הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שתלי שומן לבנים וחומים: גישה לתיקון ליקויים רבייתיים, מטבוליים וכלייתיים בעכברים שמנים שחורים ושזופים (BTBR)

1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68759

⸱

9 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Albert Einstein Research and Education Institute, Hospital Israelita Albert Einstein, 2School of Medicine, Faculdade Israelita de Ciências da Saúde Albert Einstein, 3Nephrology Division, Federal University of São Paulo

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול השתלת רקמת שומן לבן וחום המציע אסטרטגיה מבטיחה להיפוך תת-פוריות, השמנת יתר והיפרגליקמיה, תוך שיפור תפקוד הכליות בעכברי BTBR סוכרתיים והשמנת יתר.

תקציר

השתלת רקמת שומן לבנה (WAT) ורקמת שומן חומה (BAT) התגלתה כאסטרטגיה טיפולית מבטיחה להיפוך הפרעות מטבוליות ללא צורך במתן מתמשך של חומרים אקסוגניים. WAT מתפקד כאיבר אנדוקריני מרכזי המעורב בהומאוסטזיס אנרגטי, בעוד ש-BAT היא רקמה תרמוגנית קריטית לוויסות חום. מודל העכברים השמנים Black and Tan Brachyuric (BTBR) מחקה מקרוב מאפיינים מרכזיים של השמנת יתר, סוכרת מסוג 2 (T2DM) ומחלת כליות סוכרתית (DKD), כולל היפרגליקמיה, עמידות לאינסולין, היפומטבוליזם ותת-פוריות.

באמצעות הפרוטוקול המוצג להלן, השתלה משולבת של WAT ו-BAT שמקורם בתורמים מסוג BTBR והטרוזיגוטים למושתלי BTBR שמנים הביאה להיפוך תת-פוריות, הנחתה של עלייה במשקל, נורמליזציה של בקרה גליקמית ושיפור פרמטרים כלייתיים. יש לציין כי היפרטרופיה כלייתית ואפופטוזיס הופחתו, בעוד שמספר הפודוציטים נשמר. ממצאים אלה מצביעים על כך שהשתלת WAT ו-BAT משולבת עשויה לייצג אסטרטגיה טיפולית חלופית לטיפול בסוכרת מסוג 2, עם יתרונות מקבילים בהפחתת DKD והשמנת יתר. יתר על כן, גישה זו עשויה לסייע בהגדלת מספר העכברים השמנים BTBR ברי קיימא בתוך מושבות הוויווריום. חקירה נוספת של המנגנונים הבסיסיים עשויה להקל על התרגום הקליני של התערבות זו.

מבוא

מחלת כליות סוכרתית (DKD), סוכרת מסוג 2 (T2DM) והשמנת יתר מייצגים מצבים רב-גורמיים הקשורים זה בזה המהווים אתגרים בריאותיים גלובליים משמעותיים וגדלים. DKD, המוגדר כדו-קיום של סוכרת (DM) ומחלת כליות כרונית בהיעדר גורמים אחרים הניתנים לזיהוי לנזק לכליות, משפיע על כ-20-40% מהאנשים עם סוכרתסוכרת 1,2. T2DM היא הפרעה מטבולית מערכתית המאופיינת בהיפרגליקמיה כרונית ושיבושים בהומאוסטזיס של גלוקוז, שומנים ואינסולין. הוא מדורג בין עשרת גורמי התמותה המובילים ברחבי העולם, ומשפיע כיום על למעלה מ-500 מיליון אנשים3. השמנת יתר, המונעת על ידי חוסר איזון כרוני בין צריכת האנרגיה להוצאה, משפיעה כיום על אחד מכל שמונה אנשים ברחבי העולם והיא תורמת מרכזית הן לתחלואה והןלתמותה. שלושת המצבים הללו קשורים זה בזה באופן הדוק: השמנת יתר מגדילה באופן ניכר את הסיכון לפתח סוכרת מסוג 2, אשר, בתורו, מעלה משמעותית את הסיכון ל-DKD 1,4. השכיחות העולמית הגוברת של השמנת יתר, T2DM ו-DKD מדגישה את הצורך הדחוף בהבנה עמוקה יותר של המנגנונים הפתופיזיולוגיים שלהם ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות יעילות.

השתלת BAT התגלתה כאסטרטגיה טיפולית מבטיחה למאבק בהשמנת יתר ובסוכרת מסוג 2. התערבות זו נקשרה להפחתת משקל הגוף, שיפורים בתנגודת לאינסולין וסטיאטוזיס בכבד, ועלייה באדיפונקטין במחזור הדם, ביטוי קולטן β3-אדרנרגי וגנים המעורבים בחמצון חומצות שומן5. יש לציין, ניתן לסווג רקמת שומן של יונקים לשלושה סוגים עיקריים על סמך צבע: לבן, חום ובז'6. WAT מתחיל להתרחב זמן קצר לאחר הלידה ומופץ באופן נרחב בכל הגוף. הוא מתפקד כאיבר אנדוקריני מרכזי, אוגר עודף אנרגיה בצורה של טריגליצרידים על ידי קיבוע גלוקוז במחזור וחומצות שומן חופשיות6. לעומת זאת, BAT ממלא תפקיד קריטי בוויסות חום על ידי פיזור אנרגיה כחום באמצעות תרמוגנזה שאינה רועדת במקום לאחסן אותה כ-ATP6. פעילות BAT פוחתת עם הגיל, השמנת יתר וסוכרת. אצל מבוגרים, BAT מהווה חלק קטן מכלל רקמת השומן וממוקם בעיקר באזורים הסופרקלביקולרים וצוואר הרחם בבני אדם, בעוד שבעכברים הוא ממוקם בעיקר באזור הבין-שכמה6. עשיר במיטוכונדריה, BAT צורך כמויות משמעותיות של גלוקוז וחומצות שומן וקשור לעמידות לעלייה במשקל7. עדויות מתפתחות תומכות בתפקידו של BAT בקידום פנוטיפ רזה וחיובי יותר מבחינה מטבולית, מה שיוצר עניין גובר בשימוש הטיפולי בו באמצעות השתלה.

לפטין, הורמון המופרש בעיקר על ידי WAT, ממלא תפקיד מרכזי בוויסות מאזן האנרגיה, חילוף החומרים והפוריות8. הוא פועל על מערכת העצבים המרכזית כדי לעורר הפרשת הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH) בהיפותלמוס, מה שמקדם לאחר מכן את שחרור ההורמון הלוטניזציה (LH) וההורמון המגרה זקיק (FSH) מהיפופיזההקדמית 9. לפטין פועל גם ישירות על תאי תאקה וגרנולוזה בשחלות כדי לתמוך בהתפתחות זקיקים9.

מודל העכברBTBR ob/ob (BTBR obese), המוגדר גנטית כ-BTBR. Cg-Lep ob/WiscJ (שחור ושזוף, השמנת יתר, ציצית; ראה טבלת חומרים), הוא הומוזיגוטי לאובדן תפקוד ספונטני בגן הלפטין (Lep) ומציג מגוון של הפרעות מטבוליות ורבייה, כולל היפרגליקמיה, אי סבילות לגלוקוז, היפראינסולינמיה, היפרטריגליצרידמיה, פגיעה בריפוי פצעים, היפומטבוליזם, היפותרמיה ותת-פוריות עקב היפוגונדיזם היפוגונדוטרופי. זכרים מפתחים בדרך כלל סוכרת מסוג 2 עד גיל שישה שבועות, בעוד שהנקבות מפתחות זאת בגיל שמונה שבועות10. היפרגליקמיה היא חמורה ומתקדמת, כאשר רמות הגלוקוז בדם בצום עולות על 400 מ"ג/ד"ל עד עשרה שבועות. בנוסף, זכרים שמנים BTBR מציגים אלבומינוריה תלוית זמן בשבוע השמיני, ומתקדמים ל-DKD ניכר מבחינה היסטולוגית, כולל התרחבות מזנגיאלית ופודוציטוריה. תכונות אלה מבססות עכברים שמנים BTBR כמודל פרה-קליני חזק המסכם מקרוב את DKD10 האנושי.

בהתחשב בהשלכות המטבוליות העמוקות של מחסור בלפטין, נחקרו מספר אסטרטגיות להיפוך פנוטיפ ה-ob/ob , כולל טיפול בתחליפי לפטין והשתלת רקמת שומן. בעוד שרוב המחקרים השתמשו בעכברי ob/ob על רקע C57BL/6, מעטים יחסית חקרו התערבויות אלה בזן BTBR שנפגע יותר מבחינה מטבולית. בעכברי C57BL/6 ob/ob , השתלת WAT הוכחה כמנרמלת את רמות האינסולין, משפרת את הרגישות לאינסולין ומחזירה את הפוריות8. יתר על כן, השתלת BAT בעכברים רזים C57BL/6 הוכחה כמונעת עלייה במשקל הגוף, משפרת את הסבילות לגלוקוז ואת הרגישות לאינסולין, תוך הפחתת תנגודת לאינסולין, במיוחד בהקשר של השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה עתירת שומן11. בנוסף, השתלת BAT הוכחה כמשפרת את ההמודינמיקה הלבבית ואת הבריאות המטבולית12. למרות התוצאות המעודדות, מחקרים אלה מציגים מספר מגבלות חשובות. רוב המחקרים נערכו בעכברי C57BL/6 ob/ob , המציגים פנוטיפ מטבולי קל יחסית בהשוואה לזן BTBR ob/ob שנפגע בצורה חמורה יותר. כתוצאה מכך, יכולת ההכללה של ממצאים אלה למודלים עם עמידות בולטת יותר לאינסולין, היפרגליקמיה, השמנת יתר ומחלות כליות מוגבלת. יתר על כן, ההשפעות של החלפת לפטין והשתלת רקמת שומן לא נחקרו מספיק ברקע BTBR, מה שמייצג פער קריטי בספרות. רבות מההתערבויות הללו הוערכו גם בבעלי חיים רזים או לפרקי זמן קצרים, מה שאולי לא לוכד כראוי את המורכבות והאופי הכרוני של מחלות מטבוליות אנושיות. למרות שדווח על שיפורים ברגישות לאינסולין, סבילות לגלוקוז ופוריות, המנגנונים הבסיסיים נותרו לא מובנים היטב, והרלוונטיות התרגומית של ממצאים אלה למסגרות קליניות עדיין אינה ודאית. יש לציין כי ההשפעות המטבוליות המשולבות של השתלת רקמת שומן לבנה וחומה בעכברי BTBR ob/ob נותרו ברובן לא נחקרו.

מטרת מחקר זה היא לתקנן פרוטוקול להשתלת WAT ו-BAT משולבת בעכברים שמנים BTBR ולהעריך את השפעותיו על שיקום פוריות, תפקוד כליות ושינויים היסטולוגיים. מטרה משנית היא להקל על התרחבות מושבת השמנת היתר BTBR, תוך הפחתת אובדן עכברים הטרוזיגוטיים (BTBR ob/+) ועכברים מסוג בר (BTBR +/+) בוויווריום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים ישראליטה אלברט איינשטיין (HIAE) ונרשמו במכון היהודי למחקר וחינוך, סאו פאולו, ברזיל (מס' 3309-18 ומס' 4900-21). פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

הערה: עכברים שמנים BTBR (נוקאאוט גן לפטין, הומוזיגוט, ob/ob) שימשו כמודל לסוכרת מסוג 2, DKD והשמנת יתר. נקבות עכברי BTBR שמנים בגילאי 4-5 שבועות שימשו כמושתלות להשתלת רקמת שומן. בעלי החיים התורמים היו נקבות BTBR ob/+ (הטרוזיגוט) או +/+ (סוג בר) (גנוטיפ לא מאושר, אך רזה פנוטיפית). בזמן ההשתלה, לעכברים המקבלים היה משקל גוף ממוצע שנע בין 25 ל-32 גרם. כל בעלי החיים שוכנו בכלובים מאווררים בנפרד בתנאים סטנדרטיים, עם גישה אד-ליביטום למזון ומים, מחזור אור/חושך של 12 שעות ובקרת טמפרטורת הסביבה. לכל היותר חמישה בעלי חיים שוכנו בכל כלוב.

1. הליך כירורגי

  1. המתת חסד של עכברים תורמים באמצעות מנת יתר של 100% v/v isoflurane (2.5-5%), ואחריה פריקת צוואר הרחם (איור 1A).
  2. מקם את בעל החיים בשכיבה גבית (בטן למעלה) וחטא את הבטן התחתונה עם 0.5% כלורהקסידין דיגלוקונאט אלכוהולי. בצע חתך בקו האמצע של 2-3 ס"מ בבטן כדי לקצור WAT מפשעתי (איור 1B). מניחים את הרקמה הכרותה בצינור של 3 מ"ל על קרח.
  3. מקם מחדש את החיה בשכיבה גחונית (בטן למטה) ובצע חתך בקו האמצע של 1-2 ס"מ בין עצם השכמה כדי לקצור BAT בין-שכמה (איור 1C). מאגר רקמת שומן מ-10-14 תורמים. ודא שסך ה-WAT + BAT שווה ל-10-15% ממשקל הגוף של המקבל.
  4. הומוגניזציה של WAT ו-BAT בנפרד באמצעות מחט 16 גרם ומזרק 3 מ"ל (איור 1D).
  5. מדדו את משקל השומן הסופי באמצעות איזון אנליטי (איור 1E) ושמרו דגימות על קרח עד להשתלה.
  6. להרדים עכברים שמנים BTBR מושתלים בתא איזופלורן 100% v/v (אינדוקציה של 2.5-5%) ולשמור על הרדמה באמצעות מסכת פנים (1.5-2.5%). ברגע שהנשימה יורדת ל-≤1 נשימה כל 3 שניות, הניחו את החיה בשכיבה גחונית (איור 1F).
  7. חיטוי אזור הגב באמצעות 2.0% כלורהקסידין דיגלוקונאט לא אלכוהולי (איור 1G).
  8. יש להזריק 100-200 מיקרוליטר של שומן הומוגני לכל אתר באמצעות מחט של 16 גרם על פני 6-26 אתרים על פני השטח הגב. השתמש במלקחיים כדי לסייע בהפצה. יש למרוח תמיסת כלורהקסידין של 0.5% על כל אתר הזרקה לאחר ההשתלה (איור 1H).
  9. יש לתת מינון תוך שרירי של טרמדול (40 מ"ג/ק"ג; תמיסה של 50 מ"ג/מ"ל) לשיכוך כאבים וחיות בית בנפרד כדי למנוע פציעה במהלך ההחלמה.
  10. למחרת יש לנקות את אתרי ההזרקה בתמיסת כלורהקסידין 0.5% ולתת מנה שנייה של טרמדול.

figure-protocol-1
איור 1: סכמטי של הליך השתלת השומן. (A) המתת חסד של תורם באמצעות איזופלורן בקופסה סגורה. (ב) קציר WAT מפשעתי. (ג) קציר של BAT בין-שכמי. (D) הומוגניזציה של שומן. (E) שקילת שומן. (ו) הרדמה מקבלת. (ז) אספסיס אחורי. (H) הזרקת שומן בטכניקה בעזרת מלקחיים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. הזדווגות לאחר ההשתלה

  1. שבועיים לאחר ההשתלה, עכברי BTBR שמנים נקבות עם עכברי BTBR ob/+ זכרים (הטרוזיגוטים) להזדווגות.

3. הערכות תפקודיות

  1. מדוד את משקל הגוף מדי שבוע באמצעות איזון אנליטי.
  2. העריכו את רמת הגלוקוז בדם בצום באמצעות גלוקומטר בחמש נקודות זמן: שבועות 4-7, 8-10, 14-16, 18-20 ו-24-26.
  3. הנח את החיה בכלוב מטבולי עם גישה למים למשך 6 שעות, כדי לאסוף דגימת שתן.
  4. למדוד את רמות האלבומין בשתן בשיטת ELISA ולקבוע את רמות הקריאטינין בשתן בשיטת חומצה פיקרית קולורימטרית בגיל 6-8 שבועות. חשב את יחס האלבומין לקריאטינין בשתן (uACR) על ידי חלוקת ריכוז האלבומין (מיקרוגרם) בריכוז הקריאטינין (מ"ג).

4. ניתוח מורפולוגי

  1. המתת חסד של עכברים בגיל 24 שבועות על ידי מתן מנת יתר של 100% v/v isoflurane (2.5-5%), ולאחר מכן פריקת צוואר הרחם כדי להבטיח מוות.
  2. אסוף שחלות, כליות ולבלב בגיל 24 שבועות.
  3. מניחים את האיברים שנקטפו בפורמלין ניטרלי של 10% ומקבעים בטמפרטורת החדר למשך 24-48 שעות.
  4. לאחר הקיבוע, יש לעבד רקמות באמצעות מעבד רקמות אוטומטי להסרת מים ולהטמיע בפרפין לניתוח היסטולוגי.
    1. טבלו את הרקמות ברצף בתמיסות האתנול הבאות למשך שעה כל אחת: 70%, 85%, 95% (2x) ו-100% (2x).
    2. העבירו את הרקמות לקסילן טרי למשך שעה אחת, ולאחר מכן אמבט קסילן שני למשך שעה נוספת.
    3. טבלו את הרקמות בשעוות פרפין מומסת בטמפרטורה של 6 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן העבירו לפרפין טרי למשך שעה נוספת.
    4. כוונו את הרקמות בתבנית מחוממת מלאה בפרפין מותך והניחו להתמצק בטמפרטורת החדר.
    5. חותכים ארבעה חלקים לא רצופים בעובי 3.5 מיקרומטר מכל בלוק באמצעות מיקרוטום. צף את הסרטים על אמבט מים של 4 מעלות צלזיוס כדי לשטח, ולאחר מכן הרכיב חלקים בודדים על מגלשות זכוכית טעונות חיובית. מסננים עודפי מים ומניחים שקופיות על צלחת חימום של 3 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
  5. העריכו את מספר הזקיקים בשחלות ובגודל אי הלבלב באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E).
    1. דגרו על שקופיות רקמה משובצות פרפין בתנור בטמפרטורה של 6 מעלות צלזיוס למשך שעה. העבירו את השקופיות למיכל עם קסילן טרי ודגרו למשך 30 דקות להמסת פרפין, והחליפו את הקסילן בתמיסה טרייה לאחר 15 דקות.
    2. טבלו שקופיות ברצף במשך 30 שניות כל אחת בתערובת קסילן: אתנול, 100% אתנול, 85% אתנול ו-70% אתנול.
    3. שוטפים במי ברז (10 שניות), מכתימים בהמטוקסילין האריס (30 שניות) וטובלים באתנול 95% (3 שניות).
    4. טבלו את השקופיות ברצף בתערובת של 70%, 85%, 100% אתנול וקסילן: אתנול למשך 30 שניות כל אחת.
    5. טבלו את השקופיות בקסילן טרי למשך 5 דקות, ולאחר מכן אמבט קסילן שני למשך 5 דקות נוספות כדי להבטיח קיבוע כתמים.
    6. הרכיב מגלשות עם כיסויים באמצעות מדיום הרכבה.
  6. הערך את הגודל הגלומרולרי ואת התרחבות המטריצה המזנגיאלית באמצעות צביעת חומצה-שיף תקופתית (PAS) של חלקי כליה.
    1. דגרו על מגלשות בטמפרטורה של 6 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת וטבלו בקסילן טרי למשך 5 דקות כדי להפחית את חלקי הרקמה.
    2. טבלו ברצף שקופיות באתנול של 99%, 95% ו-70% למשך 30 שניות כל אחת.
    3. שוטפים במי ברז למשך 10 שניות.
    4. מרחו 10 טיפות חומצה תקופתית ודגרו למשך 10 דקות.
    5. שוטפים במים זורמים למשך 3 דקות ומייבשים.
    6. מוסיפים 10 טיפות מגיב שיף ודוגרים למשך 15 דקות בתא חשוך.
    7. שוטפים במים זורמים למשך 3 דקות ומייבשים.
    8. יש להוסיף 10 טיפות של המטוקסילין האריס לכתמים נגדיים ולדגירה למשך 3 דקות.
    9. שוטפים את המגלשות במים זורמים למשך 3 דקות ומייבשים.
    10. טבלו את השקופיות ברצף בתערובת של 70%, 85%, 100% אתנול וקסילן: אתנול למשך 30 שניות כל אחת.
    11. טבלו את השקופיות בקסילן טרי למשך 5 דקות, ולאחר מכן אמבט קסילן שני למשך 5 דקות נוספות כדי לתקן את הכתם.
    12. הרכיב מגלשות עם כיסויים באמצעות מדיום הרכבה.
  7. להעריך אפופטוזיס זקיקי (קספאז-3 שסוע) בשחלות ובכליות, ומספר הפודוציטים (תאי WT-1+) בכליות על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC).
    1. דגרו את המגלשות בטמפרטורה של 6 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן טיפול בקסילן למשך 30 דקות (החלף קסילן לאחר 15 דקות).
    2. טבלו את המגלשות ברצף ב-100%, 90% ו-70% אתנול ומים (30 שניות כל אחד).
    3. בצע אחזור אנטיגן על ידי חימום השקופיות במאגר ציטראט (pH 6.0) ב-95 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות באמצעות מיקרוגל כדי לחשוף אתרי אנטיגן.
    4. יש לשטוף במאגר כביסה אחד למשך 15 דקות, ולהחליף את המאגר כל 5 דקות.
    5. חסום את הפרוקסידאז האנדוגני עם מי חמצן כדי למנוע כתמי רקע ולמנוע קשירה לא ספציפית באמצעות אלבומין בסרום בקר (BSA).
      הערה: עבור צביעת קספאז-3 שסועה, חסום פעילות פרוקסידאז אנדוגנית למשך 7 דקות ו-30 שניות; לצביעה WT-1, יש לחסום למשך 5 דקות.
    6. חזור על הכביסה כמו ב-4.7.4.
    7. יש למרוח 10 מיקרוליטר של נוגדנים ראשוניים כנגד קספאז-3 (אפופטוזיס) ו-WT-1 (פודוציטים). דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של מעלות צלזיוס בתא חשוך ולח.
    8. חזור על הכביסה כמו ב-4.7.4.
    9. יש למרוח 10 מיקרוליטר של נוגדן משני מצומד חזרת פרוקסידאז (HRP) למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר בחושך.
    10. חזור על הכביסה כמו ב-4.7.4.
    11. החל 10 מיקרוליטר של DAB (3,3'-Diaminobenzidine) ככרומוגן כדי לדמיין את פעילות HRP, וליצור משקעים חומים.
      הערה: לצביעת קספאז-3 שסועה, דגרו עם DAB למשך דקה ו-30 שניות; לצביעה WT-1, דגירה למשך 45 שניות.
    12. חזור על הכביסה כמו ב-4.7.4.
    13. קטעי כתמים נגדיים עם המטוקסילין האריס למשך 30 שניות עד דקה, תלוי בעוצמה הרצויה.
    14. יש לשטוף במי ברז למשך 1-2 דקות או עד שהמים צלולים.
    15. טבלו את השקופיות ברצף ב-70%, 85%, 95% ו-100% אתנול (30 שניות כל אחד), וקסילן: תערובת אתנול (30 שניות).
    16. מניחים את השקופיות בתמיסת קסילן טרייה למשך 5 דקות, ומעבירים לאמבטיית קסילן שנייה למשך 5 דקות נוספות.
    17. הרכיב מגלשות עם כיסויים באמצעות מדיום הרכבה.
  8. נתח קטעים מוכתמים באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך בהגדלה של פי 40. השתמש בתוכנה אוטומטית לניתוח תמונות כדי לבחור אזורי עניין (ROI) עבור כל איבר.
    1. שחלות (H&E): ספור וסווג סוגי זקיקים לכל חתך.
    2. לבלב (H&E): בחר איים באמצעות כלי החזר ההשקעה כדי לעקוב באופן ידני אחר קווי המתאר של כל אי לבלב. לאחר הגדרת ההחזר על ההשקעה, התוכנה תחשב אוטומטית את השטח במיקרומטר רבוע (מיקרומטר2).
    3. כליה (H&E): כמת את האזור הגלומרולרי על ידי בחירת כלי החזר ההשקעה כדי לעקוב באופן ידני אחר הקצה החיצוני של כל ציצית גלומרולרי. השתמש בפונקציה Measure Area כדי להשיג את השטח שלה במיקרומטר2. לאחר המעקב, התוכנה תחשב אוטומטית את השטח במיקרומטר2.
    4. כליות (PAS)
      1. כדי לכמת מטריצה מזנגיאלית, השתמש בכלי הסף כדי לזהות ולבחור אזורים חיוביים ל-PAS (מג'נטה/ורוד) בתוך הגלומרולוס. התאימו את ערכי הסף של הצבע והעוצמה לפי הצורך כדי לבחור במדויק אזורים מוכתמים ב-PAS, באמצעות חלון התצוגה המקדימה כדי למקד את הבחירה. הגדר את אזור ה-PAS שנבחר כהחזר על ההשקעה. לאחר המעקב, התוכנה תחשב אוטומטית את השטח במיקרומטר2.
      2. נרמל את הרחבת המטריצה המזנגיאלית על ידי חישוב אחוז השטח החיובי ל-PAS ביחס לשטח הגלומרולרי הכולל.
    5. שחלות וכליות (IHC לקספאז שסוע-3)
      1. בחר החזר ROI המתאים למבנים זקיקים או גלומרולריים. החילו מסיכת צבע לזיהוי כתמים חיוביים ל-DAB (חום) על-ידי התאמת סף הגוון, הרוויה והעוצמה. השתמש בפונקציית התצוגה המקדימה כדי להבטיח בחירה מדויקת של אות DAB ולחדד את הגדרות הסף כדי לא לכלול המטוקסילין (כחול), כתמים נגדיים ורקע לא ספציפי.
      2. לאחר הגדרת הסף הרצוי, הגדר את הבחירה כ-ROI ומדוד את האזור החיובי ל-DAB (מיקרומטר2). חשב את אחוז השטח המוכתם על ידי חלוקת האזור החיובי ל-DAB בשטח ההחזר הכולל על ההשקעה והכפלה ב-100.
    6. כליות (IHC עבור WT-1+): ספרו גרעינים מוכתמים בצבע חום לכל גלומרולוס כדי להעריך את מספר הפודוציטים.
      הערה: ספירת הזקיקים לקטע (ממוצע ± SD) היתה: השמנת יתר BTBR (7.7 ± 3.11), מושתלת (5.8 ± 3.24), BTBR רזה (4.6 ± 5.62). ספירת האיים לכל קטע (ממוצע ± SD) היתה: BTBR השמנת יתר (18.3 ± 8.42), מושתלים (9.7 ± 5.45), BTBR רזה (6.8 ± 1.72). להעריך 30 גלומרולי לבעל חיים עבור מדידת התרחבות שטח גלומרולרי ומטריצה מזנגיאלית. הנתונים בוטאו כממוצע ± סטיית תקן (SD) או שגיאת תקן של הממוצע (SEM), לפי הצורך. הנורמליות הוערכה באמצעות מבחן שפירו-וילק. ANOVA חד כיווני עם מבחן הפוסט הוק של טוקי יושם לצורך השוואות בין קבוצות בפיזור נורמלי. מדידות חוזרות נותחו באמצעות ANOVA דו-כיווני או מודלים של אפקטים מעורבים, עם תיקון גייסר חממה במידת הצורך. עבור נתונים שאינם מופצים באופן נורמלי, נעשה שימוש במבחן Kruskal-Wallis עם ההשוואות המרובות של Sidak. בצע את כל הניתוחים באמצעות תוכנה סטטיסטית מתאימה, עם מובהקות סטטיסטית מוגדרת ב-p <-0.05 (ראה טבלת חומרים לפרטים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כמות השומן המושתל ויעילות הפרוטוקול
לאחר סטנדרטיזציה של הפרוטוקול, הוערכו שני נפחי השתלת שומן (5-9.9% ו-10-15% ביחס למשקל הגוף של התורם) ליעילות, שהוגדרו כהשגת הריון אחד לפחות וכתוצאה מכך צאצאים ברי קיימא. קבוצת 5-9.9% הציגה שיעור הצלחה של 23.8%, בעוד שקבוצת 10-15% השיגה 52.2%, המקבילה לעלייה של פי 2.2 ביעילות הפרוטוקול (איור 2A). לגבי הרכב הרקמות, איור 2B הראה עלייה פרופורצי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מדגים כי השתלת WAT ו-BAT משולבת היא גישה טיפולית יעילה לשליטה בהיפרגליקמיה, מניעת עלייה במשקל הגוף והיפרטרופיה של תאי אי, שיקום תת-פוריות נשית ושיפור תפקוד הכליות על ידי הפחתת אפופטוזיס ושימור מספרי הפודוציטים במודל פרה-קליני של T2DM, DKD והשמנת יתר.

למרות שמחקרים קודמים חקרו השתלת WAT ו-BAT כאסטרטגיות לוויסות הומאוסטזיס גלוקוז ורגישות לאינסולין11, שיפור תפקוד הלב12,13, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

אנו מודים לצוותים הטכניים של המרכז להכשרה ניסויית וכירורגית (CETEC) והמכון היהודי למחקר וחינוך (IIEP) על תמיכתם. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מלגת מחקר לתואר שני מ-CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior/Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel) ל-S.B, מענק מלגת מחקר ישיר לדוקטורט מ-CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior/Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel) ל-M.L.F, מענק מלגת מחקר לתואר שני מ-FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Research Foundation; no. 2024/08173-6) ל-M.O.M., ומענק מלגת חניכה מדעית מ-FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Research Foundation; no. 2019/12636-3) ל-M.T.A.B-R. עבודה זו נתמכה גם על ידי מענקים מ-FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Research Foundation; מס' 2017/23195-2 ומס' 2021/02216-7), ו-EFSD (הקרן האירופית לחקר הסוכרת) ל-É.B.R. המחברים מצהירים כי לא השתמשו בעבודה שנוצרה על ידי בינה מלאכותית (AI) בכתב יד זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת כלורהקסידין דיגלוקונאט אלכוהולית 0.5%Rioquí מיקהSKU 1068253
מחט 16 גייג'בקטון דיקינסוןSKU 305198
תמיסת 2.0% כלורהקסידין דיגלוקונאט לא אלכוהוליתRioquí מיקהSKU 1113045
מזרק 3 מ"לבקטון דיקינסוןSKU 309657
רצועות Accu-Check & ndash; פרפורמהרושEAN 4015630981960
ערכת PAS כחולה אלציאניתEasyPathSKU EP-11-20019
אלבומין סרום בקר (BSA)סיגמא-אלדריץ'A4612
תוכנת CellSensאולימפוסCELLENS
pH 6.0 של בופר ציטראט: חומצה ציטרית מונוהידראט + נתרן הידרוקסידסיגמא-אלדריץ'C1909 + 28-3010
נוגדן קספאז-3 מקוטעטכנולוגיית איתות סלולרי9661
אנלייזר קובאס C 111רוש4528778001
קריאטינין Kבדיקת מעבדה96-300
EnVision FLEX DAB+ כרומוגןאגילנט-דאקוK3468
EnVision FLEX / תגובת גילוי HRPאגילנט-דאקוSM802
Envision תגובת חוסם פרוקסידאז FLEXאגילנט-דאקוSM801
בופר מצע EnVision FLEXאגילנט-דאקוSM803
EnVision FLEX היה עם בופר 20xאגילנט-דאקוK800721-2
אאוסיןאגילנט-דאקוCS701
קורא מיקרופלט GloMax DiscoverפרומגהGM3000
בדיקת אקומטר - PerformaרושEAN 4015630980512
תוכנת GraphPad Prism 8 (תוכנה סטטיסטית)GraphPad של Dotmatics-
100% v/v איזופורין (איזופלורן)Cristá ליה-
המטוקסיליןאגילנט-דאקוCS700
מיקרוסקופ אור IX51אולימפוסIX51
כלוב מטבולי לעכבר יחידטקניפלסט3600M021
מדיום הרכבה - אנטלןסיגמא-אלדריץ'100869
ערכת אלבום עכבר ELISAאבקאםAb207620
זן עכבר: BTBR. Cg-Lepob/WiscJמעבדות JAX4824
ערכת חומצה מחזורית (PAS)EasyPathEP-11-20014
RM255 מיקרוטוםLeica Biosystems14050237960
TP1020 מעבד רקמותLeica BiosystemsTP-1020
טרמדול 50 מ"ג/מ"לGrü ננטל4022444
נוגדן WT-1סנטה קרוזSC-192

מקורות

  1. Zhao, M., Cao, Y., Ma, L. New insights in the treatment of DKD: recent advances and future prospects. BMC Nephrol. 26 (1), 72(2025).
  2. van Raalte, D. H., et al. Combination therapy for kidney disease in people with diabetes mellitus. Nat Rev Nephrol. 20 (7), 433-446 (2024).
  3. Xu, M., et al. Trends and future predictions of chronic kidney disease due to diabetes mellitus type 2 attributable to dietary risks: insights based on GBD 2021 data. Front Nutr. 11, 1494383(2024).
  4. GBD 2021 Adult BMI Collaborators. Adult BMI Collaborators. Global, regional, and national prevalence of adult overweight and obesity, 1990-2021, with forecasts to 2050: a forecasting study for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet. 405 (10481), 813-838 (2025).
  5. Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).
  6. Ghesmati, Z., et al. An update on the secretory functions of brown, white, and beige adipose tissue: Towards therapeutic applications. Rev Endocr Metab Disord. 25 (2), 279-308 (2024).
  7. Dewal, R. S., et al. Transplantation of committed pre-adipocytes from brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis. iScience. 27 (2), 108927(2024).
  8. Klebanov, S., Astle, C. M., DeSimone, O., Ablamunits, V., Harrison, D. E. Adipose tissue transplantation protects ob/ob mice from obesity, normalizes insulin sensitivity and restores fertility. J Endocrinol. 186 (1), 203-211 (2005).
  9. Childs, G. V., Odle, A. K., MacNicol, M. C., MacNicol, A. M. The importance of leptin to reproduction. Endocrinology. 162 (2), 1-18 (2021).
  10. Hudkins, K. L., et al. BTBR Ob/Ob mutant mice model progressive diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 21 (9), 1533-1542 (2010).
  11. Stanford, K. I., et al. Brown adipose tissue regulates glucose homeostasis and insulin sensitivity. J Clin Invest. 123 (1), 215-223 (2013).
  12. Pinckard, K. M., et al. A novel endocrine role for the BAT-released Lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function. Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).
  13. Valgas da Silva, P. C., et al. Brown adipose tissue prevents glucose intolerance and cardiac remodeling in high-fat-fed mice after a mild myocardial infarction. Int J Obes (Lond). 46 (2), 350-358 (2022).
  14. Zhang, Y., et al. Brown adipose tissue transplantation ameliorates diabetic nephropathy through the miR-30b pathway by targeting Runx1. Metabolism. 125, 154916(2021).
  15. Clee, S. M., Nadler, S. T., Attie, A. D. Genetic and genomic studies of the BTBR ob/ob mouse model of type 2 diabetes. Am J Ther. 12 (6), 491-498 (2005).
  16. Stoehr, J. P., et al. Identification of major quantitative trait loci controlling body weight variation in ob/ob mice. Diabetes. 53 (1), 245-249 (2004).
  17. Liu, X., Zhang, Z., Song, Y., Xie, H., Dong, M. An update on brown adipose tissue and obesity intervention: Function, regulation and therapeutic implications. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1065263(2022).
  18. Mollah, M. L., Yang, H. S., Jeon, S., Kim, K., Cheon, Y. P. Overaccumulation of fat caused rapid reproductive senescence but not loss of ovarian reserve in ob/ob mice. J Endocr Soc. 5 (1), bvaa168(2021).
  19. Serke, H., et al. Leptin-deficient (ob/ob) mouse ovaries show fatty degeneration, enhanced apoptosis and decreased expression of steroidogenic acute regulatory enzyme. Int J Obes (Lond). 36 (8), 1047-1053 (2012).
  20. Diamanti-Kandarakis, E., Dunaif, A. Insulin resistance and the polycystic ovary syndrome revisited: an update on mechanisms and implications. Endocr Rev. 33 (6), 981-1030 (2012).
  21. Chang, A. S., Dale, A. N., Moley, K. H. Maternal diabetes adversely affects preovulatory oocyte maturation, development, and granulosa cell apoptosis. Endocrinology. 146 (5), 2445-2453 (2005).
  22. Almog, B., et al. Leptin attenuates follicular apoptosis and accelerates the onset of puberty in immature rats. Mol Cell Endocrinol. 183 (1-2), 179-191 (2001).
  23. Beyerstedt, S., et al. Combining sodium-glucose co-transporter-2 inhibitor with mesenchymal stem cells and brown adipose tissue (BAT) and white adipose tissue (WAT) transplantation to mitigate the progression of diabetic kidney disease: a pre-clinical approach. Stem Cell Res Ther. 16 (254), 1-15 (2025).
  24. Sávio-Silva, C., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells in a pre-clinical model of diabetic kidney disease and obesity. Int J Mol Sci. 22 (4), 1546(2021).
  25. Takemura, S., Shimizu, T., Oka, M., Sekiya, S., Babazono, T. Transplantation of adipose-derived mesenchymal stem cell sheets directly into the kidney suppresses the progression of renal injury in a diabetic nephropathy rat model. J Diabetes Investig. 11 (3), 545-553 (2020).
  26. Pichaiwong, W., et al. Reversibility of structural and functional damage in a model of advanced diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 24 (7), 1088-1102 (2013).
  27. Almog, B., et al. Leptin attenuates follicular apoptosis and accelerates the onset of puberty in immature rats. Mol Cell Endocrinol. 183 (1-2), 179-191 (2001).
  28. O'Brien, P. D., et al. BTBR ob/ob mice as a novel diabetic neuropathy model: Neurological characterization and gene expression analysis. Neurobiol Dis. 73, 348-355 (2015).
  29. Sávio-Silva, C., et al. Mesenchymal stem cell therapy for diabetic kidney disease: A review of the studies using syngeneic, autologous, allogenic, and xenogenic cells. Stem Cells Int. 2020, 8833725(2020).
  30. Morsy, M. A., et al. Leptin gene therapy and daily protein administration: a comparative study in the ob/ob mouse. Gene Ther. 5 (1), 8-18 (1998).
  31. Wang, Y., Asakawa, A., Inui, A., Kosai, K. Leptin gene therapy in the fight against diabetes. Expert Opin Biol Ther. 10 (10), 1405-1414 (2010).
  32. Blüher, S., Shah, S., Mantzoros, C. S. Leptin deficiency: clinical implications and opportunities for therapeutic interventions. J Investig Med. 57 (7), 784-788 (2009).
  33. Paz-Filho, G., Mastronardi, C. A., Licinio, J. Leptin treatment: facts and expectations. Metabolism. 64 (1), 146-156 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

השתתלת רקמת שומןרקמת שומן חומהרקמת שומן לבנהלקות מטבוליתגרעונות רבייתייםתפקוד כלייתי לקוירמת גלוקוז בדם בצוםאפופטוזיס של השחלהגנזה פוליקולרית
שתלי שומן לבנים וחומים: גישה לתיקון ליקויים רבייתיים, מטבוליים וכלייתיים בעכברים שמנים שחורים ושזופים (BTBR)
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.