Method Article

מערכת זיהוי מולקולרית משולבת מבוססת PCR לזיהוי בו זמנית של ארבעה טפילי מעיים זואונוטיים ממקורות מרובים

DOI:

10.3791/69180

⸱

October 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Public Health Molecular Biology, Yancheng Center for Disease Control and Prevention, 2Clinical Laboratory, Yancheng Maternal and Child Health Care Hospital Affiliated to Yangzhou University, 3Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיתור ארבעה טפילי מעיים זואונוטיים ממספר מקורות בו זמנית המבוסס על שילוב של מערכת זיהוי מולקולרית משולבת מבוססת תגובת שרשרת פולימראז (PCR).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות זיהומיות הן גורמים קריטיים המשפיעים על בריאות האדם, התפתחות כלכלית ויציבות חברתית. ביניהם, מחלות טפיליות מעיים זואונוטיות הפכו יותר ויותר למוקד דאגה עולמי עם מחלות זיהומיות מתעוררות ומתעוררות מחדש, במיוחד קריפטוספורידיום, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis ו-Giardia. רק מחקרים מעטים פורסמו על האפידמיולוגיה של הטפילים הנ"ל, מלווים בנושאים כמו מטרות זיהוי בודדות, שיעורי גילוי נמוכים ושיעורי גילוי חסרים גבוהים. מחקר זה נועד להקים מערכת זיהוי מולקולרית משולבת המבוססת על שילוב של בדיקות PCR לזיהוי סימולטני של ארבעת טפילי המעיים הזואונוטיים הנ"ל בדגימות שנאספו מעכברי בר, חיות מחמד ובעלי חיים (בקר וכבשים), על מנת לספק תמיכה טכנית יעילה לזיהוי טפילים שגרתי בתרחישים מרובים, כולל ממשקי בעלי חיים-סביבה במיוחד במתקני מעקב מקומיים.

במחקר זה, שלקח את הזיהוי של Enterocytozoon bieneusi בצואה של 95 עכברי בר ו-30 חתולים וכלבים (25 מחתולים ו-5 מכלבים) כבדיקה ראשונית, כאשר נעשה שימוש בשתי קבוצות של פריימרים כדי להגביר את הגן ITS, התוצאות החיוביות של כל PCR היו זהות לחלוטין (5.26%), אך השילוב של 2 סטים של בדיקות תגובת שרשרת פולימראז (PCR) הביא לשיעור חיובי גבוה יותר (6.32%) עבור Enterocytozoon bieneusi. עבור ג'יארדיה, 9 דגימות חיוביות זוהו באמצעות הגן בטא-ג'יארדין (BG), בעוד שלא זוהו חיוביים באמצעות הגנים גלוטמט דהידרוגנאז (GDH) וטריוז פוספט איזומראז (TPI). התוצאות לעיל הראו כי שילוב של בדיקות PCR עבור מספר מקטעים גנטיים שיפר את יכולת הזיהוי של פתוגנים ייעודיים, בהשוואה לכל בדיקת PCR בודדת. רצפי המטרה אושרו על ידי ריצוף סנגר. מערכת זו תוכננה לשפר ולהקל על המעקב אחר מצב ההדבקה, התפוצה והאבולוציה הפילוגנטית של טפילי מעיים זואונוטיים ממקורות מרובים, ולספק בסיס לאזהרות מדויקות ורגישות בשלב מוקדם. מטרתו לבנות גשר טכני להשגת יעד בריאות אחת על פני ממשקי אדם-חיה-סביבה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ה-Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis ו-Giardia הם פתוגנים פרוטוזואים נפוצים ומוזנחים בקלות עם שכיחות עולמית. בשנים האחרונות, בשל גורמים כמו שיקום וחדירה לנישות האקולוגיות של מוקדי הטבע, הפופולריות של גידול חיות מחמד והתפתחות גידול בעלי חיים ועופות, השכיחות של מחלות טפיליות מעיים זואונוטיות מרובות מקורות במכרסמים, חיות מחמד (חתולים וכלבים) ובעלי חיים (בקר וכבשים) הפכה יותר ויותר למוקד התפתחות, התפרצות ומחלות זיהומיות המתעוררות מחדש באזורים ביתיים וכפריים, המסכנות באופן חמור את בריאות האדם ואת ביטחון בריאות הציבור העולמי 1,2,3,4.

לטפילים אלה יש מינים תוך-גנריים מורכבים ויכולת הסתגלות נרחבת למארח. הם יכולים להדביק לא רק מכרסמים, חיות מחמד, מעלי גירה של בעלי חיים, עופות וציפורים, אלא גם מינים זואונוטיים, שיכולים להדביק בני אדם ולגרום לתסמינים קליניים כמו כאבי בטן, שלשולים והקאות. הם רגישים במיוחד בקרב ילדים, קשישים, נשים בהריון ואוכלוסיות מדוכאות חיסון, ויכולים להיות מועברים דרך מים, מזון ואוויר, מה שמהווה סיכונים משמעותיים לבריאות הציבור 3,5,6.

נכון לעכשיו, הזיהוי של ארבעת הטפילים הנ"ל מסתמך בעיקר על מורפולוגיה, הנוטה לזיהוי שגוי בשל דמיון מורפולוגי בתוך סוגים וגורמים סובייקטיביים, במיוחד בהבחנה בין מינים וגנוטיפים. טכניקות ביולוגיה מולקולרית היו בשימוש נרחב לזיהוי מינים, סוגים וגנוטיפים של טפילים אלה. עבור Blastocystis ו-Cryptosporidium, הזיהוי מתמקד בעיקר בגן תת-היחידה הקטנה של חומצה ריבונוקלאית ריבוזומלית (SSU rRNA) 3,7,8; עבור Enterocytozoon bieneusi, הגן המתועתק הפנימי (ITS) 4,9; ועבור ג'יארדיה, הגנים בטא-ג'יארדין (BG), גלוטמט דהידרוגנאז (GDH) וטריוז פוספט איזומראז (TPI)10,11. למרות שתגובת שרשרת פולימראז קונבנציונלית מקוננת (PCR) שיפרה מאוד את יכולות הזיהוי וההקלדה של ארבעת הטפילים הללו, היא אינה מספיקה באיתור מקרים שהוחמצו וזיהוי מינים חדשים או קוואזימינים בעלי מאפיינים גנטיים משמעותיים. זה משפיע לעתים קרובות על היעילות של חקירה אפידמיולוגית, העברה ובקרת מחלות בבני אדם, בעלי חיים ומארחים אחרים, ומציב אתגרים גדולים לביטחון בריאות הציבור בבני אדם, בעלי חיים והסביבה.

בשל הדמיון בתסמינים, דרכי ההעברה וטווח הפונדקאי של ארבעת הטפילים הללו, אין עדיין מערכת מולקולרית משולבת לזיהוי יעיל תוך הימנעות מזיהוי חסר וזיהוי מדויק של מינים חדשים או קוואזימינים עם הבדלים גנטיים משמעותיים. מחקר זה הקים מערכת זיהוי מולקולרית משולבת בוגרת המבוססת על טכנולוגיית ריצוף PCR בתפוקה גבוהה על ידי סקירת ספרות, לזיהוי סימולטני של ארבעת טפילי המעיים הזואונוטיים בדגימות מרובות מקורות (עכברי בר, חיות מחמד, בקר וכבשים). בשילוב עם ניתוח ביואינפורמטי, מערכת זו יושמה לזיהוי טפילי מעיים זואונוטיים מרובי מקורות, ניטור גורמים אפידמיולוגיים כגון התפלגות זיהום ואבולוציה פילוגנטית, והתראה מוקדמת על זיהומים בבני אדם ובעלי חיים וזיהום סביבתי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר אושר ונערך על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של המרכז המחוזי לבקרת מחלות ומניעתן בג'יאנגסו. מחקר זה נערך בהתאם למהדורת 2020 של הנחיות האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית בנושא המתת חסד של בעלי חיים, העקרונות המנחים של התקנות לניהול חיות ניסוי (צו מס' 2 של הוועדה הממלכתית למדע וטכנולוגיה של הרפובליקה העממית של סין, 1988), והעקרונות המנחים לטיפול הומני בבעלי חיים שהונפקו על ידי משרד המדע והטכנולוגיה של הרפובליקה העממית של סין.

1. הכנת צואה טרייה מעכברי בר, חיות מחמד ובעלי חיים (בקר וכבשים)

  1. הרדמת עכברים על ידי שאיפת פחמן דו חמצני ממקור פחמן דו חמצני דחוס משומר בקופסת פלסטיק שקופה אטומה, עם שיעור החלפה של 30%-70% מנפח המיכל לדקה. לאחר הרדמה מלאה ותרדמת, בצע פריקת צוואר הרחם בעכברים.
  2. איסוף דגימות צואה טריות: אסוף דגימות צואה מכלבים, חתולים, בקר וכבשים תוך שעה לאחר עשיית הצרכים, עם צינור אחד לכל צואה של בעל חיים, והימנע מזיהום צולב.
    1. לכוד מכרסמים באמצעות כלובי פיתיון עם מכשירי שחרור בבתי גידול פראיים שונים. הניחו את העכברים שנלכדו בשקיות עכברים והעבירו אותם מיד למעבדה. בפעולה סטרילית בארון בטיחות ביולוגית, נתחו את העכברים כדי לאסוף את פי הטבעת המכיל צואה, הניחו אותו בצינור קריו של 2 מ"ל ואחסנו אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לזיהוי מאוחר יותר.
    2. בחר כלבים וחתולים מחנויות לחיות מחמד באזורים שונים כאובייקטי מחקר. אספו מיד צואה טרייה שהופרשה לתוך צינורות קריו-טיוב של 5 מ"ל, המסומנים במידע מלא על הדגימה, והובילו אותם מיד למעבדה לאחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    3. בחר בקר וכבשים מחוות בעלי חיים (אינטנסיביות או חופשיות) כאובייקטי מחקר. אסוף צואה טרייה שהופרשה מיד לתוך צינורות קריו-צינורות של 50 מ"ל, המסומנים במידע דגימה מלא, והעבר אותם מיד למעבדה לאחסון ב-80 מעלות צלזיוס.

2. מיצוי DNA כולל מצואה טרייה של עכברי בר, חיות מחמד ובעלי חיים (בקר וכבשים)

  1. טיפול מקדים בצואה:
    הערה: נעשה שימוש בערכת מיני שרפרף DNA מהירה של QIAamp.
    1. בפעולה סטרילית בארון בטיחות ביולוגית, הוסף כ-200 מ"ג צואה ממקורות שונים למאגר מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS), הוסף חרוזי פלדה והומוגניזציה יסודית באמצעות מטחנת רקמות.
    2. מחממים את זה ב-70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות וצנטריפוגה ב-10,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (15-25 מעלות צלזיוס).
    3. הוסף 600 מיקרוליטר של סופרנטנט לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל המכיל 25 מיקרוליטר של פרוטאינאז K, הוסף 600 מיקרוליטר של Buffer AL ומערבולת למשך 15 שניות.
    4. יש לדגור בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הוסף 600 מיקרוליטר של 100% אתנול נטול מים לליזאט ולמערבולת לערבוב.
  2. הוסף בזהירות 600 מיקרוליטר של הליזאט לעמוד ספין, צנטריפוגה בטמפרטורה של 14000 × גרם למשך דקה אחת, והנח את עמוד הסיבוב בצינור איסוף חדש של 2 מ"ל. חזור על שלב זה פעם נוספת.
  3. פתח בזהירות את עמוד הסיבוב, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר AW1, צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך דקה אחת, והנח את עמוד הסיבוב בצינור איסוף חדש של 2 מ"ל. פתח בזהירות את עמודת הסיבוב, הוסף 500 מיקרוליטר של Buffer AW2 וצנטריפוגה במהירות מרבית למשך 3 דקות.
  4. הנח את עמוד הסיבוב בצינור איסוף חדש של 2 מ"ל (מוכן בנפרד) וצנטריפוגה בחום של 14000 × גרם למשך 3 דקות. הנח את עמוד הסיבוב בצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל, והוסף 100 מיקרוליטר של מאגר Elution ישירות לקרום עמוד הסיבוב.
  5. דגירה בטמפרטורת החדר (15-25 מעלות צלזיוס) למשך דקה אחת, וצנטריפוגה בטמפרטורה של 14000 × גרם למשך דקה אחת כדי לחסל DNA.
  6. קבע את הריכוז והטוהר של ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר אולטרה-מיקרו. השתמש ב-DNA שחולץ לזיהוי לאחר מכן או אחסן אותו ב-20 מעלות צלזיוס לשימור לטווח ארוך.
    הערה: יחס A260/A280 צריך להיות 1.8-2.0 כדי להבטיח את שלמות וטוהר ה-DNA המופק.

3. זיהוי PCR קונבנציונאלי מקונן של קריפטוספורידיום ובלסטוציסטיס המכוון ל-RNA ריבוזומלי תת-יחידה קטנה (SSU rRNA)

הערה: Dream Taq Green PCR Mix שימש לשלב זה.

  1. הכן את מערכת תגובת ה-PCR על קרח באמצעות PCR Mix: 25 מיקרוליטר של 2× מאגר Taq, 2 מיקרוליטר מכל אחד מהפריימרים קדימה ואחורה, 16 מיקרוליטר של ddH2O ו-5 מיקרוליטר של תבנית, בנפח כולל של 50 מיקרוליטר.
  2. עבור קריפטוספורידיום, בצע את שלבים 3.2.1-3.2.2.
    1. השתמש ב-F1R11 ו-F-1R1-1 8,11 כפריימרים לתגובה בסיבוב הראשון. הגדר את תוכנית התגובה: דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות, עם התארכות סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
    2. השתמש ב-F2R21 וב-F-1R2-1 8,11 כפריימרים בסיבוב השני, עם תוכנית התגובה הבאה: דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, עם התארכות סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
  3. עבור בלסטוציסטיס, בצע את השלבים 3.3.1-3.3.4.
    1. השתמש ב-F1R13 ו-F1-1R-1 3,12 כפריימרים לתגובה בסיבוב הראשון. הגדר את תוכנית התגובה עבור F1R1 באופן הבא: דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, חישול ב-60 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 100 שניות, עם התארכות סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
    2. הגדר את תוכנית התגובה עבור F1-1R-1 באופן הבא: דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, עם התארכות סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
    3. השתמש ב-F2R23 ו-F2-1R-1 3,12 בתור פריימרים לסיבוב השני. הגדר את תוכנית התגובה עבור F2R2 באופן הבא: דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, חישול ב-60 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, עם התארכות סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
    4. הגדר את תוכנית התגובה עבור F2-1R-1 באופן הבא: דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 50 שניות, עם התארכות סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
      הערה: רצפי פריימר מוצגים בטבלה 1 1,3,8,11,12.
פטוגן (מחולל מחלה)גודל מוצר צפוי (bp)רצפי פריימר (5′-3′)הפניות
קריפטוספורידיום830F1: CCATTTCCTTCGAAACAGGA1
R1: TTCTAGAGCTAATACATGCG
F2: AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA
R2: GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG
607F-1: GACATATCATTCAAGTTTCTGACC8,11
R1-1: CTGAAGGAGTAAGGAACAACC
R2-1: TCTAAGAATTTCACCTCTGACTG
בלסטוציסטיס600F1: GGGATCCTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC3
R1: GGAAGC TTATCTGGTTGATCCTGCCAGTA
F2: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT
R2: GAGCTTTTTAACTGCAACAACG
460F1-1: TGCTTTCGCACTTGTTCATC3,12
F2-1: GATTTATTGTCACTACCTCC
R-1: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT

טבלה 1: רצפי פריימר עבור SSU rRNA של קריפטוספורידיום ובלסטוציסטיס.

4. זיהוי PCR קונבנציונלי מקונן של גן Enterocytozoon bieneusi ITS, וגנים Giardia BG, GDH ו-TPI

הערה: Dream Taq Green PCR Mix שימש לשלב זה.

  1. הכן את מערכת תגובת ה-PCR על קרח באמצעות תערובת PCR: 25 מיקרוליטר של 2× מאגר Taq, 2 מיקרוליטר כל אחד של פריימרים קדימה ואחורה, 16 מיקרוליטר של ddH2O ו-5 מיקרוליטר של תבנית, בנפח כולל של 50 מיקרוליטר.
  2. עבור Enterocytozoon bieneusi, בצע את השלבים 4.2.1-4.2.2.
    1. השתמש ב-F1R19 ו-F1-1R1-12 כפריימרים לתגובה בסיבוב הראשון. הגדר את תוכנית התגובה באופן הבא: דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 50 שניות, עם התארכות סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
    2. השתמש ב-F2R29 ו-F2-1R2-12 כפריימרים בסיבוב השני, כאשר תוכנית התגובה היא כדלקמן: דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 50 שניות, עם התארכות סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
  3. עבור ג'יארדיה, בצע את השלבים 4.3.1-4.3.3.
    1. השתמש ב-BG-F1R1, GDH-F1R1 ו-TPI-F1R1 2,10 כפריימרים לתגובה בסיבוב הראשון עבור שלושת גני המטרה. הגדר את תוכנית התגובה של הסיבוב הראשון לכולם באופן הבא: דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, חישול ב-50 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, עם התארכות סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
    2. הגדר את תוכנית התגובה של הסיבוב השני עבור BG-F2R2 2,10 ו-TPI-F2R2 2,10 כדלקמן: דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 50 שניות, עם התארכות סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
    3. הגדר את תוכנית התגובה של הסיבוב השני עבור GDH-F2R2 2,10 כדלקמן: דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, חישול ב-60 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 50 שניות, עם התארכות סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
      הערה: רצפי פריימר מוצגים בטבלה 2 2,9,10.
פטוגן (מחולל מחלה)גודל מוצר צפוי (bp)רצפי פריימר (5′-3′)הפניות
Enterocytozoon bieneusi390F1: GGTCATAGGGATGAAGAG9
R1: TTCGAGTTCTTTCGCCTC
F2: GCTCTGAATATCTATGGCT
R2: ATCGCCGACGGATCCAAGTG
390F1-1: GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT2
R1-1: TATGCTTAAGTCCAGGGAG
F2-1: AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG
R2-1: AGTGATCCTGTATTAGGGATATT
ג'יארדיה511BG-F1: AAGCCCGACGACCTCACCCCAGTGC2,10
BG-R1: GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC
BG-F2: GAACGAACGAGATCGAGGTCCG
BG-R2: CTCGACGAGCTTCGTGTT
530GDH-F1: TTCCGTRTYCAGTACAACTC2,10
GDH-R1: ACCTCGTTCTGRGTGGCGCA
GDH-F2: ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT
GDH-R2: GTGGCGCARGGCATGCA
530TPI-F1: AAATIATGCCTGCTCGTCG2,10
TPI-R1: CAAACCTTITCCGCAAACC
TPI-F2: CCCTTCATCGGIGGTAACTT
TPI-R2: GTGGCCACCACICCCGTGCC

טבלה 2: רצפי פריימר לגן Enterocytozoon bieneusi ITS, וגנים Giardia BG, GDH ו-TPI.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברים קריפטוספורידיום, גן Blastocystis SSU rRNA, גן Enterocytozoon bieneusi ITS ותוצאות בדיקת PCR של גן Giardia BG
כל 95 דגימות הצואה הרקטליות מעכברים נבדקו לגן ITS של Enterocytozoon bieneusi באמצעות שתי קבוצות של פריימרים, וכתוצאה מכך 5 דגימות חיוביות לכל שיטה, וכתוצאה מכך 6 דגימות חיוביות בסך הכל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ה-Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis ו-Giardia הם טפילי מעיים זואונוטיים נפוצים; השניים הראשונים מסווגים כפתוגנים ביולוגיים בקטגוריה B על ידי מכוני הבריאות הלאומיים של ארה"ב (NIH), וכל הארבעה רשומים על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) כ-24 מהטפילים החשובים ביותר הנישאים במזון ברחבי העולם. הם עלולים להדביק בני אדם, בעלי חיים ולזהם את הסביבה, מה שעלול לגרום להתפרצויות מחלות ולהשפיע באופן משמעותי על ביטחון בריאות הציבור...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי ועדת הבריאות המחוזית של ג'יאנגסו (מענק מס. Ym2023024), פרויקט המחקר הרפואי העירוני של יאנצ'נג (מס' מענק. YK2023085), והקרן הפתוחה של מעבדת המפתח למיקרוביולוגיה פתוגנית למחלות זיהומיות מתעוררות ומתעוררות מחדש (המרכז המחוזי של ג'יאנגסו לבקרת מחלות ומניעתן) (PM202402).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose צ'ינגקה טקTSJ001
ערכת חילוץ ג'ל QiaquickQiagen 28704ערכת חילוץ ג'ל DNA
סולם 100 בסיסים פלוס DNATransGen  ביוטכנולוגיהBM311סולם DNA
צבע 4S ירוק פלוס חומצה גרעיניתBBIA616696-0500צביעת DNA
10× בופר TBEסולרביולוגיהT1051בופר אלקטרופורייזיס
קיוביט 4.0תרמוhttps://www.thermofisher.com/in/en/home
/תעשייתי/ספקטרוסקופית-יסודית
-ניתוח איזוטופים/ספקטרוסקופיה מולקולרית/
fluorometers/qubit/models/qubit-4.html?
ef_id=:G:s& s_kwcid=AL!3652!10!77515
785702067!!!! 77516061528018!! 380468
453!1240249321530142& CID=bid_pca_
aqb_r01_co_cp1359_pjt0000_bid
00000_0se_bng_bt_pur_con		מכשיר כמותי פלואורסצנטי
מיני ספייס 1000טנוןhttp://en.biotanon.com/PRODUCT/
PRODUCTLIST?ID=3040&
סוג = פרט		מדמת ג'ל
  ערכת מיני צואה מהירה ל-DNA להוצאת DNAQIAGEN51604ערכת חילוץ חומצות גרעין
בסיס ProFlexתרמוhttps://www.thermofisher.com/
in/en/home/life-science/pcr/
thermal-cyclers-realtime-
instruments/thermal-cyclers
/proflex-pcr-system.html		PCR
Dream Taq Green PCR MixתרמוK1082הגברת PCR 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhao, Q., et al. Cryptosporidium spp. in large-scale sheep farms in China: prevalence and genetic diversity. Sci Rep. 14 (1), 11218(2024).
  2. Li, F., Wang, R., Guo, Y., Li, N., Feng, Y., Xiao, L. Zoonotic potential of Enterocytozoon bieneusi and Giardia duodenalis in horses and donkeys in northern China. Parasitol Res. 119 (3), 1101-1108 (2020).
  3. Jinatham, V., Maxamhud, S., Popluechai, S., Tsaousis, A. D., Gentekaki, E. Blastocystis One Health approach in a rural community of Northern Thailand: prevalence, subtypes and novel transmission routes. Front Microbiol. 12 (1), 746340(2021).
  4. Deng, L., et al. Occurrence and genetic characteristics of Cryptosporidium spp. and Enterocytozoon bieneusi in pet red squirrels (Sciurus vulgaris) in China. Sci Rep. 10 (1), 1026(2020).
  5. Zhao, W., Zhou, H. H., Ma, T. M., Cao, J., Lu, G., Shen, Y. J. PCR-based detection of Cryptosporidium spp. and Enterocytozoon bieneusi in farm-raised and free-ranging geese (Anser anser f. domestica) from Hainan Province of China: natural infection rate and the species or genotype distribution. Front Cell Infect Microbiol. 9 (1), 416(2019).
  6. Feng, Y., Xiao, L. Zoonotic potential and molecular epidemiology of Giardia species and giardiasis. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 110-140 (2011).
  7. Zhao, G. H., et al. Genotyping Cryptosporidium andersoni in cattle in Shaanxi Province, Northwestern China. PLoS One. 8 (4), e60112(2013).
  8. Ryan, U., Xiao, L., Read, C., Zhou, L., Lal, A. A., Pavlasek, I. Identification of novel Cryptosporidium genotypes from the Czech Republic. Appl Environ Microbiol. 69 (7), 4302-4307 (2003).
  9. Gui, B. Z., et al. Novel genotypes and multilocus genotypes of Enterocytozoon bieneusi in two wild rat species in China: potential for zoonotic transmission. Parasitol Res. 119 (1), 283-290 (2020).
  10. Ye, J., et al. Occurrence of human-pathogenic Enterocytozoon bieneusi, Giardia duodenalis and Cryptosporidium genotypes in laboratory macaques in Guangxi, China. Parasitol Int. 63 (1), 132-137 (2014).
  11. Alves, M., Xiao, L., Sulaiman, I., Lal, A. A., Matos, O., Antunes, F. Subgenotype analysis of Cryptosporidium isolates from humans, cattle, and zoo ruminants in Portugal. J Clin Microbiol. 41 (6), 2744-2747 (2003).
  12. Santín, M., Gómez-Muñoz, M. T., Solano-Aguilar, G., Fayer, R. Development of a new PCR protocol to detect and subtype Blastocystis spp. from humans and animals. Parasitol Res. 109 (1), 205-212 (2011).
  13. Bouwknegt, M., et al. Prioritisation of food-borne parasites in Europe, 2016. Euro Surveill. 23 (9), 17(2018).
  14. Xiao, L., Fayer, R. Molecular characterisation of species and genotypes of Cryptosporidium and Giardia and assessment of zoonotic transmission. Int J Parasitol. 38 (11), 1239-1255 (2008).
  15. Cacciò, S. M., Beck, R., Lalle, M., Marinculic, A., Pozio, E. Multilocus genotyping of Giardia duodenalis reveals striking differences between assemblages A and B. Int J Parasitol. 38 (13), 1523-1531 (2008).
  16. Wawrzyniak, I., et al. Blastocystis, an unrecognized parasite: an overview of pathogenesis and diagnosis. Ther Adv Infect Dis. 1 (5), 167-178 (2013).
  17. Honigsbaum, M. Disease X and other unknowns. Lancet. 393 (10180), 1496-1497 (2019).
  18. A scientific framework for epidemic and pandemic research preparedness. , WHO. At https://cdn.who.int/media/docs/default-source/consultation-rdb/prioritization-pathogens-v6final.pdf?sfvrsn=c98effa7_7&download=true (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PCR DetectionZoonotic ParasitesIntestinal ParasitesMolecular DetectionCryptosporidium DetectionEnterocytozoon BieneusiBlastocystis DetectionGiardia DetectionSanger SequencingOne Health

Related Articles