מאמר שיטה

פרוטוקול פשוט לבידוד ותרבית של הפטוציטים מעכברי MASLD

1.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68782

⸱

18 ביולי 2025

 ,  ,  , 
1Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China

במאמר זה

סיכום

מחקר זה קובע פרוטוקול סטנדרטי לבידוד הפטוציטים ראשוניים מעכברי מחלת כבד סטאטוטית הקשורה להפרעות בתפקוד מטבולי (MASLD), המאפשר חקירות רלוונטיות למחלה של סטיאטוזיס ותפקוד מטבולי לקוי ללא העמסת שומנים מלאכותית. השיטה מניבה הפטוציטים בעלי תפוקה גבוהה וכדאיות גבוהה המתאימים למחקרים מכניסטיים וטיפוליים.

תקציר

מחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי (MASLD), המאופיינת בהצטברות שומנים פתולוגית (סטאטוזיס) בתוך הפטוציטים, מייצגת נטל בריאותי עולמי משמעותי וגדל. תרביות הפטוציטים ראשוניות של עכברים משמשות כמודלים הכרחיים ex vivo להבהרת פתוגנזה של MASLD והתערבויות טיפוליות. עם זאת, בידוד אמין של הפטוציטים באיכות גבוהה מכבד סטאטוטי נותר מאתגר מבחינה טכנית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט לבידוד יעיל של הפטוציטים ראשוניים מעכברי MASLD באמצעות טכניקת זלוף קולגנאז. פרוטוקול זה מייצר הפטוציטים המציגים סטיאטוזיס אינהרנטי מבלי לדרוש אינדוקציה מלאכותית באמצעות תוספי פלמיטט וחומצה אולאית, ובכך משמר פנוטיפ רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית. הפרוטוקול מניב הפטוציטים ברי קיימא וטוהר גבוה והוא ישים באופן אוניברסלי לבידוד כמויות גבוהות של הפטוציטים מעכברי MASLD. יתר על כן, הוא מתאים להערכה פרמקולוגית או למחקרי התערבות גנטית. לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול הניתן לשחזור לבידוד הפטוציטים בעלי תפוקה גבוהה, טוהר גבוה ובר קיימא מאוד למחקרים ביולוגיים של תאים במורד הזרם כדי להקל על גילוי מטרות טיפוליות ותרופות חדשות עבור MASLD.

מבוא

מחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי (MASLD) מאופיינת בהצטברות שומנים פתולוגית בהפטוציטים ומייצגת את הפרעת הכבד הכרונית השכיחה ביותר בעולם1. על פי ההערכות, MASLD משפיע על 38% מהאוכלוסייה הבוגרת בעולם והפך לאיום משמעותי על בריאות האדם2. מנגנוני MASLD לא הובהרו במלואם ואפשרויות הטיפול מוגבלות מאוד. גילוי מטרות טיפוליות חדשות ופיתוח תרופות ממוקדות ל-MASLD הפכו לצורך קליני קריטי. הפטוציטים, כסוג התא השולט המרכיב את הכבד, הם האתר העיקרי של חילוף החומרים של גלוקוז-שומנים-תרופות בכבד. הפטוציטים ראשוניים שומרים על תפקוד שלם יותר של הפטוציטים מאשר קווי תאי הפטוציטים ומהווים כלי שימושי לחקר מנגנוני מחלות כבד ופיתוח תרופות3. בידוד ותרבית של הפטוציטים ראשוניים מעכברים עם כבד שומני היא טכניקה בסיסית לחקר פתופיזיולוגיה של הכבד, כולל חילוף חומרים של שומנים, עמידות לאינסולין ותגובות דלקתיות. פרוטוקול קודם שנקבע לבידוד הפטוציטים ממודלים עכבריים של מחלת כבד שומני השתמש בצנטריפוגה שיפוע כדי לאפשר באופן ספציפי הפרדה של אוכלוסיות הפטוציטים נורמליות ומצטברות שומנים. הפטוציטים מבודדים עמוסי שומנים אלה מהווים אפוא מערכת מודל מבחנה קריטית לחקירת פתוביולוגיה של מחלת כבד שומני3. המטרה העיקרית של גישה זו היא להשיג בקלות ובחסכון הפטוציטים ברי קיימא ובעלי תפוקה גבוהה השומרים על מאפיינים פנוטיפיים ספציפיים למחלה ובכך מסוגלים לחקות MASLD במבחנה.

ההליך הכללי לבידוד הפטוציטים בעכברים מורכב מתהליך דו-שלבי שמתחיל בשטיפת הדם מהכבד בתמיסת זלוף איזוטונית, כגון תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS), ולאחר מכן עיכול הכבד באמצעות תמיסת עיכול המכילה קולגנאז. ההתקדמות האחרונה בזלוף כבד וטכניקות עיכול אנזימטי שיפרו את התפוקה והכדאיות של הפטוציטים ראשוניים בעכברים נקבות4. שיפורים בשיטות מסורתיות של זלוף קולגנאז דו-שלבי, כגון אופטימיזציה של הרכב החיץ וקיצור זמני העיכול, היו קריטיים בהתאמת פרוטוקולים ניסיוניים לדגימות כבד שומני. הפטוציטים ראשוניים משמשים כמודלים הכרחיים להבהרת המנגנונים הפתופיזיולוגיים העומדים בבסיס MASLD וסיבוכים קרדיומטבוליים שלו, במיוחד באמצעות תפקידם בתיווך דיבור צולב לב-כבד ואינטראקציות בין ציר כבד-כלי דם באמצעות מתווכי אנדותל וגורמים אנגיוגניים 5,6. תאים אלה מספקים תובנות קריטיות לגבי רשתות התקשורת הרב-איבריות המניעות את התקדמות המחלה, כפי שמעידים הקשרים הקליניים בין MASLD, מחלת כליות כרונית ומחלת לב איסכמית7, תוך שהם מציעים פלטפורמה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לפיתוח טיפולים ממוקדים המטפלים בביטויים של תסמונת מטבולית בכבד ובלב וכלי דם. המחקר הנוכחי במבחנה של MASLD מסתמך בעיקר על הפטוציטים נורמליים מגורים על ידי חומצה פלמיטית/אולאית (PA/OA) או קווי תאי הפטוציטים אנושיים (למשל, HepG2 ו-Huh7), אשר אינם משכפלים כראוי את המאפיינים הפתופיזיולוגיים של הפטוציטים סטאטוטיים בתנאי מחלה, ומגבילים את הרלוונטיות התרגומית שלהם לחקר אינטראקציות לב-כבד-כלי דם. גישה זו אינה מצליחה ללכוד את התפקוד המטבולי הכרוני, המיקרו-סביבה הדלקתית והדיבור הבין-איברי הספציפי למחלה האופייני להתקדמות MASLD.

ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לבודד הפטוציטים מעכברי MASLD, ללא צורך להוסיף באופן מלאכותי טיפולי חומצה פלמיטית וחומצה אולאית. לסיכום, אנו מציגים שיטה פשוטה וניתנת לשחזור להשגת הפטוציטים בעלי תפוקה גבוהה עם כדאיות מצוינת המתאימה למחקר ביולוגיה של התא במורד הזרם כדי לתמוך בגילוי מטרות טיפוליות חדשות ופיתוח תרופות עבור MASLD.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל שלבי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת המדע והטכנולוגיה של סין. עכברי C57BL/6J זכרים הוזנו בתזונה עתירת שומן (HFD, #12492, דיאטת מחקר) במשך יותר מ-12 שבועות במחקר זה.

1. הכנת צלחת או צלחת תרבית מצופה קולגן

  1. הוסף 15 מ"ל 100% EtOH ל-35 מ"ל של H2O מזוקק כפול (ddH2O). הכינו תמיסה של קולגן מסוג I 50 מיקרוגרם/מ"ל ב-30% EtOH. מסננים עם קצה מסנן סטרילי של 0.22 מיקרומטר.
  2. מצפים צלחת או צלחת תרבית תאים עם 30 מיקרוליטר תמיסת קולגן לס"מ2. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה.
  3. הסר עודפי נוזלים בעזרת פיפטה וייבש את צלחת התרבות או התבשיל. הקרינו את הכלים המצופים באור אולטרה סגול למשך 0.5 שעות לעיקור. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך פחות מחודש.
    הערה: אורך הגל של ה-UV lamp הוא 254 ננומטר, ועוצמת ה-UV היא לא פחות מ-400 mw/m2. המרחק של מקור מנורת ה- UV מהכלים המצופים בקולגן הוא 1 מ '.

2. הכנת תמיסת זלוף

  1. כמה ימים לפני בידוד הפטוציטים, הכינו ריאגנטים לבידוד הפטוציטים ואמצעי תרבית המפורטים בטבלה 1. מסנן תמיסת זלוף A ו-B עם קצה מסנן סטרילי של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך פחות מחודש. הכינו אמבט מים והגדירו את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס.
  2. מחממים מראש תמיסות זלוף A ו-B באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. יש להוסיף 40 מ"ג קולגנאז מסוג IV ל-80 מ"ל של תמיסת זלוף B לפני הניתוח.
  3. יש לשאוב 75% EtOH בקצב של 4 מ"ל/דקה למשך 5 דקות באמצעות משאבה פריסטלטית ב-RT. העבר את צינור המשאבה מ-75% EtOH לתמיסת זלוף שחוממה מראש A.
    הערה: הרכיבו את יחידת מילוי הסירקולציה המחוממת בהתאם לתצורה המוצגת באיור 1A.

3. הליך כירורגי

  1. הרדמת העכבר בשיטה מאושרת. יש להזריק נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג) תוך צפק. ודא את אובדן רפלקס הסיבוב לפני שתמשיך.
  2. אבטח את הגפיים העליונות והתחתונות של העכבר על לוח דיסקציה. עקר את אזור הניתוח עם 75% אלכוהול.
  3. חותכים את קרומי הבטן הפנימיים והחיצוניים באמצעות מכשירי דיסקציה. סובב את האיברים הקרביים לצד שמאל של העכבר בעזרת צמר גפן כדי לחשוף את הווריד הנבוב התחתון (IVC) ואת וריד השער של הכבד (PV).
  4. לחץ על הווריד הנבוב התחתון בעזרת צמר גפן כדי לבלוט אותו החוצה. הכנס מחט שוכנת 22-G במקביל לווריד הנבוב התחתון.
  5. משוך את חלק הברזל של המחט השוכנת. השאירו את הקטטר בווריד הנבוב התחתון. חבר את המחט לקו זלוף עם קצה מסנן של 0.22 מיקרומטר.
    הערה: מחט שוכנת מורכבת מחלק מחט ברזל וחלק קטטר מפלסטיק. הקפידו על החדרה מדויקת לווריד הנבוב התחתון והמתינו עד שהמחט השוכנת תתמלא בדם. היפטר מכל בועות האוויר מהמחט השוכנת. השלם את כל ההליך במהירות כדי למנוע פקקת.
  6. הגדר את קצב הזלוף ל-5 מ"ל/דקה של נוזל זלוף A. התחל בזלוף והתבונן בכבד עד שהוא נראה נפוח. חתוך מיד את וריד הפורטל.
  7. עסו בעדינות את הכבד באמצעות צמר גפן כדי להבטיח שטיפה יסודית של הדם. המשך בזלוף עד שהכבד הופך לצהוב אדמה.
  8. עבור לנוזל זלוף B המכיל 0.05% קולגנאז מסוג IV. המשך בזלוף עד שהכבד מתעכל במלואו.
    הערה: לוקח לפחות 10 דקות לכל עכבר להתעכל הכבד. נפח של 80 מ"ל של תמיסת זלוף B המכילה קולגנאז מספיק לעכבר אחד כדי לעכל את הכבד שלו. רקמת הכבד עוברת עיכול אנזימטי מלא עד להשגת ריכוך מקסימלי, כאשר הפרנכימה הסגורה בקפסולה מגיעה למצב של שבריריות קיצונית המועדת לשיבוש מכני.
  9. הסר את הכבד מבטן העכבר. מניחים את הכבד בכלי בגודל 10 ס"מ המכיל DMEM.
  10. המשך בארון בטיחות ביולוגית. גרסו את הכבד לאבקה בעזרת פינצטה (כבד מעוכל היטב משחרר הפטוציטים בקלות).
  11. מסננים את המתלים על פני מסנן רשת של 70 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל. כוונן את עוצמת הקול ל-45 מ"ל (לכל עכבר) עם מדיום DEM.
  12. צנטריפוגה בחום של 50 × גרם למשך 4 דקות. יש לשפוך את הסופרנטנט לחלוטין.
  13. השעו מחדש את הגלולה עם מדיום DMEM לנפח סופי של 25 מ"ל (לכל עכבר). צנטריפוגה שוב בחום של 50 × גרם למשך 2 דקות.
  14. יש לשפוך את הסופרנטנט לחלוטין. השעו מחדש את הגלולה ב-25 מ"ל של מדיום תרבית בתוספת 10% FBS.
  15. מערבבים היטב את המתלה. צבעו את התאים בכחול טריפן לספירה. המשך לחסן לתרבית באופן מיידי.
    הערה: מניחים 2 מ"ל של מדיום המכיל 2 × 105 תאים לבאר לתוך כלים מצופים קולגן של 6 בארות. החלף את מדיום ה-DMEM לאחר שעתיים של חיסון תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול הנוכחי יושם על עכברי C57BL/6J זכרים שהוזנו ב-HFD במשך יותר מ-12 שבועות. הפטוציטים הראשוניים המבודדים נבדקו למורפולוגיה ותפקוד. השגנו תפוקה ממוצעת של 2 × 107 תאים לבידוד מכ-40 גרם כבד עכבר. כדאיות התאים נקבעה בין 85%-86% על ידי צביעת Calcein AM של תאים חיים. התשואה מכל בידוד עכברים שמנים (DIO) המושרה על ידי דיאטה הספיקה כדי לזרוע 15 צלחות סטנדרטיות של 6 בארות. איור 1B-G מציג תוצאות מייצגות של בידוד ותרבית הפטוציטים ראשוניים בעכברי DIO בצור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בידוד הפטוציטים ברי קיימא של עכברים כרוך בהליך דו-שלבי קריטי המתחיל בזלוף כלי דם יסודי באמצעות תמיסה איזוטונית להסרת רכיבי דם, ולאחר מכן עיכול אנזימטי מבוקר עם תמיסת קולגנאז פעילה 9,10. בידוד מוצלח תלוי בשמירה על תנאים פיזיולוגיים אופטימליים לאורך כל התהליך, במיוחד טמפרטורה יציבה (37 מעלות צלזיוס) ו-pH (7.2-7.4) של תמיסות זלוף, שכן פרמטרים אלה קובעים ישירות את כדאיות התא11,12

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא דווח על ניגוד עניינים פוטנציאלי על ידי המחברים.

תודות

העבודה הזו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [מס' 82373967].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטרילייםNest602052
אנטי-HNF4 ואלפא; נוגדןImmunowayYM8517
נוגדן נגד IgGProteintech30000-0-AP
BODIPYThermo Fisher ScientificD3922
CaCl2Merck (SigmaAldrich)C5670
צנטריפוגהתרמו סורוול ST16R
קולגן סוג I קורנינג354236
קולגנאז, סוג 4סנגון ביוטקA004186-0001
מחט מעצרBRAUN4254074B
מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)GibcoC11995500BT
EGTAYeasen60339ES10
אתנולMerck (SigmaAldrich)493511
סרום בקר עובריSigmaF2442
גלוקוזMerck (SigmaAldrich)G7021
HEPESGibco15630080
Isoginkgetin MedChemExpressHY-N2117
K2HPO4 Merck (Supelco)PHR2900
KClMerck (SigmaAldrich)P3911
Na2HPO4 · 12H2OMerck (SigmaAldrich)04273
NaClMerck (SigmaAldrich)S9888
NaHCO3Merck (SigmaAldrich)S6014
מסנן מחט 0.22µ MMillex-GPSLGV033RB
נילוס אדוםInvitrogenN1142
פניצילין/סטרפטומיצין (100X)Gibco15140122
אדנו-וירוס רקומביננטיObio Technology Corp., Ltd. אדנו-וירוסים רקומביננטיים המקודדים עכבר מתויג דגל IER2 (Ad-Ier2, NM_010499.4) ואדנווירוס בקרה (Ad-NC) נבנו על ידי Obio Technology Corp., ltd.
נתרן פנטוברביטלMerck (SigmaAldrich)P3761
מסנני תאים סטריליים, 100 μ mFisher Scientific22363549
Trypan BlueBeyotimeST2780-5g
משאבה פריסטלטית בזרימה משתנהארוכה יותרBT100-1F

מקורות

  1. Israelsen, M., Francque, S., Tsochatzis, E. A., Krag, A. Steatotic liver disease. Lancet. 404 (10464), 1761-1778 (2024).
  2. Targher, G., Byrne, C. D., Tilg, H. Masld: A systemic metabolic disorder with cardiovascular and malignant complications. Gut. 73 (4), 691-702 (2024).
  3. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protoc. 1 (3), 100222(2020).
  4. Feng, M., Divall, S., Wu, S. An improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation. J Vis Exp. (176), e61812(2021).
  5. Driessen, S., et al. Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease and the heart. Hepatology. , (2023).
  6. Chew, N. W. S., et al. Cardiovascular-liver-metabolic health: Recommendations in screening, diagnosis, and management of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease in cardiovascular disease via modified delphi approach. Circulation. 151 (1), 98-119 (2025).
  7. Miyamori, D., et al. Coexistence of metabolic dysfunction-associated fatty liver disease and chronic kidney disease is a more potent risk factor for ischemic heart disease. J Am Heart Assoc. 12 (14), e030269(2023).
  8. Zhang, Z., et al. A natural small molecule isoginkgetin alleviates hypercholesterolemia and atherosclerosis by targeting ACLY. Theranostics. 15 (10), 4325-4344 (2025).
  9. Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods Mol Biol. 987, 283-293 (2013).
  10. Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells. J Vis Exp. (178), e63062(2021).
  11. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: Cell characterization and asialoglycoprotein receptor-based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  12. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. J Vis Exp. (140), e58323(2018).
  13. Xu, S., et al. TRIM56 protects against nonalcoholic fatty liver disease by promoting the degradation of fatty acid synthase. J Clin Invest. 134 (5), e166149(2024).
  14. Xu, S., et al. The clinical antiprotozoal drug halofuginone promotes weight loss by elevating GDF15 and FGF21. Sci Adv. 11 (13), eadt3142(2025).
  15. Tiriticco, V., et al. Rat liver perfusion and primary hepatocytes isolation: An old procedure crucial for cutting-edge 3D organoids culture. J Vis Exp. (213), e66857(2024).
  16. Wei, S., et al. Nafld and nash: Etiology, targets and emerging therapies. Drug Discov Today. 29 (3), 103910(2024).
  17. Fang, T., et al. Mouse models of nonalcoholic fatty liver disease (nafld): Pathomechanisms and pharmacotherapies. Int J Biol Sci. 18 (15), 5681-5697 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ex vivo
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים