הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת חדירות מחסום המעי על ידי זיהוי שטף של עוקבים פלואורסצנטיים על פני חד-שכבות קולונואידים אנושיות

1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68857

⸱

17 באוקטובר 2025

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Children's Hospital Colorado, 2Department of Medicine, Mucosal Inflammation Program, Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Colorado, 3Rocky Mountain Veterans Hospital

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים טכניקה למדידת שלמות מחסום המעי, לפיה קצב הטרנסלוקציה של סוכר מתויג פלואורסצנטי בגודל ידוע משקף את החדירות של קולונואידים במעי אנושי שמקורם ברקמות.

תקציר

מחסום המעי הוא אתר קריטי של ויסות בין אנטיגנים לומינליים למערכת החיסון המארח, וחוסר הוויסות שלו מעורב במחלות מרובות במערכת העיכול. אורגנואידים במעי יכולים להיות כלי שימושי להבנה ולמידול הבדלים בשלמות מחסום המעי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המשתמש בקולנואידים אנושיים כדי לכמת הבדלי מחסום מעיים תפקודיים על ידי מדידת השטף של עוקבים פלואורסצנטיים על פני חד-שכבות אורגנואידים. לאחר גידול חד-שכבות למפגש, אנו מוסיפים עוקב פלואורסצנטי, כגון FITC-dextran, לתא האפיקלי ומזהים את הטרנסלוקציה שלו לתוך החדר הבסיסי לאורך זמן. טרנסלוקציה מוגברת של העוקב הפלואורסצנטי משקפת מחסום אפיתל חדיר יותר, או חלש יותר. פרוטוקול זה הוא פלטפורמה ניתנת להתאמה המאפשרת הערכה של הבדלים במחסום המעי התפקודי על פני מספר מצבים במקביל. באמצעות וריאציות של פרוטוקול זה, ניתן להעריך חדירות טרנס-אפיתל למולקולות בעלות גודל, צורה ומבנה כימי שונים, כמו גם הבדלי חדירות בהקשר של טיפולים מבודדים או שינויים מיקרו-סביבתיים בצד האפיקלי או הבסיסי של תאי האפיתל. זה מאפשר הבנה מעמיקה יותר של המנגנון והטיפול בשיבוש מחסום במצבי מחלה.

מבוא

רירית המעי היא מבנה מורכב הממלא תפקיד חשוב בוויסות המגע בין המטבוליטים, האנטיגנים והחיידקים בלומן המעי לבין מערכת החיסון ומחזור המעי. תאי אפיתל המעי הם מרכיב מרכזי במערכת זו, ובתנאים בריאים יוצרים מחסום סלקטיבי ביותר. הובלה על פני האפיתל יכולה להתרחש באמצעות מנגנונים מרובים: הובלה אקטיבית או פסיבית טרנס-תאית, נקבוביות פרא-תאיות או מסלולי דליפה המווסתים על ידי צמתים הדוקים וצמתים נצמדים. האם מולקולה יכולה להשתמש באחד מהמסלולים הללו כדי לעבור על פני האפיתל נקבעת על ידי ההידרופוביות, הגודל והמבנה הכימי. ברגע שהן חוצות את האפיתל, מולקולות אלו יכולות לקיים אינטראקציה ביתר קלות עם תאי חיסון ריריים ולהיכנס למחזור הדם או הלימפה של המעי 1,2 הפרעה במחסום המעי היא סימן היכר של מספר מחלות דלקתיות במערכת העיכול, כגון מחלת מעי דלקתית ומחלת צליאק 1,3,4,5,6,7. מחסום מעיים מוחלש זה נחשב כממלא תפקיד בפתופיזיולוגיה של תהליכי מחלה אלה באמצעות טרנסלוקציה לא מווסתת של אנטיגנים פתוגניים, שיכולים ליצור תגובה דלקתית מקומית או מערכתית.

ישנם מספר פרוטוקולים מבוססים למדידת מחסום המעי. מחקרי מבחנה משתמשים באופן מסורתי בקווי תאים סרטניים, כגון תאי T84 או Caco-2, כדי למדוד התנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית (TEER) ולכמת רכיבי צומת הדוק ודבקות8. Ex vivo, ניתן לבצע מדידות של זרם טרנסאפיתל באמצעות תאי Ussing על ביופסיה או דגימות מעי כריתה9. מחקרי in vivo כוללים בדרך כלל מתן עוקבים אינרטיים דרך הפה, ולאחר מכן מדידת ספיגת הדם או השתן של העוקבים הללו10,11. למרות שטכניקות אלה הוכחו כשימושיות בחקר מחסום המעי, הן מציגות מספר מגבלות: לקווי תאים אלמותיים שעברו טרנספורמציה יש מטבעם שינויים מטבוליים ושלד המשפיעים על מחסום המעי בדרכים לא מוגדרות היטב; הגישה למטופלים, דגימות מטופלים או אורגניזמים מודלים יכולה להיות מוגבלת; קשה לשלוט במחקרים in vivo עבור גורמים מבלבלים או להסיק מסקנות ברמה המולקולרית. לפיכך, למרות שדווחו עדויות להפרעה זו במחסום במודלים מרובים של מחלות, ההבנה של המנגנון של פגמים אלה במחסום המעי נותרה מוגבלת, והיכולת שלנו למקד ולטפל בהיבט זה של מחלות במערכת העיכול נותרה חמקמקה.

אורגנואידים במעי האנושי מציעים יכולת ייחודית ומרגשת להבהיר את הגורם והטיפול בפגמים במחסום המעי. אורגנואידים במעי אנושיים שמקורם ברקמות הם תרביות תאים ראשוניות שמקורן בתאי גזע בוגרים הממוקמים בבסיס קריפטות המעי12. ניתן לבודד תאים אלה מביופסיה או מדגימות כירורגיות ולתרבית אותם כדי לשמור על שינויים גנטיים ואפיגנטיים שנראו בחולים מהם הם נגזרו 13,14,15. הם משמשים כמודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית מאשר קווי תאים אלמותיים מסורתיים מכיוון שאין להם את השינויים המטבוליים של קווי תאים סרטניים וניתן להתמיין לסוגי התאים השונים הקיימים באפיתל המעי הבוגר 16,17,18. בנוסף, מכיוון שניתן להרחיב אותם במבחנה, הם נגישים ושימושיים יותר למחקרים מבוקרים על ההשפעה התאית של טיפולים שונים ומצבי גידול במקביל. למרות שישנן מגבלות הטמונות גם במודלים של אורגנואידים במעי, בעיקר היעדרם של סוגי התאים האחרים שאינם אפיתל וההקשר של מערכת הגוף השלמה, הוכח כי אורגנואידים במעי האנושי מספקים מודל אמין להיבטים מרובים של מחלות במערכת העיכול13.

בין אלה, הוכח כי אורגנואידים במעי מודלים מקרוב פגמים במחסום המעי, ומדגימים שינויים צפויים בארגון הצומת ההדוק ו-TEER בהגדרת עלבונות מחסום 19,20,21. כאן, אנו מאמצים טכניקה אחת להערכת שלמות המחסום בקולונואידים אנושיים, שבה מזוהה שטף של מולקולות מתויגות פלואורסצנטיות על פני חד-שכבות אורגנואידיות22. בפרוטוקול זה, אורגנואידים גדלים ומבשילים לחד-שכבות דו-ממדיות מקוטבות על ממברנות חדירות למחצה. הבדיקה כרוכה בתוספת של עוקב פלואורסצנטי למשטח האפיקלי של חד-שכבת האפיתל, ונוכחותו בצד הנגדי מכומתת לאורך זמן. שטף מוגבר של העוקב משקף אפיתל דולף או חדיר יותר. בדיקה זו מספקת קריאת מחסום פונקציונלית, שיכולה להוסיף להערכות של מבנה הצמתים ההדוקים והנצמדים. בנוסף, למרות שמדידות TEER משמשות לעתים קרובות כדי לספק הערכה בסיסית של שלמות המחסום, ניתן להתאים את בדיקת השטף המתוארת כאן כדי לזהות חדירות של מולקולות מסוגים שונים, מטען וגודל, ובכך לאפיין את המחסום בפירוט רב יותר. ניתן להשתמש במספר עוקבים פלואורסצנטיים זמינים מסחרית למטרה זו. יתר על כן, באמצעות שימוש בספקטרום פלואורסצנטי שאינו חופף, ניתן להעריך חדירות למספר עוקבים בו זמנית. יתר על כן, התצורה החד-שכבתית של בדיקה זו מאפשרת להעריך את תגובת המחסום לתנאי גידול המיושמים במיוחד על פני השטח האפיקליים או הבסיסיים של התאים בלבד. עם זאת, הערכה מבוקרת של השפעת הטיפולים, השינויים המיקרו-סביבתיים ותנאי התרבות המשותפת אפשרית.

ידוע כי פגמים במחסום המעי ממלאים תפקיד פתוגני חשוב בהתפתחות של מספר מחלות במערכת העיכול, אך המונח "מעי דולף" נמצא בשימוש הולך וגובר בתקשורת הפופולרית ללא דיוק23, והמאמצים להתמקד במחסום המעי הפגום היו מוגבלים בהצלחה. זה מדגיש את הצורך במודלים משופרים כדי להעריך ולאפיין את מחסום המעי. המערכת המתוארת משתמשת בשכבות חד-שכבתיות פיזיולוגיות של אורגנואידים במעי שמקורן ברקמות אנושיות כדי להעריך את שלמות המחסום התפקודי בתנאים מבוקרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הדגימות נרכשו ונעשה בהן שימוש בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת קולורדו (IRB), פרוטוקול מספר 14-2012.

הערה: כל ההליכים בשלבים 1-3 צריכים להיעשות בארון בטיחות ביולוגית סטרילי בטכניקה סטרילית. סכימה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.

1. הקמת קולונואידים אנושיים מתרבויות קפואות

הערה: ודא שכל החומרים מוכנים בארון הבטיחות הביולוגית לפני הפשרת התאים כדי למזער את החשיפה של אורגנואידים מופשרים למדיום הקפאה. הפרוטוקול מתחיל בקולנואידים אנושיים שמקורם ברקמות שמקורן בהקפאה. פרוטוקולים לגזירה ושימור בהקפאה של קולונואידים אנושיים תוארו בעבר24.

  1. הכנת מדיום גזע אורגנואיד במעי אנושי
    1. הכן את המדיה הממוזגת Wnt-3A/Noggin/R-Spondin 3 (L-WRN) בהתאם לפרוטוקולים שתוארו קודם לכן25,26.
    2. השלימו את מצע ה-L-WRN עם גורמי הגדילה הבאים: גורם גדילה אפידרמיס [50 ננוגרם/מ"ל], ניקוטינאמיד [10 מ"מ], A83-01 [500 ננומטר], SB202190 [10 מיקרומטר], CHIR99021 [3 מיקרומטר], תיאזוביבין [4 מיקרומטר], SB431542 [4 מיקרומטר], גסטרין I [10 ננומטר].
    3. יש לערבב את מדיית L-WRN בתוספת 1:1 עם חומר אורגנואיד מסחרי במעי.
    4. ממש לפני השימוש, תוסף Y-27632 [10 מיקרומטר].
      הערה: הרכב המדיום האופטימלי של גזע האורגנואיד במעי עשוי להשתנות בהתאם לקו המעבדה והמעי הגס. ייתכן גם שימוש בתוספת L-WRN לבד או שימוש במדיה אורגנואידית מסחרית במעי בלבד. השימוש של פרוטוקול זה בחלקים שווים של מדיה מותנית L-WRN ומדיה מסחרית עמיד יותר לשונות מאצווה לאצווה בהשוואה לשימוש במדיה מותנית בלבד והוא חסכוני יותר בהשוואה לשימוש במדיה מסחרית בלבד.
  2. הכנת מדיום בידול
    1. תוסף DMEM/F12 עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-2 מ"מ L-אלניל-L-גלוטמין דיפפטיד.
    2. יש לערבב תוסף DMEM/F12 1:1 עם מדיום גבעול אורגנואיד במעי משלב 1.1
  3. הכנת מטריצה חוץ-תאית (ECM)
    1. הפשירו ECM למשך הלילה על קרח, ואז הכינו 100 מיקרוליטר אליקוט.
      הערה: ניתן להקפיא מחדש את המינון בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. עיין בהוראות היצרן לקבלת פרטים.
    2. דגירה על אליקוטים על קרח עד לזמן הציפוי של תאים.
  4. הפשרה וציפוי אורגנואידים
    1. יש להפשיר את תכולת הקריוביאל באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, ולהבטיח שהבקבוקון יישאר שקוע, אך הפקק נמצא מעל המים, עד להפשרה.
    2. העבירו את תכולת הבקבוקון לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 13 מ"ל של מדיום DMEM/F12 בתוספת קר כקרח (משלב 1.2.1).
    3. צנטריפוגה בחום של 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    4. שאפו את הסופרנטנט, והשאירו כ-1 מ"ל של נפח שיורי מעל כדורית התא.
    5. הניחו את הצינור על קרח. הוסף 1 מ"ל של DMEM/F12 בתוספת קר כקרח (משלב 1.2.1) ופיפטה את המתלה 10-15 פעמים כדי להשעות מחדש את הגלולה.
    6. צנטריפוגה בחום של 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    7. הסר את חומר השטיפה באמצעות פיפטה, והשאיר כמה שפחות שאריות חומר שטיפה מעל גלולת התא.
    8. הוסף 100 מיקרוליטר של ECM מופשר לגלולה. יש להשעות ביסודיות, ולוודא שהאורגנואידים מפוזרים באופן שווה ללא גושים. פיפטה לאט כדי למנוע הכנסת בועות אוויר.
    9. צלחת ECM על ידי פיפטינג של כ -10 כיפות או טיפות תלת מימדיות של ECM, כ -10 מיקרוליטר כל אחת, לבאר אחת של צלחת בת 6 בארות.
    10. הפוך את הצלחת במהירות ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות או עד שהכיפות מתמצקות.
    11. לאחר הגדרת הכיפות, הוסף 2 מ"ל של מצע גזע אורגנואיד במעי (משלב 1.1) לבאר.
    12. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, באינקובטור לח עם 5% CO2. החלף את המדיה כל יומיים.
    13. המשך לשלב 2 ברגע שהאורגנואידים תופסים יותר מ-75% משטח כיפת ה-ECM או צוברים פסולת מרכזית.

2. מעבר והתרחבות של קולונואידים אנושיים

  1. עבור כל באר, שאפו את מצע הגידול מהבארות מבלי לשבש את כיפות ה-ECM.
  2. שטפו את הכיפות בעדינות עם 1 מ"ל של מי מלח קרים כקרח (PBS), ולאחר מכן הסירו PBS.
  3. הוסף 1 מ"ל טריפסין קר כקרח לכל באר. השתמש בפיפטה כדי לפרק את כיפות ה-ECM על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. פיפטו את התערובת 10-15 פעמים כדי לנתק לחלוטין את ה-ECM.
  4. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.
  5. הוסף 1 מ"ל של DMEM/F12 בתוספת קר כקרח (משלב 1.2.1) לבאר כדי לנטרל טריפסין. פיפטה את התערובת במרץ 20-30 פעמים עד שהתאים מתפרקים לאשכולות של 2-3 תאים כל אחד.
  6. העבירו את מתלה התא לחרוטי של 15 מ"ל.
  7. השתמש ב-1 מ"ל נוספים של DMEM/F12 בתוספת (משלב 1.2.1) כדי לשטוף את הבאר ולהוסיף את תמיסת הכביסה לחרוט של 15 מ"ל.
  8. הוסף תוספת DMEM/F12 (משלב 1.2.1) כדי להגיע לנפח כולל של 13 מ"ל בחרוט של 15 מ"ל.
  9. המשך בשלבים 1.4.3-1.4.12 של שלב 1 תוך שימוש בכמות מתאימה של ECM כדי להתרחב לבארות נוספות.
    הערה: באר משולבת של אורגנואידים ב-100 מיקרוליטר ECM יכולה בדרך כלל להיות מועברת ל-2-3 בארות (200-300 מיקרוליטר של ECM). באר משולבת אחת של אורגנואידים מספיקה לכ-3-6 חד-שכבות בשלב 3.

3. יצירת חד-שכבות קולונואידיות אנושיות

  1. תוספות תרבית תאים בציפוי קולגן
    1. מניחים תוספות תרבית תאי פוליסטירן (גודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר) בצלחת של 24 בארות ומוסיפים 100 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי קולגן לתא האפיקלי של כל תוספת.
    2. אטום את הצלחת בסרט איטום כדי למנוע אידוי.
    3. יש לדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 4-24 שעות.
      הערה: אין הבדל בתוצאות בתוך זמן הדגירה הזה, אך ניתן לבחור זמן דגירה קצר או ארוך יותר כדי להתאים לנקודת הפסקה נוחה.
  2. ציפוי חד-שכבות אורגנואיד
    1. בצע את שלבים 2.1-2.5 כדי לנתק את האורגנואידים.
    2. העבירו את מתלה התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.
    3. שטפו את הבארות עם 1 מ"ל כל אחת של DMEM/F12 בתוספת (משלב 1.2.1). אסוף את אמצעי הכביסה הזה והעביר אותו דרך מסננת התאים.
    4. שטפו את מסננת התאים בתוספת DMEM/F12 (משלב 1.2.1) עד שהנפח הכולל בצינור החרוטי של 50 מ"ל מגיע ל-15 מ"ל.
    5. מעבירים את המסנן לחרוטי של 15 מ"ל.
    6. צנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    7. שאפו את הסופרנטנט והשאירו 1 מ"ל מעל הגלולה.
    8. הוסף 1 מ"ל נוסף של מדיום DMEM/F12 בתוספת (משלב 1.2.1) והשהה מחדש.
    9. בדוק את ההשעיה במיקרוסקופ כדי לאשר דיסוציאציה מוחלטת. במידת הצורך, פיפטה את התאים במרץ עד שהם הופכים לרוב תאים בודדים.
    10. צנטריפוגה בחום של 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר את חומר השטיפה באמצעות פיפטה, והשאיר כמה שפחות שאריות חומר שטיפה מעל גלולת התא.
    11. השעו מחדש בנפח קטן (200-1000 מיקרוליטר) של מדיום גזע אורגנואיד במעי (משלב 1.1). המשיכו על הקרח.
    12. קח ציטוט של תרחיף התאים כדי להשתמש בו כדי לספור תאים ברי קיימא בשיטה המועדפת. השתמש בספירת התאים הקיימא כדי לקבוע את נפח תרחיף התאים הדרוש לצלחת של 100,000 תאים ברי קיימא לכל הוספה.
    13. שאפו את תמיסת ציפוי הקולגן מכל תוספת מבלי לגעת בקרום התוספת.
    14. הוסף את הנפח המתאים של אמצעי גזע אורגנואיד במעי (משלב 1.1) לתא האפיקלי של כל תוספת כדי להביא את הנפח הסופי ל-200 מיקרוליטר לאחר הוספת תרחיף התא.
      הערה: אם מעדיף, ניתן לכוונן את תרחיף התאים בשלב 3.2.12 לריכוז סופי של 100,000 תאים/200 מיקרוליטר, ואז ניתן לצפות 200 מיקרוליטר לתוך החדר האפיקלי. עם זאת, אם תרחיף התא כולו אינו משמש לציפוי חד-שכבתי, הדבר עלול להוביל לבזבוז מוגזם של מדיה.
    15. הוסף את הנפח המתאים של תרחיף התאים לתא האפיקלי.
    16. הוסף 500-1000 מיקרוליטר של מצע גזע אורגנואיד במעי לתא הבסיסי.
      הערה: 500 מיקרוליטר מספיקים לקולנואידים טיפוסיים. אם התאים פעילים יותר מבחינה מטבולית או רגישים אחרת להצטברות תוצרי פסולת, שימוש בנפח גדול יותר בתא הבסיסי עשוי להועיל לשמירה על הצמיחה.
    17. חזור על הפעולה עבור כל התוספות/בארות.
    18. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, באינקובטור לח עם 5% CO2.
    19. החלף את המדיה פעם בשבוע.
      הערה: ניתן ליישם טיפולים מעניינים על התאים האפיקליים ו/או הבסיסיים של התוספות בכל עת לפני או אחרי הציפוי.

4. מדידת התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER) והתבגרות חד-שכבתית

  1. למדוד התנגדות
    1. השתמש במד וולט/אוהם אפיתל בהגדרת אוהם. נקה את הגשושית על ידי ניגובה עם מגבון משימה ספוג באתנול 70%. הנח את הזרוע הארוכה יותר של האלקטרודה בתא הבסיסי ואת הזרוע הקצרה יותר בתא האפיקלי של התוספת. מדידת שיא.
      הערה: אם מדידות TEER הן גם נקודת קצה מעניינת, בצע גם מדידות התנגדות של תוספת מצופה קולגן ללא תאים כרקע. לאחר מכן, TEER מחושב כ (התנגדות - התנגדות להכנסת רקע) x שטח הפנים של התוספת. שטח הפנים של התוספת בפרוטוקול זה הוא 0.33 ס"מ2. חישוב זה ייתן TEER באוהם·ס"מ2. אם אתה משתמש במד וולט/אוהם אפיתל שונה מהמפורט בטבלת החומרים, השתמש בהוראות היצרן לשימוש במונה למדידת התנגדות.
    2. יש לחזור על הפעולה מדי יום עד להתייצבות המדידה.
      הערה: מישור מתרחש בדרך כלל לאחר 2 עד 3 שבועות עם TEER גדול מ-200 אוהם·ס"מ2, אך משתנה בהתאם לקו המעי הגס ולתנאי הגדילה.
  2. לאחר שההתנגדות התייצבה, התחל את התבגרות האורגנואידים על ידי החלפת אמצעי הגזע באמצעי התמיינות (משלב 1.2).
  3. המשך מדידות TEER יומיות. צפו לעלייה ב-TEER ולרמה שנייה.
    הערה: הרמה השנייה מתרחשת בדרך כלל בסביבות 7 ימים עם TEER של 1500-2500 אוהם·ס"מ2, אך זה משתנה בהתאם לקו המעי הגס ולתנאי הגידול.
  4. לאחר שמדידות TEER התייצבו בפעם השנייה, המשך לשלב 5.

5. בדיקת שטף FITC-dextran

הערה: פרוטוקול זה משתמש ב-FITC-dextran 4 kDa (רדיוס סטוקס 14 Å). עם זאת, בהתאם לצרכי הניסוי, ניתן להשתמש בעוקבים פלואורסצנטיים בגדלים, מטענים ופלואורופורים שונים22. ניתן להשתמש גם במספר עוקבים בו זמנית, ובמקרה זה, יש לאשר ספקטרום עירור ופליטה לא חופפים. שלבים 5.1-5.3 מוצעים להתבצע בארון חימום (אינקובטור לא לח, ללא CO2 ) המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס. אם זה לא זמין, יש לחמם ריאגנטים ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש, ולשמור על תאים, מאגרים ודגימות שנאספו ב-37 מעלות צלזיוס בזמני הדגירה.

  1. הכנת ריאגנטים
    1. הכן את תמיסת המלח המבודדת של האנק (HBSS) עם HEPES של 10 מ"מ והתאם את ה-pH ל-7.4. יש לחמם ל-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: במידת הצורך, הכינו HBSS+HEPES עם טיפולים מעניינים. הכן מספיק ל-80 מיקרוליטר לבאר בתא האפיקלי ו-1 מ"ל לבאר בתא הבסיסי.
    2. יוצקים כ -50 מ"ל מה- HBSS + HEPES החם לכוס קטנה לשטיפת התוספות. יש גדולה יותר בקרבת מקום לפסולת נוזלית.
    3. הפשרה מלאה של FITC-dextran 4 kDa. הכן תמיסה של 1.25 מ"ג/מ"ל ב-HBSS עם HEPES. הכן נפח מספיק של תמיסת FITC-dextran כדי להקצות 80 מיקרוליטר לבאר ו-1 מיקרוליטר לעקומה הסטנדרטית.
      הערה: ניתן לכוונן את ריכוז ההתחלה על סמך הגודל והחדירות הצפויה של העוקב. לדוגמה, ניתן להוסיף עוקבים קטנים יותר או קבועים יותר בריכוז נמוך יותר כדי לשמר ריאגנטים. אם יש צורך ליישם טיפולים על התא האפיקלי, הכינו תמיסת FITC-dextran ב-HBSS+HEPES שטופלו כראוי.
  2. יישום של FITC-dextan על חד-שכבות
    1. הכינו צלחת טרייה של 24 בארות על ידי הוספת 1 מ"ל של HBSS+HEPES (עם טיפול במידת הצורך) לבארות המתאימות.
    2. שטפו את החד-שכבות האורגנואידיות על ידי אחיזת התוספת במלקחיים, הרמתו מהבאר, טבילה בכוס המכילה HBSS+HEPES חם (משלב 5.1.2) כדי למלא את התא האפיקלי, ולאחר מכן להפוך אותו על הפסולת כדי לרוקן את תמיסת הכביסה.
    3. חזור על כביסה זו פעמיים נוספות.
    4. הנח את התוספת לבאר המתאימה של הצלחת הטרייה שהוכנה בשלב 5.2.1.
    5. פיפטה בעדינות 80 מיקרוליטר של תמיסת FITC-dextran לתוך החדר האפיקלי. פיפטה על דופן התוספת על מנת למנוע הפרעה לחד-שכבה.
    6. חזור על שלב 5.2.5 עבור כל החד-שכבות.
    7. הוסף HBSS או PBS לכל בארות ריקות כדי לשמור על לחות.
  3. איסוף דגימות שטף
    1. מיד לאחר שלב 5.2.7, אספו 70 מיקרוליטר מהתא הבסיסי של כל באר לבאר של צלחת שחורה שטוחה ושקופה של 96 בארות ושמרו על הגנה מפני אור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. זו תהיה נקודת זמן 0.
    2. דגרו את הצלחת, מוגנת מפני אור, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    3. כל 30 דקות למשך שעתיים, מערבבים את המאגר בבאר הבסיסית, ואז אוספים 70 מיקרוליטר נוספים לבארות ריקות של צלחת 96 הבארות התחתונה השקופה משלב 5.3.1.
  4. הכנת העקומה הסטנדרטית
    1. הוסף 1 מיקרוליטר מתמיסת FITC-dextran השמורה (1.25 מ"ג/מ"ל; שלב 5.1.3) ל-999 מיקרוליטר של HBSS+HEPES. זה יהיה דילול של 1:1000 או 1.25 מיקרוגרם/מ"ל עבור העקומה הסטנדרטית.
    2. יש לדלל תמיסה זו באופן סדרתי ביחס של 1:1 על ידי לקיחת 150 מיקרוליטר מהתמיסה והוספתה ל-150 מיקרוליטר של HBSS+HEPES, ולאחר מכן ערבוב היטב. חזור על זה באופן סדרתי עשר פעמים נוספות בסך הכל דילול של 12 שלבים.
      הערה: פעולה זו תיצור עקומה סטנדרטית של: 1250, 625, 312.5, 156.25, 78.13, 39.06, 19.53, 9.77, 4.88, 2.44, 1.22 ו-0.61 ננוגרם/מ"ל. בהתאם לחדירות קווי התאים, ייתכן שהעקומה הסטנדרטית תצטרך להיות מרוכזת פחות או יותר. בפעם הראשונה שהניסוי מתבצע, שמור תמיסת FITC-dextran נוספת של 1.25 מ"ג/מ"ל למקרה שיהיה צורך ליצור מחדש את העקומה הסטנדרטית בריכוז שונה.
    3. פיפטה 70 מיקרוליטר מכל דילול של העקומה הסטנדרטית לבארות ריקות של הלוח התחתון השקוף של 96 בארות משלבים 5.3.1 ו-5.3.3. חזור על הפעולה עבור השכפול השני.
  5. מדוד פלואורסצנציה בקורא צלחות פלורסנט עם ההגדרות הבאות: עירור 490 ננומטר, פליטה ל-520 ננומטר, קריאה מתחתית הצלחת, עם רווח של 100 וגובה קריאה של 7 מ"מ.
    הערה: התאם את אורכי גל העירור/פליטה בהתאם לפלואורופור הנבחר.
  6. ניתוח נתונים
    1. שרטט את העקומה הסטנדרטית עם ריכוז על ציר ה-x והפלואורסצנטיות על ציר ה-y. השתמש באפשרות זו כדי לקבוע את משוואת הרגרסיה הליניארית.
    2. השתמש במשוואת רגרסיה ליניארית זו ובקריאות הפלואורסצנטיות של הדגימות כדי לחשב את ריכוז ה-FITC-dextern בכל נקודת זמן עבור כל דגימה.
    3. שרטט את הריכוז לאורך זמן עבור כל דגימה וחשב את השיפוע של משוואת רגרסיה ליניארית, המייצגת מיקרוגרם/דקה (מיקרוגרם/דקה). חלקו זאת בשטח הפנים של תוספת תרבית התא (0.33 ס"מ) כדי לקבוע את קצב השטף כמיקרוגרם לדקה לסנטימטר מרובע (מיקרוגרם/דקה/ס"מ2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול זה, נותחה החדירות של קולונואידים אנושיים בריאים בנוכחות ובהיעדר איתות דלקתי. תוספת של תערובת של ציטוקינים דלקתיים, המכונה ציטומיקס, הכוללת IFNγ, TNFα ו-IL-1β (כל אחד ב-10 ננוגרם/מ"ל), הוכחה בעבר כגורמת לתפקוד לקוי של מחסום המעי כפי שנמדד על ידי TEER במודלים של תאי אפיתל במעי20,27. מטרתנו הייתה לקבוע אם ניתן לסכם את תפקוד המחסום הזה באמצעות בדיקת שטף FITC-dextran המתוארת.

קולונואידים אנושיים בריאים מתורם יחיד הורחבו (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

זהו פרוטוקול להערכת מחסום המעי במודל המייצג פיזיולוגית של חד-שכבות קולונואידים אנושיות. בדיקת שטף העוקב הפלואורסצנטי המתוארת כאן מספקת מידע על השלמות התפקודית של המחסום מעבר למה שנאסף עם סוגים אחרים של מבחני מחסום, כגון TEER, מדידות תא Ussing או הערכה של ביטוי חלבון צומת הדוק. בנוסף, השימוש במודלים של אורגנואידים במעי שמקורם בחולה מעניק את היתרון של סיכום הפיזיולוגיה האנושית המורכבת13,19 טוב יותר מקווי תאים בני אלמוות, כולל מטבול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין גילויים או ניגודי אינטרסים.

תודות

ד"ר שון קולגן ממומן על ידי מענקי NIH DK1047893, DK50189, DK095491, DK103639 ו-VA Merit BX002182.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות צנטריפוגה חרוטיים 15 מ"לסלטריט229411
בקבוקון קריוגני עם הברגה פנימית 2 מ"ל קורנינג430488
צינורות צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"לסלטריט229421
צלחת 6 בארות, תרבית רקמות מטופלתסלטריט229106
70 μ מסננת תאים Mבז352350
צלחת תחתונה שחורה/שקופה 96 בארתרמו סיינטיפיק165305
A83-01 מו"פ D2939
קורא צלחות BioTek Synergyזריזסינרגיה H1
סלומטר אוטומטי T4 Brightfield מונה תאיםאקסלCMT-AT4P
תאי ספירת תאים של סלומטראקסלNC1531583
CHIR99021סיגמא-אולדריץ'SML1046-5 מ"ג
תמיסת ציפוי קולגן יישומי תאים125-50
DMEM/F-12ג'יבקו11330057
DMSOסיגמא-אולדריץ'D2650-100 מ"ל
אתנול 100%פישר סיינטיפיקא4094
מד וולטום EVOM2 עם אלקטרודה Stx2מכשירי דיוק עולמייםNC9792051
סרום בקר עוברי (FBS)ציטיבהSH30396.03HI
סינון קצות פיפטפישר סיינטיפיק02-707-000, 02-707-002, 02-707-006, 02-707-008
פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC)-דקסטרן, 4kDaסיגמא-אולדריץ'46944
גסטרין I (אדם)מו"פ D3006
גלוטה-מקס פישר סיינטיפיק35050061200 מ"מ דיפפטיד L-alanyl-L-גלוטמין
תמיסת מלח חוצצת של הנקס 10xתרמו סיינטיפיק14065056
HEPES 1 חודשיםתרמו סיינטיפיק15630080
אינטרפרון גמא רקומביננטי אנושיביולג'נד575308
אינטרלוקין 1 בטא רקומביננטי אנושיתרמו-סיינטיפיק200-01B-500UG
מדיום גידול אורגנואידים במעי IntestiCult (אנושי)טכנולוגיות STEMCELL06010 מדיה אורגנואידית מסחרית במעי
מיקרוסקופ הפוך חיאולימפוסIX85
מטריגלקורנינג354234מטריצה חוץ-תאית (ECM)
חממה מיקרוביולוגיתפישר סיינטיפיק151030515
צלחת Multiwell לתרבית מתלים, 24 בארגריינר ביו-וואן662102
ניקוטינאמידמו"פ D4106
פרפילםמיליפור סיגמאHS234526Bסרט איטום
פיפטות פסטר (זכוכית בורוסיליקט)פישר סיינטיפיק13-678-20ב
PBS ג'יבקו10010-023
פניצילין סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)ג'יבקו15140122
גורם גדילה אפידרמיס רקומביננטימו"פ D2028-EG
צנטריפוגה בקירורבקמן קולטרBE-AX15R
SB202190 מו"פ D1264
תיאזוביביןמו"פ D3845
הכנס תרבית תאים ThinCert לצלחת 24 בארות, 0.4 μ mגריינר ביו-וואן662641
טריפסין-EDTA (0.25%)פישר סיינטיפיק25200114
גורם נמק גידול אלפא רקומביננטי אנושימו"פ Dברקוד 10291-ת"א-100
Y-27632 דיהידרוכלוריד טוקריסTB1254-GMP

מקורות

  1. Vanuytsel, T., Tack, J., Farre, R. The role of intestinal permeability in gastrointestinal disorders and current methods of evaluation. Front Nutr. 8, 717925(2021).
  2. Tsai, P. Y., et al. Il-22 upregulates epithelial claudin-2 to drive diarrhea and enteric pathogen clearance. Cell Host Microbe. 21 (6), 671-681.e4 (2017).
  3. Bjarnason, I., O'morain, C., Levi, A. J., Peters, T. J. Absorption of 51chromium-labeled ethylenediaminetetraacetate in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 85 (2), 318-322 (1983).
  4. Bjarnason, I., Peters, T. J., Veall, N. A persistent defect in intestinal permeability in coeliac disease demonstrated by a 51cr-labelled EDTA absorption test. Lancet. 1 (8320), 323-325 (1983).
  5. Schulzke, J. D., Bentzel, C. J., Schulzke, I., Riecken, E. O., Fromm, M. Epithelial tight junction structure in the jejunum of children with acute and treated celiac sprue. Pediatr Res. 43 (4 Pt 1), 435-441 (1998).
  6. Schumann, M., et al. Cell polarity-determining proteins par-3 and pp-1 are involved in epithelial tight junction defects in coeliac disease. Gut. 61 (2), 220-228 (2012).
  7. Zeissig, S., et al. Changes in expression and distribution of claudin 2, 5 and 8 lead to discontinuous tight junctions and barrier dysfunction in active Crohn's disease. Gut. 56 (1), 61-72 (2007).
  8. Schoultz, I., KeitaÅ, V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909(2020).
  9. Thomson, A., et al. The ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19 (1), 98(2019).
  10. Gan, J., et al. A case for improved assessment of gut permeability: A meta-analysis quantifying the lactulose:Mannitol ratio in coeliac and Crohn's disease. BMC Gastroenterol. 22 (1), 16(2022).
  11. Sequeira, I. R., Lentle, R. G., Kruger, M. C., Hurst, R. D. Standardising the lactulose mannitol test of gut permeability to minimise error and promote comparability. PLoS One. 9 (6), e99256(2014).
  12. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  13. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  14. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nat Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Basak, O., et al. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190.e4 (2017).
  19. Jelinsky, S. A., et al. Molecular and functional characterization of human intestinal organoids and monolayers for modeling epithelial barrier. Inflamm Bowel Dis. 29 (2), 195-206 (2023).
  20. Kollmann, C., et al. Human organoids are superior to cell culture models for intestinal barrier research. Front Cell Dev Biol. 11, 1223032(2023).
  21. Parente, I. A., Chiara, L., Bertoni, S. Exploring the potential of human intestinal organoids: Applications, challenges, and future directions. Life Sci. 352, 122875(2024).
  22. Sanders, S. E., Madara, J. L., McGuirk, D. K., Gelman, D. S., Colgan, S. P. Assessment of inflammatory events in epithelial permeability: A rapid screening method using fluorescein dextrans. Epithelial Cell Biol. 4 (1), 25-34 (1995).
  23. Lacy, B. E., Wise, J. L., Cangemi, D. J. Leaky gut syndrome: Myths and management. Gastroenterol Hepatol. 20 (5), 264-272 (2024).
  24. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and Culture of Human Intestinal Organoids Derived from Adult Stem Cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  25. Vandussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-wrn conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Res. 37, 101430(2019).
  26. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  27. Wang, R. X., Lee, J. S., Campbell, E. L., Colgan, S. P. Microbiota-derived butyrate dynamically regulates intestinal homeostasis through regulation of actin-associated protein synaptopodin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (21), 11648-11657 (2020).
  28. Al-Qadami, G., et al. Intestinal organoid coculture systems: Current approaches, challenges, and future directions. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 328 (3), G252-G276 (2025).
  29. Wang, Y., Kim, R., Sims, C. E., Allbritton, N. L. Building a thick mucus hydrogel layer to improve the physiological relevance of in vitro primary colonic epithelial models. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (4), 653-655.e5 (2019).
  30. Yang, L., et al. A tunable human intestinal organoid system achieves controlled balance between self-renewal and differentiation. Nat Commun. 16 (1), 315(2025).
  31. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659-668 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FITC Dextran
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.