שיטה פשוטה ומהירה לבידוד סימולטני של איים ראשוניים ותאי אצינר ראשוניים בלבלב מעכברים

Summary

מחקר זה פיתח שיטה פשוטה לחילוץ יעיל של איים ראשוניים תפקודיים ותאי אקינר מהלבלב בעכבר, ומציע כלי חשוב לחקר תקשורת בין-תאית בפתוגנזה של סוכרת מונעת מדלקת לבלב חריפה.

Abstract

במחקר על פתוגנזה של דלקת לבלב פוסט-חריפה (PPDM-A), תקשורת דו-כיוונית לא תקינה בין תאי האקינר של הלבלב (PACs) לתאי האי היא מוקד מרכזי. עם זאת, קווי תאים מונצחים אינם יכולים לשחזר מצבים פתופיזיולוגיים, ולכן הפקת תאים ראשוניים איכותיים היא קריטית. השיטות הנוכחיות לחילוץ איים ראשוניים מעכברים מסתמכות בעיקר על פרפוזיה פנימית של הלבלב באמצעות קנולציה בצינור מרה, שיש לה מחסום טכני גבוה ואינה מתאימה להפעלה על ידי חוקרים ללא ניסיון.

מחקר זה שינה את השיטה, וביטל את הצורך בפרפוזיה מורכבת בתוך החיים . עכברים בדרגת SPF מסוג C57BL/6J (בגיל 6-8 שבועות) הורדמו והועברו להמתה, ואחר כך בוצעו בידוד לבלב. הלבלב עוכל במבחנה עם קולגנאז P; האיים הראשוניים הופרדו באמצעות צנטריפוגציה של גרדיאנט צפיפות פיקול, ותאי אקינר הושגו באמצעות סינון מסננת תאים וצנטריפוגה. הקיימות והתפקוד של התאים הוערכו באמצעות צביעת קלצין/פרופידיום יודיד (Calcein/PI), בדיקת הפרשת אינסולין מונעת גלוקוז, וזיהוי פעילות עמילאז.

התוצאות הראו שהשיטה המותאמת הייתה קלה להפעלה: התפוקה לכל עכבר הייתה (120 ± 5) איים ראשוניים ו-1.6-1.95 תאים × 10⁷ אצינריים; שיעורי הקיימות של איים קטנים ותאי Acinar היו (97.52 ± 0.16)% ו-(96.55 ± 0.95)%, בהתאמה. יתרה מזאת, האיים הפגינו יכולת הפרשת אינסולין תקינה, ותאי האצינר היו רגישים לגירוי סרולין. שיטה זו פשוטה ואמינה, ומספקת מסגרת ישימה לחקר אינטראקציות אקסוקריניות-אנדוקריניות בלבלב ו-PPDM-A. עם זאת, יש לו מגבלות, כמו יישום לא מאומת בעכברים.

Introduction

דלקת לבלב חריפה (AP) עלולה לשבש את תפקוד האנדוקרינים של הלבלב דרך מסלולים מרובים, כגון פגיעה פרנכימלית בלבלב ומפלסים דלקתיים, ובכך לגרום לדלקת לבלב פוסט-חריפה (PPDM-A^{) 1,2}. נכון להיום, הפתוגנזה המרכזית של PPDM-A נותרה לא ברורה, ותקשורת דו-כיוונית לא תקינה בין האנדוקרין בלבלב לבין מהאזורים האקסוקריניים היא מוקד מחקר מרכזי³. למרות שקווי תאי β מונצחים קיימים (כגון INS-1, MIN6) הם כלים נפוצים למודלים של תאי סוכרת במבחנה, אופיים שמקורו בגידול מוביל להבדלים משמעותיים מתאי האי הראשוניים הרגילים מבחינת תגובתיות גלוקוז והטרוגניות תאית. כתוצאה מכך, הם אינם יכולים לשחזר באמת את המצב הפתופיזיולוגי תחת המיקרו-סביבה של דלקת לבלב חריפה ^4,5. לכן, השגת איים ראשוניים ותאי אקינר איכותיים הפכה לבסיס הטכני המרכזי להבהרת מנגנון האינטראקציה ביניהם.

השיטות הנוכחיות לבידוד איים ראשוניים מעכברים מתבססות בעיקר על טכנולוגיית קנולציה בצינור המרה, הכוללת מיקום מדויק וקנולציה של צינור המרה כדי להזריק תמיסת קולגנאז לפרנכימת הלבלב עבור פרפוזיה in vivo ^6,7. עם זאת, לבידוד איים ראשוניים מעכברים ניאונטליים, הואנג ואח^{' השיגו} תוצאות מצוינות באמצעות עיכול חוץ גופי ללא פרפוזיה פנימית ללבלב. בהתבסס על הניסיון המעשי של צוות המחקר שלנו, ביצוע פרפוזיה מיטבית ללבלב באמצעות קנולציה בצינור המרה הוא אתגר לביצוע מהיר ויעיל ללא הכשרה מיוחדת. בהשראת השיטה לבידוד איים ראשוניים מעכברים ניאונטליים, הצוות שלנו שינה את פרוטוקול החילוץ כדי להפוך אותו לפשוט ונגיש יותר לחוקרים ללא ניסיון בפרפוזיה. גישה מותאמת זו מספקת גם חלופה פשוטה יותר לבידוד איים ראשוניים מעכברים צעירים או מאלה עם צינורות מרה עדינים. יתרה מזאת, שיטה זו מציעה יתרונות הן ביעילות הבידוד (כמות) והן בטוהר (איכות) של איים קטנים ותאי אצינר. הוא מאפשר לחוקרים לבצע ניסויים באותו הקשר פתולוגי ופיזיולוגי, ומקל על ניתוח מעמיק של מנגנון האינטראקציה בין איים קטנים לתאי אקינאר.

השיטה דורשת שליטה קפדנית על זמן העיכול בלבלב; טחינת הלבלב לפני העיכול היא גם שלב קריטי. בנוסף, יש לשים לב לעוצמת הפיזור המכני של רקמת הלבלב לאחר העיכול. כל הגורמים הללו משפיעים על כמות ואיכות האיים המבודדים והתאים האצינריים. שיטה זו לא אושרה בעכברים ואינה יכולה להרחיב אותה לייצור בשלב זה.

Protocol

הליכים הכוללים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה או ועדת האתיקה של מרכז בעלי החיים המעבדה של בית החולים צ'אנגהאי (מספר אישור: CHEC (A.E)-2025-026). עכברים בדרגת SPF C57BL/6J (בני 6-8 שבועות, במשקל 18-25 גרם, זכרים או נקבות, n = 3) נשמרו במחזור אור/חושך של 12 שעות עם גישה חופשית למזון (תזונה תחזוקת) ומים.

פסולת חדה, כגון מזרקים ומחטים, ייאספו במיכלי החדים הייעודיים של המעבדה ויושלכו על ידי סוכנויות מקצועיות מוסמכות. בהתאם להנחיות להתנהגות אתית בטיפול ושימוש בבעלי חיים לא-אנושיים במחקר, גופות העכברים יונחו במקפיא גופות העכברים הייעודי של המעבדה וישרפו על ידי גופים מקצועיים.

1. הכנת מגיב

הערה: תמיסות כמו מדיום גרדיאנט צפיפות סטרילי ייאספו בתוף איסוף הפסולת הכימית של המעבדה. כל הפסולת הכימית תיפטר על ידי סוכנויות מקצועיות מוסמכות כפי שמסודר על ידי המעבדה.

1. הכנת תמיסת קולגנאז P
   1. בצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל, שוקלים ברצף 25 מ"ג קולגנאז P, 42 מ"ג כלוריד סידן חסר מים, ו-0.02 גרם מעכב טריפסין. הוסיפו 45.5 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק ו-500 מיקרוליטר של תמיסת HEPES, ואז מערבולת עד שהתמוססה לחלוטין. חטא את התמיסה על ידי סינון דרך פילטר של 0.22 מיקרון, והעבר את התמיסה המסוננת לצינור צנטריפוגה סטרילי חדש בנפח 50 מ"ל. זה מניב תמיסת קולגנאז P של 0.5 מ"ג/מ"ל, המשמשת לעיכול רקמת הלבלב לאחר מכן.
2. טיפול בתמיסת גרדיאנט צפיפות סטרילית
   1. מסננים את תמיסת גרדיאנט הצפיפות הסטרילית דרך פילטר של 0.22 מיקרון לצורך עיקור, ואז העבירו אותו לצינור צנטריפוגה סטרילי חדש בנפח 50 מ"ל. תייג בבירור את פרטי התמיסה ואחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. מאז, הוא מכונה "פיקול".
3. הכנת בופר עצירה ומדיום שלם
   1. הוסף 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין למדיום DMEM ריק ולמדיום RPMI-1640, בהתאמה, כדי להכין את המדיום השלם של DMEM ואת RPMI-1640 שלם (שגם משמש כבופר עצירה לעיכול הלבלב). סמן בבירור את פרטי התמיסה ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
4. הכנת תמיסות גלוקוז בריכוזים שונים
   1. בצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל, הוסף 50 מ"ל של בופר HEPES ביקרבונט Krebs-Ringer (KRBH) ו-0.25 גרם אלבומין סרום בקר (BSA)-V להכנת תמיסת KRBH המכילה 0.5% BSA. לאחר מכן, ב-28.33 מ"ל מתמיסת KRBH המכילה 0.5% BSA, מוסיפים 168 מיקרו-ליטר גלוקוז (1 מ') ו-1.5 מ"ל תמיסת סידן כלורי (50 מ"מ) להכנת תמיסת גלוקוז של 5.6 מ"מ. ב-9.28 מ"ל של תמיסת KRBH המכילה 0.5% BSA, מוסיפים 220 מיקרוליטר גלוקוז (1 מ') ו-500 מיקרוליטר תמיסת סידן כלוריד (50 מ"מ) להכנת תמיסת גלוקוז של 22 מ"מ.

2. בידוד של איים קטנים בלבלב ותאי אקינר בלבלב (PACs)

הערה: כל כלי הניתוח חייבים לעבור עיקור אוטוקלאב.

1. הוסף את תמיסת המלח המאוזנת של האנק ותמיסת הקולגנאז P לפלטת 12 הבארות. והוסף 3 מ"ל תמיסת קולגנאז P לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל לעיכול הבא.
   הערה: הוסיפו 2 מ"ל תמיסת מלח מאוזנת של האנק לשלוש בארות ו-2 מ"ל תמיסת קולגנאז P לבאר אחת.
2. שקלו והרדימו את העכבר בהזרקה תוך-פריטונלית של 1.25% טריברומואתנול במינון של 0.025 מ"ל לגרם לפני הניתוח, בדקו את מצב ההרדמה על ידי צביטה על כרית הרגל של העכבר: עומק ההרדמה נקבע על ידי ירידה הדרגתית בקצב הנשימה וללא תגובה ללחיצה על כרית הרגליים. לאחר אישור ההרדמה העמוקה, יש להמתים את העכברים באמצעות ניתוק צוואר הרחם. טבלו את העכברים באתנול של 75% למשך 5 דקות לחיטוי, ואז העבירו אותם לארון בטיחות ביולוגית לבידוד הלבלב.
   הערה: טריברומואתנול (1.25%) מסופק כתמיסה מוכנה מראש בעת הרכישה; אין צורך בהכנה ידנית. החוקרים חייבים ללבוש כפפות ומסכות לאורך כל הניסוי. אם מתרחש מגע עור במהלך הזרקת 1.25% טריברומואתנול, יש לנגב מיד את שארית התגובה באתנול חסר מים, לשטוף במים זורמים למשך 5 דקות, ולמרח קרם לחות להקלה על היובש. לא מעורבים כימיקלים קורוזיביים במחקר זה. תגובות כימיות לפסולת, כגון 1.25% טריברומואתנול, ייאספו במיכלים אטומים ייעודיים המסומנים "פסולת כימית מסוכנת".
3. עשה חתך בטן בצורת "V" כדי לפתוח את חלל הבטן של העכבר. האיבר הלימפואידי האדום כהה באזור ההיפוכונדרי השמאלי הוא הטחול, והאיבר הלבן שמחובר לטחול הוא הלבלב. בצע בזהירות ניתוח קהה של הלבלב לאורך הקצה התחתון של הקיבה והחיבור של הלבלב.
4. שטפו את רקמת הלבלב המבודדת בתמיסת המלח המאוזנת של האנק והסירו את ההתקמפות המזנטריות שנותרו, הטחול ורקמת השומן הפרי-פנקריאטית.
5. העבר את הלבלב המעובד מראש לצלחת 12 בארות המכילה 2 מ"ל תמיסת קולגנאז P. החזק את הלבלב במקום עם פינצטה ביד שמאל, והשתמש במזרק של 1 מ"ל ביד ימין כדי להזריק תמיסת קולגנאז P לפרנכימה של הלבלב עד שהרקמה נראית שקופה ובצקתית.
   הערה: נפח תמיסת הקולגנאז P לפרפוזיה הוא 600-800 מיקרוליטר.
6. חתכו את הלבלב לחתיכות רקמה בגודל 1-2 מ"ק במהירות עם מספריים כירורגיות.
   הערה: גודל חלקי הרקמה שווה בערך לקוטר הפנימי של קצה פיפטה סטנדרטי בנפח 200 מיקרוליטר.
7. חתכו את קצה פיפטה בנפח 1-1.5 ס"מ מרחוק (להגדלת הפתח) והשתמשו בקצה המותאם הזה כדי להעביר את חלקי רקמת הלבלב יחד עם 2 מ"ל תמיסת קולגנאז P לצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל טעון מראש ב-3 מ"ל תמיסת קולגנאז P.
8. דגרו את צינור הצנטריפוגה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות, תוך ניעור עדין כל 5-6 דקות במהלך תקופה זו.
   הערה: מטרת ניעור צינור הצנטריפוגה היא להבטיח מגע מלא בין רקמת הלבלב לתמיסת הקולגנאז P.
9. הוסף 10 מ"ל של RPMI-1640 מדיום שלם כדי לסיים את אפקט העיכול של תמיסת הקולגנאז P.
10. פיפט את הכדור שוב ושוב עם פיפטת פסטר של 5 מ"ל (15-20 תנועות למעלה ולמטה) עד שאין גושים גדולים ברורים של הרקמה.
11. הוסיפו 10 מ"ל RPMI-1640 מדיום מלא, ואז צנטריפוגה ב-180 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והשליכו את הסופרנאנט.
12. החזיר את הכדור לתלות עם 20 מ"ל RPMI-1640 מלא בינוני. מסנן את המתלים דרך מסננת של 40 רשתות, ואז צנטריפוגה ב-180 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
13. השליכו בעדינות את הסופרנטנט, הוסיפו 20 מ"ל תמיסת Ficoll כדי להחזיר את הכדור, והוסיפו בהדרגה 15 מ"ל של RPMI-1640 מדיום מלא.
    הערה: בשלב זה ניתן להבחין בממשק נוזלי שקוף.
14. צנטריפוגה בעדינות ב-640 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
    הערה: הימנעו מרעידות אלימות במהלך צנטריפוגה כדי למנוע הפרעות בממשק.
15. הסר בזהירות את צינור הצנטריפוגה, ושאף את השכבה הבינונית האדומה העליונה באמצעות פיפטת פסטר בנפח 5 מ"ל. לאחר מכן, שואף בזהירות את הנוזל המכיל את האיים בממשק שכבת הנוזל והעבר אותו לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 50 מ"ל. הוסיפו 20 מ"ל RPMI-1640 בינוני מלא, צנטריפוגה ב-180 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והשליכו את הסופרנאנט.
16. החזירו את הכדור עם 20 מ"ל RPMI-1640 בינוני מלא, צנטריפוגה ב-180 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והשליכו את הסופרנטנט.
17. תלה מחדש את הכדור עם 10 מ"ל של מדיום RPMI-1640 מלא והעבר אותו לצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ.
18. תחת מיקרוסקופ ביולוגי הפוך (הגדלה פי 100), יש לבחור איים ידנית באמצעות פיפטה של 20 מיקרוליטר. העבר את האיים הנבחרים ללוח תרבית תאים עם 24 בארות טעון מראש ב-500 מיקרוליטר של מדיום מלא RPMI-1640 לכל באר.
19. השליך את שכבת תמיסת Ficoll, החזיר את הכדור (מהשלב 2.15) עם 10 מ"ל של מדיום DMEM מלא, סינון דרך מסננת תא 100 מיקרון, צנטריפוגה ב-180 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והשליך את הסופרנאנט.
20. החזירו את הכדור עם 10 מ"ל DMEM בינוניים מלאים, צנטריפוגה ב-180 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, תלה מחדש את הכדור עם 5 מ"ל של מדיום DMEM מלא לניסויים הבאים.

3. זיהוי חיוניות של איי לבלב ותאי אקינר

1. העבר את האיים המבודדים ואת מספר מתאים של תאים אקינריים ללוחות תרבית תאים של 12 בארות/24 בארות המכילות 1 מ"ל של מדיום מלא RPMI-1640 ו-1 מ"ל של מדיום מלא DMEM, בהתאמה. הניחו את הלוחות באינקובטור תאים של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂, למשך 15 דקות לאיזון.
2. צנטריפוגה את לוחות תרבית התאים עם 12 בארים/24 בארים בטמפרטורה של 180 × גרם למשך 30 שניות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. בינתיים, יש להכין את תגובת הצביעה בהתאם להוראות ערכת בדיקת העמידות והציטטוטוקסיות של תאי קלציאן/פרופידיום (קלציאן/PI) (הגנה מפני אור במהלך ההכנה).
3. השליכו בעדינות את המדיום, שטפו את האיים והתאים האצינריים פעם אחת עם מלח מפוזר פוספט (PBS), ואז הצנטריפוגות באותם תנאים כמו שלב 3.2.
4. השליכו את ה-PBS, והחזירו את האיים והתאים האקינריים עם התגובה המוכנה לצביעה. עטוף את צלחת התרבית בנייר אלומיניום (כדי להגן מפני אור) ודגר באינקובטור תאים עם 5% CO₂ בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
5. בסביבה מוגנת מאור, יש לצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (הגדלה פי 100) ולבצע ניתוח חיוניות תאים באמצעות ImageJ.

4. בדיקת אצינר עמילאז

1. זרעו את תאי האצינר בלוח של 12 בארות בצפיפות של 1.5 ×^{10 6} תאים לבאר עם 1 מ"ל מדיום. הגדיר את תאי הבקרה (Ctrl) ותאי הגירוי הכחול (10 ננומטר, 20 ננומטר, 50 ננומטר; מסומנים כ-C10, C20, C50). לאחר 30 דקות של גירוי, אספו סופרנטנטים לזיהוי פעילות עמילאז לפי הוראות היצרן.

5. בדיקת שחרור אינסולין מונעת גלוקוז

1. זרעו 10 איים קטנים לכל באר בצלחת של 24 בארות. ייצוב את האיים ב-RPMI-1640 מדיום מלא למשך שעתיים, ואז זרוק את המדיום.
2. דגרו את האיים הקטנים ב-1 מ"ל של תמיסת גלוקוז של 5.6 מ"מ ל-1 שעה. אסוף את הסופרנטנט אחר כך.
3. שטוף את האיים עם בופר KRBH. לאחר מכן, דגרו את האיים בתמיסת גלוקוז של 22 מ"מ למשך שעה ואספו שוב את הסופרנטנט.
4. לזהות את ריכוזי האינסולין בשני העל-טבעיים (מתנאי גלוקוז נמוך וגלוקוז גבוה) באמצעות ערכת ELISA של INSULIN (Mouse INS). חשב את מדד האינסולין המופעל על ידי גלוקוז (GSI):
   GSI = ריכוז האינסולין במדיום עם רמות סוכר גבוהות / ריכוז אינסולין במדיום נמוך גלוקוז

Results

לאחר צנטריפוגציה של גרדיאנט צפיפות תמיסת פיקול, נצפו איים קטנים סמוך לממשק בין שכבת הנוזל השקופה וחסרת הצבע לבין התווך, כאשר PACs הופיעו כסדימנט בתחתית הצינור (איור 1).

תחת מיקרוסקופ אופטי, האיים היו בדרך כלל עגולים או אליפטיים וצבעם חום-זהוב, עם תפוקה יציבה של (120 ± 5) איים לכל עכבר (איור 2A,B). PACs מבודדים טריים היו כדוריים והתפזרו בעיקר באשכולות (3-8 תאים אקינריים בכל אשכול). קצות האפיקליים של תאי האקינר היו כהים יותר, עם גרגירי זימוגן נראים בבירור; לא נצפו גרנולות או מבנים וזיקולריים סביב התאים, ורקע התמיסה היה נקי. התפוקה של תאי אקינר נעה בין 1.6 ל-1.95 × 10⁷ תאים לעכבר [(1.77 × 10⁷) ± (1.75 × 10⁶)] (איור 2C,D).

תוצאות צביעת קלצין/PI של איים קטנים ותאי אקינר מוצגות באיור 3A: תאים מוצבעים בקלצין (ירוק) היו הרוב, בעוד שתאים צובעים ב-PI (אדום) היו נדירים. ניתוח כמותי של התמונות הצבעוניות החיות/המתות בוצע באמצעות ImageJ. התוצאות הראו כי שיעורי הקיימות של האיים המבודדים ותאי האקינר היו (97.52 ± 0.16)% ו-(96.55 ± 0.95%%, בהתאמה (איור 3B).

פעילות העמילאז הבסיסית של תאי האקינר המבודדים בלבלב הייתה (0.79 ± 0.01) U/mL. לאחר גירוי עם קארולאין בריכוזים של 10 ננומטר, 20 ננומטר ו-50 ננומלר, פעילות העמילאז של תאי האצינר הייתה (1.45 ± 0.03) U/mL, (1.65 ± 0.05) U/mL, ו-(1.39 ± 0.02) U/mL, בהתאמה. תוצאות ANOVA חד-כיווניות הצביעו על כך שבהשוואה לקבוצת הביקורת (Ctrl), כל הקבוצות שקיבלו גירוי סרולין הראו הבדלים משמעותיים בפעילות העמילאז (כל P < 0.001). בנוסף, נצפה הבדל משמעותי בפעילות העמילאז בין קבוצות הסרולין של 20 ננומטר ל-10 ננומטר (P < 0.001) (איור 4A).

כאשר גירוי בתמיסת גלוקוז של 5.6 מ"מ, הפרשת האינסולין של האיים המבודדים הייתה (0.27 ± 0.04) ng/mL/אי/שעה. כאשר גירוי עם תמיסת גלוקוז של 22 מ"מ, הפרשת האינסולין של האיים המבודדים הייתה (0.94 ± 0.04) ng/mL/אי/שעה, עם GSI של 3.44. התוצאות מצביעות על כך שהאיים המבודדים מציגים תגובת הפרשת אינסולין טיפוסית ויעילה תחת גירוי עם תמיסות גלוקוז בריכוזים שונים (איור 4B).

חברי צוות המחקר שלנו הבחינו כי כמות ואיכות האיים המבודדים ותאי האצינר קשורות קשר הדוק לזמן העיכול, שדורש שליטה קפדנית במהלך הפעולה ופחות מושפע מגורמים שונים. בינתיים, תנודות בתפוקה ובחיוניות קשורות גם הן באופן הדוק לכריתה מלאה של הלבלב ולהפרדה מכנית של רקמת הלבלב, דבר שדורש תשומת לב במהלך הניתוח.

איור 1: תוצאות צנטריפוגציה של גרדיאנט צפיפות תמיסת פיקול. שכבת האי ממוקמת בממשק בין שכבת הנוזל השקופה וחסרת הצבע לבין מדיום הגידול. המשקע בתחתית צינור הצנטריפוגה הוא PACs. קיצור: PACs: תאים אקינריים בלבלב. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: מאפיינים מורפולוגיים וכמותיים של איים קטנים ו-PACs. (א) מורפולוגיה של איים מבודדים מרקמת לבלב עכבר. פס קנה מידה = 100 מיקרון. (B) ניתוח כמותי של מספר האיים שבודדו מרקמת לבלב עכבר (n = 3). (ג) מורפולוגיה של PACs שבודדו מרקמת לבלב עכבר. פס קנה מידה = 100 מיקרון. (D) ניתוח כמותי של מספר ה-PACs שהופרדו מרקמת לבלב עכבר (n = 3). כל הנתונים הובאו לביטוי כממוצע ± SD. קיצור: PACs: תאי אקינריים בלבלב. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: הערכת כדאיות של איים קטנים ו-PACs. (א) צביעת פלואורסצנציה של קלצין/פרופידיום יודיד להערכת היתכנות של איים עכבריים ו-PACs. ירוק: תאים חיים. אדום: תאים מתים. פס סולם = 100 מיקרון. (B) ניתוח כמותי של הקיימות של איים קטנים ו-PACs (n = 3). כל הנתונים הובאו לידי ביטוי כממוצע ± SD. קיצורים: PACs: תאי אקינר בלבלב; PI = פרופידיום יודיד. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: הערכת פעילות האמילאז של PACs ויכולת הפרשת האינסולין באיים. (A) פעילות עמילאז של PACs תחת גירוי בריכוזים שונים של סרולין (Ctrl): קבוצת ביקורת; C10, C20 ו-C50: ריכוזי הסרולין היו 10 ננומטר, 20 ננומטר ו-50 ננומטר (n = 3). (B) ניתוח כמותי של ריכוזי הפרשת אינסולין מגובה גלוקוז (n = 3). כל הנתונים הוצגו כממוצע ± SD. ***P < 0.001. קיצורים: GSI = אינדס אינסולין מגורה גלוקוז; PACs: תאים אקינריים בלבלב. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

Discussion

בשנים האחרונות, פוסט-דלקת לבלב, סוכרת (PPDM) זכתה לתשומת לב רחבה ^1,9,10. חקירת המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם PACs משפיעים על הפרשת הורמון באיים בהקשר של AP היא בעלת חשיבות רבה.

הפתוגנזה של AP קשורה בעיקר להפעלה מופרזת של אנזימי הלבלב בתאי האקינרי, מה שמוביל לעיכול עצמי של רקמת הלבלב^11,12. למרות שקווי תאים כמו AR42J, 266-6 (קווי תאים אקינריים) ו-MIN6, INS-1 (קווי תאים β) זמינים כיום, מודלים אלו של תאים במבחנה אינם יכולים לשחזר במלואם את המורכבות הפיזיולוגית של תאים ראשוניים ואיים ^4,5. לכן, בידוד תאי אקינר ראשוניים ואיים קטנים הוא חיוני למחקרים מעמיקים על האינטראקציה בין המחלקות האקסוקריניות והאנדוקריניות של הלבלב. כיום, שיטות לבידוד איים מבוססות היטב; עם זאת, רובם אינם עונים על צורכי המחקר לחקר האינטראקציה בין איים קטנים לתאי אקינר בלבלב ^6,7,8.

פרוטוקול ניסויי זה מייעל את תהליך הפרפוזיה בלבלב, ומוריד את המחסום הטכני, ובכך מאפשר לחוקרים ללא הכשרה מיוחדת בקנולציה של צינור מרה לבצע ניסויים. במקביל, הוא מבטיח את הכמות והאיכות של האיים המבודדים ותאי האקינריים, ומספק שיטה פשוטה ומהירה לבידוד בו-זמני של איי עכבר ראשוניים ותאי אצינר ראשוניים בלבלב.

למרות ששיטה זו מפשטת את תהליך בידוד האיים, שלבים מרכזיים עדיין דורשים שליטה קפדנית כדי להבטיח תפוקה גבוהה והפרדה יעילה של איים קטנים ותאי אקינר בלבלב. שלבים אלו כוללים פרפוזיה מספקת ללבלב, הפרעה נכונה לרקמות (הבטחת טחינה יסודית), עיכול לבלב (שליטה מדויקת על זמן העיכול וניעור ידני במהלך העיכול), ופיפטינג מכני (שליטה במספר ועוצמת פעולות הפיפטינג). לפני בחירת האיים, יש לייצב איים שהוחזרו בתנור תאים למשך כ-10 דקות כדי לאפשר איסוף יעיל יותר של האיים.

חשוב לציין שבמהלך פרפוזיית לבלב, תוצאות טובות יותר מושגות כאשר מזריקות ווסיקולות נוזל נקיות יותר; כל רקמת הלבלב צריכה להיות מזורזת במלואה, אך זמן הפרפוזיה צריך להיות נשלט תוך 1-2 דקות. אם מתגלה חיוניות נמוכה של תאים, יש להתאים את זמן המגע בין רקמת הלבלב לקולגנאז P (כולל זמן הפרפוזיה וזמן העיכול באמבט מים). בנוסף, שים לב לנזק מכני במהלך בידוד – לדוגמה, הימנע מכוח מופרז בעת פיזור רקמת הלבלב. יש לשמור על הטכניקה האספטית לאורך כל הבידוד של האיים הקטנים ותאי האקינר כדי למנוע זיהום. מגיבים מוכנים צריכים להיות מסוננים דרך מסנן של 0.22 מיקרון. תהליך הבידוד צריך להתבצע בארון בטיחות ביולוגית, וכל הכלים והצרכנים המשמשים במהלך הבידוד חייבים להיות סטריליים. שני המדיום המלאים שהוכנו מכילות גם 1% תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין.

להרדמה לעכברים: קבע את עור הצוואר של העכבר עם האגודל השמאלי והאצבע המורה, ותמכו בבטנו עם הטבעת והאצבעות הקטנות (שמירה על יציבה של הראש כלפי מטה, בטן כלפי מעלה כדי לחשוף את חלל הבטן). החזק את המזרק ביד ימין, הכנס אותו בזווית של 30° לעור הבטן התחתונה השמאלית של העכבר (1 ס"מ מהמפשעה ו-0.5 ס"מ מהקו האמצע), מזריק את ההרדמה באיטיות, ולוחץ על אתר ההזרקה עם מטוש כותנה סטרילי במשך 10 שניות לאחר גמילה מהמחט כדי למנוע דליפת תרופה. להרדימו את העכבר רק על ידי ניתוק צוואר הרחם לאחר שהוא מורדם לחלוטין.

אם נדקרת על ידי מחט מזוהמת (חשופה לדם או רקמת עכבר) או שננשכת על ידי עכבר, מיד סחטו את האזור סביב הפצע בכיור הקרוב ביותר (לוחצים מהקצה הפרוקסימלי לקצה המרוחק של הפצע כדי להוציא כמות קטנה של דם), שטפו את הפצע ברציפות במים זורמים במשך 15 דקות, ואז חיטו אותו ב-75% אתנול או 0.5% פובידון-יוד.

תוצאות בדיקות פעילות עמילאז בתאי אקינר הראו כי תאי האקינר המבודדים בלבלב היו בעלי רמת הפעלה בסיסית נמוכה והיו רגישים לגירוי סרולין: פעילות העמילאז עלתה בהדרגה עם עלייה בריכוז סרולין, הגיעה לרמה הגבוהה ביותר של 20 ננומטר סרולין, וירדה מעט כאשר ריכוז הסרולין היה 50 ננומטר. תוצאות בדיקת הפרשת האינסולין המונעת על ידי גלוקוז הראו כי האיים המבודדים הראו תגובה טיפוסית ויעילה להפרשת אינסולין תחת גירוי עם תמיסות גלוקוז בריכוזים שונים. תוצאות אלו מצביעות על כך שתאי האצינר והאיים שהופקו בפרוטוקול זה מתאימים לניסויים במבחנה עתידיים.

הליך בידוד האי והתאים האקינרי בפרוטוקול ניסויי זה קל לתפעול. תוצאות ניסוי מראות כי האיים הקטנים והתאים האצינריים שבודדו באמצעות פרוטוקול זה מציגים כמות וחיוניות מצוינות. בנוסף, מספר חברי הצוות שלנו אימתו פרוטוקול זה באמצעות עכברים מרובים; תוצאות האימות מצביעות על שחזוריות טובה, נתונים אמינים ותנודות מינימליות בתפוקת התאים. עם זאת, לפרוטוקול זה יש גם מגבלות מסוימות. למרות שיש לו תלות מוגבלת בכישורים הטכניים של המפעיל, הוא עדיין דורש ממפעיל ידע בסיסי באנטומיה של העכבר כדי לנתח לחלוטין את הלבלב של העכבר – זהו תנאי מוקדם לכל תהליך הבידוד. אם מבודדים רקמות לבלב ממספר עכברים בו-זמנית, יש להתאים את כמות תמיסת הקולגנאז P ותגובות אחרות בהתאם. בנוסף, בידוד בו-זמני מיותר משני עכברים אינו מומלץ: הפרש הזמן בין עיבוד רקמות הלבלב של עכברים שונים במהלך ניתוח, פרפוזיה וטחינה ישפיע על זמן המגע בין רקמת הלבלב לקולגנאז P, ובכך יפגע ביעילות ובחיוניות של בידוד התאים. לכן, היישום בקנה מידה גדול שלו עשוי להיות מוגבל. יתרה מזאת, פרוטוקול זה לא אומת בעכברים. אם מבודדים איים ותאי אקינר מחולדות, ייתכן שיהיה צורך בהתאמה נוספת במינון חלק מהתגובות וזמן העיכול.

לסיכום, פרוטוקול ניסויי זה מספק שיטה פשוטה ומהירה לבידוד בו-זמני של איים ראשוניים של עכברים ותאי אצינר ראשוניים בלבלב. הוא מתאים יותר לחוקרים חסרי ניסיון לבצע בידוד תאי איים ותאי אקינריים, תוך מתן מסגרת ניסויית מעשית למחקרים חובניים על אינטראקציות אקסוקרינית-אנדוקרינית בלבלב.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 & mu; מסנן m	מילקס	SLGPR33RB	סנן את תמיסת הקולגנאז P המוכנה
0.25 מ' סידן כלוריד (סטרילי)	ביוטיים	ST365	מסלול איתות תלוי סידן להפעלת הפרשת אינסולין
מזרק של 1 מ"ל	ג'ירוי	10084692516405	משמש להזרקת קולגנאז P לרקמת הלבלב.
תמיסת טריברומואתנול 1.25%	בייג'ינג יוסידה ביוטכנולוגיה בע"מ.	JT0781	הרדמה
צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל	אפנדורף	30121589	אסוף את הסופרנטנט של התא לצנטריפוגה ואחסון.
פעם אחת הנק' תמיסת מלח מאוזנת	ביושארפ	BL561A	הכינו את תמיסת הקולגנאז P ושוטפים את רקמת הלבלב
לוח תרבית תאים עם 12 בארות	סארסטדט	83.3921	החזק את רקמת הלבלב ואת האצינר שהופק מהתרבית
צינור צנטריפוגה 15 מ"ל	בייג'ינג לאבגיק טכנולוגיה בע"מ.	CT-002-15A	החזקת פתרונות במהלך הניסוי
לוח תרבית תאים עם 24 בארים	סארסטדט	83.3922	תרבות האיים שנחצבו
40-רשת  מסננת	ויידאן אינסטרומנטס	לא זמין	סינון רקמת הלבלב
פיפטת פסטר 5 מ"ל	ביושארפ	BS-XG-03L	פיפטינג של נוזלים והפרעה פיזית לרקמת הלבלב
צינור צנטריפוגה 50 מ"ל	בייג'ינג לאבגיק טכנולוגיה בע"מ.	CT-002-50A	החזקת תמיסות במהלך הניסוי, הכילה רקמות וצנטריפוגה
צלחות תרבית תאים בגודל 60 מ"מ	בייג'ינג לאבגיק טכנולוגיה בע"מ.	12211	מיכל לאחסון תרביות המכיל איים קטנים לקטיף קל
תמיסת 75% אתנול	היינאוט	לא זמין	להשרות את העכברים לחיטוי.
Adobe Photoshop 2023	Adobe Inc.	לא זמין	יצר תמונות.
צנטריפוגה בקמן אלגרה X-12/X-12R	בקמן	אלגרה X-12/X-12R	צנטריפוגה
אלבומין סרום בקר (BSA)-V	סולרביולוגיה	A8020	שמור על התפקוד הפיזיולוגי התקין של האיים הקטנים והשתמש (זה/זה) להכנת תמיסות גלוקוז בריכוזים שונים.
עכברי C57BL/6J, SPF, 6– בן 8 שבועות, במשקל 18 שבועות; 25 גרם	מרכז חיות המעבדה של האוניברסיטה הרפואית הימית
ערכת בדיקת עמידות וציטוטוקסיות של תאי קלציאן/PI	ביוטיים	C2015L	לזהות את הקיימות והרעילות התאית של תאי בעלי חיים בהתבסס על צביעת פלואורסצנציה כפולה של תאי חיים ומתים של Calcein-AM (Calcein AM) ו-Propidium yodide (PI) בו-זמנית.
כלוריד סידן (חסר מים)	סאנגון ביוטק	10043-52-4	הכינו את תמיסת הקולגנאז P
מסננת תאים (100 ו-mu; m)	ביושארפ	BS-100-XBS	סינון תאים אקינריים
קולגנאז P	סיגמא	11213857001	עיכול רקמת לבלב
תמיסת D-(+)-גלוקוז (20%, סטרילית)	ביוטיים	ST491	מגרה הפרשת אינסולין מאיים קטנים.
DMEM בסיסי (1x) (Dulbecco' S Modified Eagle Medium)	גיבקו	C11995500BT	תרבית תאים אקינריים
סרום בקר עוברי (FBS)	ביוווסט	S140B-500	הכינו את מדיום התרבות
פתרון סטרילי Ficoll-Paque PREMIUM	ציטיבה	17544203	מדיום גרדיאנט צפיפות לסטרטיפיקציה של גרדיאנט צפיפות
GraphPad Prism 8.0.1	GraphPad Software, LLC	לא זמין	יצירת תמונות וביצוע ניתוח סטטיסטי.
תמיסת HEPES (1 מ')	ביושארפ	BL1061A	הכינו את תמיסת הקולגנאז P
צנטריפוגה מהירה/מקוררת	סיגמא	3K15	צנטריפוגה
ImageJ	מעבדת המכון הלאומי לבריאות למכשור אופטי וחישובי (LOCI)	לא זמין	לנתח תמונות פלואורסצנציה של תאים ולחשב את הקיימות של התאים.
מיקרוסקופ ביולוגי הפוך	לייקה	לא זמין	התבוננו במורפולוגיית התאים ובחרו את האיים הקטנים.
מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך	אולימפוס	IX73	התבוננו באותות הפלואורסצנטיים התאיים וצילמו תמונות פלואורסצנטיות.
בופר HEPES ביקרבונט Krebs-Ringer	ליג'ין	CZ0103	שמור על התפקוד הפיזיולוגי התקין של האיים הקטנים והשתמש (זה/זה) להכנת תמיסות גלוקוז בריכוזים שונים.
ערכת ELISA של INS (אינסולין) ל-Mouse	חברת ווהאן פיין ביוטכנולוגיה בע"מ.	EM0260	גלה את רמת הפרשת האינסולין באיים קטנים.
מלקחיים עיניים (10 ס"מ, מעוקלים עם וו)	מכשירים רפואיים של צ'ינגיי	לא זמין	סייע בניתוח
מלקחיים עיניים (10 ס"מ, ישר עם שן)	מכשירים רפואיים של צ'ינגיי	לא זמין	סיוע בפירוק והפרדה פתאומית של רקמת הלבלב ובהוצאת רקמת הלבלב
תמיסת סטרפטומיצין של פניצילין	גיבקו	15140-122	הכינו את מדיום הגידול למניעת זיהום
RPMI-1640 בינוני,	KeyGEN BioTECH	KGL1501-500	סיימו את תמיסת העיכול של הקולגנאז P ותרבו את האיים הקטנים
מעכב טריפסין מגליסין מקס (סויה)	סיגמא	T6522	הכינו את תמיסת הקולגנאז P
מספריים כורגיים (10 ס"מ, מחודדים ישר)	מכשירים רפואיים של צ'ינגיי	לא זמין	סיוע באנטומיה וחתוך רקמת הלבלב לחתיכות קטנות
אמבט מים	OAICLAB	OW-HF	שמור על טמפרטורת העיכול.
ערכת בדיקת פעילות α-אמילאז ו-β-אמילאז	Elabscience	E-BC-K006-M	לזהות את רמות העמילאז המופרשות על ידי תאי אקינר בתנאים שונים