL-7, IL-15, IL-21) ויצירת EVs בתנאים היפוקסיים (1-2% O2) 5,6,7.

מטרת מחקר זה הייתה לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR) וקולטן גורם גדילה אפידרמלי אנושי 2 (HER2) המכוונים ל-CAR EVs במבחנה, תוך שימוש בתאי סרטן שד MCF-7 ותאי לוקמיה מיאלואידית K562. רכבים חשמליים בודדו והועשרו ממדיה ממוזגת תא CAR (CM) באמצעות IEX, אופיינו באמצעות מעקב אחר ננו-חלקיקים וניתוח כתמים מערביים, ועברו בדיקות פונקציונליות. רכבי CAR EV המכילים מטען ציטוטוקסי אנדוגני גרמו למעשה למוות תאים במבחנה. הנתונים שהתקבלו מבססים את ההיתכנות של ייצור EV ממוקד וניתן להרחבה עבור יישומים טיפוליים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: טפל בכל התאים החיים בתוך ארון בטיחות ביולוגית מוסמך ברמה 2 (BSL-2) באמצעות PPE מתאים (למשל, כפפות, חלוקי מעבדה). יש לטהר חומרים מסוכנים ביולוגיים, כגון כדורי תאים המכילים תאים חיים, באמצעות תמיסת נתרן היפוכלוריט (אקונומיקה) סופית של 10%.

1. תרבית תאים ואיסוף CM

  1. תרבית של תאי CAR
    הערה: למרות שתאי ה-CAR המומרים לנטי-ויראלים ששימשו במחקר זה הועברו למיקור חוץ, הפרוטוקול נשאר ישים לתאי CAR-T/NK שנוצרו בתוך הבית באמצעות טכניקות סטנדרטיות של הנדסת תאים.
    1. שמור על תאי CAR NK/T בתרבית נטולת קסנו (מדיום גידול בתוספת 100 IU/mL IL-2) בצפיפות של 0.5-1 x 106/mL, בתא לח ב-37 מעלות צלזיוס (5% CO2, 21% O2). עקוב כל 2-3 ימים והגבל את ספירת התאים ל-3 פעמים בשבוע עקב אילוצי קיבולת מעבר.
    2. אשר את ביטוי CAR באמצעות מיקרוסקופיה, וודא שהתאים פלואורסצנטיים (אם מתויגים כראוי). תאים בגושים בריאים מעידים על תרבית תאי CAR חזקה.
  2. קולקציית CM
    1. לאחר שתרביות תאים מגיעות למפגש של 80%, העריכו את כדאיות התאים וקבעו את צפיפות התאים החיים באמצעות ניתוח ספירת תאים אוטומטי כחול טריפאן.
    2. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 300 × גרם (טמפרטורת החדר) למשך 5 דקות ליצירת כדור.
    3. יש לאסוף בזהירות את הסופרנטנט והצנטריפוגה בטמפרטורה של 3,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להבהיר.
    4. אחסן את ה-CM המובהר ב-80 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן להעשרת EV.

2. בידוד והעשרה של EV

הערה: השיטות הבאות מתארות שתי גישות להעשרת שלפוחית חוץ-תאית (EV): שיטת IEX, שפותחה עבור בידוד EV עבור אנליזה פונקציונלית במבחנה , ושיטת לכידת פאן-אקסוזום בתפוקה גבוהה, המותאמת למחקרי אפיון במורד הזרם.

  1. העשרת רכבי CAR EV פונקציונליים באמצעות IEX
    הערה: כל המפרטים הנפחיים באים לידי ביטוי במונחים של נפח עמודה (CV), המשקף את הקשר הפרופורציונלי בין נפחי הריאגנטים לנפח מיטת השרף בתוך העמודה הכרומטוגרפית.
    1. הבא את עמודת IEX (ראה טבלת חומרים לפרטי העמודה המשמשת) לטמפרטורת החדר (RT) על ידי מתן אפשרות לעמוד במשך 15 דקות לפני השימוש. הוסף 10 CV של מאגר התחדשות, ואחריו שיווי משקל באמצעות מאגר שיווי משקל איזוטוני של 10 CV (ב-pH 7.4) (ראה טבלת חומרים לפרטי המאגרים).
      הערה: אל תאפשר לעמודה להתייבש לתקופות ממושכות. שמור תמיד את העמודה זקופה.
    2. הפשירו את ה-CM והעבירו דרך מסנן פוליאתרסולפון (PES) של 0.22 מיקרומטר.
    3. הוסף את הדגימה לעמודה המאוזנת (עד 31.2 CV), ואחריה 10 CV של מאגר כביסה איזוטוני (ב-pH 7.4). הוסף 2.5 CV של מאגר פליטה היפרטוני (ראה טבלת חומרים) ואסוף את הזרימה, מכיוון שזו דגימת הפליטה של EV.
    4. בצע החלפת חוצץ ב-EV eluate באמצעות מסננים צנטריפוגליים אולטרה-סינון זמינים מסחרית (חתך של 30 kDa) ותמיסה איזוטונית כמדלל, מה שמבטיח מקדם דילול מינימלי של פי 100. נפח היעד לאחר החלפת מאגר יכול להיקבע על ידי המשתמש כך שיתאים לפרמטרים הניסיוניים שלו.
    5. בצע שלב סינון אחרון באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי לעקר את הרכבים החשמליים המועשרים עבור מבחנים פונקציונליים במבחנה .
    6. קבע את התפלגות הגודל, הריכוז והתפוקה של CAR-EV באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA)8,9.
  2. בידוד EV פאן-אקסוזום בתפוקה גבוהה (באמצעות מערכת טיהור אוטומטית, המבוצעת בטמפרטורת החדר (RT)), לאפיון מערך מוגבל או גדול של דגימות10,11.
    1. הכן שלוש צלחות 96 בארות עמוקות (DW) עם 1 מ"ל של 1x PBS לבאר.
    2. צור צלחת 'פליטה' על ידי הוספת 35 מיקרוליטר של מאגר נתרן דודציל סולפט (SDS) 1% לכל באר.
    3. הכן צלחת 'כריכה' המכילה 1 מ"ל של דגימת CM ו-30 מיקרוליטר של חרוזי לכידת פאן-אקסוזום EXO-NET לכל באר.
    4. הגדר את ההגדרות הבאות במערכת הבידוד האוטומטית:
      1. שלב 1: טיפ לאיסוף: ודא שפרוטוקול הבידוד מתחיל בכך שהמכשיר מפעיל מסרק קצה באר בעומק 96 כדי לאפשר מניפולציה של חרוזים מגנטיים לאורך תהליך הבידוד.
      2. שלב 2: ודא שדגימת ה-CM והחרוזים המגנטיים מעורבבים בתנאי מהירות איטית מתמשכת למשך 30 דקות כדי לאפשר לכידה יעילה של EVs על החלקיקים המגנטיים. לאחר הערבוב כלולים 5 מחזורים של 30 שניות כל אחד כדי להבטיח לכידת חרוזים מגנטיים.
      3. שלב 3: ודא שכל אחד משלושת שלבי הכביסה משתמש בתערובת עדינה במהירות איטית של 30 שניות כדי להסיר מזהמים שאינם קשורים במיוחד תוך שמירה על שלמות הרכבים החשמליים הקשורים. כמו קודם, השלב מסתיים עם 5 מחזורים של 30 שניות כל אחד כדי ללכוד את החרוזים המגנטיים.
      4. שלב 4: סילוק חלבון EV (ליזה): ודא ש-EVs קשורים עוברים ליזה לשחזור חלבון בתהליך דו-שלבי. ערבוב ראשוני למשך 30 שניות (ערבוב תחתון) מתבצע לפני דגירה למשך 7 דקות ו-30 שניות במצב מושהה, כאשר מיקום הקצה מוחזק מעל הבאר. לאחר שהזמן חולף, יש ערבוב נוסף של 30 שניות והפסקה למשך 7 דקות ו-30 שניות נוספות. לבסוף, משולבים 5 מחזורים של 30 שניות כל אחד.
      5. שלב 5: בשלב זה, ודא שתכולת החלבון נמצאת במאגר, ואילו החרוזים מחוברים לקצה. לאחר שלב הפליטה, מסרק הקצה המשומש מושלך ומשלים את הפרוטוקול.
        הערה: חרוזי לכידת פאן-אקסוזום של EXO-NET מכילים 0.05% (w/w) תמיסת שימור. למרות שאינו מסווג כמסוכן על פי תקנות מינהל הבטיחות והבריאות התעסוקתית (OSHA), יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים (PPE) בעת הטיפול, במיוחד בהקשר של נוזלים ביולוגיים.

3. אפיון רכבים חשמליים באמצעות כתמים מערביים

הערה: רכבי CAR-EV אופיינו בכתם מערבי (Granzyme B ו-Calnexin), בהשוואה לתאים כביקורת.

  1. הכן ליזטים של תאים על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של מאגר 1x בדיקת רדיו-אימונו-משקעים (RIPA) (עם מעכבי פרוטאז) לכל 1 × 106 תאים . דגירה על קרח למשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה בטמפרטורה של 14,000 × גרם (4 מעלות צלזיוס) למשך 15 דקות כדי להסיר פסולת תאים. ניתן ליז EVs באמצעות אותו מאגר או 1% SDS.
  2. כמת את כמות החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית (BCA) (או ננו ספקטרופוטומטר מתאים).
  3. הרכיבו ג'ל 4-12% SDS-polyacrylamide במנגנון אלקטרופורזה בהתאם לפרוטוקול היצרן. הכן ליזטים של חלבון באמצעות המאגר של Laemmli.
    הערה: מערכות ג'ל עשויות להשתנות בהתאם למותג
  4. טען 5 מיקרוגרם דגימה לכל באר והפעל ג'לים ב -200 וולט למשך 20 דקות.
  5. בצע העברה מערבית באמצעות ממברנות פלואוריד פוליווינילידן (PVDF), וחסימת הכתמים עם 5% אלבומין בסרום בקר (BSA) בתמיסת מלח 1x Tris-buffered עם 0.1% Tween 20 (1x TBST) לאחר מכן.
  6. לדגור את הכתמים בנוגדנים חד-שבטיים ראשוניים (Granzyme B ו-Calnexin, דילול של 1 ל-500 בתמיסה של 5% BSA ב-1x TBST), עומד (לא רועד), ולילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  7. למחרת, שטפו את הכתמים 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחד עם 10-15 מ"ל של 1x TBST לפני הדגירה בנוגדנים משניים (תלוי במין, 1 ל-1,000 דילול בתמיסה של 5% BSA ב-1x TBST למשך שעה אחת ב-RT). זהה רצועות באמצעות כימילומינסנציה משופרת (ECL), עם תמונות שצולמו באמצעות מצלמה דיגיטלית של התקן מצמד טעון (CCD).

4. בדיקה פונקציונלית (באמצעות MTS)

הערה: ציטוטוקסיות הוערכה על ידי בדיקת MTS במבחנה [(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium], שבה תאים מפחיתים את תרכובת הטטרזוליום לתוצר פורמאזן צבעוני מסיס, הניתן למדידה בספיגה של 490 ננומטר. סרטן שד MCF-7 ותאי סרטן דם K-562 טופלו עד 3 ימים בשלושה ניסויים עצמאיים עם ריכוזים הולכים וגדלים (0-500,000 חלקיקים לתא) של CAR-EVs.

  1. זרע 5,000 תאים נמענים לבאר (50 מיקרוליטר לבאר) בצלחת של 96 בארות באמצעות פיפטה רב-ערוצית. שמור עמודה אחת עבור מדיום ריק (עבור חיסור רקע מגיב MTS). הימנע מבארות קצה, מלא אותן ב -200 מיקרוליטר מים סטריליים.
    הערה: יש לצפות תאים דבקים יום מראש כדי להבטיח חיבור תאי למשטח הצלחת לפני הטיפול.
  2. הוסיפו רכבים חשמליים בכמויות הולכות וגדלות (למשל, 2.5 x 105 ו-4.5 x 105, או 0.5, 0.75 ו-1 מיליון רכבים חשמליים לתא). כלול בקרות: 'ללא EV', 1x PBS 'מאגר EV', ובקרת הרג תאים חיובית (למשל, מעכב מולקולה קטנה ספציפית למטרה או 0.1% TX-100).
  3. דגרו תאים בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (5% CO2, 21% O2) למשך 2-3 ימים.
  4. בנקודת הזמן שנקבעה לטיפול יש לבחון את התאים באמצעות מיקרוסקופיה. הוסף את מגיב ה- MTS (20 מיקרוליטר לכל תרבית של 100 מיקרוליטר לבאר). דגירה בין 1-4 שעות, מדידת הספיגה באמצעות קורא צלחות ב-490 ננומטר, מדי שעה.
  5. הפחת קריאת ספיגה בינונית ריקה לניתוח נתונים. חשב סטטיסטיקה באמצעות מבחן t של סטודנט עבור השוואות של שתי קבוצות, או ANOVA חד כיווני עם השוואות מרובות עבור שלוש קבוצות או יותר.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת עבודה טיפוסית של תרבית תאי CAR T/NK, ואחריה בידוד, אפיון וניצול EVs בבדיקה פונקציונלית מודגמת באיור 1. CM מתרבית של תאי CAR T/NK נאסף, לפני העשרת EV ואפיון במורד הזרם (כולל ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים) ופעילות פונקציונלית מוערכת באמצעות בדיקת MTS מרובת בארות (איור 1).

ניתן לדמיין תאי CAR מתויגים GFP באמצעות מיקרוסקופיה כדי לאשר את הביטוי של מבנה ה-CAR בתרבית. יש לבצע מיקרוסקופיה כצעד שגרתי לפני ובמהלך איסוף ה-CM כדי להבטיח יעילות העברה מספקת. חשוב לכסות ערוצי שדה בהיר ו-GFP, כדי ללכוד אוטו-פלואורסצנטיות פוטנציאלית בעת הערכת יעילות. יש לציין כי לתאי T יש נטייה להתגבש באופן טבעי (באופן דומה נצפתה בתאי NK; הנתונים אינם מוצגים), וניתן לראות בבירור פלואורסצנטיות כאשר תאים מציגים פנוטיפ גושי (איור 2).

לאחר העשרת EV, ניתן לאפיין EVs באמצעות NTA ו-Western Immunoblotting. באמצעות NTA, ניתוח תפוקת החלקיקים יכול לאשר ריכוז מוגבר ב-EVs המבודדים, בהשוואה ל-CM (איור 3A). נתוני הכתם המערבי מאשרים עוד יותר את הביטוי של הסמן הציטוליטי גרנזים B בתאי CAR ו-EVs, ואת היעדר הקלנקסין באחרון, מה שמאשר את היעדר החומר הסלולרי בתכשירים. תאים HEK293T נכללים כבקרה שלילית ל-CAR (איור 3B).

ניתוח פונקציונליות EV בוצע באמצעות בדיקת MTS כדי לקבוע את כדאיות/יכולת התפשטות התאים. ההשפעה של CAR-EVs המכוונים ל-EGFR ו-HER2 על סרטן השד MCF-7 וכדאיות וצמיחת תאי סרטן הדם K562 נקבעת על ידי מדידת מגיב MTS הקולורימטרי בספיגה של 490 ננומטר (לאחר הסרת אות הרקע). בדוגמה זו, EGFR המכוון ל-CAR-EVs הפחית את כדאיות תאי MCF-7 ו-K562 ב-70% ו-40%, בהתאמה. HER-2 המכוון ל-CAR-EVs הפחית את MCF-7 ב-~10% (כפי שנקבע באמצעות מבחן ה-t של הסטודנט). בהתחשב בפריסת הניסוי, שימוש במבחן לא פרמטרי (למשל, Mann-Whitney U) עשוי להציע תובנות חזקות יותר במחקרים הבאים (איור 4).

figure-results-1
איור 1: ייצור CAR-EV, העשרה, אפיון EV וקריאה פונקציונלית. דיאגרמה סכמטית המתארת זרימת עבודה טיפוסית של ייצור, ייצור ואפיון של דגימות CAR-EV מועשרות לפני ניתוח הפונקציונליות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ניתוח מיקרוסקופיה מייצג על ידי אישור ביטוי GFP בתאי CAR-T מכווני HER2. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, תוך שימוש במטרה פי 20. סרגל הקשקשת הלבן מייצג אורך של 50 מיקרומטר. לתאי T יש נטייה טבעית לגדול בגושים לפני הניתוק לתאים בודדים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: אפיון של תאי CAR ורכבים חשמליים. (A) ניתוח חלקיקי ננו-מעקב של CAR-T CM ורכבים חשמליים מועשרים. ריכוז החלקיקים של EVs היה גדול פי 1.6-2.1 מזה של CM, בעוד שריכוז החלבון הופחת ב->80%. הבדלים מובהקים סטטיסטית נבדקו עם ANOVA חד כיווני ומבחן ההשוואה המרובה של Tukey; עמ≤ 0.001, **** עמ≤ 0.0001. (B) ניתוח כתמים מערביים של תאי T מתמרים ו-CAR-EVs מועשרים אישר את נוכחותו של גרנזים B ציטוליטי הן בתאי CAR והן בתאי EVs, בעוד שהיעדר נצפה בתאים HEK293T שאינם CAR. קלנקסין לא זוהה ב-CAR-EV, מה שמעיד על זיהום נמוך על ידי חלקיקי רשתית אנדופלזמית. עומס חלבון לנתיב = 5 מיקרוגרם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ההשפעה של CAR-EVs על כדאיות תאי המטרה (תאי סרטן שד MCF-7 וקו תאי לוקמיה מיאלוגנית כרונית K562). תאי המטרה טופלו במינון יחיד של 4.5 x 105 ו-2.5 x 105 EVs לתא (EGFR או HER2 CARs, בהתאמה) או בקרה (EV buffer) למשך עד 3 ימים. (A) תאי CAR-EVs שמכוונים ל-EGFR. (ב) רכבי CAR-EV מכווני HER2. ירידה בקריאת הספיגה (המעידה על יעילות הטיפול) נצפתה בשני קווי התאים. הנתונים מייצגים את הספיגה הממוצעת ± SD (n = 3), שנותחה באמצעות מבחן t של סטודנט דו-זנבי לא מזווג, עם ערכי p המציינים מובהקות סטטיסטית; ** עמ≤ 0.01. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שילוב היעילות המוכחת של טיפול ב-CAR עם היתרונות המבטיחים של טיפול מבוסס שלפוחית חוץ-תאית (EV) עשוי לשפר את יעילות הטיפולים בסרטן, כפי שהוכח במחקרים שהתמקדו בסרטן השד והריאות12,13. הגישה הטיפולית CAR-EV מתייחסת למגבלות הנוכחיות של טיפול CAR, כגון אתגרי אספקה ורעילות נלווית, תוך מינוף התאימות הביולוגית ויכולות המיקוד של רכבים חשמליים. שילוב שיטות אלה עשוי להקל על פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לסרטן, ולהרחיב את ההזדמנויות ליישום EVs בסביבה קלינית. בנוסף, הנדסה והעשרה של EVs פונקציונליים מספקים שיטה בטוחה יותר (באמצעות אנקפסולציה של מטען ציטוליטי) ומדויקת יותר (כלומר, הוספת תחומי מיקוד) להעברת מטען טיפולי, במיוחד למקומות מאתגרים כגון ליבת הגידול, מח העצם ואזורים המוגנים על ידי מחסומים כמו מחסום דם-מוח או מחסום דם-אשך 14,15,16. למרות השיטה המבוססת היטב של העשרת EV באמצעות אולטרה-צנטריפוגה, נותרו מספר מגבלות. אילוצים בולטים כוללים: מדרגיות, בידוד משותף של זיהומים ותפוקה מוגבלת לאחר הייצור17. יש צורך ברור בתהליכים משופרים ליצירת רכבים חשמליים טיפוליים בקנה מידה גדול.

מחקר הוכחת היתכנות זה מדגים כי IEX היא שיטה ניתנת להרחבה ויעילה לייצור, בידוד והעשרה של CAR-EVs פונקציונליים, תוך שימוש ב-CM מובהר מתאים המבטאים CAR כקלט. IEX מאפשרת עיבוד בתפוקה גבוהה ותומכת הן במחקר והן בייצור בקנה מידה של cGMP, מה שמאפשר בקרת איכות לאורך כל זרימת העבודה - מייצור EV ועד לבדיקת מוצר התרופות הסופי18,19. בעוד שאפיון EV חיוני לאישור התפקוד, התשואה יכולה להשתנות באופן משמעותי עקב הבדלים בנפח הדגימה, ריכוז הקלט והמאפיינים הספציפיים ל-EV כגון מטען פני השטח ומאפייני הכריכה. נתונים פנימיים המשתמשים בתאי MCF-7 מראים תשואה ממוצעת לפני הטיהור של ~2.85 × 108 חלקיקים למ"ל, כאשר ריכוזים לאחר הטיהור נעים בדרך כלל בין 3 × 1011 ל-1 × 1012 חלקיקים למ"ל. ניתן לכוונן רמות אלו על ידי שינוי נפח ההשעיה מחדש במהלך החלפת המאגר כך שיתאים לצרכים במורד הזרם. בהתחשב בשונות זו, מומלץ מאוד למשתמשים לבצע אופטימיזציה של הפרוטוקול עם CM הרלוונטי להגדרת הניסוי שלהם, כדי להבטיח תשואות ניתנות לשחזור וחזקות.

מספר שלבים בפרוטוקול הם קריטיים לייצור מוצלח של רכבי CAR-EV, עם דגש מיוחד על שלבי העמסת הדגימה והפליטה. שלבים אלה משפיעים ישירות על היעילות של לכידת EV על ידי העמודה וכתוצאה מכך על התשואה הכוללת. שלב החלפת המאגר הוא קריטי, מכיוון שהסרה לא מלאה של מומסים עודפים עלולה לפגוע ביציבות EV, ולהוביל להתדרדרות לאורך זמן. לאחר מכן ניתן לאפיין רכבים חשמליים על ידי שימוש בשיטות כגון NTA או פרופיל פרוטאומי. אם רכבי CAR-EV מיועדים לבדיקות פונקציונליות, כגון מחקרי קליטה תאית או התערבויות טיפוליות, יש חשיבות עליונה לסטריליות. שלב עיקור 'טרמינלי' אחרון (0.22 מיקרומטר) חיוני למניעת זיהום מיקרוביאלי, שעלול לבלבל את תוצאות הניסוי או להוות סיכוני בטיחות ביולוגית. בהתחשב בגורמים אלה, מומלץ מאוד למשתמשים לנקוט משנה זהירות במהלך שלבים אלה כדי לשמור על יכולת השחזור והשלמות התפקודית של הכנת ה-EV הסופית.

ייתכן שיהיה צורך במספר שינויים בפרוטוקול כדי לטפל בבעיות נפוצות שנתקלים בהן במהלך ייצור CAR-EV. תפוקה נמוכה נגרמת לרוב על ידי העמסה לא אופטימלית של CM, החורגת או נופלת מיכולת הכריכה של העמודה. כדי לקבוע את נפח הקלט האופטימלי, רצוי לבצע מחקר טיטרציה של CM, להגדיל בהדרגה את העומס כדי לזהות את נקודת ההתאוששות המקסימלית של EV. סתימת מסנן, הנצפית בדרך כלל במהלך שלב הסינון הסטרילי האחרון, נובעת לרוב מריכוז וצמיגות מוגזמים של הדגימה, מה שעלול לקדם צבירת EV. במקרים כאלה, מומלץ לדלל את הכנת ה-EV הסופית. אם הדילול אינו אפשרי, ניתן לבצע סינון סטרילי לפני החלפת המאגר; עם זאת, גישה זו מחייבת שכל הצעדים הבאים יבוצעו בתנאים אספטיים מחמירים כדי לשמור על סטריליות.

הפיתוח של EVs כתרופות לסרטן דורש תהליכי ייצור הניתנים לשחזור ואימות חזק של יעילותם כנגד קווי תאי סרטן מטרה. מגבלה נפוצה של IEX בהעשרת EV היא בידוד משותף של חלקיקים שאינם EV - אתגר הניתן לזיהוי באמצעות ניתוח במורד הזרם של סמנים ספציפיים ל-EV, וניתן להפחתה באמצעות אופטימיזציה נוספת של CM. אפיון שחרור בקרה של EVs צריך לכלול: NTA לקביעת מספר וגודל החלקיקים, וריכוז EV לאחר העשרה; ניתוח גנטי ותעתיק של ביטוי מבנה CAR; קביעת ביטוי חלבון תאי וחלבון EV של ה-CAR, סמנים ביולוגיים קנוניים של EV וסמנים ציטוליטיים (למשל, גרנזים B ופרפורין); והשפעות על המטרה ומחוצה לה. שילוב טכניקות נוספות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM), יספק אימות מורפולוגי להשלמת אפיון מבוסס גודל, ויתמוך בניתוח מקיף יותר. כדי לשמור על בקרת איכות, מוצרי EV צריכים לעבור בדיקות מיקופלזמה וזיהום אנדוטוקסין כדי לוודא סטריליות והתאמה לייצור קליני. השימוש בתכשירים מתאימים לאחסון לטווח ארוך של רכבי CAR-EV פונקציונליים עשוי להציע הזדמנויות לשיפור יציבותם, כולל שמירה על איכות, כמות ויעילות טיפולית. הערכה עקבית של ביצועים פונקציונליים חיונית להבטחת שלמות המוצר. יש לציין כי בדיקת MTS המשמשת במחקר זה מציעה הערכה עקיפה של ציטוטוקסיות באמצעות מדידת פעילות מטבולית. מחקרים עתידיים יפיקו תועלת משילוב מבחני ציטוטוקסיות סטנדרטיים, כגון שחרור לקטט דהידרוגנאז (LDH), צביעת Annexin V/PI או פרופיל הפעלת קספאז, כדי לתאר את ההשפעות הציטוטוקסיות בצורה מדויקת יותר. יתר על כן, שילוב משווים של תאי CAR (שאינם משולבים במחקר הנוכחי בשל מגבלות מקור) לבד או בשילוב עם CAR-EVs, וכולל טיפול מקביל בקווי תאי בקרה שאינם סרטניים, יכול להעמיק את הערך הפרשני של הממצאים.

מחקר זה מדגיש את השימוש הפוטנציאלי ברכבי EGFR/HER2 CAR EVs כאסטרטגיה טיפולית בת קיימא לסוגי סרטן ספציפיים. ניתן להשיג שיפור היעילות של CAR EVs באמצעות מינון מרובה או הפעלה מוקדמת של תאי T אב כדי להגביר את הציטוטוקסיות. יתר על כן, התקדמות בגישות מתפתחות, כגון מטעני siRNA, ושיפורים ביכולת הקישור של EGFR/HER2 מהווים הזדמנויות לחדד את העיצוב של פלטפורמות טיפוליות אלה20,21. היישום המבטיח של קולטני אנטיגן כימריים כפולים (dual-CARs) בטיפול תאי מציע הזדמנות נוספת להתקדמות. הרחבת השימוש ב-CARs כפולים על ידי שימוש בעמיתיהם EV בטיפולים יכולה להיות צעד מרכזי בהרחבת ההיקף הטיפולי שלהם ושיפור שיטות הטיפול22,23. ניטור בזמן אמת של ציטוטוקסיות של תאי סרטן מונעי CAR EV (למשל, הפעלת קספאז 3/7, קריאת עכבה) מספק תובנות חשובות לקביעת משטרי מינון אופטימליים, מה שמקל על תרגום יעיל ליישומי in vivo עתידיים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Asari K, Chelvaretnam C, Mom KT, Bhuiyan S, Pham Q, Fitri A, Palma C, Shojaee M, Khanabdali R, Hinch L ו-Rice G הם עובדי INOVIQ Ltd.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לסיינה ברטון, היבה ראשיד, שרה ניקסרשט, שיאליני ויגנראג'ה ואבל סוג'ייב על תרומתם למעבדה. המחברים מודים לכל משתפי הפעולה הפנימיים והחיצוניים, כאשר מחקר זה נתמך וממומן על ידי INOVIQ Ltd.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים
1x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), pH 7.4ג'יבקו10010049העשרת EV
1% נתרן דודציל סולפט (SDS)סיגמאL3771-100Gממיסים 1 גרם אבקת SDS ב-10 מ"ל מים טהורים במיוחד
1x תמיסת מלח חוצצת Tris עם Tween-20 (TBST)כימיקלים תרמו סיינטיפיקJ77500. K2לדלל במים טהורים במיוחד ליצירת תמיסה 1x (לחלופין, הכינו תמיסת פוליסורבט-20/Tween-20 0.1% במי מלח 1x tris)
96 בארות מיקרופלייט פוליסטירן תחתון שטוח מטופל TC, סטריליקורנינג3595in vitro מבחן פונקציונלי
ג'ל חלבון מיני Bolt Bis-Tris Plus, 4-12%, 1.0 מ"מ, פורמט WedgeWellInvitrogenאפיון תא/EV
אלבומין סרום בקרסיגמא-אולדריץ'A9647-100Gאפיון תא/EV
נוגדן קלנקסיןאיתות תאיםשנת 2433אפיון תא/EV
תאי CAR-NK/TProMab ביוטכנולוגיותמשתנהתחום קשירת ליגנד חוץ-תאי CAR תלוי במטרה המועדפת על תאי הנמען
CellTiter 96 AQueous One Solution בדיקת התפשטות תאים (MTS)פרומגהG3580in vitro מבחן פונקציונלי
cOmplete, קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTAרוש11836170001ליזה של תאים
מגיב לזיהוי כתמים מערביים של ECLאמרשםRPN2232אפיון תא/EV
מאגר סילוקאינוביקהעשרה/בידוד EV
מאגר שיווי משקלאינוביקהעשרה/בידוד EV
עמודת EXO-ACE IEXאינוביקהעשרה/בידוד EV עבור בדיקה פונקציונלית במורד הזרם
מזהה פטנט AU2024901931
EXO-NET חרוזי לכידת פאן-אקסוזוםאינוביקבידוד EV לאפיון במורד הזרם
מזהה פטנט WO/2014/011673
נוגדן Granzyme Bאיתות תאים4275אפיון תא/EV
IL-2 אנושי IS, דרגת פרימיוםמילטני ביוטק130-097-744תרבית נטולת קסנו של תאי T/NK
ערימות העברה iBlot 2, PVDFInvitrogenאפיון תא/EV
ImmunoCult-XF (cGMP)טכנולוגיות תאי גזע100-0956תרבית נטולת קסנו של תאי T/NK
ק-562ATCCCCL-243in vitro מבחן פונקציונלי
MCF-7ATCCHTB-22in vitro מבחן פונקציונלי
יחידת מסנן מזרק Millex-GP, 0.22 ומיקרו; mמרק מיליפורSLGPR33RSסינון מסוף
מאגר התחדשותאינוביקהעשרה/בידוד EV
מאגר RIPA (פי 10)טכנולוגיית איתות תאים9806ליזה של תאים
תמיסת טריפאן כחולה, 0.4%ג'יבקו15250061הערכת כדאיות וצפיפות התאים
מאגר כביסהאינוביקהעשרה/בידוד EV
<חזק>ציוד
מונה תאים אוטומטיInvitrogenהרוזנת השנייה פלורידההערכת כדאיות וצפיפות התאים
מכשיר חילוץ אוטומטי על שולחןInvitrogenמערכת KingFisher Apexמערכת טיהור אוטומטית בתפוקה גבוהה
ראה קישור לפרטי פרוטוקול: https://www.inoviq.com/site/technology/resources
מיקרוסקופ פלואורסצנטיצייסאקסיו אובזרבר 7תרבית תאים
ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA)Particle Metrix GmbHזטאוויו PMX-130ניתוח חלקיקים
קורא צלחותב.מ.ג. לאבטקספקטרוסטאר ננוin vitro מבחן פונקציונלי
צנטריפוגה ספסל בקירורבקמן קולטראוונטי J-15Rתרבית תאים & עיבוד העשרת EV
מיכל ג'ל מיני SDS-PAGEInvitrogenא25977אפיון תא/EV
מערכת העברת כתמים מערבייםInvitrogenאייבלוט 2אפיון תא/EV

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J. H., Geyer, M. B., Brentjens, R. J. CD19-targeted CAR T-cell therapeutics for hematologic malignancies: Interpreting clinical outcomes to date. Blood. 127 (26), 3312-3320 (2016).
  2. Jain, M. D., Smith, M., Shah, N. N. How I treat refractory CRS and ICANS following CAR T-cell therapy. Blood. 141 (20), 2430-2442 (2023).
  3. Tang, X. J., et al. Therapeutic potential of CAR-T cell-derived exosomes: A cell-free modality for targeted cancer therapy. Oncotarget. 6 (42), 44179-44190 (2015).
  4. St-Denis-Bissonnette, F., et al. A clinically relevant large-scale biomanufacturing workflow to produce natural killer cells and natural killer cell-derived extracellular vesicles for cancer immunotherapy. JEV. 12 (12), e12387(2023).
  5. Jiang, Y., et al. Hypoxia enhances the production and antitumor effect of exosomes derived from natural killer cells. Ann Transl Med. 9 (6), 473-473 (2021).
  6. Decot, V., et al. Natural-killer cell amplification for adoptive leukemia relapse immunotherapy:comparison of three cytokines IL-2, IL-15, or IL-7 and impact on NKG2D, KIR2DL1, and KIR2DL2 expression. Exp Hematol. 38 (5), 351-362 (2010).
  7. Kim, I. Y., et al. Functional enhancement of exosomes derived from NK cells by IL-15 and IL-21 synergy against hepatocellular carcinoma cells: The cytotoxicity and apoptosis in vitro study. Heliyon. 9 (6), e16962-e16962 (2023).
  8. Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. J Vis Exp. (95), e50974(2015).
  9. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis-an accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. JEV. 8 (1), 1596016(2019).
  10. Khanabdali, R., et al. High throughput surface epitope immunoaffinity isolation of extracellular vesicles and downstream analysis. Biol Methods Protoc. 9 (1), bpae032(2024).
  11. Salomon, C., et al. Early detection of ovarian cancer: An accurate high-throughput extracellular vesicle test. J Clin Oncol. 43 (16_suppl), 5582-5582 (2025).
  12. Fu, W., et al. CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity. Nat Commun. 10 (1), 1-12 (2019).
  13. Zheng, W., et al. Inhalable CAR-T cell-derived exosomes as paclitaxel carriers for treating lung cancer. J Transl Med. 21 (1), 383(2023).
  14. Tian, J., et al. Engineered exosome for drug delivery: Recent development and clinical applications. Int J Nanomed. 18, 7923-7940 (2023).
  15. Chen, Z., et al. Encapsulation and assessment of therapeutic cargo in engineered exosomes:a systematic review. J Nanobiotechnology. 22 (1), 18(2024).
  16. Basyoni, A. E., Atta, A., Salem, M. M., Mohamed, T. M. Harnessing exosomes for targeted drug delivery systems to combat brain cancer. Cancer Cell Int. 25 (1), 150(2025).
  17. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Curr Protoc Cell Biol. 88 (1), e110(2020).
  18. Zhang, W., et al. Large-scale separation and purification of exosomes using ion-exchange chromatography. Biomed Res Ther. 11 (4), 6348-6356 (2024).
  19. Fernandes, R. P., et al. Targeted isolation of extracellular vesicles from cell culture supernatant using immuno-affinity chromatography. Sep Purif Technol. 358 (Part A), 130312-130312 (2024).
  20. Jiang, J., et al. Anti-EGFR ScFv functionalized exosomes delivering LPCAT1 specific siRNAs for inhibition of lung cancer brain metastases. JNB. 22 (1), 159(2024).
  21. Dobersberger, M., et al. An engineering strategy to target activated EGFR with CAR T cells. Cell Rep Methods. 4 (4), 100728-100728 (2024).
  22. Shi, M., et al. Bispecific CAR T cell therapy targeting BCMA and CD19 in relapsed/refractory multiple myeloma:a phase I/II trial. Nat Commun. 15 (1), 3371(2024).
  23. Roddie, G., Amrolia, P. J. Dual targeting CAR-T cells for B-cell acute lymphoblastic leukaemia and B-cell non-Hodgkin lymphoma. Blood Adv. 9 (4), 704-721 (2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CARGMPRNACAR EGFRCAR HER2

מאמרים קשורים