מאמר שיטה

התקדמות בפרופיל מטבולי של ספרואידים תלת מימדיים של גידולי מוח לבדיקת תרופות

757 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68833

⸱

5 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Innovation and Research, Peking University Third Hospital, 2Cancer Center of Peking University Third Hospital, 3Biobank, Peking University Third Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מקימים פלטפורמת פרופיל מטבולי המשלבת ספרואידים גליומה תלת מימדיים (תלת מימדיים) ונורמליזציה מבוססת הדמיה באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי. גישה זו מאפשרת הערכה מדויקת יותר של התגובות המטבוליות של הגידול לטיפולים תרופתיים ומספקת תובנות לגבי מנגנוני עמידות פוטנציאליים.

תקציר

גידולי מוח, במיוחד גליומות, מאתגרים לטיפול בגלל אופיים האגרסיבי, מיקרו-סביבת הגידול המורכבת והעמידות לטיפולים קונבנציונליים. תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות (2D) לרוב לא מצליחות לשכפל את סביבת הגידול האמיתית, מה שמוביל לתחזיות לא מדויקות של יעילות התרופה. טכנולוגיית ניתוח שטף חוץ-תאי, המשמשת בדרך כלל לניתוח מטבולי בזמן אמת בתרבויות דו-ממדיות, מודדת פרמטרים מטבוליים מרכזיים, כגון קצב החמצה חוץ-תאית (ECAR) וקצב צריכת חמצן (OCR), ומספקת תובנות לגבי חילוף החומרים התאי. השימוש במודלים תלת מימדיים מייצג התקדמות משמעותית, מכיוון שהם מחקים בצורה מדויקת יותר את סביבת הגידול in vivo . מנתח השטף החוץ-תאי הותאם למודלים תלת מימדיים (תלת מימדיים) של תאי גליומה, המאפשרים ניתוח של מסלולים מטבוליים קריטיים, כולל גליקוליזה וזרחון חמצוני, בהקשר רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית.

תאי U87 נזרעו בצפיפות מתאימה בצלחת הצמדה נמוכה של 96 בארות ותרבית במשך 5 ימים. ביום החמישי, נצפתה היווצרות ספרואידים תלת מימדיים באמצעות הדמיה בעלת תוכן גבוה. לאחר מכן הועברו הספרואידים שנוצרו בהצלחה ללוחית בדיקה מטבולית מצופה בפולי-L-ליזין לניתוח מטבולי. כדי לשפר את הדיוק של מדידות אלה, מערכות הדמיה בעלות תוכן גבוה מעריכות את גודל התא התלת-ממדי, ומאפשרות נורמליזציה מדויקת של נתוני שטף חוץ-תאי וממזערות שינויים מטבוליים עקב הבדלים בגודל התא. גישה משולבת זו מספקת ניתוח אמין יותר של התגובות המטבוליות של תאי גליומה לטיפולים תרופתיים, וחושפת מנגנונים פוטנציאליים של עמידות לתרופות. בסופו של דבר, מתודולוגיה זו מציעה תובנות חשובות לגבי הדינמיקה המטבולית של גליומות ותומכת בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות ורלוונטיות מבחינה קלינית.

מבוא

גליומות, צורה נפוצה ואגרסיבית של גידול במוח, מהוות אתגרים קליניים משמעותיים בגלל התקדמותן המהירה, מיקרו-סביבת הגידול ההטרוגנית ביותר והעמידות הניכרת לטיפולים קונבנציונליים1. מורכבויות אלה מחייבות מודלים ניסיוניים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית כדי לשפר את הדיוק של הערכות טיפוליות. מערכות תרבית תאים דו-ממדיות מסורתיות (2D) אינן מצליחות לסכם את ארכיטקטורת הגידול in vivo ואת האינטראקציות בין תאים2, מה שמוביל לעתים קרובות למסקנות מטעות לגבי יעילות התרופות וביולוגיה של הגידול3.

כדי להתמודד עם מגבלות אלה, מודלים תלת מימדיים של גידולים (תלת מימדיים) התגלו כחלופה מעולה, המציעה רלוונטיות ביולוגית משופרת על ידי חיקוי המאפיינים המבניים והתפקודיים של גידולים in vivo 4,5. במקביל, תכנות מחדש מטבולי מוכר יותר ויותר כסימן היכר של התקדמות גליומה ועמידות לטיפול 6,7,8. ניתוח שטף חוץ-תאי הפך לטכניקה שאומצה באופן נרחב למדידה בזמן אמת של פרמטרים מטבוליים מרכזיים, כגון קצב החמצה חוץ-תאית (ECAR, מדידת פליטת פרוטונים בעיקר מייצור לקטט גליקוליטי) וקצב צריכת החמצן (OCR, כימות ניצול חמצן מיטוכונדריאלי בזרחון חמצוני), המספק תובנות קריטיות לגבי מסלולי זרחון גליקוליטיים וחמצונים 9,10,11.

במחקר זה, ניתוח שטף חוץ-תאי הותאם לניתוח ספרואידים תלת מימדיים של גליומה, מה שמאפשר חקירה של מסלולים מטבוליים בהקשר הדומה מאוד לתנאי גידול in vivo . תאי גליומה U87 נזרעו בצפיפות של 1,500 תאים לבאר בצלחות שקופות עם תחתית עגולה ונמוכה במיוחד עם 96 בארות ותרבית במשך 5 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 כדי להקל על היווצרות ספרואידים. נעשה שימוש בהדמיה בעלת תוכן גבוה כדי לאשר את המורפולוגיה הספרואידית ולהעריך את גודל התא. לפני הניתוח המטבולי, ספרואידים תלת מימדיים צפופים ומעגליים בקוטר של כ-220 מיקרומטר הועברו ללוחות בדיקה מצופים מראש בפולי-L-ליזין כדי להבטיח יציבות הידבקות ומדידה. חשוב לציין, נורמליזציה של נתונים מטבוליים על בסיס גודל הכדור בוצעה באמצעות הדמיה משולבת בעלת תוכן גבוה, הפחתת השונות ושיפור אמינות הנתונים.

פלטפורמה משולבת זו, המשלבת תרבית תלת מימדית, טכנולוגיית ניתוח שטף חוץ-תאי ונורמליזציה מבוססת הדמיה, מאפשרת הערכה מדויקת יותר של התגובות המטבוליות של גליומה להתערבויות טיפוליות. מחקר זה מספק מסגרת איתנה לחקר היסודות המטבוליים של עמידות לתרופות ותורם לפיתוח אסטרטגיות טיפול יעילות יותר הניתנות לתרגום קליני לגליומות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: המפרט המלא של כל הריאגנטים והחומרים המתכלים מפורט בטבלת החומרים.

1. תרבית תאים דו-ממדית

  1. שמור על תאי U87 במדיום חיוני מינימלי (MEM) בתוספת 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS) בתנאים סטריליים. בצע הליכי מעבר סטנדרטיים ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80%.
    הערה: לאורך תהליך התרבית, עקוב מקרוב אחר מצב התא והוצא תאים המציגים צמיחה חריגה או שינויים מורפולוגיים מהניסויים הבאים.
  2. זרע תאי U87 לתוך תכלי תרבית תאים בגודל 10 ס"מ ודגירה באינקובטור תרבית תאים סטרילי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% (v/v) CO2 ו-90-95% לחות יחסית.
    הערה: יש להחליף את המדיום באופן קבוע כדי לשמור על תנאי גידול אופטימליים.

2. 3D היווצרות ספרואידים של תאים

  1. הכנה לניסויים
    1. סקור את זרימת העבודה כולה באיור 1 לפני שתתחיל בהליכים ניסיוניים.
      זהירות: הקפידו על טכניקות אספטיות לאורך כל הניסוי כדי להבטיח את בריאות התא ולמנוע זיהום.
  2. דיסוציאציה וספירת תאים
    1. הסר את המדיום המושקע מכלי תרבית התאים ושטוף את תאי U87 שלוש פעמים עם 9 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) (3 מ"ל לשטיפה). השלך ריאגנטים משומשים בתמיסת אקונומיקה של 20-25% (v/v) כדי לנטרל את כל החומרים הביו-אקטיביים.
    2. מוסיפים לתבשיל 1 מ"ל תמיסת טריפסין ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות. נטרל טריפסין עם 2 מ"ל של DMEM המכיל 10% FBS שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס לאחר ניתוק כל התאים תחת תצפית מיקרוסקופית.
    3. העבירו את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 200 × גרם למשך 3 דקות. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את כדור התא ב-1 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS. פזרו את התאים בעדינות כדי להבטיח מתלה תאים אחיד. לאחר מכן ספרו באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי, ורשמו את ספירת התאים הראשונית.
      הערה: טפל בתאים בעדינות במהלך הכביסה והוספת המדיה כדי למנוע נזק מכני. ניתן לשלוט בכוח הפיפטינג כדי למנוע היווצרות בועות, מה שעלול להשפיע על כדאיות התא ודיוק הספירה.
  3. דילול תרחיף תאים
    1. מחממים את המדיום שאינו בשימוש ל -37 מעלות צלזיוס. שמור על מתלי התאים בטמפרטורת החדר (RT; 25 ± 2 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות.
    2. על בסיס ספירת התאים הראשונית, יש לדלל את תרחיף התאים עם DMEM המכיל 10% FBS לנפח סופי של 20 מ"ל, מה שמבטיח כ-200,000 תאים.
      הערה: לפני הדילול הסופי, פיפטה בעדינות את מתלה התא כדי למנוע שקיעה. המדיום הלא מנוצל נשמר ב-37 מעלות צלזיוס, ומתלי התאים הודגרו ב-RT. אם נזרעו 96 בארות עם 1,500 תאים לבאר, הוכן נפח כולל של 22 מ"ל כדי להסביר עודף. תרחיף התאים המדולל הועבר לצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל ועורבב היטב.
  4. זריעת תאים בצלחות 96 בארות חיבור נמוכות במיוחד
    1. מערבבים היטב את מתלה התא הסופי באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר. הוסף 200 מיקרוליטר של המתלה (1,500 תאים / באר) לאט לכל באר של צלחת חיבור שקופה עם תחתית עגולה נמוכה במיוחד של 96 בארות לאורך הקצה.
      הערה: ליעילות, שקול להשתמש בפיפטה רב-ערוצית.
    2. השלך את כל המתלה שנותר לאחר מילוי כל הבארות כדי למנוע זיהום.
  5. צנטריפוגה
    1. אטום את הצלחת היטב עם פרפילם כדי למנוע דליפה במהלך הצנטריפוגה. צנטריפוגה את התערובת בחום של 200 × גרם למשך 2 דקות כדי לגלול את התאים בתחתית כל באר.
    2. מוציאים את הצלחת מהצנטריפוגה, מסירים בזהירות את הפרפילם ומניחים את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 .

3. ציפוי פולי-D-ליזין של לוחות הבדיקה המטבולית

הערה: מיקרו-צלחת בדיקה מטבולית היא מיקרו-צלחת מיוחדת המיועדת להדבקה ספרואידית של תאים במהלך ניתוח שטף חוץ-תאי.

  1. הכן תמיסת ציפוי על ידי המסת 5 מ"ג פולי-D-ליזין ב -50 מ"ל מים סטריליים. מערבבים היטב.
  2. הוסף 30 מיקרוליטר מתמיסת הציפוי לכל באר של צלחת הבדיקה המטבולית. ודא היעדר בועות על ידי ניעור עדין או שאיבת התמיסה העודפת.
  3. דגרו את הצלחת וכסו אותה למשך 20 דקות ב-RT. שאפו את תמיסת הציפוי, ושטפו את הבארות פעמיים עם 200 מיקרוליטר מים סטריליים.
  4. יבש את הצלחת באוויר למשך 30 דקות לפחות ולאחר מכן חמם ב-37 מעלות צלזיוס ללא CO2 למשך 30 דקות כדי לייצב את הציפוי.
  5. הוסף 175 מיקרוליטר של מדיום שחומם מראש לכל באר, ושמור את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה נטולת CO2 עד שהיא מוכנה להעברת ספרואיד תאים.

4. ניטור צמיחה ספרואידית

  1. העבר את לוחות הספרואידים למערכת הדמיה בעלת תכולה גבוהה לאחר 5 ימי תרבית.
  2. פרמטרי הדמיית תצורה: הגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס ואת ה-CO2 ל-5%, והתאם את סוג הצלחת, הערוצים וטווח המיקוד.
  3. רכוש תמונות ספרואידיות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרות פי 10 ותוכנת הדמיה.
  4. זהה בארות המכילות ספרואידים שלמים (למשל, איור 2A-C) ורשום את מיקומם להעברה. אל תכלול בארות עם ספרואידים לא סדירים (למשל, איור 2D)."

5. טיפול בכדורים

הערה: הטיפול התרופתי בוצע על ספרואידים תלת מימדיים בוגרים כדי להעריך תגובות מטבוליות.

  1. הקצאת קבוצת ספרואידים
    1. הקצה ספרואידים שלמים לשתי קבוצות:
      קבוצת ביקורת: 6 בארות שכפול
      קבוצת טיפול: 6 בארות משוכפלות (מטופלות בפנופיבראט)
  2. הכנת תמיסת תרופות
    1. הכן את תמיסת העבודה של פנופיברט במדיום טרי שחומם מראש בריכוז האופטימלי (למשל, 100 מיקרומטר).
      הערה: קבוצות הטיפול הוקמו מחדש ב-100% DMSO ליצירת תמיסות מלאי, אשר לאחר מכן דוללו במדיום טרי שחומם מראש. קבוצות הביקורת קיבלו את אותו ריכוז סופי של DMSO (0.1% v/v) כפי שהיה קיים בדגימות שטופלו בתרופות. הריכוז הסופי נקבע באמצעות מבחני מינון-תגובה.
  3. תחליף בינוני
    1. שאפו 100 מיקרוליטר מדיום מכל באר לאט לאורך הקיר.
      הערה: הימנע ממגע עם תחתית הבאר כדי למנוע הפרעה כדורית.
    2. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום טרי לבארות הבקרה.
    3. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה פנופיברט לבארות הטיפול.
  4. דגירה לאחר הטיפול
    1. מחזירים את הצלחת בעדינות ל-37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 . תרבית במשך 72 שעות.
  5. הערכה מורפולוגית
    1. הערך את תקינות הספרואידים לאחר הליך ההדמיה בשלב 4.

6. העברת ספרואידים תאים

  1. הסר בזהירות את לוחית החיבור הנמוכה המכילה ספרואיד ממערכת ההדמיה והנח אותה על משטח סטרילי בתוך ארון בטיחות ביולוגית. הנח את לוחית הבדיקה המצופה פולי-L-ליזין צמודה זו לזו לצורך העברה.
  2. חתוך את קצה הפיפטה של 20 מיקרוליטר כדי להקל על שאיפה עדינה של ספרואידים של התא ללא נזק.
  3. שאפו בעדינות כל כדור שלם מתחתית הבאר והעבירו אותו לבאר המתאימה של צלחת התא, מה שמאפשר לו להתיישב במשך 20 שניות. אשר הידבקות על ידי היעדר שברים צפים מתחת למיקרוסקופיה של 10×.
  4. חזור על הפעולה עבור כל הספרואידים וודא את יעילות ההעברה באמצעות מערכת ההדמיה המתוארת בשלב 4.

7. בדיקה מטבולית

  1. הסרת גז לדוגמא
    1. הנח את לוחית הבדיקה הספרואידית שטופלה בתרופות בתא הידרציה מאוזן מראש של 37 מעלות צלזיוס נטול CO2.
      הערה: הסרת גז רציפה בוצעה במשך שעה אחת עם בקרה סביבתית קפדנית כדי להבטיח דיוק מדידה מטבולית.
  2. הכנת ריאגנטים ומתן תרופות
    1. במקביל הכינו את המגיב וטענו את התרופה במהלך תקופת הסרת הגז של שעה.
      הערה: המטרה העיקרית של ניסוי זה היא להעריך את הלחץ המיטוכונדריאלי; כל הנהלים חייבים להיות מותאמים בקפידה למטרה זו. יש לעקוב אחר פרוטוקולים ספציפיים עבור סוגי ניסויים שונים כדי להבטיח דיוק ואמינות נתונים.
    2. הכנת תרופות: השתמש בתרכובות הבאות:
      אוליגומיצין (מעכב קומפלקס מיטוכונדריאלי V)
      קרבוניל ציאניד-4 (טריפלואורומטוקסי) פנילהידרזון (FCCP, מפרק)
      תערובת של רוטנון (מעכב קומפלקס I) ואנטימיצין A (מעכב קומפלקס III)
      הערה: התרופות התקבלו מערכת בדיקת המאמץ המיטוכונדריאלי ששימשה במחקר זה. תרכובות מסוימות מסוכנות ביולוגית; יש להשתמש בפרוטוקולי בטיחות ביולוגית קפדניים (ציוד מגן אישי ומוכנות לשעת חירום).
    3. ניסוח תרופות
      1. הכן את תמיסות המלאי של תרופות האבקה כפי שמוצג בטבלה 1.
      2. לדלל את תמיסות המלאי לריכוזי העבודה המפורטים בטבלה 2.
        הערה: התמיסות מערבולות או מעורבלות ביסודיות כדי להבטיח הומוגניות על פני שיפועי ריכוז.
  3. טעינת תרכובות למחסניות בדיקה לגילוי
    הערה: מחסנית בדיקה לזיהוי היא מחסנית חד פעמית המכילה בדיקות חיישן ביולוגי למדידה בזמן אמת של חמצן ו-pH.
    1. הפעלת מחסנית בדיקה (חייבת להקדים את טעינת המתחם):
      הערה: ודא את הפעלת החיישן על ידי השלמת השלבים הבאים לפחות 12 שעות לפני השימוש:
      1. הוסף 200 מיקרוליטר מתמיסת הקליברנט לכל באר של צלחת ההידרציה.
      2. מקם את מחסנית בדיקת הזיהוי בזהירות על לוחית ההידרציה, והבטיח טבילה מלאה של כל הבדיקות בתמיסת הקליברנט.
      3. דגרו את היחידה המורכבת בחממה נטולת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12-24 שעות כדי להפעיל את החיישנים.
        הערה: טבילה לא שלמה או הידרציה לא מספקת גורמת לסחיפה במדידה (±שגיאת OCR של 15%).
    2. השתמש בפיפטות רב-ערוציות או אלקטרוניות כדי לספק נפחים מדויקים לבארות, תוך הימנעות מטיפות שיוריות בקצוות הבאר.
      הערה: מכיוון שאין צורך בגירוי תרופתי חריף, עקוב אחר רצפי הטעינה הסטנדרטיים.
    3. הנח את לוחית הבדיקה על משטח יציב לאחר הטעינה כדי למנוע הפרעות במהלך ההובלה.
      הערה: דיוק הטעינה משפיע באופן משמעותי על התוצאות.
  4. תצורת תוכנה
    1. הפעל תוכנה ובחר את פרוטוקול בדיקת המאמץ המיטוכונדריאלי.
    2. הקצה קבוצות בהתאם לקיבוץ הניסוי שהוגדר מראש.
    3. הגדר את שם הקובץ ולחץ על התחל הפעלה.
  5. כיול מחסניות בדיקת זיהוי.
    1. הכנס בעדינות את לוחית הבדיקה הטעונה לחריץ המכשיר לפי הנחיית המערכת.
    2. התחל כיול (15-20 דקות). לשמור על תנאים יציבים; הימנע מרעידות.
    3. הסר את לוחית ההידרציה מיד לאחר הכיול (בהתאם להוראות שעל המסך).
      הערה: הסר את מכסה הצלחת לפני הכיול.
  6. פרופיל מטבולי של ספרואידים תלת מימדיים
    1. העבר את לוחית הבדיקה הספרואידית התלת-ממדית נטולת הגז לחריץ מדידת המכשיר. ודא יישור מדויק עם מערך הבדיקה על ידי אישור הדברים הבאים: (i) מכווני חריץ התאמה בפינת הצלחת; (ii) באר A1 מיושרת עם המיקום באינדקס; (iii) אין רווח גלוי בין הצלחת למשטח המכשיר
    2. לחץ על התחל כדי להתחיל בדיקות מאמץ מיטוכונדריאלי (משך: ~1.5 שעות). עקוב אחר פרמטרי המכשיר לאורך כל הדרך.
      הערה: הסר את מכסי לוחית הבדיקה התלת-ממדית לפני המדידה.
  7. ניתוח נתונים
    1. ניתוח הדמיה
      1. העבר לוחות בדיקה ספרואידיים תלת-ממדיים למערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה.
        הערה: התמונות נרכשו כמתואר בשלב 4. הדמיה גילתה שרוב הספרואידים נשארו שלמים, בעוד שמיעוטם סבלו מנזק במהלך תהליך ההעברה, כפי שמוצג באיור 3.
      2. נתח את הנתונים המורפולוגיים (למשל, שטח, אורך, רוחב) של ספרואידים של התא באמצעות תוכנת הרמוני גרסה 5.2, לפי שלבים 7.7.1.3-7.7.1.7.
      3. החילו את המודול Texture Region בצורה גסה כדי להפריד בין ספרואידים תלת-ממדיים לרקע באמצעות חלוקת תוכן התמונה לשלושה אשכולות על בסיס תכונות המרקם של עצמים בתמונות.
      4. החל את מודול Find Image Region כדי לחדד את ההפרדה של ספרואידים תלת-ממדיים מבודדים מראש באמצעות מאפייני גודל מבוססי נפח כדי להסיר זיהומים ולשמור על ספרואידים שלמים.
      5. למדוד את הפרמטרים המורפולוגיים של הספרואידים התלת-ממדיים באמצעות מודול מאפייני מורפולוגיה .
      6. החל את המודול Select Population כדי לסנן בסופו של דבר ספרואידים מקוריים של תאים תלת-ממדיים.
      7. ייצא את תוצאות הנתונים המורפולוגיים, כפי שמוצג בטבלה 3.
    2. עיבוד נתונים
      הערה: נרמל את נתוני התא באמצעות פרמטרים מיציאות ההדמיה כדי למזער חפצים ניסיוניים.
      1. פתח את הנתונים המטבוליים הגולמיים באמצעות תוכנת הניתוח.
      2. בחר באפשרות נורמליזציה כדי לגשת לממשק העריכה של מצב הנורמליזציה.
      3. הזן את שטח החתך של ספרואידים הכלולים בכל באר מתאימה של לוחית הבדיקה בשדה ערכי נורמליזציה .
      4. הגדר את פרמטר גורם קנה המידה ל- 1,000,000.
      5. לחץ על החל כפתור כדי לסיים את תהליך הנורמליזציה. התוצאות הסופיות מוצגות באיור 4.

8. פינוי פסולת

  1. השלך את כל הפסולת הניסיונית (מדיה, ריאגנטים, חומרים מתכלים ותרחיפים לתאים) בהתאם לפרוטוקולי ניהול פסולת ביולוגית ומעבדה. חיטוי או חיטוי כימי של הפסולת הביו-אקטיבית לפני סילוקה, כדי למנוע זיהום סביבתי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שלושת השלבים הקריטיים ביותר בתהליך גילוי חילוף החומרים האנרגטי של ספרואידים של תאים תלת-ממדיים הם תרבית של ספרואידים תלת-ממדיים, תהליך העברת הספרואידים והדמיה וכימות של ספרואידים לאחר הגילוי (איור 1). בנוסף, התבוננות במצב הספרואידים של התא חשובה ביותר. כאשר הניסויים נערכו בהתאם להליכי הניסוי שהוזכרו לעיל, ספרואידים זוהו ביוםהחמישי (איור 2), והספרואידים גדלו לשטח ממוצע של כ-50,000 מיקרומטר רבוע (טבלה 3). אם רוצים להאריך את זמן הצמיחה ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההתאמה של ניתוח שטף חוץ-תאי למודלים של גליומה תלת מימדית מייצגת התקדמות מתודולוגית קריטית בחקר חילוף החומרים של תאי הגידול. בעוד שתרבויות דו-ממדיות מסורתיות שימשו זה מכבר כבסיס לניסויים במבחנה , הן אינן מצליחות ללכוד את הארכיטקטורה המרחבית, אינטראקציות תא-תא ומטריצת תא, ושיפועי חמצן וחומרים מזינים האופייניים לגידולים in vivo 12. תכונות אלה רלוונטיות במיוחד בגליומות, שבהן תכנות מחדש מטבולי ממלא תפקיד מפתח בהתקדמות הגידול ובעמידות לטיפול

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין, מספרי מענקים 82471329 ו-82001248.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 10 ס"מקורנינג430167
צינור צנטריפוגה 15 מ"לקורנינג430791
צינור צנטריפוגה 50 מ"לקורנינג430828
קלצ'ין, AMInvitrogenC1430
רוזנת 3תרמו פישרמונה תאים אוטומטי
סרום בקר עובריג'יבקוA5669701
הרמוניה 5.2פרקין אלמרתוכנת הדמיה
הוכסט 33342סולארביוג0031
MEM EBSS בינוניהייקלוןSH30024.01
אופרטה CLSפרקין אלמרמערכת ניתוח הדמיה בעלת תוכן גבוה
PBSהייקלוןSH30256.01
פולי-D ליזין הידרוברומידסיגמא עמ' 7280
צלחות חיבור אולטרה-נמוכות עם תחתית עגולה 96 בארותקורנינג4515
תוכנת Seahorse Wave Desktopזריז
סוסון ים XFe96זריזמכונת בדיקה מטבולית חוץ-גופית
סורוול ST8Rתרמו פישרצנטריפוגה
טריפסין 0.25% EDTAג'יבקו25200072
קו תאים U87MG תשתית לאומית של משאבי תא
תמיסת גלוקוז XF 1.0 M, 50 מ"לזריז103577-100
תמיסת פירובט XF 100 mM, 50 מ"לזריז103578-100
תמיסת גלוטמין XF 200 מ"מ, 50 מ"לזריז103579-100
תמיסת קליברנט XF 500 מ"ל זריז100840-000
ערכת בדיקת מאמץ מיטו תא XFזריז103015-100
XF DMEM בינוני, pH 7.4, 500 מ"לזריז103575-100
XFe96/XF Pro מערך בדיקה לזיהוי Fluxpakזריז103792-100
XFe96/XF Pro Fluxpak-צלחות בדיקה מטבוליותזריז103792-100

מקורות

  1. Wu, W., et al. Glioblastoma multiforme (GBM): An overview of current therapies and mechanisms of resistance. Pharmacol Res. 171, 105780(2021).
  2. Crowley, A. E. 85th annual report on medical education in the United States. Executive summary. Jama. 254 (12), 1553-1554 (1985).
  3. Zhang, X., et al. Nutritionally physiological cell culture medium and 3D culture influence breast tumor proteomics and anticancer drug effectiveness. Pharmacol Res. 210, 107519(2024).
  4. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
  5. Bahl, R., et al. Growing desmoplastic three-dimensional pancreatic cancer spheroids from coculture. J Vis Exp. 211, e66625(2024).
  6. Faubert, B., Solmonson, A., Deberardinis, R. J. Metabolic reprogramming and cancer progression. Science. 368 (6487), eaaw5473(2020).
  7. Baksh, S. C., Finley, L. W. S. Metabolic diversity drives cancer cell invasion. Nature. 605 (7911), 627-628 (2022).
  8. Yoshida, G. J. Metabolic reprogramming: The emerging concept and associated therapeutic strategies. J Exp Clin Cancer Res. 34, 111(2015).
  9. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).
  10. Hong, X., Muñoz-Cánoves, P. Measuring oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in muscle stem cells using a Seahorse analyzer: Applicability for aging studies. Methods Mol Biol. 2640, 73-88 (2023).
  11. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol Cells. 47 (8), 100095(2024).
  12. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).
  13. Rybkowska, P., et al. The metabolic changes between monolayer (2D) and three-dimensional (3D) culture conditions in human mesenchymal stem/stromal cells derived from adipose tissue. Cells. 12 (1), 178(2023).
  14. Białkowska, K., Komorowski, P., Bryszewska, M., Miłowska, K. Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures-examples of methods of preparation and the most important application. Int J Mol Sci. 21 (17), 6225(2020).
  15. Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186(2020).
  16. Juarez-Moreno, K., Chávez-García, D., Hirata, G., Vazquez-Duhalt, R. Monolayer (2D) or spheroids (3D) cell cultures for nanotoxicological studies? Comparison of cytotoxicity and cell internalization of nanoparticles. Toxicol In Vitro. 85, 105461(2022).
  17. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. Elife. 9, e52904(2020).
  18. Beaufort, I. N., et al. Author commentary on Ilse N. Beaufort et al. Endoscopy. 56 (5), v6(2024).
  19. Liu, D., Chen, S., Win Naing, M. A review of manufacturing capabilities of cell spheroid generation technologies and future development. Biotechnol Bioeng. 118 (2), 542-554 (2021).
  20. Trettner, K. J., Hsieh, J., Xiao, W., Lee, J. S. H., Armani, A. M. Nondestructive, quantitative viability analysis of 3D tissue cultures using machine learning image segmentation. APL Bioeng. 8 (1), 016121(2024).
  21. Dominijanni, A. J., Devarasetty, M., Forsythe, S. D., Votanopoulos, K. I., Soker, S. Cell viability assays in three-dimensional hydrogels: A comparative study of accuracy. Tissue Eng Part C Methods. 27 (7), 401-410 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Poly D Lysine

מאמרים קשורים