פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה ISO15189 אוטומטית ומוסמכת של הדור הבא לאיתור שינויים גנומיים ממוקדים ברקמות משובצות פרפין קבועות בפורמלין של סרטן תאים לא קטנים (NSCLC).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי שינויים ממוקדים בסרטן ריאות של תאים לא קטנים באמצעות ריצוף מהדור הבא
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הצלחת הטיפול הממוקד בסרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) תלויה בזיהוי מדויק של שינויים במניעים, כולל מוטציות, איחוי גנים והגברה. ריצוף הדור הבא (NGS) התגלה ככלי אבחון מולקולרי מקיף, המסוגל לזהות סטיות גנומיות ידועות וחדשות, ומספק תמיכה קריטית לטיפול NSCLC מותאם אישית. עם זאת, NGS נותרה שיטה מורכבת ומאתגרת מבחינה טכנית. למרות האימוץ הנרחב שלה, NGS עדיין מתמודדת עם כמה אתגרים, כולל מורכבות טכנית וזמני אספקה ממושכים. כאן, מוצג זרימת העבודה של NGS עם אישור ISO15189 המיושמת במעבדה הקלינית. הפרוטוקול הסטנדרטי כלל הערכת תאיות גידול (≥20%), מיצוי DNA מרקמות משובצות פרפין קבועות בפורמלין (FFPE) (קלט DNA ≥ 50 ננוגרם), הכנת ספרייה אוטומטית וניתוח ביואינפורמטיקה. על ידי שילוב אמצעי בקרת איכות מחמירים (QC) בכל שלב, זרימת העבודה מבטיחה אמינות נתונים גבוהה. חוץ מזה, החידוש העיקרי בזרימת העבודה היה האוטומציה של בניית ספריות NGS. המערכת האוטומטית של בניית ספריית NGS כללה תיקון קצה, זנב A, קשירת מתאם, לכידת הכלאה וטיהור, מזעור יעיל של טעויות אנוש, שיפור יכולת השחזור הניסיוני, הפחתת זמן מעשי ובכך שיפור היעילות. יחד, הניסיון מוכיח כי QC קפדני והכנת ספרייה אוטומטית חיוניים לשמירה על דיוק ומדרגיות בבדיקות NGS קליניות. גישה אופטימלית זו לא רק מבטיחה עמידה בתקני ISO15189 אלא גם תומכת בביקוש הגובר לאונקולוגיה מדויקת בניהול NSCLC.
מבוא
סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) מהווה 75%-85% מכלל מקרי סרטן הריאות, ומייצג הן עדיפות קלינית והן אתגר טיפולי 1,2,3. בשנים האחרונות, עם הפיתוח המוצלח והיישום הקליני של תרופות ממוקדות מולקולרית כגון מעכבי קולטן גורם גדילה אפידרמלי טירוזין קינאז (EGFR-TKIs), הטיפול ב-NSCLC מתקדם נכנס לעידן הטיפולים המדויקים המותאמים אישית 4,5,6. טיפול ממוקד מציע יעילות מדויקת, ספציפיות גבוהה ותופעות לוואי מינימליות 7,8
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול קיבל פטור מ-IRB עבור דגימות ארכיון אנונימיות.
1. שלבי בדיקה מקדימים ובקרת איכות
- רשום מידע לדוגמה במערכת ניהול מידע המעבדה (טבלה 1). מלא את טופס ההסכמה מדעת לבדיקת מוטציות גנטיות.
- קבל דגימת NSCLC FFPE. ודא שהדגימה המשמשת לבדיקה היא דגימת רקמת פרפין שאוחסנה לא יותר משנתיים. ודא שהדגימות מעובדות ומאוחסנות על פי שיטות פתולוגיות סטנדרטיות.
הערה: מחקר זה מתמקד בעיקר בזרימת העבודה המתודולוגית, ולא בביצוע ניתוח קליני בקנה מידה גדול. לכן, לא נקבעה דרישת מספר מדגם ספציפי לשלב זה של המחקר. - חותכים חלקים באמצעות להבי מיקרוטום חד פעמיים. החלף ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תוך שימוש בזרימת עבודה אוטומטית של ניתוח NGS עם בקרות איכות מחמירות, המעבדה ביצעה פרופיל גנומי מקיף של דגימות NSCLC. זרימת העבודה האופטימלית לזיהוי (איור 2) זיהתה באופן מהימן מספר שינויים גנומיים הניתנים לפעולה קלינית בדגימות גידול מייצגות (איור 3).
תוצאות הריצוף הדגימו מוטציה בתדר גבוה של EGFR p.L858R missense (AF=89.25%) המלווה בהגברה משמעותית של מספר עותקי הגן EGFR (CN=14.7). בנוס.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כל דוח NGS מוסמך מסתתר מאחורי תהליך קפדני, שנותר מורכב וגוזל זמן28. כדי לטפל בבעיות אלה, המעבדה פיתחה מערכת NGS אוטומטית לחלוטין. פעולה זו מפחיתה משמעותית את ההתערבות הידנית, ממזערת שגיאות ניסוי ומקצרת משמעותית את זמן האספקה. לכן, מערכת זו סיפקה אסטרטגיה אמינה ויעילה יותר עבור NGS, וביססה חשיבה חדשה לאיכות הנתונים במחקר גנומי.
המערכת המשולבת כוללת אוטומציה מקיפה לאורך כל זרימת העבודה, ומספקת יעילות עיבוד משופרת ואמינות תוצאות. ראשית, ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן למדעי הטבע של בייג'ינג של הרפובליקה העממית של סין (7252122), קרן המחקר האונקולוגי הקליני של בייג'ינג Xisike של הרפובליקה העממית של סין (Y-HS202402-0021), קרן המחקר להוראה להכשרת התמחות של בית החולים לסרטן, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה והמכללה הרפואית של פקין יוניון (E2025004), ומימון המחקר הקליני הלאומי של בתי חולים ברמה גבוהה (2025-LYZX-R-B03).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Agilent ערכת DNA ברגישות גבוהה | אג'ילנט | 5067-4626 | לשימוש עם ה מערכת הביואנלייזר Agilent 2100 |
| ערכת Agilent DNA 1000 Reagents | אג'ילנט | 5067-1504 | לשימוש עם ה מערכת הביואנלייזר Agilent 2100 |
| אנלייזר ביולוגי Agilent 2100 | אג'ילנט | G2939A | העריך את גודל השברים של הספרייה ואת נוכחות המתאמים. |
| קונצרט כלי אוטומטי מלא לטיהור חומצות גרעין | קונצרט | MC1002 | משמש למיצוי DNA |
| שווה ביט 1&פעמיים; ערכת בדיקת dsDNA HS | ואזימה | EQ121-02-AA | לשימוש עם ה פלואורומטרי קיוביט 3.0 |
| ערכת זיהוי משולבת של מוטציות גנטיות של EGRR/KRAS/BRAF/ALK אנושי | ברנינג רוק | BR-LC00102 | בניית הספרייה |
| מגניס BR | אג'ילנט טכנולוגיות | G7595AA | הכנה אוטומטית לספריית NGS |
| ME220 אולטרסוניקטור ממוקד | קובאריס | 500396 | אולטרסוניקציה |
| NanoDrop One/OneC | תרמו פישר | ND-ONE-W | זיהוי ספקטרופוטומטרי גלוי באורך גל מלא ב-UV |
| NextSeq 550Dx | אילומינה | 20005715 | רצף |
| NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (300CYS) | אילומינה | 20024908 | לשימוש עם NextSeq 550Dx |
| תגובת חילוץ חומצות גרעין | קונצרט | RC1102 | משמש למיצוי DNA |
| פלואורומטרי קיוביט 3.0 | חיים | Q33216 | משמש לזיהוי ריכוזי חומצות גרעין או ספרייה |
| ערכת בדיקת HS של קיוביט dsDNA | חיים | Q32851 | לשימוש עם ה פלואורומטרי קיוביט 3.0 |
מקורות
- Feng, R. M., Zong, Y. N., Cao, S. M., Xu, R. H. Current cancer situation in China: Good or bad news from the 2018 global cancer statistics. Cancer Commun (Lond). 39 (1), 22(2019).
- Siegel, R. L., Kratzer, T. B., Giaquinto, A. N., Sung, H., Jemal, A. Cancer statistics, 2025. CA....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
