פרוטוקול מעודכן להרכבה ושימוש במערך המיני-ביו-ריאקטור (MBRA)

Summary

מערך המיני-ביו-ריאקטור (MBRA) הוא מערכת תרבית בעלת תפוקה גבוהה, ניתנת להתאמה אישית, זרימה רציפה המאפשרת טיפוח של קהילות מיקרוביאליות מורכבות, ותומכת בניסויים מקבילים לחקר דינמיקת המיקרוביום, אינטראקציות טיפוליות ותגובות מיקרוביאליות לגורמים סביבתיים.

Abstract

המיקרוביום האנושי מורכב מקהילות מיקרוביאליות מגוונות ודינמיות הממלאות תפקידים חיוניים בבריאות המארח. הבנת קהילות אלה ותגובותיהן לגורמים סביבתיים היא קריטית לקידום טיפולים מבוססי מיקרוביום. מודלים מסורתיים במבחנה לטיפוח מיקרוביוטה שמקורה בבני אדם לרוב חסרים יכולת הרחבה ודורשים מומחיות טכנית נרחבת, מה שמגביל את הנגישות והתפוקה שלהם. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, פיתחנו את מערכת Minibioreactor Array (MBRA) - פלטפורמה מודולרית, חד-שלבית, עם זרימה רציפה לגידול תפוקה גבוהה של קהילות מיקרוביאליות. מערכת זו מאפשרת גידול מקביל של עד 48 קהילות מיקרוביאליות נפרדות, ותומכת בגמישות ניסויית תוך שמירה על צמיחה יציבה של מערכות אקולוגיות מורכבות. פרוטוקול זה מספק הנחיות מפורטות לגבי ייצור, הרכבה, עיקור ותפעול של MBRA. העיצוב המודולרי של המערכת מאפשר שילוב קל בתאים אנאירוביים ותומך בהתאמה אישית למגוון רחב של יישומים ניסיוניים. הוא שימש לחקר תגובות מיקרוביאליות לאנטיביוטיקה, תרכובות תזונתיות ופלישת פתוגנים, ולסריקת קהילות עמידות לפתוגנים. עם הנגישות, המדרגיות ויכולת השחזור שלו, ה-MBRA מייצג מערכת מודל רבת עוצמה לחקירת אינטראקציות מיקרוביאליות ולקידום מחקר המיקרוביום.

Introduction

המיקרוביום האנושי הוא מערכת אקולוגית מורכבת של מיקרואורגניזמים הממלאת תפקיד קריטי בתהליכים פיזיולוגיים רבים ומשפיעה עמוקות על בריאות האדם. המיקרוביום האנושי משתרע על פני אתרים אנטומיים רבים ברחבי גופנו, כל אחד מהם מכיל קהילות מיקרוביאליות דינמיות המקיימות אינטראקציה פעילה בדרכים שעדיין^{לא הבנו} במלואן. הרחבת הידע שלנו על מעורבותן של קהילות מיקרוביאליות בבריאות ובמחלות תלויה בהבנתנו את האינטראקציות המיקרוביאליות המתרחשות בסביבות^אלה. כדי לחקור ולתפעל ביעילות את המערכות המורכבות הללו למטרות טיפוליות, יש צורך בגישה רדוקציוניסטית. חקר אינטראקציות מיקרוביאליות בודדות באמצעות מערכות מודל פשוטות מאפשר הבנה טובה יותר של המורכבות המלאה של המיקרוביום².

מגוון רחב של מערכות מודל זמינות לגידול קהילות מיקרוביאליות שמקורן בבני אדם. מערכות אלו קידמו את ההבנה שלנו לגבי קהילות מיקרוביאליות הקשורות לאדם ונעות בין תרבית אצווה חד-שלבית למערכות זרימה רציפה רב-שלבית מורכבות יותר. מערכות מודל, כגון סימולטור המערכת האקולוגית המיקרוביאלית של המעי האנושי³, מערכת הכימוסטט החד-שלבית של כלי הדם^{הכפול 4} ומערכת בקרת הסביבה למיקרוביוטה של המעיים⁵ משכפלות את התנאים הפיזיולוגיים של אתרים אנטומיים ספציפיים ומספקות קירובים קרובים במבחנה של סביבות מיקרוביאליות. עם זאת, אימוצם על ידי מיקרוביולוגים מוגבל מכיוון שהם יקרים, דורשים מומחיות טכנית ברמה גבוהה להפעלה ותחזוקה, ויש להם תפוקה מוגבלת.

כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פיתחנו את מערכת Minibioreactor Array (MBRA) - מערכת תרבית חד-שלבית בזרימה רציפה שנועדה להקל על צמיחה יציבה של קהילות מיקרוביאליות ממקורות מגוונים בסביבה מבוקרת ^6,7,8. מערכת ה-MBRA בולטת ממודלים אחרים של מעיים בפשטות ההרכבה והתפעול שלה, בשילוב עם יכולות תפוקה גבוהות המאפשרות גידול בו זמנית של קהילות מיקרוביאליות מרובות, מה שמגביר את יעילות הניסוי. יתר על כן, האופי הפשוט והקומפקטי של מערכת זו מאפשר את פעולתה בתוך תאים אנאירוביים ומיקרואוקסיים כדי להקל על צמיחת חיידקים מאתרים אנאירוביים והיפוקסיים, כגון מערכת העיכול והנרתיק. האופי הרב-תכליתי של מערכת זו מונף לבדיקת קהילות מערכת העיכול העמידות ל-Clostridioides difficile ⁹, כמו גם לבדיקת ההשפעות של אנטיביוטיקה^10,11 ומצעים תזונתיים¹² על קהילות מיקרוביאליות.

MBRAs מיוצרים על ידי הדפסת תלת מימד או ייצור תוספים, תוך מתן עדיפות לבהירות ועמידות למים בבחירת החומרים שלנו (ראה טבלת חומרים למידע על פולימרים). כל מערך מכיל שישה תאים נפרדים, כולם מצוידים ביציאות לייבוא מדיה, ייצוא פסולת ואיסוף דגימות. מדיה טרייה מסופקת באופן רציף למערכת בזמן שהפסולת מופקת בו זמנית, כאשר קצב הזרימה נשלט במדויק על ידי שתי משאבות פריסטלטיות. התוכן במערכת נסער כל הזמן באמצעות מוטות ערבוב וצלחת ערבוב של 60 נקודות כדי להקל על תרביות הומוגניות. הפרוטוקול המתואר כאן מותאם לנפח עבודה של 15 מ"ל לתא, אם כי כל ביו-ריאקטור יכול להכיל טווח של 1-20 מ"ל בהתאם לדרישות הניסוי. המשאבה הפריסטלטית וצינורות המשאבה יכולים להכיל קצבי זרימה הנעים בין 0.016 ל-2.9 מ"ל/דקה, המתאימים לשיעורי תחלופה של כ-15.63 עד 0.09 שעות, בהתאמה. בעוד שהמערכת תואמת למגוון רחב של פורמולציות מדיה ותוספות תזונתיות או תזונתיות, יש לקחת בחשבון כמה שיקולים מעשיים: מדיה צמיגה מאוד עשויה לדרוש כיול מחדש של קצבי הזרימה, ונוכחותם של חלקיקים לא מומסים או רכיבים בלתי מסיסים עלולה לסתום את צינורות המשאבה או מחברים צרים, במיוחד בקצבי זרימה נמוכים יותר. המודולריות של המערכת מאפשרת התאמה מהירה וקלה של ניסויים על ידי התאמת בחירת המדיה, איסוף הדגימות, קצבי הזרימה ונפח העבודה. בשילוב עם ארבע משאבות פריסטלטיות בעלות 24 ערוצים ושתי פלטות ערבוב של 60 נקודות, המערכת יכולה להפעיל 48 תאים נפרדים לכל ניסוי בתא אנאירובי יחיד, ולתמוך בהקרנה אנאירובית בתפוקה גבוהה.

פרוטוקול זה משמש כמדריך ויזואלי וגרסה מעודכנת של שיטת הרכבה ותפעול MBRA שפורסמה בעבר שפותחה על ידי המעבדה שלנו⁴. מספר שיפורים מרכזיים שולבו כדי לשפר את יכולת השחזור, לייעל את זרימת העבודה ולמזער זיהום. ראשית, קשיות ה-PTFE נחרטות כעת כימית כדי למנוע מהן להתנתק וליפול לתאי הביוריאקטור. שנית, קש מדיה נוסף לקווי ההזנה כדי לכוון את זרימת המדיה לתחתית התאים, ולמנוע מהמדיה לטפטף במורד דפנות החדר. זה היה מקור ידוע להיווצרות ביופילם. שלישית, אורכי צינורות C-flex תוקננו וקוצרו, ומחזיק צינור מודפס בתלת מימד תוכנן כדי ליצור מערך קומפקטי ומאורגן יותר. לבסוף, ביו-ריאקטורים כבר לא מפורקים במלואם בין כל שימוש, מה שמפחית משמעותית את עלויות הזמן והחומר הכרוכות בניסויים חוזרים. שיפורים מצטברים אלה ואחרים משקפים אופטימיזציה איטרטיבית המבוססת על שימוש נרחב במערכת על פני מספר פרויקטים במעבדה שלנו.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה מיועד להכנה והרכבה של פס MBRA יחיד (איור 1). כל MBRA מורכב מביו-ריאקטור מודפס בתלת מימד, צינורות כדי להקל על זרימת מצע גידול, וצינורות כדי להקל על פליטת הפסולת מתאי הביוריאקטור. רשימה מלאה של החלקים המרכיבים MMRA יחיד, כולל תמונות, ניתן למצוא בטבלה 1. ציוד נוסף הנדרש כולל שתי משאבות פריסטלטיות ופלטת ערבוב (ראה טבלת חומרים לפרטי המכשיר).

1. הכנה לפני ההרכבה

1. תחריט פוליטטרפלואורואתילן (PTFE)
   הערה: בעוד שהתכונות הכימיות של PTFE הופכות אותו לאידיאלי לשימוש במערכת MBRA זו, הסיכה שלו אינה מאפשרת להיקשר לחלקי ביו-ריאקטור אחרים באמצעות אפוקסי בלבד. כדי לאבטח את צינור ה-PTFE לתוך פתיונות הזכר המושחל, תחילה יש לחרוט אותו כימית כדי לאפשר הדבקה של אפוקסי. נעשה שימוש בתחריט פלואורוקרבון (ראה טבלת חומרים). איור 2A משמש כמדריך ויזואלי להדבקת צינורות ה-PTFE כדי להקל על תהליך תחריט זה.
   1. חותכים שנים עשר אורכים של 25 מ"מ של צינורות PTFE. שישה מהם ייחתכו לשניים לאחר החריטה כדי לשמש כקשיות לקווי ההזנה ("קש מדיה").
      הערה: יש לחרוט רק את החלק המודבק. כדי למנוע תחריט של המשטח הפנימי ואזורים לא רצויים, יש להדביק את הצינור ולאטום אותו בשני הקצוות.
   2. בעזרת סרט תיוג מעבדה לשימוש כללי (רוחב 19 מ"מ), עטפו סרט לחלוטין סביב החלק העליון, המכסה ~5 מ"מ של צינור ה-PTFE (איור 2A). מרחו קטע נוסף של סרט סביב החלק התחתון, המכסה ~10 מ"מ של צינור ה-PTFE (איור 2A).
   3. צבט בחוזקה את קצות הסרט כדי למנוע מתמיסת התחריט להגיע לחלק הפנימי של ה-PTFE (איור 2A). זה אמור להשאיר ~10 מ"מ של צינורות PTFE חשופים לתחריט.
   4. הכן ארבעה פתרונות: תמיסת תחריט הפלואורוקרבון המחוממת ל-55 מעלות צלזיוס (ראה טבלת חומרים לפרטים על תמיסת תחריט הפלואורוקרבון), 100% אתנול (EtOH), מזוקק H₂O מחומם ל-70 מעלות צלזיוס, ומזוקק H₂O + 2-5% חומצה אצטית המחוממת ל-70 מעלות צלזיוס.
      זהירות: תמיסת תחריט הפלואורוקרבון היא קורוזיבית מאוד. בצע את כל השלבים במכסה אדים עם PPE. השלך כימיקלים לפי הנחיות מוסדיות.
   5. מחממים את כל הפתרונות לטמפרטורות המצוינות בשלב 1.1.4. יש לחמם את תמיסת תחריט הפלואורוקרבון באמבט מים, את שאר התמיסות ניתן לחמם על פלטה חמה. יוצקים תמיסות ל -4 מיכלי זכוכית נפרדים עמוקים מספיק כדי להטביע את הצינור המודבק לחלוטין.
   6. טבלו את כל צינורות ה-PTFE בתמיסת תחריט הפלואורוקרבון. מערבולת כדי להבטיח חשיפה אחידה של פני השטח. משרים דקה אחת, עד שהמשטח החרוט משחים.
      הערה: ניתן להשתמש בכף מסננת רחפן מתכת להעברת צינורות PTFE בין פתרונות.
   7. העבירו את הצינורות לאמבט EtOH למשך 5-20 שניות.
   8. מעבירים את הצינורות ל-70 מעלות צלזיוס H₂0 אמבטיה למשך 15-30 שניות.
   9. העבירו את הצינורות לאמבט 70 מעלות צלזיוס H₂0 + 2-5% חומצה אצטית למשך דקה.
   10. הסר את הצינור והניח על כרית סופגת בתוך מכסה האדים. הניחו לצינור החרוט להתייבש למשך הלילה (לפחות 16 שעות). לאחר הייבוש, הסר את הסרט מהצינור החרוט.
   11. ה-PTFE החרוט מוכן להדבקה ויישאר ניתן להדבקה למשך מספר חודשים אם יאוחסן בטמפרטורת החדר. ברגע שהצבע החום על משטחי התחריט דוהה, הוא כבר לא ניתן להדבקה.
       הערה: אין לחשוף את ה-PTFE החרוט לאור UV, מכיוון שהוא ישפיל את התחריט.
   12. חותכים 6 מצינורות ה-PTFE החרוטים לשניים כדי לשמש כקשיות לקווי ההזנה (איור 2A).
2. פסולת אפוקסי וקשיות מדיה
   1. הכנס כל אחת מ-6 קשיות פסולת ה-PTFE החרוטות ו-6 קשיות המדיה PTFE החרוטות לתוך ה-luer הזכרי המושחל שלהן. ודא שהמשטחים החרוטים מיושרים עם החלק התחתון של הלואר הזכר (איור 2).
   2. מערבבים שרף אפוקסי ומקשיח ביחס של 1:1 בסירת שקילה או בצלחת פטרי. בעזרת קצה פיפטה של 1 מ"ל, מרחו אפוקסי סביב בסיס הלואר הזכרי המושחל במקום בו הוא פוגש את צינור ה-PTFE.
   3. מקם כל חתיכה אנכית ואפשר לאפוקסי להתייצב למשך 24 שעות.
      הערה: קופסת קצה פיפטה ריקה בנפח 1 מ"ל עובדת היטב כדי להחזיק אותם זקופים.

2. מכלול MBRA

1. הכנת MBRA וחלקים
   1. ודא שרצועות המערך של Minibioreactor מודפסות בתלת מימד (ראה משלים file 1) ומכילות 6 תאי ביו-ריאקטור עצמאיים. כל תא מכיל שלוש יציאות בגודל 1/4 אינץ', אותן יש להשחיל כדי להכניס אביזרים. בצע את ההשחלה עם ברז שבר בגודל 1/4 אינץ'-28NF עם מפתח ברז עם ידית T.
      הערה: מומלץ להשתמש במוביל ברז בעת השחלת היציאות כדי להבטיח הברגה אינסטלציה.
   2. לאחר ההברגה, שטפו כל תא ביו-ריאקטור במים כדי להסיר שאריות פלסטיק. הוסף מוט ערבוב מגנטי בגודל 10X3 מ"מ ו-1 מ"ל מים מזוקקים לכל תא. המים יסייעו לתהליך העיקור במהלך החיטוי.
   3. מקם מכונת כביסה מגומי על גבי כל יציאה של הביוריאקטור. עבור כל תא, הברג פנימה 1 לואר זכר מושחל קש פסולת, 1 לואר זכר מושחל קש מדיה ו-1 לואר זכר מושחל ריק לכל אחת מהיציאות כפי שמצוין באיור 2B.
   4. הכנס 6 מחיצות גומי על דוקרני לואר נקבה בגודל 3/32 אינץ'. קפלו את השרוול העליון של המחיצה כלפי מטה כדי לכסות את הצוואר. חבר אותם ליציאות של כל תא המצוין באיור 2B.
   5. חותכים רצועות צינורות C-flex באורך הבא: 2 3/8 אינץ', 3 11/16 אינץ', 5 1/4 אינץ', 6 1/2 אינץ', 7 13/16 אינץ' ו-9 אינץ', ו-9 אינץ' (שניים מכל אורך יידרשו הן לקווי הפסולת והן לקווי ההזנה). לאחר החיתוך, חבר דוקרני לואר נקבה בגודל 1/8 אינץ' לקצה אחד ומחבר נעילת לואר זכר לקצה הנגדי של כל אורך צינור.
      הערה: האורכים המשמשים כאן מותאמים להפחתת העומס ולמשאבות הממוקמות במרחק של ~1 אינץ' מצלחת הערבוב. בהתאם להגדרה הרצויה, ייתכן שיידרשו אורכים ארוכים יותר.
   6. הכנס דוקרני נקבה בגודל 1/16 אינץ' לכל קצה של צינור ה-E-lab האדום בעל 2 עצירות (1.14 מ"מ ID) וצינור ה-E-lab הכתום בעל 2 עצירות (0.89 מ"מ ID). חזור על תהליך זה שש פעמים עבור כל רצועת MBRA.
      הערה: להכנסה קלה יותר של דוקרני ה-luer הנקבה בגודל 1/16 אינץ', טבלו לזמן קצר את קצות צינור ה-E-lab במים כמעט רותחים כדי לרכך את הפלסטיק.
   7. חבר את צינורות ה-E-lab לצינור C-flex שהוכן בשלב 2.1.5. יש לחבר כל אחד מ-6 האורכים של צינורות C-flex לקו E-lab אחד אדום וכתום אחד באמצעות פתיונות נקבה.
   8. חותכים עשרים ואחת חתיכות בגודל 1 אינץ', חתיכה אחת בגודל 2 אינץ', שלוש חתיכות בגודל 3 אינץ' וחתיכה אחת בגודל 12 אינץ' של צינורות C-flex. חבר דוקרני לואר נקבה בגודל 1/8 אינץ' ומחבר נעילת לואר זכר לקצוות של חתיכה אחת בגודל 3 אינץ' וחתיכת הצינור בגודל 12 אינץ'. לצינורות הנותרים, חבר מחברי נעילת לואר זכר לשני הקצוות. חלקים אלה ירכיבו את מכלולי עצי קו הפסולת וקו ההזנה.
2. הרכבת עץ קו פסולת
   1. עקוב אחר התרשים התלת-ממדי המוצג באיור 3B כדי להרכיב את עץ קו הפסולת.
   2. חבר את הקצוות החשופים של צינור ה-E-lab האדום בעל 2 מצבים (1.14 מ"מ ID) למנעולי הזכר הטרמינל בעץ קו הפסולת המורכב. חבר אותם בסדר עולה על סמך אורך צינורות C-flex המחוברים לצינור ה-E-lab בעל 2 המצבים. חבר את צינור ה-C-flex בגודל 3 אינץ' עם דוקרני הלואר הנקבה בגודל 1/8 אינץ' ומחבר נעילת הלואר הזכר לחלק העליון של עץ קו הפסולת.
3. מכלול עץ קו הזנה
   1. עקוב אחר התרשים התלת-ממדי המוצג באיור 3A כדי להרכיב את עץ קו ההזנה.
      הערה: עצי קו ההזנה אינם משלבים את מחברי הלואר מזכר לזכר המשמשים בעץ קו הפסולת. מניסיוננו, מחברים אלה מועדים לדליפה ויכולים להשתחרר בקלות, מה שמגדיל את הסיכון לזיהום הן בתאי הביוריאקטור והן בבקבוקי המדיה. כדי להפחית זאת, עץ קו ההזנה נבנה ללא רכיבים אלה.
   2. חבר את הקצוות החשופים של צינור ה-E-lab הכתום בעל 2 מצבים (0.89 מ"מ ID) למנעולי הזכר הטרמינליים בעץ קו ההזנה המורכב. חבר אותם בסדר עולה בהתבסס על אורך צינור ה-C-flex המחובר לצינור ה-E-lab בעל 2 המצבים. חבר את צינור ה-C-flex בגודל 12 אינץ' לחלק העליון של עץ קו ההזנה.
4. הרכבה מלאה: שלב את הרכיבים המוכנים למערכת תרבית MBRA.
   1. חבר את צינור ה-C-flex באורך משתנה בקצה עץ קו ההזנה לביו-ריאקטור, בסדר עולה, כאשר הקו הקצר ביותר בצד שמאל של רצועת הביוריאקטור והארוך ביותר בצד ימין.
   2. חבר את צינור ה-C-flex באורך משתנה בקצה עץ קו הפסולת לרצועת הביוריאקטור בסדר יורד, כאשר הקו הארוך ביותר משמאל והקצר ביותר מימין. קו הפסולת הקצר ביותר ממוקם בצד ימין של רצועת הביוריאקטור מכיוון שהוא הקרוב ביותר למשאבת הפסולת. לעומת זאת, קו ההזנה הארוך ביותר נמצא בצד ימין מכיוון שמשאבת ההזנה ממוקמת בצד שמאל (איור 1).
5. עיקור מערכים מורכבים: הכן את המערכת המורכבת לעיקור.
   1. צרור את כל קווי ההזנה של C-flex יחד בצד שמאל של ה-MBRA ואבטח בעזרת עניבת טוויסט. עשה את אותו הדבר עבור קווי הפסולת בצד ימין של הרצועה.
   2. צור לולאה עם צינורות ה-E-lab הכתומים בעלי 2 המצבים בין קווי ה-C-flex. אבטח את הלולאה באמצעות סרט חיטוי. עשה את אותו הדבר עבור צינורות המעבדה האלקטרונית האדומים עם 2 עצירות בצד הפסולת של רצועת הביוריאקטור. זה יחסוך מקום במהלך החיטוי.
   3. מכסים את הנקבה בקצה קו הפסולת ועץ קו ההזנה בחתיכת נייר כסף כדי למנוע זיהום לאחר הוצאתו מהחיטוי. שחרר את פתיונות ההברגה הזכריים עם המחיצות בכל תא ביו-ריאקטור כדי לאפשר לאדים לברוח במהלך החיטוי.
      הערה: שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח שאדים יורשו לברוח מהביו-ריאקטור במהלך החיטוי. אם לא מאוורר כראוי, עלול להתרחש סדקים בתאי הביוריאקטור.
   4. הנח את ה-MBRA בפח חיטוי ומתח את קו ההזנה ועצי קו הפסולת לפחים נפרדים הסמוכים לפח המכיל את ה-MBRAs. אם צינורות ה-E-lab ליד דוקרני הנקבה בגודל 1/16 אינץ' או חלקים כלשהם של צינור ה-C-flex מתעקמים במהלך החיטוי, הצינור עלול להיסתם ולהפריע לזרימת המדיה או הפסולת.
   5. חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס, ≥-15 psi למשך 25 דקות. השתמש בתוכנית פליטה איטית האופיינית למחזורי נוזלים. הניחו לביו-ריאקטור להתקרר בטמפרטורת החדר לאחר מחזור החיטוי. לאחר שה-MBRA התקרר מספיק, הדק מחדש את פתיונות הזכר המושחלים עם המחיצות.
      הערה: רצועות ביו-ריאקטור שעברו חיטוי הופכות לגמישות ונוטות להיסדק אם הן דחוסות. אפשר מספיק זמן להתקרר לפני הידוק האבזור.
      הערה: צינור ה-E-lab הכתום בעל 2 עצירות נוטה להיסדק במהלך תהליך החיטוי ועלול להיפרד מהדוקרנים הנקביים בגודל 1/16 אינץ'. אם מתרחש סדק, יש לרסס את שני הקצוות באתנול של 70%, ואז לחתוך את הקצה הסדוק בעזרת סכין גילוח סטרילי ולחבר מחדש את הצינור לדוקרן. לחלופין, ניתן לעקר צינורות E-lab נוספים עם פתיונות נקבה בגודל 1/16 אינץ' מחוברים בנפרד בשקית חיטוי, ולהחליף את כל הצינור.

3. הרכבת מדיה ובקבוקי פסולת

1. מכלול בקבוקי מדיה
   הערה: בדוגמה הנוכחית, המערכת כולה מוזנת בבקבוק יחיד של 2 ליטר. עיין באיור 4A לתמונה של מכלול מכסה בקבוק המדיה.
   1. הברג מתאמי Dibafit (מתאמי מכסה בקבוק) לשתי יציאות ההברגה על גבי מכסה הבקבוק מסדרת Q. הוסף קטע של 3 אינץ' של צינורות C-flex לאחד המתאמים וקטע של 12 אינץ' של צינורות C-flex לשני. לסוף כל קטע צינור, הוסף מחבר מנעול לואר זכר.
      הערה: אורך הצינור הנדרש כדי להגיע לעץ קו ההזנה של ה-MBRA עשוי להשתנות וניתן לכוונן אותו בהתאם.
   2. חותכים חתיכה בגודל 12 אינץ' של צינור PTFE כדי לשמש כקש שממנו ניתן לשאוב מדיה. חותכים את הקצה בזווית של 45 מעלות בעזרת סכין גילוח כדי למנוע סתימה בדופן הבקבוק. הכנס את ה-PTFE לחור הקטן בתחתית מכסה הבקבוק המחובר לקטע 12 אינץ' של צינורות C-flex.
   3. חותכים חתיכה בגודל 2 אינץ' של צינור C-flex ומחברים דוקרני לואר נקבה לקצה אחד ומחבר נעילת לואר זכר לקצה השני. חבר את הצינור הזה לקטע הצינור בגודל 12 אינץ' שבסופו של דבר יתחבר לעץ קו ההזנה. אבטח את החלק בגודל 2 אינץ 'בעזרת פינצ'קוק. הנח את לולאת הפינצ'קוק סביב הצינור בגודל 3 אינץ 'של מכסה הבקבוק. זה ישמש כמעצור זמני למניעת דליפת מדיה במהלך ואחרי החיטוי.
   4. הכן את המדיה הרצויה. התקן את מכסה הבקבוק המורכב במלואו על בקבוק המדיה. עטפו את צינור ה-C-flex בגודל 12 אינץ' סביב הבקבוק ואבטחו את הקצה עם הפינצ'קוק על הצינור בגודל 2 אינץ', כמתואר לעיל. אין להבריג את המכסה בחוזקה, אלא לשחרר אותו מעט כדי למנוע הצטברות לחץ במהלך החיטוי.
   5. השתמש בנייר כסף כדי לכסות את קצה הצינור בגודל 3 אינץ 'הנובע מפקק הבקבוק. אוטוקלאב לזמן המתאים לפרוטוקול התקשורת. לאחר העיקור, הסר את נייר הכסף מהצינור בגודל 3 אינץ' והברג מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר לתוך מחבר נעילת הלואר הזכר. זה יאפשר זרימת אוויר לבקבוק המדיה בזמן השאיבה, אך ימנע זיהום.
      הערה: לפני השימוש, ודא שמכסי הבקבוקים מסדרת Q אטומים היטב על הבקבוקים, שכן אטימה לא נכונה עלולה למנוע זרימה תקינה.
2. הרכבת בקבוקי פסולת: כדי להימנע מהחלפת בקבוקי פסולת מדי יום, המעבדה יצרה מערכת איסוף פסולת מדורגת (איור 4B) המאפשרת למלא בקבוקי 2 ליטר מרובים בפסולת במהלך הניסוי. ההגדרה של מערכת פסולת שכבתית זו היא כדלקמן:
   1. הברג את מתאמי מכסה הבקבוק לשתי יציאות ההברגה על גבי פקק בקבוק מסדרת Q. חזור על הפעולה עבור 2-4 פקקי בקבוקים, תלוי במספר בקבוקי אחסון הפסולת הנדרשים.
   2. חותכים חתיכת PTFE בגודל 2 אינץ' לכל פקק בקבוק. הכנס חתיכה זו בתוך מכסה הבקבוק בחור המיועד לפינוי פסולת לבקבוק הבא במערכת.
   3. חותכים אורך של צינורות C-flex מספיק זמן כדי להימתח בין עץ קו הפסולת הנובע מהמשאבה למיקום מערכת בקבוקי הפסולת. התקן מחבר נעילת לואר זכר לקצה הסמוך לעץ קו הפסולת וחבר את הקצה השני למתאם מכסה הבקבוק ללא צינור ה-PTFE על מכסה הבקבוק.
   4. חותכים אורך שני של צינורות C-flex כדי לחבר את פקקי הבקבוקים בבקבוקי הפסולת הראשון והשני. חבר את הצינור על מתאם מכסה הבקבוק עם קשית ה-PTFE על הבקבוק הראשון ועל מתאם מכסה הבקבוק ללא קשית ה-PTFE בבקבוק השני.
      הערה: כל בקבוק במפל בקבוקי הפסולת המדורגים חייב להיות ממוקם מעל הראשון כדי לאפשר לכוח הכבידה לסייע בזרימה מבקבוק אחד למשנהו (איור 4B). מומלץ להניח את כל הבקבוקים במיכל משני (למשל, פח אחסון פלסטיק פתוח) ולסדר אותם בסדר יורד באמצעות עליות, כגון מיכלים חדים הפוכים.
   5. המשיכו בשרשרת זו לכמה בקבוקים שתרצו. על הבקבוק הסופי, חבר קטע צינור C-flex בגודל 3 אינץ' עם מחבר נעילת לואר זכר למתאם מכסה הבקבוק החינמי. לאחר מכן חבר מזרק של 20 מ"ל כדי להחיל ואקום ולהקל על מפל הפסולת.

4. חיבור, תפעול ופירוק MBRA

1. חיבור למשאבות
   1. הסר את סרט החיטוי המחזיק את צינורות המעבדה האלקטרונית יחד הן עבור קווי הפסולת והן עבור קווי ההזנה. שחרר את צרורות צינורות C-flex.
   2. מקם את ה-MBRA בין שתי המשאבות על גבי צלחת הערבוב. ניתן להדק אותו על הצלחת באמצעות המחזיקים המודפסים בתלת מימד (ראה משלים file 2). ודא שהוא מיושר עם עמדות הערבוב המצוינות על צלחת הערבוב.
   3. חבר את צינור ה-E-lab של קו ההזנה למחסניות המשאבה הפריסטלטית. מקם את העצירות של צינורות ה-E-lab בחריצים במחסניות. עשה את אותו הדבר עבור צינורות המעבדה האלקטרונית של קו הפסולת על המשאבה מימין לצלחת הערבוב.
   4. נעל את מחסניות המשאבה הפריסטלטית לתוך המשאבה. ודא שהמחסניות יושבות במלואן על המשאבה והצינור נמצא בתוך תעלת המחסניות.
      הערה: נעל את המחסניות במקומן על המשאבות רק אם בכוונתך להתחיל את הזרימה תוך 24 שעות. אם משאירים clamp ללא זרימת מדיה למשך יותר מ-24 שעות, הצינורות עלולים להידחס ולהיסתם. אם זה קורה, פשוט הסר את המהדק ועסה בעדינות את הצינור בנקודת הדחיסה.
   5. סדר את צינורות ה-C-flex באמצעות מחזיקי הצינורות המודפסים בתלת מימד (קובץ משלים 3).
   6. חבר את קצה עץ קו הפסולת לצינור המוביל לבקבוקי הפסולת.
      הערה: בעת הפעלת מספר MBRAs, יהיה צורך לחבר את עצי קו הפסולת יחד לפני חיבורם לצינור המוביל לבקבוקי הפסולת. ניתן לעשות זאת על ידי יצירת עץ הסתעפות פשוט עבור כל MMRA נוסף.
   7. חבר את הלואר הנקבי על צינור הכניסה של קו ההזנה למחבר הזכר בצינור ה-12 אינץ' מכובע בקבוק המדיה.
      הערה: שני הקצוות צריכים להיות סטריליים בשלב זה. הימנע מלגעת בהם עם כל מקור זיהום פוטנציאלי. אם יש חשד לזיהום, יש להשרות כל קצה באקונומיקה של 10% למשך 10 דקות לפני החיבור.
   8. הפעל את שתי המשאבות כדי להתחיל בזרימת המדיה. ודא שהמשאבות זורמות בכיוון הנכון (שתיהן מכוונות לכיוון השעון ("CW") אם הפסולת נמצאת מימין למשאבות).
   9. שימו לב לגודל ולקצב של טיפות המדיה הנופלות לכל תא ביו-ריאקטור; כל הבדלים גדולים בכך עשויים להצביע על שונות בקצב הזרימה. אם נצפתה שונות, מומלץ להחליף כל צינור הזנה כתום בעל 2 עצירות E-lab המחובר לתא הביוריאקטור הפוגע. זה יעזור להגביל את שונות קצב הזרימה בריצת הניסוי.
      הערה: זה הזמן לאבחן ולתקן נזילות במערכת, לכן עקוב מקרוב אחר תהליך המילוי הראשוני.
   10. ברגע שתאי הביוריאקטור מגיעים לקיבולת, כבו את שתי המשאבות ואפשרו לביו-ריאקטורים לשבת במשך 24-48 שעות. שלב זה חיוני כדי לבדוק אם יש זיהום פוטנציאלי בתאים לפני תחילת הניסוי.
2. חיסון MBRA
   הערה: כאן אנו מתארים את הפרוטוקול הבסיסי לעיקור המחיצה והזרקת חיסון.
   1. הכן את החיסון לפי המפרט הרצוי.
   2. מרחו תמיסת אקונומיקה טרייה של 10% על החלק העליון של המחיצה על כל תא ביו-ריאקטור באמצעות טפטפת פלסטיק. הפקידו מספיק אקונומיקה כדי לצפות לחלוטין את החלק העליון של המחיצות. תן לזה לשבת 10 דקות. יבש את המחיצה בעזרת מגבון מעבדה סטרילי.
   3. בעזרת מחט באורך 3 אינץ '22 גרם ומזרק המכיל את הדגימה, חודרים את מרכז המחיצות. ודא שהמחט נוגעת במדיה בתוך החדר, ולאחר מכן הזריק את החיסון לתא הביוריאקטור. שטוף את המזרק על ידי הסרת המדיה והזרקתו חזרה לתא. הסר את המחטים מהמחיצה והשליך אותן למיכל חד.
   4. אפשר לחיסון לגדול לתקופה מתאימה, בהתבסס על תכנון הניסוי, לפני תחילת הזרימה. לדוגמה, קהילות חיידקים צואתיות דורשות גידול אצווה ראשוני של 4-16 שעות כדי להגדיל מספיק ביומסה⁸.
   5. הפעל את שתי המשאבות לקצב הזרימה הרצוי, בהתאם לזמן התחלופה הנדרש. עיין במדריך המשאבה הפריסטלטית למידע נוסף על קצבי הזרימה.
      הערה: ללא קשר לקצב הזרימה הרצוי, יש להפעיל תמיד את משאבת הפסולת במהירות גבוהה יותר ממשאבת המדיה כדי להבטיח שתאי הביוריאקטור לא יעלו על גדותיהם. לגידול קהילת החיידקים במערכת העיכול שלנו, אנו משתמשים בקצב תחלופה של 1.92 מ"ל לשעה, המושג על ידי הגדרת משאבת המדיה ל-1.0 סל"ד ומשאבת הפסולת ל-2.0 סל"ד.
   6. שוב, שימו לב לגודל ולקצב של טיפות המדיה הנופלות לכל תא ביו-ריאקטור, כל הבדלים גדולים בכך עשויים להצביע על שונות בקצב הזרימה. אם נצפתה שונות, מומלץ להחליף כל צינור הזנה כתום בעל 2 עצירות E-lab המחובר לתא הביוריאקטור הפוגע. זה יעזור להגביל את שונות קצב הזרימה בריצות ניסיוניות.
3. דגימת MBRA
   1. מרחו תמיסת אקונומיקה של 10% על החלק העליון של המחיצה על כל תא ביו-ריאקטור, מספיק כדי לצפות לחלוטין את פני השטח. תן לזה לשבת 10 דקות. לאחר 10 דקות יש לייבש את המחיצה בעזרת מגבון מעבדה סטרילי.
   2. בעזרת מחט ומזרק באורך 3 אינץ' בגודל 22, חודרים את מרכז המחיצה ומכניסים את המחט במלואה לתא הביוריאקטור. תוך כדי החזקת המזרק, משוך לאחור את הבוכנה כדי להוציא את הדגימה מהתא.
      הערה: הימנע מהסרת יותר מ-20% מהנפח הכולל של תא הביוריאקטור בבת אחת. הסרת יותר מזה עלולה לשבש את הקהילה המיקרוביאלית, שכן פליטת הפסולת נקטעת עד שמדיה טרייה ממלאת מחדש את החדר לרמת קש הפסולת PTFE.
   3. הסר את המחט והוציא את הדגימה למיכל מתאים. השלך את המחט למיכל חד.
4. פירוק ושיפוץ MBRA
   הערה: לאחר ניסויים, יהיה צורך לעקר את ה-MBRA ולהכין אותו לניסויים עתידיים.
   1. החלף את כניסת המדיה עם 1 ליטר של 10% אקונומיקה במים נטולי יונים (DI). הגדל את קצב הזרימה בשתי המשאבות למקסימום כדי לעקור את תכולת תאי הביוריאקטור עם תמיסת האקונומיקה.
   2. לאחר שהתאים מתבהרים (כל המדיה הוחלפה באקונומיקה), הפוך את ה-MBRA לחיטוי מעל קו המילוי למשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, ישר את הרצועה והמתן 5 דקות נוספות לעיקור.
      הערה: אל תאפשר לאקונומיקה לשבת מעבר ל-10 הדקות כמתואר לעיל, מכיוון שהדבר יגרום לשינוי צבע הפלסטיק ולהחלשת המדיה וצינורות הפסולת.
   3. החלף את תמיסת האקונומיקה של 10% ב-1 ליטר מים DI. שטפו את המערכת במי DI עד שכל המים עברו. נתק את צינורות ה-E-lab של הביוריאקטור מהמשאבות והסר את ה-MBRAs.
   4. כדי לשפץ, הסר את המחיצה המשומשת ואת כל המים מלבד 1 מ"ל מכל תא.
   5. החלף את המחיצה ואת צינור ה-E-lab הכתום בעל 2 המצבים ובצע את השלבים הקודמים כדי להתכונן לחיטוי (שלבים 2.5.1 עד 2.5.5) עד 3 פעמים. לאחר השימוש החוזר השלישי, יש לפרק לחלוטין את ה-MBRA, להחליף את צינורות ה-C-flex ולעקר כל חלק בנפרד ב-70% EtOH או להחליף אותו אם נשבר. האפוקסי המחזיק את הפסולת וההזנה PTFE יהפוך שביר לאחר מספר מחזורי חיטוי ויהיה צורך למרוח אותו מחדש.
      הערה: צינורות ה-E-lab הכתומים עם 2 עצירות מוחלפים בין כל ריצה כדי להגביל את שונות קצב הזרימה הנגרמת על ידי בלאי ומחזורי חיטוי חוזרים ונשנים.

Results

כדי להקל על צמיחתם של חיידקים אנאירוביים, כמו אלה הנמצאים במערכת העיכול, ניתן להגדיר ולהפעיל את ה-MBRA בתוך תאים אנאירוביים. כדי להדגים את היכולת לגדל קהילות חיידקים מורכבות ישירות מאתרים רלוונטיים בגוף האדם, הוכנה וגדלה דגימת צואה אנושית במערכת זו. כל העבודה בוצעה בתא אנאירובי שהוגדר ל-37 מעלות צלזיוס, ותרביות גודלו במדיה הביוריאקטורית שלנו, BRM3⁷.

תרחיץ צואה הוכן על ידי הפשרת צואה אנושית באופן אנאירובי ולאחר מכן ערבוב עם מי מלח חוצץ פוספט (PBS) לריכוז סופי של 25% משקל/נפח. לאחר אישור הסטריליות, חוסנו תשעה תאי ביו-ריאקטור כל אחד ב-3 מ"ל של אותה תרחיץ צואה. קהילות מיקרוביאליות גודלו בן לילה ללא קלט מדיה או פינוי פסולת, וכתוצאה מכך תרביות אצווה נפרדות במשך תקופה של 16 שעות. לאחר מכן, משאבות ההזנה הופעלו והוגדרו לקצב זרימה של 1.92 מ"ל לשעה. לאחר ארבעה ימים של זרימה רציפה, נאספו דגימות מהביו-ריאקטורים ונותחו להרכב הקהילה המיקרוביאלית באמצעות ריצוף גנים 16S rRNA ואחריו הפחתת רעשים עם Deblur וסיווג טקסונומי עם מסד הנתונים SILVA 138 SSU ב-QIIME 2¹³. בסך הכל זוהו 65 סוגים בכל תשעת החזרים, אך ביו-ריאקטורים נשלטו על ידי 18 סוגים בלבד, שכל אחד מהם מהווה לפחות 2% שכיחות בכל אחד מתשעת החזרות (איור 5). הביוריאקטורים הראו יכולת שחזור גבוהה כך ש-22 מתוך 65 הסוגים זוהו בכל תשעת החזרות, ו-17 סוגים נוספים זוהו לפחות במחצית מהשכפולים. רוב הסוגים שנעדרו מכור אחד לפחות (37 מתוך 43 סוגים) היו מינים נדירים, כל אחד עם שכיחות יחסית של פחות מ-2% בביו-ריאקטורים. לסיכום, תרביות ה-MBRA בזרימה רציפה תמכו בקהילות מיקרוביאליות מורכבות וניתנות לשחזור שמקורן באותה דגימת צואה, גם לאחר תרביות אצווה נפרדות למשך 16 שעות בכל תא ביו-ריאקטור.

איור 1: מערך המיני-ביו-ריאקטור (MBRA). MMRA מורכב במלואו, כולל תוויות לעץ צינורות קו ההזנה והפסולת, תאי הביוריאקטור ורצועת הביוריאקטור. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מדריך תחריט PTFE ופריסת יציאת MBRA. (A) תרשים זרימה לעקוב אחר תחריט המדיה ופסולת קשיות PTFE. (B) כל תא ביו-ריאקטור מכיל יציאה לקשית מדיה + לואר זכר מושחל, קש פסולת + לואר זכר מושחל, ומחיצה + לואר זכר מושחל. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: עצי הזנה וקווי פסולת של MBRA. תמונות מייצגות שיש לעקוב אחריהן בהרכבה של (A) עץ קו הזנה ו-(B) עץ קו פסולת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: פקק בקבוק מדיה ומערכת שכבות פסולת. (A) דוגמה לפקק בקבוק מורכב מסדרת Q המשמש למשיכת מדיה לתוך ה-MBRAs. (ב) תמונה של מערכת איסוף הפסולת המדורגת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: שפע יחסי של סוגי חיידקים. (A) גרף עמודות מוערם מראה את השפע היחסי של כל הסוגים שמהווים לפחות 2% שפע בכל אחת מהדגימות המוצגות. (B) מדדי גיוון אלפא של OTUs נצפים ומגוון שאנון בין כל תשעת תאי הביוריאקטור. כל תשעת תאי הביוריאקטור חוסנו באותה תרחיץ צואה שהוכן מצואה אנושית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: רכיבי MBRA. תמונות ותיאורים של כל החלקים הבודדים הנדרשים להרכבה מלאה של ה-MBRA, יחד עם הכמות הדרושה לכל רכיב. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: מדריך לפתרון בעיות. בעיות נפוצות שנתקלו בהן בהפעלת ה-MBRA, יחד עם הסיבות הפוטנציאליות והפתרונות המומלצים. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

קובץ משלים 1: Stl file להדפסת תלת מימד של רצועות Minibioreactor Array. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 2: Stl להדפסת תלת מימד של מחזיקי הביוריאקטורים המשמשים לעיגון הביוריאקטורים ללוחות הערבוב. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 3.: Stl file להדפסת תלת מימד של מחזיקי הצינורות המשמשים לארגון פסולת C-flex וצינורות הזנה המשתרעים מה-MBRAs. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה המלאה והתפעול הבסיסי של מערך מיני-ביו-ריאקטור (MBRA) לגידול תפוקה גבוהה של קהילות חיידקים, תוך שילוב מספר שיפורים מרכזיים לשיטה שפורסמה בעבר. מערכת ה-MBRA נותרה כלי רב-תכליתי וחסכוני המאפשר לחוקרים לטפח מערכות אקולוגיות מיקרוביאליות מורכבות תוך תמיכה בשכפולים ניסיוניים רבים במקביל. בגירסה מעודכנת זו, אנו מציגים שיפורים המשפרים את יכולת השחזור, מייעלים את זרימת העבודה ומפחיתים את הסיכון לזיהום. אלה כוללים קשיות PTFE חרוטות כימית (איור 2) למניעת ניתוק, קשית הזנה על קו המדיה (איור 2) כדי למזער את היווצרות הביופילם, אורכי צינורות סטנדרטיים עם מחזיק צינורות מודפס בתלת-ממד נלווה (קובץ משלים 3) עבור התקנה קומפקטית ומאורגנת יותר, ופרוטוקול שימוש חוזר ממוטב המבטל את הצורך בפירוק מלא בין ניסויים. יחד, שיפורים אלה מייצגים שיפורים איטרטיביים שפותחו באמצעות שימוש נרחב במערכת MBRA על פני יישומים ניסיוניים מגוונים במעבדה שלנו. על ידי התייחסות הן לשלבי הרכבה קריטיים והן לשיפורים מעשיים, דיון זה מדגיש את התועלת של ה-MBRA כמערכת מודל המתפתחת ללא הרף לחקר המיקרוביום.

ההצלחה של מערכת MBRA מסתמכת במידה רבה על הרכבה ועיקור מדויקים של רכיבים כדי להבטיח פעולה ללא זיהום. השלבים העיקריים כוללים התאמה נכונה של מכסים, צינורות ומחברים מסדרת Q, המאפשרים הרכבה מודולרית ומאפשרים הזנת מדיה ואיסוף פסולת. הקפדה על איטום הדוק בין בקבוקי מדיה, מאגרי פסולת ותאי ביו-ריאקטור חיונית למניעת דליפות ולשמירה על תנאים סטריליים. שלב קריטי נוסף הוא אימות קצב זרימת המשאבה הפריסטלטית לפני הניסוי, מכיוון שחוסר עקביות עלול להוביל לאספקת מדיה לא אחידה ועלול להשפיע על דינמיקת הצמיחה המיקרוביאלית. רוב המשאבות הפריסטלטיות הרב-ערוציות המשתמשות בקלטות כוללות מנגנון התאמת חסימה, שיש להשתמש בו כדי לכוונן את קצב הזרימה של כל ערוץ. אפילו עם כיול נכון, צינורות המעבדה האלקטרונית נשארים מקור עיקרי לשונות. כדי להפחית זאת, חשוב לנטר חזותית את התדירות והגודל של טיפות המדיה הנכנסות לכל תא ביו-ריאקטור הן במהלך המילוי הראשוני והן במהלך תחילת הניסויים. בדיקות חזותיות אלו מאפשרות זיהוי מוקדם של חוסר עקביות בקצב הזרימה שאחרת עלולות לפגוע בשחזור הניסיוני. טבלה 2 מספקת אסטרטגיות לפתרון בעיות עבור בעיות נפוצות שנתקלו בהן במהלך ההרכבה והשימוש ב-MBRA. שלבי פתרון בעיות אלה מבטיחים שחזור על פני ניסויים ומונעים שיבושים במהלך גידול ארוך טווח.

למרות נקודות החוזק שלה, למערכת MBRA יש מגבלות מסוימות שיש לקחת בחשבון בעת תכנון ניסויים. בניגוד למערכות מתקדמות יותר, ל-MBRA חסרות יכולות ניטור אקטיביות, כגון מדידות צפיפות אופטית בזמן אמת (OD), בקרת pH וויסות טמפרטורה. היעדר מדידה אקטיבית זה מגביל את יכולתה של המערכת לנטר שינויים דינמיים בגידול חיידקים ובפעילות מטבולית בזמן אמת. יתר על כן, בעוד שהמערכת תומכת בגידול אנאירובי בתוך תאים, היא אינה כוללת בקרת גז משולבת, מה שעלול להגביל יישומים הדורשים סביבות מיקרואירופיליות מדויקות או מועשרות ב-CO₂. למחקרים הדורשים בקרה כזו, מערכות חלופיות עם ויסות גז מובנה עשויות להתאים יותר.

מערכת ה-MBRA מציעה יתרונות מרכזיים על פני מודלים קיימים של ביו-ריאקטורים, כולל תפוקה גבוהה, מדרגיות וחסכוניות, תוך שמירה על היכולת לטפח קהילות חיידקים מורכבות בזרימה רציפה כדי לחקות סביבות דינמיות כמו מערכת העיכול האנושית ^6,8,10. העיצוב הקומפקטי והמודולרי שלו מאפשר הפעלה בו-זמנית של ביו-ריאקטורים מרובים, מה שהופך אותו לאידיאלי למחקרים בעלי תפוקה גבוהה כגון סינון קהילות שמקורן בצואה לעמידות בפני פלישת פתוגנים⁹. עיצוב מודולרי זה מספק גמישות ניסיונית נרחבת: כל רצועה יכולה להיות מסופקת על ידי בקבוק מדיה יחיד, כפי שמודגם בפרוטוקול זה, או על ידי עד שישה מקורות מדיה נפרדים, אחד לכל תא ביו-ריאקטור. נפח העבודה נשלט על ידי אורכו של קש פסולת PTFE דק המוחדר ליציאת הפסולת של כל תא, הקובע את גובה הנוזל; בפרוטוקול זה, קשיות 25 מ"מ שומרות על נפח עבודה של 15 מ"ל, אך ניתן להשיג נפחים בין 1-20 מ"ל על ידי חיתוך או הארכה של הקשית. בנוסף, קשיות הזנה קצרות יותר מוכנסות לכניסת המדיה כדי לכוון את הזרימה לכיוון בסיס החדר, מונעות מהמדיה לטפטף במורד דפנות התא ולהפחית את היווצרות הביופילם מעל קו המילוי. ניתן גם לכוונן את מהירויות המשאבה או קוטר צינורות המשאבה כדי לשנות את קצב התחלופה של המערכת. עד כה, נעשה שימוש נרחב במערכת MBRA לחקר השינויים התפקודיים והרכביים של קהילות מיקרוביאליות בתגובה למגוון גורמים, כולל אנטיביוטיקה¹⁰, תרופות לסרטן¹⁴ ותרכובות תזונתיות שונות 12,15,16,17. העיצוב הפשוט והמודולרי הופך אותו לאידיאלי להתאמה לצרכים ניסיוניים שונים. לדוגמה, ה-MBRA שונה לחקר ביופילמים בתנאים דמויי כימוסטט¹⁸, מה שמדגים את הרבגוניות שלו למחקרי אקולוגיה מיקרוביאלית מעבר לתרביות פלנקטוניות.

איטרציות עתידיות של מערכת MBRA עשויות להפיק תועלת משדרוגים הנדסיים נוספים המרחיבים את הפונקציונליות, הדיוק ופוטנציאל התפוקה שלה. שיפור אחד כזה הוא שילוב יציאות נוספות בכל תא ביו-ריאקטור. ניתן להשתמש ביציאות אלו כדי לתמוך בניטור פעיל של פרמטרים סביבתיים כגון pH, טמפרטורה, גז או צפיפות אופטית. זה יטפל באחת המגבלות המשמעותיות ביותר של המודל על ידי מתן משוב וניטור בזמן אמת. שיפורים בגיאומטריית החדר או הנמל יכולים להקל על ניקוי יסודי ונגיש יותר, להפחית הצטברות שאריות ושינוי צבע ולשפר את השימוש החוזר לטווח הארוך. שילוב של משאבות פריסטלטיות נוספות עם טיימרים הניתנים לתכנות יאפשר כניסות מדיה פועמות או יומיות, המדמה טוב יותר סביבות הקשורות למארח כגון מחזורי הזנה במעיים האנושיים. לבסוף, הדפסת תלת מימד עם חומרים חלופיים, כגון פולימרים עמידים כימית וניתנים לחיטוי, עשויה לאפשר עמידות רבה יותר ותאימות למגוון רחב יותר של ריאגנטים. יחד, שיפורים אלה יכולים להרחיב משמעותית את היקף הניסוי והנאמנות של פלטפורמת MBRA.

לסיכום, ה-MBRA מספק פלטפורמה רבת עוצמה עם תפוקה גבוהה לטיפוח ולימוד קהילות מיקרוביאליות בתנאים מבוקרים. אמנם יש לו מגבלות בניטור פעיל ובקרת pH, אך הגמישות, המדרגיות והיעילות שלו הופכות אותו לכלי שלא יסולא בפז עבור מגוון רחב של מחקרים מיקרוביולוגיים, במיוחד אלה הדורשים שכפול גבוה ותפוקה ניסיונית. חשוב לציין, גישת העיצוב והייצור המודולרית של המערכת הופכת אותה לניתנת להתאמה מטבעה; חוקרים יכולים ויכולים להמשיך להתאים את ה-MBRA כך שיתאים למגוון רחב של מטרות ניסוי. יכולת הסתגלות זו מבטיחה שה-MBRA יכול להמשיך להתפתח לצד שאלות וטכנולוגיות מדעיות מתעוררות, תוך שמירה על הרלוונטיות שלו כפלטפורמה רב-תכליתית לחקר המיקרוביום.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מדריך V-Tap, גדלים סטנדרטיים 0-80 עד 5/8 אינץ'	כלי ביג גטור	STD500NP
0.22 μ מסנן מזרק M	פישר	SLGVR33RS
כונן ערבוב 2mag MIXdrive 60 (כונן בלבד)	2MAG	מ.פ 41060
מחטים היפודרמיות Air-tite, 22 גרם x3 אינץ'	VWR	89219-274
BD 1mL קצה החלקה מזרקים סטריליים סטריליים	פישר	14-823-434
ביו-ריאקטור	מעבדות פרוטו	נה	מודפס בתלת מימד מתוך DMS Somos Watershed Plastic. ראה קובץ משלים 1 לתבנית
מחזיקי ביו-ריאקטור	מעבדות פרוטו	נה	הדפסת תלת מימד מתוך PA 12 Black. ראה קובץ משלים 2 לתבנית.
פקק בקבוק ממס מסדרת Q של Diba, GL38/38-430 (זכוכית), 2 יציאות UNF(F) ללא שסתומים, כחול	קול פארמר	EW-21942-86
צינורות Diba Omnifit, PTFE, קוטר חיצוני בגודל 1/8 אינץ' (3.2 מ"מ) x קוטר פנימי 1.5 מ"מ	קול פארמר	EW-21942-76
מתאם Dibafit, 1/4 אינץ'-28 UNF(M) תחתון שטוח עד 3.2 מ"מ פנימי, מבט מהיר	קול פארמר	EW-21941-49
מפתח ברגים IRWIN 12001ZR #0-1/4 אינץ' ידית T	אמזון	B00004YOB0
אירווין הנסון פלדת פחמן גבוהה SAE ברז שבר 1/4 אינץ'. 1 יח '	זורו	G7695682
Loctite כבד חובה אפוקסי סט מהיר 8-נוזל אונקיות בקבוק	אמזון	B0044F59N0
מחבר נעילת Luer זכר לזכר	דרווין מיקרופלואידיקס	DM-MM-LUER-PP	אלטרנטיבה: Strategic Applications Inc מחבר Luer זכר לזכר - 10/pk - Fisher - NC9876577
אביזרי מתאם Masterflex, Luer to Luer, ניילון, אוונטור	VWR	MFLX45502-56
Masterflex אביזרים, ניילון, ישר, נקבה מתאם דוקרני לצינור, מזהה 1/16 אינץ'	VWR	MFLX45502-00
Masterflex אביזרים, ניילון, ישר, נקבה Luer למתאם דוקרני צינור, מזהה 3/32 אינץ'	VWR	MFLX45502-02
Masterflex אביזרים, ניילון, ישר, נקבה מתאמי דוקרנים לצינור, 1/8 אינץ'	VWR	MFLX45502-04
Masterflex אביזרים, ניילון, ישר, זכר Luer Lock למתאם דוקרני צינור, 1/8	VWR	MFLX45505-04
Masterflex אביזרים, ניילון, ישר, זכר Luer x 1/4-28 UNF	VWR	MFLX45505-82
Masterflex הולם, פוליפרופילן, מרפק, נקבה Luer לנקבה Luer Adapter	VWR	MFLX45508-26
Masterflex Ismatec צינורות משאבה, 2 מצבים, Tygon S3 E-Lab, קוטר פנימי 0.89 מ"מ	VWR	MFLX96460-26
Masterflex Ismatec צינורות משאבה, 2 מצבים, Tygon S3 E-Lab, קוטר פנימי 1.14 מ"מ	VWR	MFLX96460-30
Masterflex® צינורות העברה, C-Flex, לבן אטום, קוטר פנימי בגודל 1/8 אינץ' × קוטר חיצוני בגודל 1/4 אינץ'; 25 רגל	VWR	MFLX06424-67
מוהר' s פינצ'קוק לצינורות	VWR	470201-374
מנקי פגוש גומי ניאופרן ו-frac12; ” OD x ו-frac14; ” מזהה x 1/16 אינץ' עובי	אמזון	B01A29F1R0
מחיצת גומי חותם מדויקת	סיגמא אולדריץ'	Z553905
שפינבר מיקרו מוטות סטיג	VWR	58948-375
טטרה-תחריט	חברת R.S. Hughest	TE-500
מחזיק צינורות	מעבדות פרוטו	נה	הדפסת תלת מימד מתוך PA 12 Black. ראה קובץ משלים 3 לתבנית.
משאבת מחסנית רב-ערוצית Watson-Marlow 205S	ווטסון-מרלו	020.3724.00א	מוזל, אלטרנטיבה: משאבות פריסטלטיות דיגיטליות Ismatec IPC MFLX7800142 - FISHER - 113-200-014 או משאבה פריסטלטית Masterflex Ismatec IPC, 0.1 עד 11.25 סל"ד, 24 ערוצים, 115/230 VAC, Avantor, VWR, MFLX78006-48-CH