מאמר שיטה

זיהוי שינויים ממוקדים בסרטן ריאות של תאים לא קטנים באמצעות ריצוף מהדור הבא

DOI:

10.3791/69091

⸱

10 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, State Key Laboratory of Molecular Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Department of Education, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה ISO15189 אוטומטית ומוסמכת של הדור הבא לאיתור שינויים גנומיים ממוקדים ברקמות משובצות פרפין קבועות בפורמלין של סרטן תאים לא קטנים (NSCLC).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצלחת הטיפול הממוקד בסרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) תלויה בזיהוי מדויק של שינויים במניעים, כולל מוטציות, איחוי גנים והגברה. ריצוף הדור הבא (NGS) התגלה ככלי אבחון מולקולרי מקיף, המסוגל לזהות סטיות גנומיות ידועות וחדשות, ומספק תמיכה קריטית לטיפול NSCLC מותאם אישית. עם זאת, NGS נותרה שיטה מורכבת ומאתגרת מבחינה טכנית. למרות האימוץ הנרחב שלה, NGS עדיין מתמודדת עם כמה אתגרים, כולל מורכבות טכנית וזמני אספקה ממושכים. כאן, מוצג זרימת העבודה של NGS עם אישור ISO15189 המיושמת במעבדה הקלינית. הפרוטוקול הסטנדרטי כלל הערכת תאיות גידול (≥20%), מיצוי DNA מרקמות משובצות פרפין קבועות בפורמלין (FFPE) (קלט DNA ≥ 50 ננוגרם), הכנת ספרייה אוטומטית וניתוח ביואינפורמטיקה. על ידי שילוב אמצעי בקרת איכות מחמירים (QC) בכל שלב, זרימת העבודה מבטיחה אמינות נתונים גבוהה. חוץ מזה, החידוש העיקרי בזרימת העבודה היה האוטומציה של בניית ספריות NGS. המערכת האוטומטית של בניית ספריית NGS כללה תיקון קצה, זנב A, קשירת מתאם, לכידת הכלאה וטיהור, מזעור יעיל של טעויות אנוש, שיפור יכולת השחזור הניסיוני, הפחתת זמן מעשי ובכך שיפור היעילות. יחד, הניסיון מוכיח כי QC קפדני והכנת ספרייה אוטומטית חיוניים לשמירה על דיוק ומדרגיות בבדיקות NGS קליניות. גישה אופטימלית זו לא רק מבטיחה עמידה בתקני ISO15189 אלא גם תומכת בביקוש הגובר לאונקולוגיה מדויקת בניהול NSCLC.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) מהווה 75%-85% מכלל מקרי סרטן הריאות, ומייצג הן עדיפות קלינית והן אתגר טיפולי 1,2,3. בשנים האחרונות, עם הפיתוח המוצלח והיישום הקליני של תרופות ממוקדות מולקולרית כגון מעכבי קולטן גורם גדילה אפידרמלי טירוזין קינאז (EGFR-TKIs), הטיפול ב-NSCLC מתקדם נכנס לעידן הטיפולים המדויקים המותאמים אישית 4,5,6. טיפול ממוקד מציע יעילות מדויקת, ספציפיות גבוהה ותופעות לוואי מינימליות 7,8. שינוי זה בטיפול הגדיל בו זמנית את הביקוש לטכנולוגיות אבחון מולקולריות.

נכון לעכשיו, בדיקות מקיפות ממוקדות גידול הפכו למרכיב הכרחי בפרקטיקה הקלינית שיכולה לעזור להבהיר פרופילי מוטציות גנטיות מדויקות ובכך לספק בסיס אמין לשימוש ממוקד בתרופות לאחר מכן, ניטור עמידות לתרופות והערכת פרוגנוזה לחולים. במיוחד, בדיקות מרובות גנים מבוססות NGS, הממנפות יתרונות טכניים בעלי תפוקה גבוהה ורגישות גבוהה, כבר הומלצו ליישום קליני 9,10,11,12.

בהשוואה לטכניקות אבחון מולקולאריות מסורתיות, NGS מדגים יתרונות פורצי דרך. היתרון העיקרי של NGS טמון ביכולת התפוקה הגבוהה שלו. הוא מאפשר זיהוי בו-זמני של גנים מרובים, כולל שינויים גנטיים ידועים ולא ידועים 13,14. בינתיים, NGS משיגה בדיקות מקיפות בהפעלה אחת, תוך הפחתת עלויות יחסית, צריכת דגימה וזמן אספקה של בדיקות15,16. בהתחשב ביתרונות אלה, NGS מיושם יותר ויותר בפרקטיקה הקלינית. עם זאת, התהליכים של NGS הם מורכבים, כולל הערכת תאיות הגידול, מיצוי חומצות גרעין, הכנת ספרייה אוטומטית וניתוח ביואינפורמטיקה. איכות עיבוד הדגימה הראשוני משפיעה ישירות על ביצועי הניתוחים הביואינפורמטיים הבאים17. במיוחד, הכנת הספרייה כוללת סדרה של שלבים להמרת דגימות חומצות גרעין גולמיות לספריות סטנדרטיות התואמות למכשירי ריצוף. הכנת הספרייה כוללת פיצול, תיקון קצה, קשירת מתאם והגברת PCR18. תהליך מורכב זה מציג לעתים קרובות הטיות טכניות שונות: לדוגמה, פיצול עלול להוביל לייצוג חסר של אזורי הטרוכרומטין; העדפת המצע של ליגאז במהלך קשירת המתאם עלולה לגרום לאובדן רצפים מסוימים; והגברת PCR נוטה לגרום לכיסוי לא אחיד באזורים עם תכולת GC קיצונית19. הטיות מערכתיות אלו לא רק מפחיתות את איכות נתוני הריצוף, אלא גם עלולות להוביל למסקנות שגויות בניתוחים ביואינפורמטיים הבאים. לכן, הקמת מערכת QC קפדנית חיונית כדי להבטיח את האמינות והעקביות של תוצאות הניסוי.

כדי להתמודד עם האתגרים הטכניים ארוכי השנים הללו, המעבדה אימצה מערכת NGS אוטומטית לחלוטין. המערכת נועדה להפחית את זמן העיבוד הידני ולהפחית את תקופות האספקה הכוללות. הוא משלב פרוטוקולים ניתנים-לתכנות כדי להבטיח הן גמישות תפעולית והן דיוק עיבוד תוך שימוש במודולים ויחידות משולבים כדי למזער ביעילות הטיות טכניות פוטנציאליות בכל שלב. יתר על כן, פתרון אוטומטי זה לא רק משפר את יכולת השחזור והתפוקה של הכנת הספרייה, אלא, חשוב מכך, מבטיח שנתוני הריצוף משקפים בצורה מדויקת יותר את ההרכב המולקולרי של הדגימות המקוריות. כאן, המעבדה רוצה להציג את המערכת באמצעות זיהוי שינויים בנהג באמצעות NGS מבוסס DNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול קיבל פטור מ-IRB עבור דגימות ארכיון אנונימיות.

1. שלבי בדיקה מקדימים ובקרת איכות

  1. רשום מידע לדוגמה במערכת ניהול מידע המעבדה (טבלה 1). מלא את טופס ההסכמה מדעת לבדיקת מוטציות גנטיות.
  2. קבל דגימת NSCLC FFPE. ודא שהדגימה המשמשת לבדיקה היא דגימת רקמת פרפין שאוחסנה לא יותר משנתיים. ודא שהדגימות מעובדות ומאוחסנות על פי שיטות פתולוגיות סטנדרטיות.
    הערה: מחקר זה מתמקד בעיקר בזרימת העבודה המתודולוגית, ולא בביצוע ניתוח קליני בקנה מידה גדול. לכן, לא נקבעה דרישת מספר מדגם ספציפי לשלב זה של המחקר.
  3. חותכים חלקים באמצעות להבי מיקרוטום חד פעמיים. החלף להבים, מלקחיים ומיקרו-צינורות של 1.5 מ"ל בין דגימות כדי למנוע זיהום צולב ולהימנע מהכנסת מזהמים שמקורם במפעיל (למשל, שיער, תאי עור, רוק).
    הערה: גודל מדגם גדול (≥ 0.5 ס"מ על 0.5 ס"מ) 6-10 מיקרוליטר, חמישה גיליונות; גודל מדגם קטן (< 0.5 ס"מ על 0.5 ס"מ) ודגימות ניקוב, 6-10 מיקרוליטר, 10 גיליונות.
  4. בצע צביעה שגרתית של המטוקסילין-אאוזין (HE) כדי להעריך את תכולת תאי הגידול.
  5. בחר דגימות המכילות ≥20% תאי גידול ממאירים לניתוח במורד הזרם. תכולת הגידול מוערכת על ידי פתולוגים על שקופיות ויטראז'HE 20.
    הערה: אם תכולת הגידול נמוכה מ-20%, בהנחיית אזורי הגידול המסומנים בשקופית HE, גרד את אזור רקמת הגידול המתאים. תהליך זה משיג העשרה של רקמת הגידול על ידי הסרה יעילה של רכיבים שאינם ניאופלסטיים מסביב, ובכך מגדיל משמעותית את אחוז תאי הגידול בחומר שנאסף.
  6. בצע מיצוי חומצות גרעין באמצעות מערכת טיהור אוטומטית כמתואר להלן.
    1. חתך את בלוק ה-FFPE באמצעות מיקרוטום לקבלת סרט. הנח את הסרט לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. העבר את הסרט למיקום קלט הדגימה המיועד במכשיר החילוץ האוטומטי.
    2. השתמש במכשיר מיצוי אוטומטי עם ערכת מיצוי אוטומטית והחלף פיפטינג ידני במערכת מיצוי חומצות גרעין חרוזים מגנטיות אוטומטית.
      הערה: אוטומציה של שלב זה מסייעת להבטיח מיצוי אוטומטי כדי להבטיח ייצור DNA מדויק וניתן לשחזור עבור יישומי NGS במורד הזרם.
    3. עיין בהוראות של מטהר חומצות הגרעין האוטומטי לחלוטין ומגיב מיצוי חומצות הגרעין כדי לחלץ חומצת גרעין.
    4. לאחר מכן, בחר בתוכנית C1102, בחר זמן דגירה של הסרת שעווה כ-16 שעות, ונפח הפליטה כ-100 מיקרוליטר.
      הערה: אם תמיסת ה-DNA שחולצה לא נבדקה מיד, יש לאחסן אותה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ-6 חודשים.
  7. הערכת איכות חומצות הגרעין (טבלה 2) כמתואר להלן.
    1. השתמש באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז כדי לקבוע את גודל שבר ה-DNA. השתמש ב-Agilent2100 ובמערכות ניתוח אלקטרופורזה נימיות מיקרופלואידיות אחרות עבור דגימות בעלות קלט נמוך.
    2. ממיסים 1 גרם אגרוז ב-100 מ"ל של תמיסת TAE. מחממים את התערובת באמבט מים עד לשקיפות. מצננים את התמיסה לסביבות 60 מעלות צלזיוס.
    3. התחבר לאלקטרודה החיובית (אדומה) במכשיר האלקטרופורזה. בצע קוטב שלילי (שחור) למתח 180 וולט, הפעל במשך 15 דקות 21,22.
    4. על פי התוצאות של אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, יש לסווג את גדלי השברים לארבע רמות (A-D; טבלה 3), ובחר את חומצת הגרעין של רמות A-C לפעולות הבאות.
    5. השתמש בספקטרופוטומטריה כדי לאמת את הטוהר. ודא ש-OD260/OD280 > 1.8; OD260/OD230 > 2.0 כדי לציין רמות מזהמים מקובלות23,24.
    6. השתמש בערכת זיהוי (טבלת חומרים) המבוססת על צבעים פלואורסצנטיים ספציפיים לרצף לבדיקה פלואורומטרית כדי למדוד במדויק את ריכוז ה-DNA.
    7. הוסף 1 מיקרוליטר של DNA לבדיקה ל-199 מיקרוליטר של תמיסת עבודה, ואז ערבב, צנטריפוגה קצרה ומדוד את ריכוזו באמצעות פלואורומטר (טבלת חומרים).

2. הכנת ספרייה ובקרת איכות (איור 1)

  1. הכן DNA גנומי של שבר באמצעות אולטרסאונד (טבלת חומרים) כמתואר להלן.
    1. מערבבים 200 ננוגרם DNA גנומי ב-50 מיקרוליטר של מאגר Tris-EDTA (TE) נמוך. לאחר מכן, שמור את צינור הדגימה במתלה דגימה מקורר מראש (8 מעלות צלזיוס).
    2. הגדר את פרמטר המכשיר לפי טבלה 4. לאחר מכן התחל פיצול.
    3. השתמש באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז כדי לאמת את אפקט הפיצול. שלב זה מייצר שברי DNA עם קצוות פגומים הדורשים תיקון קצה כדי להפוך אותם לקצוות קהים לשלבים הבאים.
  2. בצע תיקון קצה ותוספת של A ב-3' כמתואר להלן.
    1. תקן את הקצוות הפגומים של FFPE DNA עם אנזימים ליצירת קצוות שטוחים, תוך הבטחת 3'-OH ו-5'-P. הוסף A לקצוות השטוחים הדו-גדיליים בגודל 3 אינץ'.
    2. הכן את תערובת ERA על ידי הוספת 7 מיקרוליטר של מאגר תיקון קצה ו-3 מיקרוליטר של אנזים תיקון קצה, החלקה ידנית עדינה של 3x-5x וצנטריפוגה למשך 1-3 שניות.
    3. הוסף תערובת ERA ל-50 מיקרוליטר של דגימת DNA שבורה, ערבב בעדינות וצנטריפוגה למשך 1-3 שניות.
    4. הנח אותו במכשיר ה-PCR ובחר בתוכנית ERA (20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; 4 מעלות צלזיוס החזק; מכסה 85 מעלות צלזיוס). בצע את הפעולה הבאה תוך שעתיים.
  3. בצע קשירת מתאם כמתואר להלן.
    1. הכן את תערובת ה-LIG של מערכת התגובה על ידי הוספת 30 מיקרוליטר של מאגר קשירה, 10 מיקרוליטר של DNA ליגאז ו-10 מיקרוליטר של מתאם DNA. לאחר מכן, החלק ידנית קלות 3x-5x וצנטריפוגה למשך 1-3 שניות.
    2. הוסף 50 מיקרוליטר של תערובת LIG למוצר של 60 מיקרוליטר מהשלב הקודם, ערבב בעדינות ואז צנטריפוגה למשך 1-3 שניות.
    3. מניחים את התערובת במכשיר PCR, ולאחר מכן בוחרים בתוכנית LIG (20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ללא חימום המכסה; 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (כיסוי חימום); 4 מעלות צלזיוס החזק; מכסה 85 מעלות צלזיוס).
  4. בצע טיהור חרוזים מגנטיים.
    1. קח 1.5 מ"ל של צינור צנטריפוגה עם ספיחה נמוכה והוסף 88 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים הומוגניים ו-110 מיקרוליטר של מוצר קשור במתאם. מערבולת ומערבבים היטב, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    2. צנטריפוגה מיד את הדגימה המודגרת למשך 1-3 שניות והנח את צינור הצנטריפוגה על מתלה מגנטי. המתן עד שהפתרון יתבהר (כ 3-5 דקות).
    3. כשהצינור מאובטח על המגנט, פתח את המכסה ושאף בזהירות את הסופרנטנט המנוקה באמצעות פיפטה מבלי להפריע לכדור החרוז.
    4. שמור את הצינור על המגנט והוסף 300 מיקרוליטר של אתנול 75% טרי שהוכן לכל צינור.
    5. המתן דקה אחת כדי לאפשר לחרוזים המגנטיים להתיישב במלואם. סובב לאט את צינור הצנטריפוגה אופקית פעם אחת כדי לספוג אתנול.
    6. חזור על שלבים 2.4.4 ו- 2.4.5 פעם אחת, ובסך הכל פי 2.
    7. בצע צנטריפוגה מיידית למשך 1-3 שניות, החזר את הצינור למתלה המגנטי והמתן 30 שניות. השתמש בפיפטה כדי להסיר שאריות אתנול ולהשאיר את מכסה הצינור פתוח.
    8. יבש את החרוזים המגנטיים בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות עד שמשטח החרוז נראה מט ואינו מראה סדקים.
    9. יש לשטוף את תוצר הקשירה עם 28 מיקרוליטר של מאגר פליטה (EB).
      הערה: יש לאזן חרוזים מגנטיים בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות לפני השימוש.
  5. להגביר ולטהר את הספרייה המוקדמת כמתואר להלן.
    1. הכן את מערכת התגובה לערבב מראש על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של מאגר PCR, 10 מיקרוליטר של פריימרים PCR, 1.5 מיקרוליטר של תערובת dNTP, 1 מיקרוליטר של אנזים PCR. הקש בעדינות ידנית על 3x-5x וצנטריפוגה למשך 1-3 שניות.
    2. הוסף 22.5 מיקרוליטר של תערובת מוקדמת ל -27.5 מיקרוליטר של המוצר המטוהר מהשלב הקודם, ערבב בעדינות ואז צנטריפוגה למשך 1-3 שניות.
    3. בחר את התוכנית PRE: 98 °C 45 שניות; (98 מעלות צלזיוס 15 שניות, 60 מעלות צלזיוס 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס 30 שניות) 12 מחזורים; 72 מעלות צלזיוס 2 דקות; החזקה של 4 מעלות צלזיוס; מכסה 105 מעלות צלזיוס.
    4. לאחר השלמת תוכנית ה-PCR, בצע טיהור חרוזים מגנטיים באמצעות אתנול 75% שהוכן טרי. יש להוציא את המוצר עם 18 מיקרוליטר של EB.
  6. לכידה היברידית כמתואר להלן.
    1. הכן את מערכת התגובה A על ידי הוספת 15 מיקרוליטר של ספרייה מוקדמת ו-4 מיקרוליטר של תערובת חוסמים.
    2. הנח על PCR והפעל את תוכנית PCR HYB (95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 65 מעלות צלזיוס החזק; מכסה 105 מעלות צלזיוס).
    3. הכן את מערכת התגובה B HYB תערובת על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של מאגר הכלאה, 0.5 מיקרוליטר של חוסם מעכב RNase ו-1 מיקרוליטר של בדיקה. החלק בעדינות 3x-5x וצנטריפוגה למשך 1-3 שניות.
      הערה: שם הגשושית הוא LCOO1, וגני הבדיקה כוללים EGFR, KRAS, BRAF, ALK וכו'.
    4. כאשר הטמפרטורה של מכשיר ה-PCR יורדת ל-65 מעלות צלזיוס, הוסף 11.5 מיקרוליטר של תערובת HYB למערכת התגובה A, ערבב בעדינות, ולאחר מכן כסה את מכסה מכשיר ה-PCR והמשיך בדגירה למשך 16-24 שעות.
    5. דגירה של מאגר כביסה 2 בצינור חרוטי של 15 מ"ל עם מחמם מתכת בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס במינון של 600 מיקרוליטר לדגימה.
    6. אחזר חרוזים מגנטיים של SCB, הפוך וערבב פי 5, מערבולת למשך 10 שניות ושיווי משקל בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. מערבולת למשך 10 שניות, העבירו 25 מיקרוליטר לצינור צנטריפוגה ספיחה נמוך של 1.5 מ"ל, הניחו על מתלה מגנטי למשך 3 דקות והשליכו את הסופרנטנט.
    7. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר שטיפת חרוזים לחרוזים המגנטיים של 25 מיקרוליטר SCB, מערבולת וערבב במשך 3 שניות, צנטריפוגה לרגע למשך 1-3 שניות, הניח לעמוד על המדף המגנטי למשך 3 דקות והשליך את הסופרנטנט.
    8. חזור על שלב 2.6.7 פעמיים, בסך הכל שלוש פעמים.
    9. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר שטיפת חרוזים לחרוזים המגנטיים, מערבולת וערבב למשך 3 שניות, השהה לשימוש מאוחר יותר.
    10. מעבירים כ-30 מיקרוליטר מהדגימה ההיברידית לחרוזים מגנטיים תלויים של SCB, מערבולת ומערבבים, מניחים על מערבל מסתובב, מדגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות וצנטריפוגה למשך 1-3 שניות.
    11. הניחו את צינור התערובת על רשת מגנטית למשך 3 דקות, ולאחר מכן שאפו כ-230 מיקרוליטר של סופרנטנט. מוסיפים 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1, מערבולת למשך 5 שניות, מניחים על מערבל סיבובי ואז מדגרים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. צנטריפוגה מיידית למשך 1-3 שניות.
    12. הנח את צינור תערובת דגימת החרוזים המגנטית על מתלה מגנטי ותן לו לעמוד למשך 3 דקות. לאחר מכן, שאפו כ -500 מיקרוליטר של נוזל סופרנטנט ושאריות.
    13. מחממים מראש 150 מיקרוליטר של מאגר כביסה 2 עד 65 מעלות צלזיוס, מערבולת למשך 10 שניות, מניחים על מערבל בטמפרטורה קבועה, מנערים ודוגרים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במהירות של 600 סל"ד. בצע צנטריפוגה מיידית למשך 1-3 שניות, הניח על מתלה מגנטי למשך 3 דקות ושאף כ-150 מיקרוליטר של נוזל סופרנטנט ושאריות.
    14. חזור על שלב 2.6.13 פי 3, בסך הכל ארבע פעמים.
    15. צנטריפוגה מיידית למשך 1-3 שניות כדי להסיר כל נוזל שנותר מצינור הדגימה. מוסיפים 20 מיקרוליטר EB, מערבבים למעלה ולמטה 8x-10x, מערבבים היטב ומניחים על קרח לשימוש מאוחר יותר.
  7. הכנה וטיהור הספרייה הסופית.
    1. הכן את מערכת התגובה POST mix על ידי הוספת 25 μL של תערובת הגברה, 5 μL של אינדקס ו-20 μL של ספריית חרוזים מגנטיים. הקש בעדינות על 3x-5x וצנטריפוגה למשך 1-3 שניות. מערבבים בעדינות, צנטריפוגה למשך 1-3 שניות.
    2. בחר תוכנית POST: 98 °C 45 שניות; (98 מעלות צלזיוס 15 שניות, 60 מעלות צלזיוס 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס 30 שניות) 12 מחזורים; 72 מעלות צלזיוס 10 דקות; החזקה של 4 מעלות צלזיוס; מכסה 105 מעלות צלזיוס.
    3. לאחר השלמת תוכנית ה-PCR, בצע טיהור חרוזים מגנטיים באמצעות אתנול 75% שהוכן טרי. הוצא את הספרייה הסופית עם 20 מיקרוליטר של EB.

3. הכנת ספרייה אוטומטית לחלוטין (טבלה 5)

  1. לחץ על לחצן ההפעלה כדי להפעיל את המערכת והמתן לאתחול. נווט אל Program Setting (הגדרת תוכנית) ובחר Run Protocol (הפעל פרוטוקול) ולאחר מכן בחר Protocol: Burning Rock HS.
  2. הגדר את פרמטרי ה-QC של aliquot כסוג מדגם: DNA באיכות גבוהה; כמות קלט (ng): 50; מחזורי טרום PCR: 12; מחזורי פוסט PCR: 12. לחץ על RUN.
  3. הכנס מחסנית ריאגנט ארוזה מראש לחריץ המיועד (מאמת אוטומטית את מיקום המגיב ומצבו).
  4. לאחר טעינת דגימות, לחץ על התחל כדי לגרום למערכת לפעול באופן אוטונומי. שים לב למחווני LED כדי לעקוב אחר ההתקדמות.
  5. לאחר סיום התוכנית, לחץ על אישור והתוכנית תעביר אוטומטית את הספרייה הסופית לצינור הספרייה, ותסיים את הכנת הספרייה.

4. רצף ו-QC

  1. בצע כימות ספרייה ובקרת איכות כמתואר להלן.
    1. מדוד את הריכוז הקדם-ספרייה ואת ריכוז הספרייה הכולל באמצעות פלואורומטריה.
    2. זיהוי גודל המקטע של הספרייה. השתמש בערכה כדי להעריך את גודל השבר של הספרייה ואת נוכחותם של מתאמים (טבלת חומרים).
      הערה: אם הספרייה הסופית מכילה דימרים פריימר, יש להוסיף שלב טיהור נוסף לפני ערבוב הדגימות במכונה. התקן המוסמך להכנסת שברים הוא ≥ 150 bp, ויעילות הלכידה הצפויה היא ≥ 40%.
    3. לדלל את ספריית הרצף ל-1.6 pM ו-1300 μL עבור פעולות רצף.
  2. בצע ניטור סביבת רצף כמתואר להלן.
    1. שלוט בסביבת הרצף, כולל טמפרטורה פנימית (19-25 מעלות צלזיוס), לחות פנימית (20%-80%).
    2. QC מלא של נתוני פלט מכשיר, כולל בסיס מעל Q30, ומסנן העברת צפיפות אשכול (PF).

5. ניתוח נתונים רצף ובקרת איכות

  1. בצע עיבוד נתונים גולמיים ופרופיל מולקולרי כמתואר להלן.
    1. השתמש ב-Burrows-Wheeler Aligner (גרסה 0.7.10) כדי ליישר את נתוני הרצף ל-hg19.
    2. בצע יישור מקומי, אופטימיזציה, סימון שכפול וקריאת וריאנטים באמצעות ערכת כלי ניתוח גנום (גרסה 3.2) ו-Vardict (גרסה 1.5.1).
    3. סנן גרסאות באמצעות צינור ה-fpfilter של VarScan (גרסה 2.4.3) והסר מיקומים עם עומקים של פחות מ-50. לסווג ולהוציא וריאנטים עם שכיחות אוכלוסייה מעל 0.1% במאגרי ExAC, 1000 גנומים, dbSNP או ESP6500SI-V2 כפולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs).
    4. הוסף ביאורים לגרסאות הנותרות באמצעות SnpEff (גרסה 3.6).
    5. לנתח וריאנטים מבניים (SVs), כולל סידורים גנומיים גדולים (LGRs), באמצעות MarkSV (כלי אלגוריתם Burning Rock). נתח וריאנטים של מספר עותקים (CNVs) על סמך עומק נתוני הכיסוי של מרווחי לכידה.
    6. נתוני כיסוי נכונים להטיות ריצוף הנובעות מתכולת גואנין-ציטוזין ותכנון בדיקה.
  2. הערך את איכות הדגימה, כולל עומק ממוצע, עומק חציוני, עומק ייחודי, גודל הכנסה, מורכבות lib, כיסוי, יחס Q30 ויחס מתאם דגימה מזווג כמתוארב-25.
  3. להפקת דוחות, אמת את גרסת הצינור והפרמטרים כדי להשלים את סקירת הביואינפורמטיקה. השתמש בהנחיות רלוונטיות כדי להעריך את הפתוגניות של מוטציות26,27. להוציא דוח סופי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוך שימוש בזרימת עבודה אוטומטית של ניתוח NGS עם בקרות איכות מחמירות, המעבדה ביצעה פרופיל גנומי מקיף של דגימות NSCLC. זרימת העבודה האופטימלית לזיהוי (איור 2) זיהתה באופן מהימן מספר שינויים גנומיים הניתנים לפעולה קלינית בדגימות גידול מייצגות (איור 3).

תוצאות הריצוף הדגימו מוטציה בתדר גבוה של EGFR p.L858R missense (AF=89.25%) המלווה בהגברה משמעותית של מספר עותקי הגן EGFR (CN=14.7). בנוס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל דוח NGS מוסמך מסתתר מאחורי תהליך קפדני, שנותר מורכב וגוזל זמן28. כדי לטפל בבעיות אלה, המעבדה פיתחה מערכת NGS אוטומטית לחלוטין. פעולה זו מפחיתה משמעותית את ההתערבות הידנית, ממזערת שגיאות ניסוי ומקצרת משמעותית את זמן האספקה. לכן, מערכת זו סיפקה אסטרטגיה אמינה ויעילה יותר עבור NGS, וביססה חשיבה חדשה לאיכות הנתונים במחקר גנומי.

המערכת המשולבת כוללת אוטומציה מקיפה לאורך כל זרימת העבודה, ומספקת יעילות עיבוד משופרת ואמינות תוצאות. ראשית, ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן למדעי הטבע של בייג'ינג של הרפובליקה העממית של סין (7252122), קרן המחקר האונקולוגי הקליני של בייג'ינג Xisike של הרפובליקה העממית של סין (Y-HS202402-0021), קרן המחקר להוראה להכשרת התמחות של בית החולים לסרטן, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה והמכללה הרפואית של פקין יוניון (E2025004), ומימון המחקר הקליני הלאומי של בתי חולים ברמה גבוהה (2025-LYZX-R-B03).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
  Agilent  ערכת DNA ברגישות גבוהה  אג'ילנט5067-4626לשימוש עם ה  מערכת הביואנלייזר Agilent 2100
  ערכת Agilent DNA 1000 Reagents  אג'ילנט5067-1504לשימוש עם ה  מערכת הביואנלייזר Agilent 2100
אנלייזר ביולוגי Agilent 2100אג'ילנטG2939Aהעריך את גודל השברים של הספרייה ואת נוכחות המתאמים. 
קונצרט כלי אוטומטי מלא לטיהור חומצות גרעיןקונצרטMC1002משמש למיצוי DNA
שווה ביט 1&פעמיים; ערכת בדיקת dsDNA HSואזימהEQ121-02-AAלשימוש עם ה  פלואורומטרי קיוביט 3.0
ערכת זיהוי משולבת של מוטציות גנטיות של EGRR/KRAS/BRAF/ALK אנושיברנינג רוקBR-LC00102בניית הספרייה
מגניס BRאג'ילנט טכנולוגיותG7595AAהכנה אוטומטית לספריית NGS
ME220 אולטרסוניקטור ממוקדקובאריס500396אולטרסוניקציה
NanoDrop One/OneCתרמו פישרND-ONE-Wזיהוי ספקטרופוטומטרי גלוי באורך גל מלא ב-UV
NextSeq 550Dxאילומינה20005715רצף
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (300CYS)אילומינה20024908לשימוש עם NextSeq 550Dx
תגובת חילוץ חומצות גרעיןקונצרטRC1102משמש למיצוי DNA
פלואורומטרי קיוביט 3.0חייםQ33216משמש לזיהוי ריכוזי חומצות גרעין או ספרייה
ערכת בדיקת HS של קיוביט dsDNAחייםQ32851לשימוש עם ה  פלואורומטרי קיוביט 3.0

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feng, R. M., Zong, Y. N., Cao, S. M., Xu, R. H. Current cancer situation in China: Good or bad news from the 2018 global cancer statistics. Cancer Commun (Lond). 39 (1), 22(2019).
  2. Siegel, R. L., Kratzer, T. B., Giaquinto, A. N., Sung, H., Jemal, A. Cancer statistics, 2025. CA Cancer J Clin. 75 (1), 10-45 (2025).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Fukuoka, M., et al. Multi-institutional randomized phase II trial of gefitinib for previously treated patients with advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 41 (6), 1162-1171 (2023).
  5. Kris, M. G., et al. Efficacy of gefitinib, an inhibitor of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase, in symptomatic patients with non-small cell lung cancer: A randomized trial. JAMA. 290 (16), 2149-2158 (2003).
  6. Zhou, C., et al. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): A multicentre, open-label, randomised, phase 3 study. Lancet Oncol. 12 (8), 735-742 (2011).
  7. Wu, K., House, L., Liu, W., Cho, W. C. Personalized targeted therapy for lung cancer. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 16 (8), C21-C34 (2013).
  8. Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogenic shock: Turning an activated kinase against the tumor cell. Cell Cycle. 5 (24), 2878-2880 (2006).
  9. Kumar, S. S., et al. High early growth response 1 (EGR1) expression correlates with resistance to anti-EGFR treatment in vitro and with poorer outcome in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab. Clin Transl Oncol. 19 (6), 718-726 (2017).
  10. Li, D., et al. Status of 10 targeted genes of non-small cell lung cancer in Eastern China: A study of 884 patients based on NGS in a single institution. Thorac Cancer. 11 (9), 2580-2589 (2020).
  11. Wen, S., et al. Genomic signature of driver genes identified by target next-generation sequencing in Chinese non-small cell lung cancer. Oncologist. 24 (11), e1070-e1081 (2019).
  12. Tan, N., Li, Y., Ying, J., Chen, W. Histological transformation in lung adenocarcinoma: Insights of mechanisms and therapeutic windows. J Transl Int Med. 12 (5), 452-465 (2024).
  13. Coco, S., et al. Next generation sequencing in non-small cell lung cancer: New avenues toward personalized medicine. Curr Drug Targets. 16 (1), 47-59 (2015).
  14. Yang, X., et al. The molecular and cellular choreography of early mammalian lung development. Med Rev. 4 (3), 192-206 (2024).
  15. Wang, R., Wang, G., Zhang, N., Li, X., Liu, Y. Clinical evaluation and cost-effectiveness analysis of serum tumor markers in lung cancer. Biomed Res Int. 2013, 195692(2013).
  16. McGinn, S., Gut, I. G. DNA sequencing-spanning the generations. Nat Biotechnol. 30 (4), 366-372 (2013).
  17. Larson, N. B., Oberg, A. L., Adjei, A. A., Wang, L. A clinician's guide to bioinformatics for next-generation sequencing. J Thorac Oncol. 18 (2), 143-157 (2023).
  18. McCombie, W. R., McPherson, J. D., Mardis, E. R. Next-generation sequencing technologies. Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (11), a036798(2019).
  19. Van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: Tone down the bias. Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).
  20. Rao, W., et al. Potential unreliability of ALK variant allele frequency in the efficacy prediction of targeted therapy in NSCLC. Front Med. 17 (3), 493-502 (2023).
  21. Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 529, 35-45 (2013).
  22. Holmes, D. L., Stellwagen, N. C. Electrophoresis of DNA in oriented agarose gels. J Biomol Struct Dyn. 7 (2), 311-327 (1989).
  23. Liu, D., et al. Quality control of next-generation sequencing-based in vitro diagnostic test for onco-relevant mutations using multiplex reference materials in plasma. J Cancer. 9 (9), 1680-1688 (2018).
  24. Zhang, C., et al. An improved NGS library construction approach using DNA isolated from human cancer formalin-fixed paraffin-embedded samples. Anat Rec (Hoboken). 302 (6), 941-946 (2019).
  25. Wood, D. E. National comprehensive cancer network (NCCN) clinical practice guidelines for lung cancer screening. Thorac Surg Clin. 25 (2), 185-197 (2015).
  26. Chinese Society of Pathology Quality Control, Chinese Medical Association Chinese Society of Oncology, China Anti-Cancer Association Chinese Society of Lung Cancer, Chinese Thoracic Oncology Group. Guidelines on clinical practice of molecular tests in non-small cell lung cancer in China. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 50 (4), 323-332 (2021).
  27. Rao, W., et al. Developing an effective quality evaluation strategy of next-generation sequencing for accurate detecting non-small cell lung cancer samples with variable characteristics: A real-world clinical practice. J Cancer Res Clin Oncol. 149 (8), 4889-4897 (2023).
  28. Hutchins, R. J., et al. Practical guidance to implementing quality management systems in public health laboratories performing next-generation sequencing: Personnel, equipment, and process management (Phase 1). J Clin Microbiol. 57 (8), e00261-e00319 (2019).
  29. Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PLoS One. 12 (6), e0178706(2017).
  30. Larguinho, M., et al. Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta. 81 (3), 881-886 (2010).
  31. Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: Promises and challenges. Cancer Lett. 340 (2), 284-295 (2013).
  32. Senst, A., Bonsiepe, H., Kron, S., Schulz, I. Application of the Agilent 2100 bioanalyzer instrument as quality control for next-generation sequencing. J Forensic Sci. 69 (6), 2192-2196 (2024).
  33. Li, W., Qiu, T., Ling, Y., Gao, S., Ying, J. Subjecting appropriate lung adenocarcinoma samples to next-generation sequencing-based molecular testing: Challenges and possible solutions. Mol Oncol. 12 (5), 677-689 (2018).
  34. Li, W., et al. Potential unreliability of uncommon ALK, ROS1, and RET genomic breakpoints in predicting the efficacy of targeted therapy in NSCLC. J Thorac Oncol. 16 (3), 404-418 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAFFPE

מאמרים קשורים