מאמר שיטה

דיסקציה של שרירי טיסה עקיפים של Drosophila melanogaster לגישות מיקרוסקופיות

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69185

⸱

7 בנובמבר 2025

 ,  ,  , 
1Division of Biological and Biomedical Systems, School of Science and Engineering, University of Missouri Kansas City

במאמר זה

סיכום

דרוזופילה היא מודל רב עוצמה להבנת מנגנונים בסיסיים של מיוגנזה. פרוטוקול זה לדיסקציה והכנה של חצאי בית החזה מאפשר ניתוח מיקרוסקופיה של שרירי תעופה עקיפים הן משלב הגולם והן משלב הבוגר. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה קונפוקלית של מורפולוגיה תאית, לוקליזציה של חלבונים, מבנה שרירים והיבטים רבים אחרים של מיוגנזה.

תקציר

שרירי התעופה העקיפים (IFM) של Drosophila melanogaster הם מודל גנטי רב עוצמה לחקר עקרונות היסוד של מיוגנזה. מנגנון ההתכווצות ומרכיבי סרקומר רבים נשמרים מזבובים ועד בעלי חוליות, ומאפשרים לחקור תהליכים תאיים מוויסות שעתוק ועיבוד RNA ועד חילוף חומרים ומכניביולוגיה המכוונים ומכווננים את התפתחות השרירים. רבים מהמסלולים התאיים הללו משתנים במיופתיות אנושיות, ומחקרי IFM מספקים תובנה רלוונטית לגבי האטיולוגיה המולקולרית של מחלות שרירים. בפרט, זבובים מתאימים היטב למיקרוסקופיה כדי לנתח מורפולוגיה ותפקוד של מיופייבר וסרקומר לאורך כל התהליך של מיוגנזה IFM, ממפרט מיובלסט ועד להיווצרות, התבגרות ותחזוקה של מיופיבריל. כאן, מוצג פרוטוקול לנתיחה של D. melanogaster IFMs בנקודות זמן של גולם ובוגרים עבור גישות מיקרוסקופיות. פרוטוקולים מאוירים מסופקים לדיסקציה של המיטורקס של IFMs גולמים מאוחרים ובוגרים, כמו גם דיסקציה בספר פתוח של IFMs גולמים מוקדמים. מתוארים הליכי קיבוע, צביעה והרכבה לדוגמא וחפצי חיתוך נפוצים, עם נתונים מייצגים המדגימים את התאימות של דיסקציה IFM עם ריאגנטים שונים לקיבוע. פרוטוקולים אלה מיושמים כדי לחקור את האלל ההיפומורפי SmnE33 של נוירון מוטורי הישרדות חלבון קושר RNA (Smn) ב-26 שעות לאחר היווצרות הגולם (APF), 72 שעות APF וב-IFMs בוגרים, ומספקים תובנה חדשה למודל ניוון מוטורי של עמוד השדרה (SMA) וממחישים את התועלת הכללית של פרוטוקול זה. פרוטוקול מפורט זה מאפשר גישה למערכת מודל IFM ורכישת נתוני מיקרוסקופיה באיכות גבוהה כדי לחקור את עקרונות המיוגנזה.

מבוא

לבעלי חיים יש מאות שרירים השולטים בתנועות שונות, החל מהפעלת אמבולציה ועד להקלה על הדיבור ועד לאחיזה בכלי. כדי לתמוך במגוון כה רחב של תפקודים, השרירים נבדלים זה מזה בגודל, בהתקשרות, ביכולת ההתכווצות, בחילוף החומרים ובביטוי הגנים1. התמקדות עיקרית בתחום הביולוגיה של השרירים היא הבנת האופן שבו הבדלים מבניים ותפקודיים אלה מתעוררים במהלך ההתפתחות ומשתנים במחלות שרירים2. התכווצות השרירים מופעלת על ידי סרקומרים הבנויים עם חוטים דקים המכילים אקטין המעוגנים בדיסק Z המשתלבים עם חוטים עבים המכילים מיוזין דו קוטביים המעוגנים בקוM 3. סרקומרים מאורגנים מקצה לקצה לשרירים מיופיברילים, וסידור קבוע זה בשריר המפוספס מופיע כרצועות בהירות וכהות לסירוגין תחת מיקרוסקופ4, ומספק שיטה חזותית מעשית לניטור שינויים בהרכבה ובארגון של סרקומר. בשילוב עם גנטיקה וגישות ביוכימיות, המיקרוסקופיה סיפקה תובנות חשובות לגבי תהליכים תאיים כגון ויסות שעתוק, עיבוד RNA, חילוף חומרים וטרנסדוקציהמכנית 5,6,7 המורים ומכווננים את התפתחות השרירים ותפקודם. רבים מהתהליכים התאיים הללו משובשים במיופתיות אנושיות ובהפרעות נוירומוסקולריות 8,9, מה שמדגיש את החשיבות של הבנת התפתחות השרירים כדי לקבל תובנה לגבי האטיולוגיה של מחלות שרירים. התקדמות בהנדסה גנטית, המאפשרת מניפולציה של תאים בודדים ותיוג אנדוגני של חלבונים10,11 יחד עם התקדמות טכנולוגית ברכישת תמונה ורזולוציה12,13 מבטיחים את החשיבות המתמשכת של מיקרוסקופיה לחקר השרירים. מערכות מודל עם פרוטוקולים ברורים ומיושמים בקלות לדיסקציה של שרירים והכנת דגימות הן אפוא בעלות ערך בתחום השרירים.

שרירי התעופה העקיפים (IFMs) של D. melanogaster הם מודל רב עוצמה ומאופיין היטב לחקר עקרונות בסיסיים של מיוגנזה8. IFMs מורכבים משישה שרירי גב-אורך (DLMs) לכל המיטורקס הנוצרים על תבניות שריר זחל ושבעה סיבי שריר גבי-גחוני (DVMs) שנבנים דה נובו במהלך התפתחות הגולם14. בשל נגישותם ליד קו האמצע, מחקרי IFM רבים מתמקדים ב-DLMs, השריר הגדול ביותר בזבובים בוגרים המשתרע על פני כל אורך 1 מ"מ של בית החזה15. בתחילת ההתגלמות, מיובלסטים IFM נודדים מהנישה שלהם על ציר דיסק הכנף אל בית החזה, שם הם מתמזגים ליצירת צינורות שריר סינציאלים16. לאחר חיבור גידים בסביבות 24 שעות APF ב-27 מעלות צלזיוס, סיבי שריר IFM מארגנים בהדרגה את הציטופלזמה והשלד הציטולוגי שלהם, קומפקטיים ויוזמים מיופיברילוגנזה בין 30-32 שעות APF17. סרקומרים חדשים מתווספים לשרוף ושרירים גדלים כדי למלא את בית החזה עד סביבות 48 שעות APF. לאחר מכן, IFMs עוברים תהליך התבגרות התואם לשינויים הן בשעתוק והן בשחבור המקדם רכישת תכונות מטבוליות והתכווצות של מבוגרים והפעלת מתיחה18. זבובים בוגרים מתקרבים מבית הגולם בין 90 שעות ל-100 שעות APF ב-27 מעלות צלזיוס, ובסביבות 100 שעות APF (נקבות בסביבות 98 שעות APF וזכרים בסביבות 102 שעות APF) ב-25 מעלות צלזיוס19. IFMs הם מערכת מודלים רב-תכליתית ורלוונטית. ניתן לנטר אותם בכל שלבי המיוגנזה, הם נבדלים מבחינה מורפולוגית ותפקודית מסוגי מיופייבר אחרים בזבוב, ונהנים ממגוון רחב של כלים גנטיים נגישים וגישות מניפולציה 8,20. מנגנון ההתכווצות, מורפולוגיה בסיסית של סרקומר ומרכיבים מבניים רבים נשמרים מזבובים לחולייתנים5, ומאפשרים תרגום של עקרונות מיוגניים מזבובים לבני אדם. ואכן, מודלים של זבובים של מחלות נוירומוסקולריות כגון ניוון מיוטוני, ניוון מוטורי של עמוד השדרה (SMA), מיופתיות מיופיברילריות ואקטינופתיה סיפקו תובנות אטיולוגיות וטיפוליות21,22. יש לציין כי זבובים מתאימים היטב למיקרוסקופיה לניתוח מורפולוגיה של מיופייבר וסרקומר על פני מיוגנזה, ממפרט מיובלסט ועד מיופיברילוגנזה ועד התבגרות ותחזוקה של סרקומר.

ה-IFMs של דרוזופילה שימשו ליישומי מיקרוסקופיה במשך יותר מארבעה עשורים, ותרמו רבות להבנת צמיחת השרירים והתפתחותם. במהלך תקופה זו, פרוטוקולי דיסקציה של IFM הותאמו ללא הרף עם התקדמות הטכנולוגיה, מה שהוביל למגוון רחב של פרוטוקולים המוצגים ברמות פירוט משתנות שהן אופטימליות עבור חלק ולא אופטימליות עבור טכניקות הדמיה אחרות. לדוגמה, פרוטוקולים שפותחו עבור מיקרוסקופ אלקטרונים כוללים תנאי קיבוע חזקים, חתך דק במיוחד וכתמים ניגודיים עם מתכות כבדות 3,23,24,25, אך אינם אופטימליים למיקרוסקופ אור. פרוטוקולים שפותחו לניתוח מהיר של IFMs מבית החזה לשימוש במבחנים ביוכימיים או אנליזות מולקולריות26,27 מאבדים את הקשר הרקמה ויכולים לשבש את מבנה המיופיבריל, ולכן הם לא אופטימליים לגישות מיקרוסקופיות. גישות דיסקציה פותחו לניתוח שריר הזחל או שריר הבטן הבוגר20,28, אך אינן אופטימליות לבידוד של IFMs שלמים. גישות הדמיה חיה דורשות דיסקציה זעיר פולשנית או מדיה מיוחדת כדי לשמור על רקמת IFM חיה במהלך תהליך ההדמיה29,30, ואינן כרוכות בשלבי הקיבוע הדרושים לשימור שרירים לאימונוהיסטוכימיה. קיימים פרוטוקולים מרובים להטמעת פרפין או חתך בהקפאה של רקמות IFM ותואמים להיסטוכימיה או צביעת נוגדנים 27,31,32, אך גישות אלה כוללות בדרך כלל הקפאה והתייבשות רקמות שיכולות לשנות את מבנה השריר ולהגביל את הזיהוי של אנטיגנים מסוימים על ידי נוגדנים ראשוניים. פרוטוקולים המקבעים ישירות את ה-IFMs משמרים את מורפולוגיה השרירים ומגבילים שינויים בקונפורמציה של אנטיגן והם רצויים לניסויים אימונוהיסטוכימיים רבים24. עם זאת, פרוטוקולים אלה מיועדים גם ליישומים ספציפיים, למשל, פרוטוקולים המנתקים IFMs המאפשרים ניתוח מיופיבריל יחיד על ידי פלואורסצנטיות, cryoEM או מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה 20,33,34. דוגמאות אחרות כוללות פרוטוקולים לניתוח סיבי IFM שלמים מבית החזה32,35 או ליצירת תכשירים שלמים או המיטורקס 20,32,36 המאפשרים ניתוח של סיבי שריר וסרקומרים בהקשר שלם. זה יכול להיות מאתגר עבור משתמש חדש למיין את המספר הגדול של הפרוטוקולים הקיימים, שרובם מבוססי טקסט. מתלמדים וחוקרים לתואר ראשון ייהנו מפרוטוקול דיסקציה מפורט של IFM כפי שהוא מיושם על יישומי אימונוהיסטוכימיה סטנדרטיים.

מאמר זה כולל סדרה של פרוטוקולים לדיסקציה והכנה של D. melanogaster IFMs בשלבי גולם ובוגרים לגישות מיקרוסקופיה אימונוהיסטוכימיה. גישה זו שימשה בפרסומים האחרונים העוקבים אחר פונקציות התפתחותיות של חלבונים קושרי RNA Bruno137 ו-Rbfox138 לאורך מיוגנזה IFM. הפרוטוקול כולל איורים מפורטים ותמונות שלב אחר שלב כדי להדריך משתמשים פוטנציאליים באמצעות דיסקציה של המיטורקס IFM של IFMs בוגרים וגולמים מאוחרים (48 שעות עד 96 שעות APF), כאשר בית החזה נחצה לאורך קו האמצע, תוך שמירה על מבנה השריר שלם. בנוסף, פרוטוקול זה מכסה דיסקציה פתוחה של שלבי גולם מוקדמים (8 שעות עד 48 שעות APF), שבהם החלק הגחוני של בית החזה נחתך ומורם, כמו פתיחת ספר, כדי לחשוף את ה-IFM השלמים המחוברים לאפידרמיס הגבי. שלבים נוספים בפרוטוקול כוללים קיבוע, צביעה והרכבת דגימה, ונתונים מייצגים מוכיחים כי גישה זו תואמת לשיטות קיבוע מגוונות להכנת רקמות לאימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. דוגמאות מייצגות ניתנות כדי לסייע למשתמשים חדשים בזיהוי חפצי נתיחה נפוצים. הפרוטוקול מיושם לניתוח הפנוטיפ ההתפתחותי IFM של SmnE33, אלל היפומורפי של נוירון מוטורי הישרדות (Smn) המשמש כמודל זבוב של ניוון מוטורי של עמוד השדרה (SMA)21,39, ב-26 שעות APF, 72 שעות APF, וב-IFM בוגרים. הנתונים המוצגים כאן מספקים תובנה לגבי התפקוד הספציפי לשריר של Smn ומדגישים את הישימות של פרוטוקול דיסקציה זה לחקר התפתחות השרירים והאטיולוגיה של מחלות שרירים.

פרוטוקול

הצהרה אתית:
כל הניסויים בפרוטוקול זה משתמשים ב-Drosophila melanogaster, חרק הולומטבולוס. חסרי חוליות אינם כפופים לתקנות רווחת בעלי חיים בארצות הברית של אמריקה, והשימוש בהם אינו דורש אישור אתי. כל העבודה בוצעה תחת הנחיות בטיחות ביולוגית מוסדיות סטנדרטיות ובטיחות מעבדה, ואושרה על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית של אוניברסיטת מיזורי קנזס סיטי תחת פרוטוקול מספר 21940 (22-11).

1. דיסקציה של המיטורקס של IFM בוגר (איור 1)

  1. הרכיבו את האספקה הדרושה, כולל שני מלקחיים Dumont #5 עם טיפים לביולוגיה, מלקחיים Dumont #3, זוג מספריים קפיציים של Vannas, פיפטה מפלסטיק, מברשת צבע, צלחת 24 בארות, מגבונים ללא מוך, שקופית מיקרוסקופ ולהבי קריוסטט (ראה טבלת חומרים). הכן 1x PBS, 0.05% PBS-T ופתרונות קיבוע (ראה קובץ משלים 1). סקירה כללית של דיאגרמת זרימה של דיסקציה הבאה של ההמיטורקס הבוגר זמינה (איור משלים 1).
  2. אסוף מבוגרים בגנוטיפ ובגיל הרצויים (לדוגמה, נסגר חדש, מבוגר יום אחד או מבוגר 5 ימים). דגימת הרדמה זבובה על CO2 או קרח.
    הערה: זבובים המשמשים בפרוטוקול זה גודלו במחזור לילה של 12 שעות: 12 שעות באינקובטור מבוקר טמפרטורה ולחות. דרוזופילה גדלה באופן סטנדרטי ב-25 מעלות צלזיוס או 27 מעלות צלזיוס, וניתן לגדל אותה ב-18 מעלות צלזיוס, מה שמאריך את מחזור הגידול מ-10 ימים לכ-20 יום.
  3. השתמש בפיפטה מפלסטיק כדי להעביר טיפה של 1x PBS40 לשקופית מיקרוסקופ מתחת למיקרוסקופ מנתח סטריאו.
  4. העבירו את זבובי הדגימה לטיפה PBS בקבוצות קטנות באמצעות מברשת צבע או מלקחיים (איור 1A). הסירו את הראש (איור 1B), את הכנפיים (איור 1C - D) ואת הבטן (איור 1E) באמצעות מספריים קפיציים של Vannas. השאר את הרגליים מחוברות (איור 1F).
  5. העבירו בעדינות את בית החזה באמצעות מברשת או מלקחיים לתמיסת קיבוע של 500 מיקרוליטר בבאר אחת של צלחת של 24 בארות. תקן למשך הזמן הרצוי (בדרך כלל 15-60 דקות) על נוטר/שייקר נדנדה.
    הערה: פרוטוקול זה תואם למאגרי קיבוע מרובים, כולל פרפורמלדהיד, גלוטרלדהיד, מתנול, תמיסת גליוקסל ואחרים. ראה תוצאות מייצגות וקובץ משלים 1 לפרטים על אופטימיזציה של תנאי הקיבוע. יש לטפל במקבעים באמצעות כפפות וציוד מגן אישי מתאים (PPE) בהתאם להנחיות הכימיקלים המסוכנים של המוסד שלך.
  6. הסר את הקיבוע עם פיפטה של 200 מיקרוליטר ושטוף ב-1 מ"ל של 0.05% PBS-T על שייקר נדנדה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: השלך את הקיבוע בהתאם להנחיות הכימיות המסוכנות של המוסד. עבור רוב האנטיגנים, ניתן לאחסן בית חזה קבוע ב-1 מ"ל של 0.05% PBS-T למשך עד שבועיים ב-4 מעלות צלזיוס לפני חיתוך וצביעה. יש לבדוק ריכוזים גבוהים יותר של Triton X-100 לפני השימוש, שכן דגירה ארוכה בחומר ניקוי עלולה לפגוע במבנה הסרקומר.
  7. הסר את המאגר עם פיפטה של 200 מיקרוליטר והעביר את בית החזה באמצעות מברשת או מלקחיים לטיפה של 0.05% PBS-T בשקופית מיקרוסקופ תחת מיקרוסקופ מנתח סטריאו.
  8. כוון את בית החזה כשהסקוטלום פונה כלפי מעלה ומיוצב בין זוג מלקחיים של Dumont #3 (איור 1G-H).
  9. החלק להב קריוסטט על פני בית החזה כדי לחרוץ את הסקוטלום (איור 1H, J, L), ולאחר מכן חתוך במכה חלקה אחת כלפי מטה לאורך קו האמצע (איור 1I, J, L - N) כדי ליצור את חתך חצי בית החזה החושף את ה-IFM (איור 1K).
    הערה: חשוב שהקוטיקולה תהיה "מחורצת" או נסדקת לפני חיתוך ה-IFM כדי למנוע מתיחה של חפצים הפוגעים במבנה הסרקומר. אין "לנסר" את הלהב קדימה ואחורה, מכיוון שתנועה זו פוגעת מכנית ב-IFM, וכתוצאה מכך מיופיברילים מרוטים. יותר מדי חיץ מערער את יציבות בית החזה בין המלקחיים ומקשה על החיתוך. גישות חלופיות כוללות ייצוב בית החזה בזה אחר זה על סרט כפול כדי להקל על החיתוכים, כמו גם חיתוך מהצד הגחוני של בית החזה.
  10. העבר את שני חצאי בית החזה למצב על המגלשה שבו הם יישארו מכוסים במאגר כדי למנוע התייבשות, אך אינם מפריעים לחתכים עתידיים. חזור על שלבים 1.8-1.10 עד שכל בית החזה נחתך.
  11. השתמש במלקחיים כדי להעביר את חצאי בית החזה משקופית המיקרוסקופ ל-500 מיקרוליטר של 0.05% PBS-T בבאר אחת של צלחת של 24 בארות והמשך בחסימה וצביעה חיסונית (ראה סעיף 4 להלן).

2. דיסקציה של המיטורקס של IFM גולם מאוחר (~48 שעות עד 96 שעות APF) (איור 2, איור 3)

  1. שלב גלמים של הגנוטיפ הרצוי וגיל עד לנקודה שנבחרה בהתפתחות הגולם (איור 2). אספו טרום-גלמים לבנים זכרים או נקבות (איור 2A, B) באמצעות מברשת לחה ודגרו על נייר סינון רטוב בצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ. בימוי הגולם והוצאתו ממארז הגולם תוארו בעבר20,26.
    הערה: גלמים עוברים שינויים מורפולוגיים מרובים ככל שהם מתבגרים, כגון היפוך ראש ופיגמנטציה של גוף הגולם, העיניים והזיפים19,41 (איור 2C). המאפיינים המורפולוגיים האלה יכולים לשמש כמדריך כללי לזיהוי גיל הגולם (איור 2D-E) ולזיהוי גלמים שאינם מתפתחים באופן נורמלי (איור 2F). עם זאת, כדי להבטיח לוח זמנים מדויק, מומלץ לאסוף טרום-גלמים לבנים בחלונות זמן צרים, למשל בימוי כל 30 דקות או כל שעתיים. נקודות זמן בשלבים הדוקים נחוצות כדי להבחין בשינויים גדולים במבנה השלד התא ובאורך השריר המתרחשים בין 24 שעות ל-35 שעות APF, כמו גם כדי להבחין בהבדלים במבנה הסרקומר ב-35 שעות, 48 שעות, 60 שעות, 72 שעות, 80 שעות ו-90 שעות APF18,42.
  2. הרכיבו את האספקה הדרושה, כולל מברשת צבע, שני מלקחיים Dumont #5 עם טיפים לביולוגיה, זוג מספריים קפיציים של Vannas, סרט מקל כפול, מגלשת מיקרוסקופ, פיפטה מפלסטיק, צלחת 24 בארות, Kimwipes ולהבי קריוסטט (ראה טבלת חומרים). הכן 1x PBS, 0.05% PBS-T ופתרונות קיבוע (ראה קובץ משלים 1). סקירה כללית של דיאגרמת זרימה של דיסקציה הבאה של ההמיטורקס הגולמי זמינה (איור משלים 2).
  3. בנקודת הזמן הרצויה, השתמשו במכחול כדי להעביר גלמים מנייר הסינון לרצועת סרט כפול המודבקת לשקופית מיקרוסקופ מתחת למיקרוסקופ מנתח סטריאו בהגדלה של פי 10-20 (איור 3A,B). סדרו את הגלמים על הסרט הפונה לאותו כיוון, כשצד הגחון כלפי מטה.
  4. השתמשו בזוג מלקחיים #5 כדי לפתוח את החלק הקדמי של מארז הגולם של הגולם הראשון, והסירו בעדינות את האופרקולום (האזור שמעל הראש) (איור 3C, D, I).
  5. השתמש בזהירות במלקחיים #5 כדי לחתוך לאורך מארז הגולם רק בגב לכנף ולקלף את מארז הגולם הרחק מהגולם במרווחים של 1-2 מ"מ. הצמד את מארז הגולם לסרט המקל הכפול בזמן שעובדים מקדימה לאחורית (איור 3E - G, I). הימנעו מלתקוע את הגולם עצמו, במקום זאת הכניסו את קצה המלקחיים בין מארז הגולם לקרום הבסיס/שק הגולם המקיף את הגולם.
  6. לאחר הסרת המארז, השתמשו בתנועת גריפה עם המלקחיים כדי להרים מתחת (איור 3H, I) והעבירו בעדינות את הגולם מהמארז לטיפה של 1x PBS בשקופית מיקרוסקופ שנייה (איור 3J, K) כדי למנוע התייבשות. חזרו על שלבים 2.4-2.6 (איור 3I) עד שכל הגלמים הוסרו ממארז הגולם.
  7. הסירו את הבטן מהגלמים המנותחים באמצעות מספריים קפיציים של Vannas (איור 3L).
    הערה: הבטן מוסרת כדי לאפשר חדירה טובה יותר על ידי קיבוע בשלב הבא. כדי להימנע מפגיעה בבית החזה, חתכו ישירות בבטן, והשאירו עד 30% מהבטן מחוברת לבית החזה.
  8. העבירו בעדינות את ראש הגולם עם בית החזה (איור 3M) באמצעות מברשת או מלקחיים ל-500 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע בבאר אחת של צלחת של 24 בארות. תקן למשך הזמן הרצוי (בדרך כלל 15-60 דקות) ושטוף ב-1 מ"ל של 0.05% PBS-T כמתואר בשלבים 1.5-1.6.
  9. הסר את המאגר עם פיפטה של 200 מיקרוליטר והעביר את בית החזה באמצעות מברשת או מלקחיים לטיפה של 0.05% PBS-T בשקופית מיקרוסקופ מתחת למיקרוסקופ ניתוח סטריאו בהגדלה של פי 10.
  10. הפרד דגימה אחת מהשאר וכוון אותה עם הצד הגחוני כלפי מטה וייצב בין זוג מלקחיים Dumont #3 (איור 3N).
  11. החלק להב קריוסטט על פני בית החזה רק עד שהקרום הבסיסי והקוטיקולה נפתחים, ולאחר מכן חתך במשיכה חלקה אחת כלפי מטה לאורך קו האמצע (איור 3O) כדי ליצור את חצי-חלקי בית החזה החושפים את ה-IFM (איור 3P).
    הערה: אין "לנסר" את הלהב קדימה ואחורה, מכיוון שתנועה זו פוגעת מכנית ב-IFMs וכתוצאה מכך מיופיברילים מרוטים. יותר מדי חיץ מערער את יציבות בית החזה בין המלקחיים ומקשה על החיתוך. ניתן לחתוך את בית החזה הגולמי כשהראש מחובר ומכוון לכיוון שמאל או ימין.
  12. העבר את שני חצאי בית החזה למצב על המגלשה שבו הם יישארו מכוסים במאגר כדי למנוע התייבשות, אך אינם מפריעים לחתכים עתידיים. חזור על שלבים 2.10-2.12 עד שכל בתי החזה נחתכו.
  13. השתמש במלקחיים כדי להעביר את חלקי חצי בית החזה משקופית המיקרוסקופ ל-500 מיקרוליטר של 0.05% PBS-T בבאר אחת של צלחת של 24 בארות והמשך בחסימה וצביעה חיסונית (ראה שלב 4 להלן).

3. דיסקציה בספר פתוח של IFM גולמי מוקדם (~15 שעות עד 48 שעות APF) (איור 4)

  1. שלב הגלמים של הגנוטיפ הרצוי והגיל עד לנקודה שנבחרה בהתפתחות הגולם (איור 2) כמתואר לעיל (שלב 2.1).
    הערה: עבור נתיחות בספר פתוח, יש לנתח גלמים בקבוצות של לא יותר מ-8-10 זבובים.
  2. הרכיבו את האספקה הדרושה, כולל מברשת צבע, שני מלקחיים Dumont #5 עם טיפים לביולוגיה, זוג מספריים קפיציים של Vannas, סרט מקל כפול, שקופית מיקרוסקופ, פיפטה מפלסטיק, כלי ניתוח סיליקון שחור, כלי כתמים מזכוכית שחורה, סיכות חרקים ומגבונים נטולי מוך (ראה טבלת חומרים). הכן 1x PBS, 0.05% PBS-T ופתרונות קיבוע (ראה קובץ משלים 1). סקירה כללית של דיאגרמת זרימה של ניתוח הספר הפתוח הבא של הגולם זמינה (איור משלים 3).
  3. בנקודת הזמן הרצויה, הסר את הגלמים ממארז הגולם כמתואר בשלבים 2.3-2.6. העבירו גלמים לכלי חיתוך סיליקון שחור מלא ב-PBS 1x לאחר הוצאתם ממארז הגולם (איור 4A).
  4. לאחר שכל הגלמים משתחררים ממארז הגולם, השתמשו במלקחיים Dumont #5 כדי להתגבר על מתח הפנים ודחפו בעדינות גלמים מנותחים אל פני הסיליקון. סדרו את הגלמים בקו ליד מרכז המנה (איור 4B).
  5. הכניסו שתי מחטי חרקים באמצעות מלקחיים Dumont #5 דרך הבטן של כל גולם כדי להחזיק אותו במקומו (איור 4C,D). ודא שהגלמים מכוונים עם צד הגחון כלפי מעלה.
  6. השתמשו במספריים קפיציים של Vannas כדי לחתוך את קרום הבסיס ואת אזור הראש הקדמי של כל גולם (איור 4E).
  7. הכניסו את המספריים לתוך הפתח וחתכו לאורך הצד הימני והשמאלי של כל גולם (איור 4F, G, Q). מקם את המספריים וחתוך ממש מתחת לחוטם המתפתח בחזרה לצומת בין בית החזה לבטן כדי להסיר את הרגליים והכנפיים עם החלק הגחוני. ודא שהמספריים מוכנסים אופקית ואינם נוגעים בחלק הגבי של בית החזה (איור 4Q).
  8. השתמשו במלקחיים Dumont #5 כדי לתפוס ולהרים את החלק הגחוני של הגולם ולהסיר אותו בעזרת מספריים קפיציים של Vannas (איור 4H, I, Q).
  9. הסר את המוח, חוט העצב הגחוני (VNC), קנה הנשימה והמעיים באמצעות מלקחיים Dumont #5 (איור 4J,K,Q). היזהר לא להפריע ל-IFMs המתפתחים, שנמצאים ישירות מתחת לקנה הנשימה ו-VNC המחוברים לאפידרמיס בחלק הגבי של בית החזה.
  10. מהדקים את הקצה של קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר ליצירת פתח רחב יותר. השתמשו בפיפטה של 200 מיקרוליטר עם הקצה הקצוץ כדי לשטוף בעדינות מאגר PBS אחד מעל בית החזה כדי להסיר את רוב גופי השומן הנותרים כדי לחשוף את ה-IFM (איור 4L,M). היו עדינים כדי להימנע מקריעת חיבורי הגידים המחברים את סיבי השריר לאפידרמיס.
  11. השתמשו במספריים קפיציים של Vannas כדי לחתוך את קו האמצע של בית החזה הגבי, וליצור שני "עלעלונים" שמכילים IFMs (איור 4N).
  12. חתכו את העלעלונים של בית החזה הגבי הרחק מהבטן באמצעות מספריים (איור 4O, Q), והעבירו את העלעלונים ל-300 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע בצלחת זכוכית שחורה באמצעות מלקחיים Dumont #5 (איור 4P). אחוז את העלונים במארז הראש עם המלקחיים כדי למנוע נזק לסיבי השריר או הגידים של IFM.
  13. תקן למשך הזמן הרצוי (בדרך כלל 15 דקות). השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להסיר בזהירות את הקיבוע ולשטוף ב-500 מיקרוליטר של 0.05% PBS-T. המשך בחסימה וצביעה חיסונית (ראה שלב 4 להלן).
    הערה: אין לאגוז או לנדנד דגימות בכלי זכוכית שחורה. חיבורי שריר-גיד בשלבים מוקדמים של הגולם הם שבירים מאוד וייקרעו עם תסיסה מתמדת של חיץ, וכתוצאה מכך אובדן IFM. פיפטה לאט ובזהירות סביב שולי המאגר בכלי כדי למנוע יניקת דגימות לקצה הפיפטה בעת החלפת תמיסות.

4. צביעה חיסונית והיסטוכימיה של דגימות IFM קבועות

  1. הרכיבו את האספקה הדרושה, כולל פיפטה, קצות פיפטה ונוגדנים או כתמים נדרשים. הכן 0.05% PBS-T, תמיסת חסימה ותערובות נוגדנים/כתמים (ראה קובץ משלים 1).
  2. הורד את תמיסת הכביסה (0.05% PBS-T) מהדגימות והוסף את תמיסת החסימה. דגירה של דגימות בתמיסת חסימה למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר (עם נדנדה לשלבים 1-2, ללא נדנדה לשלב 3).
    הערה: לחלופין ניתן לחסום דגימות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. בפרוטוקול זה, הדגימות נחסמו ב-5% סרום עיזים רגיל (NGS) ב-0.05% PBS-T. מידע נוסף על אפשרויות פתרון חסימה מסופק בקובץ משלים 1.
  3. הסר את תמיסת החסימה מבית החזה באמצעות פיפטה. מוסיפים תערובת נוגדנים ראשונית ודוגרים לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר או לילה ב-4 מעלות צלזיוס (עם נדנוד לשלבים 1-2, ללא נדנוד לשלב 3).
    הערה: פרוטוקול זה תואם לרוב הנוגדנים הראשוניים. יש לדלל נוגדנים בתמיסת חסימה. דילול הנוגדנים הראשוני שנבדק בפרוטוקול זה נע בין 1:10 ל-1:2000 ונקבעים בניסוי עבור כל נוגדן בנפרד. פרטים נוספים על האופטימיזציה של צביעת נוגדנים ראשוניים מסופקים בקובץ משלים 1.
  4. הסר את תערובת הנוגדנים העיקרית באמצעות פיפטה ושטוף את הדגימות 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחת, ב-0.05% PBS-T.
  5. הוסף נוגדנים משניים או תערובת כתמים לדגימה. מכסים את הדגימה בחתיכת נייר אלומיניום כדי למזער את ההלבנה. דגירה לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר או לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (עם נדנדה לשלב 1-2, ללא נדנוד לשלב 3).
    הערה: ניתן להשתמש ברוב הנוגדנים המשניים והכתמים התאיים הפלואורסצנטיים עם פרוטוקול זה. נוגדנים משניים רבים משמשים בדילול של 1:500. בנתונים המייצגים שלהלן (ראו תוצאות מייצגות), הגרעינים סומנו עם DAPI (מלאי של 1 מ"ג/מ"ל, מדולל 1:1000 ב-0.05% PBS-T) ו-F-אקטין עם רודמין פלואידין (מלאי 300 יחידות/מ"ל, מדולל 1:500 ב-0.05% PBS-T).
  6. הסר את התערובת המשנית/כתם באמצעות פיפטה ושטוף את הדגימות 4x למשך 10 דקות כל אחת, ב-0.05% PBS-T בטמפרטורת החדר. המשך להרכבה (שלב 5) מיד לאחר הכביסה.

5. הרכבת דגימות מוכתמות על שקופיות לניתוח מיקרוסקופיה (איור 5)

  1. הרכיבו את האספקה הדרושה כולל מברשת צבע, מלקחיים, שקופיות מיקרוסקופ חלביות, כיסויים (עובי #1), לק שקוף, אמצעי הרכבה ומגבונים נטולי מוך (ראה טבלת חומרים).
  2. סמן את אזור הכתיבה החלבי של שקופית מיקרוסקופ עם מספר המדגם הרלוונטי או מידע מזהה מועדף (תאריך, גנוטיפ, נוגדן, מספר שקופית וכו').
  3. הוסף מרווחי כיסוי (#1 כיסויים), והשאיר כ-1 ס"מ בין הכיסויים למיקום הדגימה (איור 5A-C). השתמש בטיפה קטנה של 50% גליצרול כדי להחזיק את המרווחים במקומם (איור 5A, D).
    הערה: מרווחים מונעים עיוות דגימה בעת הרכבת דגימה עבהamps. חזה בוגר דורש בדרך כלל מרווח עבה עם 2 כיסויים, 48 שעות APF thoraces מרווח עבה עם כיסוי אחד, ועלוני ספר פתוח ללא מרווח.
  4. הוסף טיפה של מדיום הרכבה לבאר בין מרווחי הכיסוי, או למרכז שקופית המיקרוסקופ אם מרכיבים דגימות גולם מוקדמות (איור 5C-D). הנח את השקופית מתחת למיקרוסקופ ניתוח סטריאו.
    הערה: קיימים סוגים מרובים של מדיית הרכבה. אם אתה משתמש במדיה מתקשה מעצמה, שקול אחת עם זמן ריפוי של מספר שעות כדי לאפשר מספיק זמן לכוון כראוי דגימות לפני שהמדיה מתקשה. הוכח כי אמצעי הרכבה משפיעים על מידות סרקומר 43,44,45, ולכן יש להשתמש באותו מגיב עבור כל הדגימות בניסוי.
  5. השתמש בפיפטה כדי להסיר כמה שיותר מאגר כביסה מהדגימות. העבירו מיד את הדגימות באמצעות מלקחיים או מברשת צבע לטיפת אמצעי ההרכבה על השקופית (איור 5E).
  6. באמצעות מלקחיים של Dumont #5, ארגנו את הדגימות לשורות ועמודות, ודאו שהדגימות אינן חופפות, וכוונו את בית החזה כשה-IFMs פונים כלפי מעלה (איור 5F,J,Q,S). התמצאות עשויה לדרוש היפוך זהיר של דגימות שבהן הזיפים/ציפורן פונים כלפי מעלה (איור 5G,H,K, L,R). היזהר לא לגעת ב-IFM, מכיוון שמגע יפגע במבנה הסרקומר (ראה תוצאות מייצגות).
  7. הוסף בזהירות כיסוי #1 (18 x 18 מ"מ או 22 x 22 מ"מ) מעל דגימות בית החזה (איור 5M). אם אתה משתמש במרווחים, לחץ בעדינות על מכסה הכיסוי עד שהוא יוצר קשר עם המרווחים משני צידי הדגימות (איור 5N).
  8. השתמש בקצה פיפטה או בטפטפת כדי למלא מחדש את אזור הדגימה במדיום הרכבה עד שכל בית החזה עטוף (איור 5O). הימנע מיצירת בועות אוויר שישבשו את רכישת התמונה.
  9. השתמש בלק שקוף כדי לאטום את התושבת הרטובה. זכור לאטום הן סביב כיסוי הדגימה והן סביב כיסויי המרווח (איור 5P,S).
    הערה: הימנע משימוש בשכבה עליונה או לק המתייבש במהירות, מכיוון שהם אוטמים בצורה גרועה ובועות אוויר ייווצרו כאשר מדיום ההרכבה מתאדה.
  10. מגלשות יבשות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש לאחסן במארז שקופיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ניתן לצלם שקופיות במשך מספר ימים או שבועות.
  11. דגימות תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי, מיקרוסקופ קונפוקלי או מערכת אחרת בהתאם לתכנון הניסוי. פרוטוקולים לרכישה וניתוח תמונות זמינים במקומות אחרים 14,30,46,47,48.

תוצאות

ניתן להשתמש בפרוטוקול הדיסקציה שהוצג לעיל כדי ליצור דגימות באיכות גבוהה לניתוח מיקרוסקופיה של מורפולוגיה של IFM myofiber וסרקומר החל מ-8 שעות לאחר היווצרות הגולם (APF) בשיטת הספר הפתוח (שלב 3) דרך שלבים בוגרים באמצעות גישת דיסקציה של המיטורקס (שלבים 1 ו-2). דיסקציות אלה יושמו כדי לחקור היווצרות שרירים וסרקומר 18,42,49, תפקוד גורם שעתוק 50,51 וויסות RNA37,38, בין היתר. התוצאות המייצגות המופיעות להלן מדגימות את התאימות של פרוטוקול זה לשיטות קיבוע שונות, מפרטות חפצי דיסקציה נפוצים, ומשתמשות בפנוטיפ המוטנטי SmnE33 כדי להמחיש את התועלת של פרוטוקול זה לטיפול בשאלות מורפולוגיות וביולוגיות תאיות במודל IFM.

דיסקציה IFM תואמת לשיטות קיבוע מרובות

היבט קריטי בהכנת דגימה עבור דגימות היסטוכימיה או אימונופלואורסצנטיות הוא שימור מדויק של מבנים תאיים באמצעות קיבוע. מקבעים משמרים את מבנה הרקמה והמורפולוגיה על ידי מניעת פירוק וייצוב מבני חלבון ושומנים באמצעות קישור צולב52,53. סוגים שונים של מקבעים, למשל, מבוססי אלדהיד לעומת ממיסים אורגניים, הם בעלי יעילות חדירה וקישור צולב שונים ומשפיעים באופן דיפרנציאלי על זיהוי מטרת נוגדנים על ידי התמקדות בקבוצות פונקציונליות נפרדות53,54. דיסקציות IFM תואמות לשיטות קיבוע מרובות, כולל 4% פרפורמלדהיד (PFA), 9% גליוקסל וקיבוע מתנול (איור 6), תוך הדגשת התועלת הכללית של פרוטוקול דיסקציה זה.

כדי להשוות את גודל הסרקומר והמורפולוגיה עם יישום שיטות קיבוע שונות, בוצעו דיסקציות המיטורקס של 1118 זבובים בוגרים ליום אחד. הושווה קיבוע של 4% PFA בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) (איור 6A,E) או בתמיסה מרגיעה (RS) (איור 6B,F). תמיסה מרגיעה מכילה ATP ומומלצת לשימוש בעת כימות מידות סרקומר לשימור סרקומרים במצבם הרגוע20,55 (ראה קובץ משלים 1). קיבוע PFA של 4% משמר ביעילות את מורפולוגיה של סרקומר, אך נראה הבדל משמעותי ברוחב הסרקומר בין קיבוע PFA של 4% ב-PBS לעומת RS (איור 6I,J). קיבוע במתנול שמר על מבנה השריר והסרקומר (איור 6C,G), אך סרקומרים היו קצרים ודקים יותר באופן משמעותי מאשר עם קיבוע PFA של 4% (איור 6I,J). ניתן לשמר ביעילות IFMs עם קיבוע גליוקסל בן לילה של 9% (איור 6D,H) (קיבוע גליוקסל של 3% לא היה יעיל), מה שגם שינה באופן משמעותי את רוחב הסרקומר בהשוואה לקיבוע PFA של 4% (איור 6I,J). לסיכום, ניתן לשמר ביעילות את המיתורים של IFM עם מספר מקבעים. עם זאת, מכיוון שגם קיבוע וגם מאגר יכולים להשפיע על מדידת ממדי סרקומר, יש לתכנן ניסויים עם בקרות מתאימות ופרוטוקול קיבוע מוגדר ועקבי.

חפצי חיתוך וקיבוע נפוצים ב-IFM

אתגר אחד במיקרוסקופיה, במיוחד עבור משתמשים חדשים ומתאמנים, הוא הבחנה בין חפצים טכניים לפנוטיפים של עצמות. כדי לסייע בהבחנה זו ב-IFMs של דרוזופילה, מוצגים נתונים מייצגים של החפצים הנצפים ביותר וכשלי דיסקציה (איור 6). פרוטוקולי קיבוע דורשים אופטימיזציה של סוג, ריכוז ואורך הקיבוע כדי למנוע קיבוע חסר או יתר 52,53,54. באמצעות מהלך זמן קיבוע של w1118 1 יום אחד של דיסקציות המיטורקס בוגרות שהודגרו ב-4% PFA בתמיסה מרגיעה, נצפה כי בעוד שזמן קיבוע של 15 או 30 דקות משמר במדויק את מורפולוגיה של סרקומר, קיבוע של 7 דקות מייצר מורפולוגיות סרקומר לא עקביות (איור 6K-M). בנוסף, הרקמה פחות נוקשה עם זמן קיבוע קצר יותר, מה שמקשה על חיתוך וחציית בית החזה מבלי לפגוע ב-IFM. חפצים נוספים יכולים להיווצר הן במהלך החיתוך והן בתהליך ההרכבה. מבנה השריר של IFM יכול להיראות לא סדיר אם הלהב עמום וגורם לקריעה או שחיקה (איור 6N) או אם הלהב מחליק או החיתוך בזווית (איור 6O). אם מלקחיים באים במגע ישיר עם IFMs קבועים במהלך הטיפול או ההרכבה, הם יוצרים רושם שיכול להוביל לחריצים או למתיחות ויכולים למשוך את הסרקומרים זה מזה (איור 6P). מתיחה או עיוות של בית החזה, בין אם במהלך חיתוך, טיפול או הרכבה, גם מושכים את הסרקומרים זה מזה וגורמים לאובדן דיסק Z מסומן בבירור (איור 6Q). לבסוף, "ניסור" או "שפשוף" של ה-IFM עם מלקחיים או להב מוביל לשחיקה ולהתפרקות, שחיקה וחוסר ארגון של שרירי השריר, במיוחד על פני השטח של השריר (איור 6R). משתמשים פוטנציאליים צריכים להכיר את החפצים הטכניים הללו ולהוציא אותם מניתוח פנוטיפי.

התקדמות התפתחותית של פנוטיפ Smn E33 ב-IFMs

דיסקציות ספר פתוח והמיטורקס שימושיות במיוחד כדי לעקוב אחר מסלול ההתפתחות של פנוטיפ שריר וכדי לאתר מתי בהתפתחות פועל גן מעניין או מתעוררים פנוטיפים של מיופיבריל. הפנוטיפ ההתפתחותי IFM של SmnE33, אלל היפומורפי של חלבון קושר RNA נוירון מוטורי הישרדות (Smn)39 מוצג כנתונים מייצגים הממחישים את התועלת הרחבה של דיסקציות ספר פתוח והמיטורקס.

הריבונוקלאופרוטאינים הגרעיניים הקטנים (snRNPs) היוצרים את הספליסאוזום, הקומפלקס המקרו-מולקולרי המזרז את תגובת השחבור ליצירת mRNAs7, מורכבים על ידי קומפלקס SMN. קומפלקס ה-SMN, המורכב מנוירון מוטורי הישרדות (Smn) וחלבוני Gemin, נדרש לקיום בכל האורגניזמים56. רמות SMN מופחתות בבני אדם מובילות להפרעה עצבית-שרירית תורשתית חמורה ניוון מוטורי של עמוד השדרה (SMA)21. דרוזופילה שימשה כמודל להבנת האטיולוגיה של SMA והתפקוד התאי של Smn, כולל התפתחות האלל ההיפומורפי SmnE33. זבובי SmnE33 הם ברי קיימא ופוריים, אך אינם יכולים לעוף או לקפוץ39. בעוד שלזבובי SmnE33 יש פגמים בעצבים מוטוריים, הם מציגים גם מבנה IFM לא מאורגן ואובדן ביטוי Actin88F ספציפי לשריר התעופה39,57. SMN ממוקם במשותף עם אלפא-אקטינין בדיסק Z בזבובים ועכברים39, מה שמרמז על כך של-Smn עשוי להיות תפקיד ספציפי לשריר.

כדי לקבל הבנה טובה יותר מתי מבנה המיופיבריל אובד ונדרש תפקוד Smn בהתפתחות שרירים, בוצע ניתוח מהלך זמן התפתחותי של פנוטיפ SmnE33 ב-IFMs ב-26 שעות APF, 72 שעות APF ומבוגר 1 עד 5 ימים. בעוד שלבקרה w1118 IFMs הן ב-APF של 72 שעות והן במבוגרים יש אות F-actin חזק מוכתם בפאלואידין (איור 7E,E',I,I') ומבנה סרקומר רגיל (איור 7G,G',K,K'), אות הפאלואידין מופחת באופן דרמטי (איור 7F,F',J,J') ומבני סרקומר נעדרים (איור 7H,H',L,L') ב-Smn E33 IFM. במקום זאת, F-actin נצפה במבנים דמויי רשת סביב גרעינים או בצרורות לא סדירים או במבנים "מתפרצי כוכבים" בציטופלזמה (איור 7H,H',L,L'), עקבי עם אובדן ביטוי Act88F18, 39 וחוסר יכולת להרכיב חוטים דקים. ניתוחים בספר פתוח בוצעו כדי לבחון את הפנוטיפ SmnE33 ב-26 שעות APF וגילו כי פיתוח IFM מוקדם מתקדם כרגיל ב-SmnE33. בהשוואה ל-1118 IFMs בקרה (איור 7A,A',C,C'), לזבובי SmnE33 יש 6 סיבי IFM אורכיים גביים לכל המיטורקס, יוצרים כבלי F-אקטין מאורגנים בפריפריה של השריר לפני המיופיבריוגנזה (איור 7B,B'), ומציגים רשת F-actin דמוית-רשת לאורך השריר (איור 7D,D'). תוצאות אלה מצביעות על כך ששלבים ראשוניים של התמיינות IFM מתקדמים כרגיל, בעוד ש-Smn נחוץ בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח IFM כדי לקיים ביטוי Act88F ולבנות סרקומרים. חשוב לציין, תוצאות מייצגות אלה ממחישות את הפירוט הפנוטיפי והרזולוציה שניתן להשיג על ידי נתיחות ספר פתוח והמיטורקס.

figure-results-1
איור 1: דיסקציה בחצי חתך של IFMs בוגרים. (A) מקמו זבוב בוגר ב-PBS 1x על שקופית מיקרוסקופ. (B) שימוש במלקחיים (ציאן, נקודה) כדי לייצב את הזבוב, הסירו את הראש בעזרת מספריים (כתום). (ג-ה) הסר את הכנף השמאלית (C) והימנית (D) ואת הבטן (E). (F) השליכו את הראש, הבטן והכנפיים, והעבירו את בית החזה לקיבוע. (G,H) כוונו בית חזה קבוע על מגלשה בטיפה של 1x PBS-T כאשר האחורי (P) והסקוטלום מצביעים כלפי מעלה (G), באמצעות מלקחיים כדי לייצב את הכיוון (H). (א-ק) השתמש בלהב קריוסטט כדי לחתוך את בית החזה לשניים (I-J), כדי ליצור שני חצי-חצאי בית חזה (K). (L) דיאגרמה של להב קריוסטט ובית חזה, הממחישה את מיקום החיתוך הסגיטלי ליצירת חצי-חתכים. הלהב מוטה ימינה כדי לחרוץ את הסקוטלום של בית החזה, ואז מועבר כלפי מטה בתנועה חלקה (חיצים צהובים) כדי לחתוך את בית החזה (קו אדום מקווקו). (מ,נ) סכמטי של מבט עטרתי (M) ורוחבי (N) של בית החזה, הממחיש את מיקום קבוצות השרירים העיקריות ואת מיקום החיתוך (בין המשולשים הצהובים). כיוון בית החזה מצוין (L, שמאל; R, ימינה; V, גחון; D, גב; A, קדמי; P, אחורי). פסי קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: שלב הגולם ומאפייני התפתחות הגולם. (A) ניתן להבחין בין גלמים זכרים ונקבות כטרום-גלמים לבנים ב-0-2 שעות APF. לגלמים זכרים יש מבנים זוגיים, עגולים ושקופים (האשך המתפתח) לכיוון האחורי (חצים). (C) טבלת מאפיינים המשמשים כסימני היכר של התפתחות הגולם. המאפיינים כוללים התבגרות של גוף הגולם, היפוך ראש וניתוק הגולם מגוף הגולם, התפתחות פיגמנטציה של העיניים, פיגמנטציה של הזיפים, הכנפיים, הרגליים, האפנדריום והקוטיקולה, ונראות הכתם הבתולי (מקוניום). צבע העיניים והפיגמנטציה מתכהים בהדרגה. העיתוי ושלבי התפתחות הגולם המסומנים בראש כל עמודה בטבלה (נקודות זמן המצוינות בטקסט שחור, שלב מקביל בהתפתחות הגולם להלן בטקסט כחול) הוגדרו בעבר על ידי ביינברידג'ובונס 19,41. (ד-ה) מהלך הזמן של התפתחות הגולם ב-0-2 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות ו-96 שעות APF בגולם שלם עם עיניים אדומות (D; Mef2-Gal4, fln-GFP) ובגולם עם עיניים כתומות שנותחו מתוך מארז הגולם (E; Fln-Gal4). שימו לב להתכהות הדרגתית של העיניים והזיפים מ-48 שעות עד 96 שעות APF. (F) דוגמאות לקטלניות של גולם בנקודות זמן מוקדמות, אמצעיות ומאוחרות של התפתחות. זבובים קטלניים של פאראטה נוצרים במלואם, אך אינם מצליחים להיסגר לחלוטין ממארז הגולם. פסי קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: דיסקציה בחתך חצי של IFMs גולמי (>APF של 48 שעות). (A-H) הוצאת גולם ממארז הגולם. הדביקו גלמים לרצועת סרט דבק כפול (A,B). פתח ברכס הקדמי (C) והסר את האופרקולום (D) באמצעות זוג מלקחיים Dumont #5 (כחול, חץ מציין את כיוון התנועה, הנקודה נייחת). השתמש במלקחיים כדי לחתוך (E) ולקלף (F) את מארז הגולם ברצועות (G). רצועות מארז הגולם מודבקות לסרט המקל הכפול. לאחר חשיפת הבטן, הרם את הגולם מהמארז (H). (I) סכמטי הממחיש את תהליך ניתוח הגולם מתוך מארז הגולם. לוחות האיורים המתאימים לכל שלב בסכימה מסומנים (למטה). הקו המקווקו האדום מסמן היכן ניתן להכניס את המלקחיים מבלי לפגוע בגולם כדי לחתוך את נרתיק הגולם. (י-ל) לאחר הוצאת הגולם מהמארז (J) והעברתו לשקופית מיקרוסקופ בטיפה של 1x PBS (K), השתמש במספריים כדי להסיר את הבטן (L). (M) השליכו את הבטן, והעבירו את בית החזה לקיבוע. (N) לאחר הקיבוע, העבירו את בית החזה של הגולם למגלשה בטיפה של 1x PBS-T. כוון את הצד הגבי של הגולם כלפי מעלה וייצב בעזרת מלקחיים. (או-פ) השתמש בלהב קריוסטט (O) כדי לחתוך חצי גולם (P). מיקום החיתוך זהה לאיור 1 M-N. פסי קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: דיסקציה בספר פתוח של IFMs גולמים (APF של <48 שעות). (A) לאחר הסרת הגולם ממארז הגולם כפי שמוצג באיור 3 A-I, העבירו את הגולם ל-1x PBS בצלחת חיתוך סיליקון שחורה. (ב-ד) דחפו בעדינות את הגולם כלפי מטה אל פני צלחת הסיליקון באמצעות מלקחיים (B), והצמידו את הצד הגחוני כלפי מעלה באמצעות שני סיכות חרקים (C,D). (E) פתחו את קרום הבסיס (bm) ואת הקוטיקולה של הראש באמצעות מספריים (כתום). (ו,ז) חותכים לאורך הצד הימני (F) והשמאלי (G). מיקום החיתוך מתואר בתרשים (Q). (ח,י) הרם את החלק הגחוני בעזרת מלקחיים (H) והסר בעזרת מספריים (I). (י,ק) השתמש במלקחיים כדי להסיר את המוח (J), קנה הנשימה הצדדי והמעיים (K). (ל-מ) השתמש בזרם עדין של חיץ מפיפטה כדי להסיר גופי שומן ולחשוף את ה-IFM. (N) חותכים את בית החזה לשני עלעלים. (או,פ) חותכים את העלונים ומעבירים אותם לקיבוע. (ש) סיכום סכמטי של השלבים בניתוח בספר פתוח. לוחות האיורים המתאימים לכל שלב מסומנים (למטה). התצוגה העליונה והצד ניתנת כדי להמחיש את מיקום החתכים (קו אדום מקווקו) בצד שמאל וימין של הגולם. הכנפיים, הרגליים והפרובוסקיס (מסומן) משמשים להבחנה בין הצד הגבי והגחוני של הגולם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: הרכבה לדוגמה על שקופיות מיקרוסקופ. (A-D) מרווחי כיסוי משמשים להרכבה של דגימות חצי חצי-חזה עבות. גליצרול (A) משמש להדבקת מרווחים (#1 כיסויים) לשקופית מסומנת (B), ודגימות מותקנות במדיום הרכבה ברווח שבין המרווחים (C). גלמים מאוחרים ובית חזה בוגר דורשים שני מרווחי כיסוי #1 (D). נקודות זמן באמצע הגולם דורשות מרווח כיסוי יחיד #1, וניתן להרכיב דיסקציות גולם מוקדמות ללא מרווח. (א-ה) דגימות המיטורקס בוגרות מועברות למדיום הרכבה בעזרת מלקחיים או מברשת צבע (E). בית החזה מכוון בתחילה באופן אקראי (F), וייתכן שיהיה צורך להפוך אותו באמצעות מלקחיים (G) כך שה-IFM מכוונים כלפי מעלה לכיוון החלקת הכיסוי (H). (א-ל) עלונים מנתיחות ספר פתוח מוקדמות מועברים להרכבה באמצעות מלקחיים (I). העלעלונים מכוונים באופן אקראי (J) וניתן להפוך אותם באמצעות מלקחיים (K) כך שה-IFM פונים כלפי מעלה לכיוון הכיסוי (L). (מ-פ) לאחר שהדגימות מכוונות כראוי, הנח כיסוי מעל הדגימות (M) והקש עליו אפילו כנגד המרווחים (N). מלאו סביב הדגימות במדיום הרכבה (O), והקפידו להימנע מהיווצרות בועות. אטום את כל הקצוות הפתוחים של הכיסוי והמרווחים עם לק (P) כדי למנוע אידוי של אמצעי ההרכבה. (ש-ר) תמונות של דגימות בית חזה בוגרות המותקנות כהלכה (Q, הגדלה פי 10) בכיוון שה-IFM פונים כלפי מעלה לכיוון הכיסוי (R, הגדלה פי 20). (S) סכמטי של השקופית שהושלמה, עם דגימות המכוונות IFM-up בין מרווחים ולק אוטם את כל הקצוות הפתוחים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6 : דיסקציות IFM תואמות למקבעים שונים. (A-H) הקרנת z קונפוקלית של מבנה מיופיבר (A-D) או תמונות מישור יחיד של מבנה מיופיבריל וסרקומר (E-H) של בקרה עם1118 IFM בוגר. דיסקציה של המיטורקס תואמת לשיטות קיבוע מרובות, כולל 4% פרפורמלדהיד (PFA) בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) (A,E) או תמיסה מרגיעה (RS) (B,F), מתנול (C,G), או תמיסת גליוקסל 9% (D,H). DAPI (1:1000), כחול; פלואידין (1:500) F-אקטין מוכתם, אפור. (I,J) כימות אורך סרקומר (I) ורוחב (J) מ-E-H. שיטת הקיבוע והמאגר יכולים להשפיע באופן משמעותי על מדידת אורך ורוחב הסרקומר. אורך סרקומר של 3.040 ±-0.2935 מיקרומטר עם קיבוע מתנול היה קצר משמעותית מהאורכים שנמדדו של 3.271 ±-0.2736 מיקרומטר, 3.190 ±-0.2586 מיקרומטר ו-3.217 ±-0.2023 מיקרומטר עם קיבוע PFA (PBS), PFA (RS) ו-9% גליוקסל, בהתאמה (p < 0.001). רוחב סרקומר היה שונה באופן משמעותי בין כל שיטות הקיבוע שנבדקו (PFA (PBS), 1.410 ± 0.1331 מיקרומטר; PFA (RS), 1.284 ± 0.2514 מיקרומטר; מתנול, 1.280 ± 0.1538 מיקרומטר; וקיבוע גליוקסל 9%, 1.137 ± 0.2032 מיקרומטר). תרשימי קופסאות מוצגים עם שפם טוקי עם נקודות נתונים חריגות המסומנות כנקודות שחורות. המובהקות נקבעה על ידי ANOVA באמצעות מבחן טוקי פוסט הוק (**, עמ' < 0.01; ***, עמ' < 0.001). (ק-מ) תמונות קונפוקליות במישור יחיד של מהלך זמן קיבוע של מבוגר w1118 ב-4% PFA בקיבוע RS, המדגימות כי זמני קיבוע של 15 (L) או 30 (M) דקות, בהשוואה ל-7 דקות (K), מביאים למבנה סרקומר שמור ועקבי. (נ,או) תחזיות Z-stack של IFMs Act88F-Gal4 בוגרים קבועות ב-4% PFA המדגימות חפצי דיסקציה בסיבי שריר. ממצאים נפוצים כוללים סיבי שריר חתוכים, בלויים או חלקיים מלהב עמום (N) או חתך זוויתי (O). (יח"צ) תמונות קונפוקליות חד-מישוריות של דגימות בוגרות w1118 קבועות ב-4% PFA ב-PBS המדגימות חפצי דיסקציה נפוצים בסרקומרים ובמיופיברילים. ממצאים טכניים נפוצים כוללים מתיחה לא סדירה של סרקומרים עקב מגע עם מלקחיים בזמן הרכבה (P), משיכת דיסקי Z מהרישום על ידי מתיחת סיבי שריר במהלך חתכים אורכיים (Q), ושרירים מרוטים, לא מאורגנים או מסתלסלים עקב שחיקה או להב עמום (R). DAPI (1:1000), כחול; פלואידין (1:500) F-אקטין מוכתם, אפור. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר (A-D, N-O), 5 מיקרומטר (E-H, K-M, P-R). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: יישום דיסקציות לחקירת פנוטיפ IFM התפתחותי של SmnE33. (א-ד) מבנה שרירים בגלמים מוקדמים ב-26 שעות APF. תמונה קונפוקלית חד-מישורית של מבנה מיופייבר (A, A', B, B') ומבנה מיופיבריל וסרקומר (C, C', D, D') בשליטה (A, A', C, C') ו-Smn E33(B, B', D, D'). גם לבקרה וגם ל-SmnE33 יש שישה סיבי שריר IFM לכל המיטורקס ויוצרים כבלי F-actin. (א-ה) מבנה שרירים בגלמים מאוחרים ב-72 שעות APF. תמונת הקרנת Z של מבנה myofiber בבקרה (E, E') ו-Smn E33 (F, F'). IFMs ב-SmnE33 קיימים על סמך צביעת DAPI אך חסרים אות F-actin חזק. תמונות קונפוקליות של מישור יחיד מגלות של-IFMs בקרה יש מבנה סרקומר מאורגן מאוד (G, G'). לעומת זאת, ל-SmnE33 IFMs (H, H') יש מבנים חריגים דמויי כוכב F-actin (חיצים צהובים) וחסרים את מבנה הסרקומר המאורגן שנצפה ב-IFM הביקורת. (א-ל) מבנה שרירים בוגר בשליטה (I, I', K, K') ו- SmnE33 (J, J', L, L'). הקרנת Z (I,J) ותמונות קונפוקליות במישור יחיד (K,L) חושפות תכולת F-actin מופחתת מאוד ומבני אקטין חריגים (חיצים צהובים) ב-SmnE33IFM. DAPI (1:1000), כחול; פלואידין (1:500) צבוע F-אקטין, מג'נטה או אפור. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר (A, B), 10 מיקרומטר (C, D, G, H, K, L), 100 מיקרומטר (E, F, I, J). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: תיאור מפורט של שיטות הקיבוע והצביעה המשמשות בטקסט ובפרט להפקת הנתונים המוצגים באיור 6 ובאיור 7. כלול מידע נוסף על קביעת דילולים של נוגדנים ראשוניים. כמו כן מסופקת רשימה של רכיבי מאגר ומתכונים המשמשים בפרוטוקול זה. נתונים אלה מניעים את פרוטוקול הדיסקציה ומדגימים את התועלת שלו למיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח פנוטיפים התפתחותיים של IFM. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 1: דיאגרמת זרימה של שלבים בדיסקציה של המיטורקס של IFMs בוגרים. סיכום טקסטואלי של השלבים באיור 1 להכנת קטעי IFM של המיטורקס. לאחר דיסקציה, קיבוע וחציית בית החזה, חתכים מוכתמים לניתוח מיקרוסקופי. אנא לחץ כאן להורדת איור זה.

איור משלים 2: דיאגרמת זרימה של שלבים בדיסקציה של המיטורקס של IFMs גולמים. סיכום טקסטואלי של השלבים באיור 3 להכנת קטעי המיטורקס של IFMs גולמים. לאחר הוצאתו ממארז הגולם, הגולם מקובע, נחצה ונצבע למיקרוסקופיה. אנא לחץ כאן להורדת איור זה.

איור משלים 3: דיאגרמת זרימה של שלבים בניתוח ספר פתוח של IFMs גולמים מוקדמים. סיכום טקסטואלי של השלבים המוצגים באיור 4 לביצוע דיסקציה פתוחה של IFMs גולמים לפני 48 שעות APF. לאחר חיתוך וקיבוע, עלוני אפיתל עם IFMs מחוברים מוכתמים למיקרוסקופיה. אנא לחץ כאן להורדת איור זה.

דיון

פרוטוקול זה מציג נוהל עבור דיסקציה של המיטורקס של D. melanogaster בוגר (איור 1) וגולם מאוחר (48 שעות - 96 שעות APF) (איור 3) כמו גם דיסקציה פתוחה של IFMs בנקודות זמן מוקדמות של גולם (8 שעות - 48 שעות APF) (איור 4). פרוטוקול זה אופטימלי עבור יישומי אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הפרוטוקול מתואר באמצעות דיאגרמות סכמטיות ותצלומים מדורגים של הליך הדיסקציה. דיאגרמות סקירה הופכות את הפרוטוקול לנגיש עוד יותר למדענים חדשים בתחום הדרוזופילה , כמו גם לחוקרים לתואר ראשון ולמתלמדים בשלבים מוקדמים. דוגמאות מייצגות של קיבוע לקוי והכנת דגימה כלולות כדי לאפשר למשתמשי פרוטוקול להבחין בין חפצים לפנוטיפים של סרקומר בתום לב .

השלב הקשה ביותר בדיסקציה של המיטורקס IFM הוא חציית בית החזה (איור 1I, J, L ואיור 3O). שלב זה דורש זמן ותרגול כדי לשלוט. ליציבות נוספת בזמן החיתוך, ניתן להניח בית חזה בודד על סרט דבק כפול ולחתוך36, אך יש להקפיד להימנע מייבוש ה-IFM. אפשר גם לחתוך מהצד הגחוני של בית החזה, כשהצד הגבי מכוון כלפי מטה, כך שמשתמשים חדשים יכולים לבדוק איזו גישה היא היעילה ביותר עם ההגדרה שלהם. יש לבצע חיתוכים עם להבים חדשים וחדים כדי למנוע נזק ל-IFM, ויש להחליף להב כאשר הוא הופך עמום. להבי מיקרוטום (קריוסטט) משמשים לחיתוך נקי של בית החזה בפרוטוקול זה, בהשוואה לפרוטוקולים אחרים המשתמשים במחט, מלקחיים או להב אזמל24, 32, 36. סכיני גילוח הם אלטרנטיבה נוספת לחצייה נקייה של בית החזה. קיבוע חשוב גם לפני חצייה, שכן רקמה מקובעת קלות, למרות שהיא נשמרת ביציבות, עשויה להיות "מעוכה" וקשה יותר לחיתוך. זמני קיבוע של 30-60 דקות מאזנים את זמינות האנטיגן ונוקשות הרקמות המאפשרים חתכים, וניתן לקצר אותם ל-15 דקות עם ניסיון.

מגבלה אחת של תכשירי המיטורקס היא חדירת נוגדנים. המיתוראסים הם דגימות עבות32, והמיקרוגרפים הקונפוקליים האיכותיים ביותר מתקבלים מ-10-20 מיקרומטר העליונים של IFMs42, 58. ריכוז חומר ניקוי נמוך מדי או זמן חדירה קצר מדי עלולים להוביל לצביעה חלשה ולא עקבית. ניתן לשפר את חדירת הנוגדנים גם על ידי דגירה ארוכה יותר (2-3 ד') בנוגדנים ראשוניים. מערכת דו-פוטונית או מטרה עם מרחק עבודה גדול יותר יכולה גם להגדיל את עומק ההדמיה59. אם הנסיין צריך לדמות את הקוטר המלא של ה-IFM myofiber, יש לשקול גישה חלופית כגון מיקרוטום24, 58 או הקפאה27 במישור הסגיטלי.

היבט חשוב שאינו מטופל בפרוטוקול הראשי הוא ניתוח נתוני תמונה. לניתוח של סיבי שריר IFM בתמונות 10x או 20x (איור 6A-D, איור 7A,B,E,F,I,J), ניתוח סטנדרטי כולל קביעה אם סיבי השריר מחוברים ואם המורפולוגיה הגסה של השריר שלמה37, 38. דוגמאות לפרמטרים שניתן לכמת, בהתאם לניסוי, כוללות את האורך, הרוחב, המספר, המספר המצורף או מספר סיבי השריר הקרועים37, 60. יתרון מרכזי של פרוטוקול זה הוא תאימות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית והיכולת לנתח מורפולוגיה של סרקומר ומיופיבריל בהגדלות גבוהות יותר של פי 60 או פי 100 (איור 6E-H, איור 7C, D, G, H, K, L). יש לנתח את המורפולוגיה של סרקומר בדגימות ללא חפצים טכניים (איור 6K-P). מספר קטגוריות של פנוטיפים אפשריים של מיופיבריל וסרקומר הוגדרו בעבר60. לרוב, אורך ורוחב סרקומר נמדדים על ידי ציור ומדידה של קו מדיסק Z לדיסק Z בתוכנת עיבוד תמונה, או לחילופין באמצעות אחד מכמה כלים אוטומטיים הזמינים באופן חופשי18, 45, 61. ניתן לשפר את הערכת המורפולוגיה של סרקומר על ידי הכללת סמנים המתייגים את דיסק ה-Z או קו M, או את החוטים העבים או הדקים30, 34,58. ניתן להשתמש בנתונים אלה כדי לתאר כמותית פנוטיפים של מיופייבר, מיופיבריל וסרקומר בין דגימת בקרה ובדיקה שהוכנה באמצעות פרוטוקול דיסקציה זה.

משתמשי הפרוטוקול צריכים להיות מודעים לכך שבעוד שקיבוע שומר על מורפולוגיה של מיופייבר וסרקומר, קיבוע כמו גם חוצצים ומדיום ההרכבה עלולים לגרום להתכווצות או נפיחות של רקמות ויכולים להשפיע על מדידת הפרמטרים המורפולוגיים45. ידוע כי קיבוע הגלוטראלדהיד וההתייבשות הדרושים למיקרוסקופ אלקטרונים מכווצים את קוטר הסרקומר43, בעוד שעורות סיבים וגליצרציה הוכחו כמגדילים את קוטר הסרקומר 44,45. תופעה זו עשויה לעמוד בבסיס ההבדלים בפרמטרים של סרקומר בספרות ומדגישה את החשיבות של הכללת דגימות בקרה ובדיקה בכל ניסוי. יש לעבד IFMs בקרה ובדיקה בו זמנית באותם מאגרים להשוואה מדויקת של פרמטרים כמותיים של סרקומר.

פרוטוקול מפורט זה נועד להפוך את דיסקציה IFM למבוגרים וגולמים עבור אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית לנגישה יותר לדרוזופילים מתחילים ומתקדמים. ניתן להתאים פרוטוקול זה לשימוש עם חרקים אחרים כמו גם לטכניקות הדמיה אחרות כגון מיקרוסקופ אלקטרונים קריו (cryo-EM), פלואורסצנציה של מולקולה בודדת (smFISH), או טרנסקריפטומיקה מרחבית. השילוב של כלים גנטיים רבי עוצמה של דרוזופילה עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מציע הזדמנויות ייחודיות לחקור עקרונות שמורים של מיוגנזה ותפקוד שרירים. מכיוון ש-IFMs מתאימים גם לגישות מולקולריות וביוכימיות26, 27, מחקרים עתידיים המקשרים פנוטיפים מולקולריים למורפולוגיה של שרירים, ביולוגיה של התא ותפקודם יספקו הבנה מעמיקה יותר של מיוגנזה והאטיולוגיה של הפרעות שרירים.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים לגרגורי מטרה על שסיפק את האלל SmnE33 ועל דיונים מועילים על Smn. המחברים מודים לפרנק שנורר, קורנליה שנבאואר, מנואלה וייטקונאט ואיינור קאיה-קופור על דיונים מועילים ותמיכה. המחברים מודים למרכז המניות של בלומינגטון על אספקת זבובים. עבודה זו נתמכה על ידי מימון סטארט-אפ מבית הספר למדע והנדסה של אוניברסיטת מיזורי קנזס סיטי (UMKC), החטיבה למערכות ביולוגיות וביו-רפואיות (MLS), תוכנית המימון למצוינות של UMKC (MLS) ומשרד UMKC למחקר ומלגות יצירתיות לתואר ראשון (SF, MLS).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות תרבית רקמה בגודל 60 מ"מפישר סיינטיפיקFB01292160 מ"מ, פוליסטירן
חומצה אצטית, קרחוניות (ACS מוסמך)פישר סיינטיפיקA38S-212
אדנוזין טריפוספט (ATP)מיליפור סיגמאA1852
נייר אלומיניום, עמידה כבדהאמזון12 אינץ'. x 1000 רגל.
כלים לניתוח סיליקון שחור: אבקת פחם פעילמיליפור סיגמאC9157זמין גם ברוב בתי המרקחת
כלים לניתוח סיליקון שחור: סילגארד 184מיליפור סיגמא761036כדי להכין כלים לניתוח סיליקון, ערבבו את רכיבי סילגארד בשקית זיפלוק וערבבו היטב. מוסיפים אבקת פחם פעילה (~200 מ"ג) לסילגארד (~50 גרם), מערבבים היטב, חתכו את פינת השקית, ממלאים כלים של 60 מ"מ לתרב, הסרו בועות עם קצה פיפטה, והתקבשו כל הלילה.
מגש שקופיות מקרטון, Research Products International Corpפישר סיינטיפיק50-136-7558
מיקרוסקופ קונפוקלי, ניקון AXR קונפוקלי הפוךניקוןwww.microscope.healthcare.nikon.com/
מיקרוסקופ קונפוקלי, Zeiss LSM 780 קונפוקלי הפוךצייסwww.zeiss.com
תא גידול חרקים דרווין (אינקובטור)פישר סיינטיפיק/דארווין צ'יימברסIN034מדגם מבוקר אור, טמפרטורה ולחות
צלחת ניתוח (זכוכית שחורה)מיקרוסקופ טכניק דיטהלם398011לימפבקן (קערות צביעה/מיכלי לימפה), זכוכית שחורה, בגודל 4x4 ס"מ, עם כיסוי זכוכית שקוף
מלקחי דומון #3כלי המדע המדויק11231-30קצה דומוקסל ישר באורך 12 ס"מ עם קצה 0.17 x 0.1 מ"מ;
דומונט #5 מלקחייםכלי המדע המדויק11252-20קצה ישר של אינוקס 11 ס"מ, מלקחיים בדרגת ביולוגיה עם קצה 0.05 x 0.02 מ"מ;
EGTA (חומצה אגטאזית)מיליפור סיגמא324626
אתנול, מוחלט (200 proof)פישר סיינטיפיקBP28184ציון ביולוגיה מולקולרית
זכוכית כיסוי פרימיום של פישרברנד (18 x 18 מ"מ), כיסויי כיסויפישר סיינטיפיק12548Aזכוכית, ריבוע, עובי #1 (0.13 - 0.16 מ"מ)
זכוכית כיסוי פרימיום של פישרברנד (22 x 22 מ"מ), כיסויי כיסויפישר סיינטיפיק12548Bזכוכית, ריבוע, עובי #1 (0.13 - 0.16 מ"מ)
לוחות תרבית תאים שטוחים (24 בארים)פישר סיינטיפיק7200740
מצלמת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי, מצלמת Infinity8טלדיין (Visual Dynamix)6 מגה-פיקסל, תאורה נמוכה, מונוכרומטית
זבוב: Smn[E33]בעלי זבוב; מתנת גרגורי מאטרה
זבוב: w[1118]מרכז המלאי בלומינגטוןRRID:BDSC_3605סטוק זבובים
גליצרולפישר סיינטיפיקBP229-1ציון ביולוגיה מולקולרית
תמיסת גליאוקסל (40% משקל ב-H2O)מיליפור סיגמא128465  זו תמיסת 40% סטוק
תוכנת עיבוד תמונה, Affinity Designer 2זיקהhttps://affinity.serif.com/en-us/
תוכנת עיבוד תמונה, Image J (פיג'י)ImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
סיכות לחרקיםכלי המדע המדויק26002-10פלדת אל-חלד, קוטר 0.1 מ"מ (פינים קטנים)
מגנזיום כלוריד (MgCl2)פישר סיינטיפיקAA12315A1
מתנול (HPLC)פישר כימיקל (פישר סיינטיפיק)A452-4להירגע ב-20- ? לפני השימוש
שקופיות מיקרוסקופ, מטושטשותפישר סיינטיפיק12-550-400שטח כתיבה, לא טעון, 75 מ"מ x 25 מ"מ x 1 מ"מ
שקופיות מיקרוסקופ, זכוכית פשוטהפישר סיינטיפיק12-544-4נקי מראש, 75 מ"מ x 25 מ"מ
להבי MX35 אולטרה מיקרוטוםאפרדיה (פישר סיינטיפיק)3053835פרופיל נמוך, 34 מעלות; זווית חיתוך; להבי נוצות C35 בגודל 80 מ"מ עובדים טוב
לק לציפורניים, שקוף (Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish)אמזון0.4 אונקיות נוזליות.
סרום עזים רגילמיליפור סיגמאS26 ליטר
נוטייטור (מיני נואטינג רוקר, בנצ'מרק)מדעי המידווסטH3D102024 סל"ד, קבוע; 8 x 6 אינץ'. פלטפורמה עם שטיח עם גומות
מברשת צבע (סיבוב מס' 0)אמזוןמכחול עגול מס' 0 או מכחול דומה מכל ציוד אמנות
פאראפורמלדהיד (PFA)מיליפור סיגמא158127-500G
סליין מפוזר עם זרחן (PBS): KClמיליפור סיגמא529552-250GMהכינו PBS לפי Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
סליין עם בופר פוספט (PBS): KH2PO4מיליפור סיגמאP0662-500Gהכינו PBS לפי Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
סליין עם בופר זרחן (PBS): Na2HPO4מיליפור סיגמאS9763-500Gהכינו PBS לפי Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
מלח מופעל פוספט (PBS): NaClפישר כימיקל (פישר סיינטיפיק)S271-1הכינו PBS לפי Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
טיפים לפיפטה PR1MA (10 ומיקרו; L)מדעי המידווסטPR10XLRK-NSיוניברסל 10 ומיקרו; קצות פיפטה L
טיפים של פיפט PR1MA (1000 ומיקרו; L)מדעי המידווסטPR-1000RK-FLיוניברסל 1000 ומיקרו; קצות פיפטה L
טיפים של PR1MA Pipette (200 ומיקרו; L)מדעי המידווסטPR-200RK-NSיוניברסל 200 ומיקרו; קצות פיפטה L
רודמין-פאלואידיןInvitrogen, גשושיות מולקולריותR415
סרט דבק דו-צדדי סקוטיסקוטש/3M (סטייפלס)649280שני הצדדים מצופים בדבק, בגודל 0.5" x 7 יארד, זמין ברוב מפעילי ציוד משרדי
נתרן די-הידרוגן פוספט דיהידרט (NaH2PO4)פישר סיינטיפיקAAA1131636
תוכנה: GraphPad Prismפריזמת GraphPadwww.graphpad.com
תוכנה: Infinity Analyze 7טלדיין (Visual Dynamix)https://www.teledynevisionsolutions.com/products/infinity-analyze/
תוכנה: Microscoft Excelמיקרוסופטhttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
טישו/Kimtech Science Kimwipes למגבים עדינים למשימות, שכבה אחתפישר סיינטיפיק06-666מגבוני טישו סטנדרטיים
פיפטת העברהפישר סיינטיפיק13-711-9AMMDפיפטה מפלסטיק
טרישן X-100מיליפור סיגמאT9284-100ML
מספריים קפיץ של ואנאסכלי המדע המדויק15000-00קצה חיתוך 3 מ"מ, קוטר קצה 0.05 מ"מ, אורך 8 ס"מ
Vectashield עם DAPIמעבדות וקטורH-2000
Vectashield ללא DAPIמעבדות וקטורH-1900
נייר ווטמןמיליפור סיגמאWHA1004070מעגלי נייר סינון, דרגה 4, 70 מ"מ
מיקרוסקופ דיסקיטינג סטריאו פלואורסצנטי Z10Visual Dynamix (Midwest Scientific)http://www.visualdynamix.net/
מיקרוסקופ ניתוח סטריאו ארגונומי Z850Visual Dynamix (Midwest Scientific)http://www.visualdynamix.net/

מקורות

  1. Schiaffino, S., Reggiani, C., Murgia, M. Fiber type diversity in skeletal muscle explored by mass spectrometry-based single fiber proteomics. Histol Histopathol. 35 (3), 239-246 (2020).
  2. Plantié, E., Migocka-Patrzałek, M., Daczewska, M., Jagla, K. Model organisms in the fight against muscular dystrophy: lessons from Drosophila and zebrafish. Molecules. 20 (4), 6237-6253 (2015).
  3. Reedy, M. C., Beall, C. Ultrastructure of developing flight muscle in Drosophila. I: assembly of myofibrils. Dev Biol. 160 (2), 443-465 (1993).
  4. Henderson, C. A., Gomez, C. G., Novak, S. M., Mi-Mi, L., Gregorio, C. C. Overview of the muscle cytoskeleton. Compr Physiol. 7 (3), 891-944 (2017).
  5. Luis, N. M., Schnorrer, F. Mechanobiology of muscle and myofibril morphogenesis. Cells Dev. 168, 203760(2021).
  6. Romani, P., Valcarcel-Jimenez, L., Frezza, C., Dupont, S. Crosstalk between mechanotransduction and metabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (1), 22-38 (2021).
  7. Nikonova, E., Kao, S. -Y., Spletter, M. L. Contributions of alternative splicing to muscle type development and function. Semin Cell Dev Biol. , (2020).
  8. Jawkar, S., Nongthomba, U. Indirect flight muscles in Drosophila melanogaster as a tractable model to study muscle development and disease. Int J Dev Biol. 64 (1-3), 167-173 (2020).
  9. Sparrow, J., Hughes, S. M., Segalat, L. Other model organisms for sarcomeric muscle diseases. Adv Exp Med Biol. 642, 192-206 (2008).
  10. Khan, A. O., Simms, V. A., Pike, J. A., Thomas, S. G., Morgan, N. V. CRISPR-Cas9 mediated labelling allows for single molecule imaging and resolution. Sci Rep. 7 (1), 8450(2017).
  11. Atoki, A. V., et al. Exploring the versatility of Drosophila melanogaster as a model organism in biomedical research: a comprehensive review. Fly (Austin). 19 (1), 2420453(2025).
  12. Ling, Y. -P., Li, J. -J., Liu, J. -W., Zeng, B., Chen, G. -L., Wang, N. Technical innovations of signal amplification in fluorescence in situ hybridization. Gene. 964, 149647(2025).
  13. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  14. Fernandes, J., Bate, M., VijayRaghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113 (1), 67-77 (1991).
  15. Swank, D. M. Mechanical analysis of Drosophila indirect flight and jump muscles. Methods. 56 (1), 69-77 (2012).
  16. Dobi, K. C., Schulman, V. K., Baylies, M. K. Specification of the somatic musculature in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (4), 357-375 (2015).
  17. Gunage, R. D., Dhanyasi, N., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Drosophila adult muscle development and regeneration. Semin Cell Dev Biol. 72, 56-66 (2017).
  18. Spletter, M. L., et al. A transcriptomics resource reveals a transcriptional transition during ordered sarcomere morphogenesis in flight muscle. eLife. 7, e34058(2018).
  19. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
  20. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  21. Matera, A. G. Chaperone dysfunction in motor neuron disease: new insights from studies of the SMN complex. Genetics. 229 (3), iyae223(2025).
  22. Jagla, K., Kalman, B., Boudou, T., Hénon, S., Batonnet-Pichon, S. Beyond mice: emerging and transdisciplinary models for the study of early-onset myopathies. Semin Cell Dev Biol. 64, 171-180 (2017).
  23. Reedy, M. K., Reedy, M. C. Rigor crossbridge structure in tilted single filament layers and flared-X formations from insect flight muscle. J Mol Biol. 185 (1), 145-176 (1985).
  24. Fyrberg, E. A., Bernstein, S. I., VijayRaghavan, K. Chapter 14: basic methods for Drosophila muscle biology. Methods Cell Biol. 44, 237-258 (1994).
  25. Volk, T., Fessler, L. I., Fessler, J. H. A role for integrin in the formation of sarcomeric cytoarchitecture. Cell. 63 (3), 525-536 (1990).
  26. Kao, S. -Y., Nikonova, E., Ravichandran, K., Spletter, M. L. Dissection of Drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches. J Vis Exp. (152), e60309(2019).
  27. Bryantsev, A. L., Castillo, L., Oas, S. T., Chechenova, M. B., Dohn, T. E., Lovato, T. L. Myogenesis in Drosophila melanogaster: dissection of distinct muscle types for molecular analysis. Methods Mol Biol. 1889, 267-281 (2019).
  28. Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila pupal abdomen immunohistochemistry. J Vis Exp. (56), e3139(2011).
  29. Segal, D. Live imaging of myogenesis in indirect flight muscles in Drosophila. Bio Protoc. 7 (13), e2377(2017).
  30. Lemke, S. B., Schnorrer, F. In vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in Drosophila pupae. J Vis Exp. 132, e57312(2018).
  31. Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Yatsenko, A. S., Klepzig, A., Shcherbata, H. R. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. J Vis Exp. (46), e2438(2010).
  32. Hunt, L. C., Demontis, F. Whole-mount immunostaining of Drosophila skeletal muscle. Nat Protoc. 8 (12), 2496-2501 (2013).
  33. Szikora, S., Novák, T., Gajdos, T., Erdélyi, M., Mihály, J. Superresolution microscopy of Drosophila indirect flight muscle sarcomeres. Bio Protoc. 10 (12), e3654(2020).
  34. Szikora, S., et al. Nanoscopy reveals the layered organization of the sarcomeric H-zone and I-band complexes. J Cell Biol. 219 (1), e201907026(2020).
  35. Xiao, Y. S., Schöck, F., González-Morales, N. Rapid IFM dissection for visualizing fluorescently tagged sarcomeric proteins. Bio Protoc. 7 (22), e2606(2017).
  36. Chakraborty, K., VijayRaghavan, K., Gunage, R. A method to injure, dissect and image indirect flight muscle of Drosophila. Bio Protoc. 8 (10), e2860(2018).
  37. Nikonova, E., et al. Bruno 1/CELF regulates splicing and cytoskeleton dynamics to ensure correct sarcomere assembly in Drosophila flight muscles. PLoS Biol. 22 (4), e3002575(2024).
  38. Nikonova, E., Mukherjee, A., Kamble, K., Barz, C., Nongthomba, U., Spletter, M. L. Rbfox1 is required for myofibril development and maintaining fiber type-specific isoform expression in Drosophila muscles. Life Sci Alliance. 5 (4), e202101342(2022).
  39. Rajendra, T. K., Gonsalvez, G. B., Walker, M. P., Shpargel, K. B., Salz, H. K., Matera, A. G. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. J Cell Biol. 176 (6), 831-841 (2007).
  40. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  41. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology. , Academic Press. San Diego. (2013).
  42. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Curr Biol. 24 (7), 705-716 (2014).
  43. Chakravorty, S., et al. Flightin maintains myofilament lattice organization required for optimal flight power and courtship song quality in Drosophila. Proc Biol Sci. 284 (1854), 20170431(2017).
  44. Tanner, B. C. W., Farman, G. P., Irving, T. C., Maughan, D. W., Palmer, B. M., Miller, M. S. Thick-to-thin filament surface distance modulates cross-bridge kinetics in Drosophila flight muscle. Biophys J. 103 (6), 1275-1284 (2012).
  45. Görög, P., et al. A myofilament lattice model of Drosophila flight muscle sarcomeres based on multiscale morphometric analysis during development. bioRxiv. , (2025).
  46. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  47. Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons. Biol Methods Protoc. 4 (1), bpz010(2019).
  48. Elliott, A. D. Confocal microscopy: principles and modern practices. Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68(2020).
  49. Kaya-Çopur, A., et al. The Hippo pathway controls myofibril assembly and muscle fiber growth by regulating sarcomeric gene expression. eLife. 10, e63726(2021).
  50. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  51. Zhang, X., et al. Mechanoresponsive regulation of myogenesis by the force-sensing transcriptional regulator Tono. Curr Biol. 34 (18), 4143-4159.e6 (2024).
  52. Kouchmeshky, A., McCaffery, P. Chapter six: use of fixatives for immunohistochemistry and their application for detection of retinoic acid synthesizing enzymes in the central nervous system. Methods Enzymol. 637, 119-150 (2020).
  53. Konno, K., Yamasaki, M., Miyazaki, T., Watanabe, M. Glyoxal fixation: an approach to solve immunohistochemical problem in neuroscience research. Sci Adv. 9 (28), eadf7084(2023).
  54. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. J Oral Maxillofac Pathol. 16 (3), 400-405 (2012).
  55. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  56. Monani, U. R. Spinal muscular atrophy: a deficiency in a ubiquitous protein; a motor neuron-specific disease. Neuron. 48 (6), 885-896 (2005).
  57. Imlach, W. L., Beck, E. S., Choi, B. J., Lotti, F., Pellizzoni, L., McCabe, B. D. SMN is required for sensory-motor circuit function in Drosophila. Cell. 151 (2), 427-439 (2012).
  58. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  59. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
  60. Schnorrer, F., et al. Systematic genetic analysis of muscle morphogenesis and function in Drosophila. Nature. 464 (7286), 287-291 (2010).
  61. Baheux Blin, M., Loreau, V., Schnorrer, F., Mangeol, P. PatternJ: an ImageJ toolset for the automated and quantitative analysis of regular spatial patterns found in sarcomeres, axons, somites, and more. Biol Open. 13 (6), bio060548(2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דיסקציה של שרירי טיסה עקיפים של Drosophila melanogaster לגישות מיקרוסקופיות
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.